Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

في تقييم فيفو الضامة السنخيه افيروسيتوسيس بعد التعرض للأوزون

Published: October 22, 2019 doi: 10.3791/60109

Summary

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتحديد ما إذا كان التعرض للأوزون ، وهو معيار من ملوثات الهواء ، يضعف الضامة السنخيه الافيروسيتوسيسه في الجسم المجري. يستخدم هذا البروتوكول الكواشف والتقنيات المستخدمة بشكل شائع ويمكن تكييفها مع نماذج متعددة من الإصابات الرئوية لتحديد الآثار علي افيروسيتوسيس الضامة السنخيه.

Abstract

الأوزون (O3) هو معيار ملوث الهواء الذي يفاقم ويزيد من حدوث الامراض الرئوية المزمنة. ومن المعروف O3 التعرض للحث علي التهاب رئوي ، ولكن يعرف القليل بشان كيفيه التعرض يغير العمليات الهامه لحل التهاب. افيروسيتوسيس هو عمليه القرار ، حيث الضامة الخلايا ابوتوتيك. الغرض من هذا البروتوكول هو قياس الضامة السنخيه افيروسيتوسيس بعد O3-الناجمة عن أصابه الرئة والتهاب. وقد وصفت عده طرق لقياس الافيروسيتوسيس ؛ ومع ذلك ، معظم تتطلب التلاعب السابقين الجسم الآخر. وصفت بالتفصيل هنا هو بروتوكول لقياس في الجسم الضام السنخيه افيروسيتوسيس 24 ح بعد O3 التعرض ، الذي يتجنب التلاعب الجسم السابق من الضامة وبمثابه تقنيه بسيطه التي يمكن استخدامها لتمثيل بدقه الاضطرابات في عمليه الحل هذه. البروتوكول هو طريقه غير مكثفه من الناحية الفنية وغير مكلفه نسبيا التي تنطوي علي الجسم كله O3 استنشاق متبوعا بلعوم الطموح من الخلايا ابوتوتيك (اي خلايا T jurkat) بينما تحت التخدير العام. ثم يقاس افيروسيتوسيس الضامة السنخيه بتقييم المجهري الخفيفة من الضامة التي تم جمعها من غسل البرونزية (BAL). يتم قياس افيروسيتوسيس أخيرا عن طريق حساب مؤشر افيروسيتيك. وبشكل جماعي ، فان الطرق المبينة تحدد النشاط افيروسيتيك في الرئة في الجسم المجري بينما تعمل أيضا علي تحليل الآثار الصحية السلبية لل O3 أو الشتائم المستنشقة الأخرى.

Introduction

تتعرض الرئة باستمرار إلى الإهانات البيئية ، بما في ذلك الجسيمات الهوائية ، والفيروسات ، والبكتيريا ، والغازات المؤكسدة التي تؤدي إلى التهاب رئوي1،2،3. هذه الإهانات يمكن ان تضر تبادل الغاز والحثعلي أصابه الانسجه لا رجعه فيه 4,5. الضامة السنخيه ، التي تشكل حوالي 95 ٪ من الخلايا المناعية الموجودة في murine والرئتين البشرية في التوازن ، هي المنظمين الحرجة من التهاب رئوي بعد الإهانات البيئية1،2، 3،4،5. الضامة السنخيه ضرورية خلال الدفاع المضيف عن طريق التخدير والقضاء علي مسببات الامراض. في الاونه الاخيره ، وقد ثبت الضامة السنخيه لتعزيز التوازن الانسجه وحل التهاب من خلال افيروسيتوسيس6،7. افيروسيتوسيس هو عمليه الفاجريه التي تبتلع الضامة والقضاء علي خلايا ابوتوتيك8،9،10. افيروسيتوسيس أيضا نتائج في إنتاج وسطاء (اي ، آيل-10 ، tgf-β ، pge2، وأكسيد النيتريك) التي تزيد من زيادة العملية ، مما ادي إلى حل التهابات9،10،11 و12و16و18. هذه العملية ضرورية لمنع النخر الثانوي وتعزيز التوازن الانسجه12,13,14. وقد ربطت العديد من الدراسات ضعف الافيروسيتوسيس مع مختلف امراض الرئة المزمنة, بما في ذلك الربو, مرض الانسداد الرئوي المزمن, والتليف الرئوي مجهول العلة8,9,15, 16و17.

O3 هو معيار الملوثات الجوية التي تفاقم ويزيد من الاصابه بامراض الرئة المزمنة19،20،21. O3 يستحث التهاب الرئة والاصابه ، ومن المعروف ان يضعف الضامة السنخيه من مسببات الامراض البكتيرية22،23. ومع ذلك ، فمن غير المعروف ما إذا كان O3 يضعف الضامة السنخيه افيروسيتوسيس. التحقيق O3-التي يسببها التعديلات في افيروسيتوسيس الضامة السنخيه سوف توفر البصيرة المحتملة في كيفيه التعرض يمكن ان يؤدي إلى حدوث امراض الرئة المزمنة وتفاقم. ويرد أدناه طريقه بسيطه لتقييم الضامة السنخيه افيروسيتوسيس في رئتي الفئران الإناث بعد التعرض الحاد O3 .

الأسلوب المبينة posseses العديد من المزايا علي بروتوكولات افيروسيتوسيس الأخرى التي يشيع استخدامها في الميدان عن طريق القضاء علي استخدام الاصباغ الفلورية مكلفه, قياسات تدفق واسعه النطاق الخلوي, والتلاعب السابقة الجسم الضام من السنخيه24 ،25. بالاضافه إلى ذلك ، يقيس هذا البروتوكول افيروسيتوسيس الضامة السنخيه في سياق البيئة المجهرية الرئة ، والتي يمكن ان تؤثر علي وظيفة الضامة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة علي جميع الأساليب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانية (IACUC) من جامعه ولاية كارولينا الشرقية.

1-الأوزون (O3) والتعرض للهواء المصفي (اليوم الأول)

  1. وضع حد اقصي 12 الإناث C57BL/6J الفئران ، 8-12 أسابيع من العمر ، في قفص من الصلب (مع 12 مقصورات منفصلة) مع الاغطيه شبكه سلكيه في O3 غرفه التعرض.
  2. وضع ميزان الحرارة في غرفه التعرض مع القفص لتسجيل بدقه درجه الحرارة والرطوبة.
  3. تشغيل الأكسجين والاشعه فوق البنفسجية (UV) الخفيفة التي تعلق علي الجهاز.
    ملاحظه: تدفق الهواء المنظم (ال> 30 تغيرات جوية/ساعة) مع درجه الحرارة التي تسيطر عليها (22-23 درجه مئوية) والرطوبة النسبية (45 ٪-50 ٪) يتم الحصول عليها من قبل جهاز O3 . O3 يتم إنشاؤها من قبل النظام في غرفه التعرض عن طريق توجيه 100 ٪ الأكسجين من خلال مولد ضوء الاشعه فوق البنفسجية ، ثم خلط مع إمدادات الهواء المصفاة.
  4. ضبط O3 تركيز إلى 1 جزء في المليون وتسجيل بانتظام o3 مستويات كل 10 دقيقه ل 3 ح. مراقبه باستمرار درجه الحرارة والرطوبة من الهواء الغرفة ، كما هو O3 تركيز مع ضوء الاشعه فوق البنفسجية الضوئية.
    ملاحظه: يتم تنفيذ التعرض للهواء المصفاة في جهاز مماثل ، مع إمدادات الهواء المصفاة فقط تتدفق من خلال غرفه التعرض.
  5. أعاده الكائنات إلى أقفاص الخاصة بهم مع الفراش ، والغذاء ، والماء الإعلان حسب بعد 3 ساعات من O3/تصفيه التعرض للهواء.

2-اعداد الخط الخلوي للخلايا التائية (اليوم الثاني)

ملاحظه: يجب ان تجري جميع الإجراءات في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.

  1. الثقافة Jurkat T الخلايا في 24 مل من الخلايا القاعدية الثقافة المتوسطة + 10 ٪ من البنسلين + 5 ٪ البنسيلين/ستربتوميسين في 37 درجه مئوية + 5 ٪ CO2 (جدول المواد). الخلايا التائية هي خط الخلية المعلقة التي يمكن الحفاظ عليها من خلال المرور 1:6-1:8 في وسائل الاعلام قبل تسخينها الوسائط كل 3 أيام. لا تهز.
  2. لاعداد الخلايا ابوتوتيك ، تنمو لهم 90 ٪ كونفلوينسي في كل قارورة (الذي يستغرق 3-4 يوما لتحقيق بعد المرور). لهذه الدراسة ، استخدم الخلايا من خمسه T75 قوارير للحصول علي عدد كاف من الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول.
    ملاحظه: تحتوي قارورة متموج علي حوالي 20-24 مليون خليه.
  3. ماصه الخلايا (التي هي القارورة بأكملها) من كل قارورة (حوالي 24 مل) ونقل الخلايا إلى أنبوب المخروطية معقمه 50 mL باستخدام ماصه المصلية. استخدام أنابيب مخروطيه متعددة لقوارير متعددة.
  4. عد الخلايا عن طريق أزاله 11 μl قسامه من الخلايا من أنبوب مخروطي 50 mL وتخلط مع 11 μl من تريلون الأزرق وصمه عار وماصه 11 μl علي الشرائح مقياس القولون.
  5. ادراج شريحة في عداد الخلية الألى وتسجيل عدد من الخلايا الحية لحساب إجمالي عدد الخلايا في كل قارورة عن طريق ضرب عدد من الخلايا الحية بنسبه 24 ، كما تحتوي كل قارورة 24 مل من وسائل الاعلام.
  6. الطرد المركزي تعليق الخلية في 271 x ز ل 5 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT) إلى خلايا بيليه.
  7. تجاهل ماده طافي عن طريق الطموح وأعاده تعليق بيليه الخلية في وسائل الاعلام للحصول علي 3.0 x 106 خلايا لكل مل.
  8. Aliquot 5 مل من الخلايا في 100 مم × 20 ملم الانسجه ثقافة النسيج (سيتم استخدام ما يقرب من تسعه اطباق; المبلغ الإجمالي للخلايا في كل طبق يجب ان يكون ~ 15 × 106).
  9. استخدام طبق واحد للسيطرة/غير مكشوف ، وسوف يتعرض الاطباق المتبقية للاشعه فوق البنفسجية.
  10. تعيين الرابط الاشعه فوق البنفسجية إلى مستوي الطاقة الصحيح ، اضغط علي زر الطاقة ، وادخل "600" باستخدام لوحه الأرقام ، والتي سيقرا الجهاز كما 600 μJ/سم2 × 100.
    ملاحظه: وحدات الطاقة المتداخلة UV في μJ/cm2 x 100; ولذلك ، لتحقيق 60 ميليجوليس/سم2، تحويل وحدات لتتناسب مع crosslinker الاشعه فوق البنفسجية.
  11. تشع جميع الاطباق مع الخلايا ، وليس بما في ذلك السيطرة ، في 60 ميليجولز (mJ)/سم2 باستخدام الرابط فوق البنفسجية. أزاله الغطاء العلوي من الاطباق ثقافة الانسجه اثناء التعرض للاشعه فوق البنفسجية ، كما ضوء الاشعه فوق البنفسجية لن تخترق الغطاء البلاستيكي.
  12. احتضان جميع الاطباق في حاضنه ثقافة الخلية ، بما في ذلك السيطرة غير المكشوفة ، في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2 لمده 4 ساعات.
  13. تاكيد موت الخلايا المبرمج عن طريق تدفق الخلوي باستخدام الكشف عن الفحص المبرمج الذي يحتوي علي الملحق V و بروبيديوم يوديد (PI) (علامات للمبرمج ونخر ، علي التوالي) بعد 4 ح من الحضانة ، في تعليمات الشركة المصنعة26، 27-
    ملاحظه: الاشعه المشعة الخلايا T في الخلية المتقاطعة للاشعه فوق البنفسجية في مستوي الطاقة من 600 μJ/سم2، بعد الحاضنة 4 ح سوف يؤدي إلى ≥ 75 ٪ من ابوتوتيك (علي حد سواء في وقت مبكر ومتاخر) الخلايا وجود النمط الظاهري ابوتوتيك أكثر من أواخر النمط الظاهري. وهذا يجعل من السهل علي الضامة السنخيه للتعرف عليها وابتلاع كما اغشيها غير قابله للاختراق, علي عكس الخلايا المتاخره ابوتوتيك, مما يؤدي إلى مؤشر افيروسيتيك اعلي والتصوير أكثر دقه من الضامة السنخيه افيروسيتوسيس في هذه الدراسة.
    1. تجمع 333 μL (1 × 106 خلايا) من الخلايا التائية من العديد من الاطباق (علي حد سواء "لا الاشعه فوق البنفسجية" و "الاشعه فوق البنفسجية مكشوفة") معا لاستخدامها لأنابيب تحليل التعويض.
    2. Aliquot 333 μL من الخلايا T Jurkat في غير ملون ، المرفق في الخامس وصمه عار واحده ، PI وصمه عار واحده ، لا الاشعه فوق البنفسجية التحكم ، و 600 μJ/سم2 UV-مكشوف المسمي تدفق أنابيب الخلوية.
    3. أنابيب الطرد المركزي في 188 x ز لمده 5 دقائق في RT وصب supernatant.
    4. غسل الخلايا عن طريق أعاده تعليق في 500 μL من البرد ، 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني).
    5. أجهزه الطرد المركزي والخلايا بيليه في 188 x ز لمده 5 دقائق في RT. تجاهل سوبرناتنت بعد طرد.
    6. اعداد 400 μL من 1x العازلة ملزمه لكل أنبوب تدفق عن طريق تمييع 10x ملزمه العازلة مع الماء المقطر في حين ان الخلايا يطرد.
    7. اعداد الضم في V و PI كاشف الحاضنة (100 μL لكل عينه/أنبوب) في تعليمات الشركة المصنعة.
    8. Decant علي ماده طافي بعد طرد وبلطف أعاده تعليق جميع الأنابيب في 400 μl من 1x العازلة ملزمه ، ثم أضافه 100 μl من المرفق الخامس الحاضنة كاشف لكل أنبوب عينه. وأخيرا ، أضافه 100 μL من الملحق الخامس وصمه عار واحده و PI وصمه عار واحده لأنابيب كل منهما ، ولكن لا تضيف اي شيء ابعد من 1x العازلة ملزمه للأنبوب غير ملون.
    9. احتضان الأنابيب في الظلام لمده 15 دقيقه في RT.
    10. الطرد المركزي جميع الخلايا في 188 x ز لمده 5 دقائق في RT والفائقة صب.
    11. أعاده التوقف المرحلي الخلايا في 400 μL من المخزن المؤقت للربط 1x ، ثم تحليل عينات للخلايا المبرمج عن طريق تدفق الخلوية. جمع ما لا يقل عن 10,000 الاحداث لكل أنبوب للسماح تمثيل دقيق لتلطيخ.
  14. الجمع بين جميع الخلايا المشعة من الاطباق إلى أنبوب مخروطي 50 mL والخلايا بيليه بطرد في 271 x ز لمده 5 دقائق في RT.
  15. تجاهل ماده طافي من الأنبوب عن طريق الطموح وأعاده التعليق الخلايا في 24 مل من الفوسفات معقمه مخزنه المالحة (تلفزيوني) والخلايا بيليه بطرد في 271 x ز ل 5 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
  16. تجاهل ماده طافي من الأنبوب عن طريق الطموح وأعاده تعليق الخلايا في كميه من القناات التلفزيونية المستخدمة للجرعات الفئران التي وافقت عليها iacuc. الجرعة المستخدمة بين 5-10 × 106 خلايا/50 μl لكل ماوس; لذلك ، ل 10 الفئران ، أعاده التعليق في 500 μL (عدد الخلايا في كل جرعه يختلف اعتمادا علي كيفيه العديد من الخلايا المستزرعة للإشعاع).
    ملاحظه: ماكياج علي الأقل جرعتين إضافيتين لحساب اي سائل قد تلتصق بجانبي طرف الماصة مما يؤدي إلى فقدان الخلايا.

3. murine بلعوم تقطير خلايا ابوتوتيك (اليوم 2)

  1. اعداد جرعات من الخلايا ابوتوتيك باستخدام ماصه P200 قبل تخدير الفئران لتسريع الاجراء. وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ، يتم استخدام حجم 50 μL يحتوي علي حوالي 5-10 x 106 خلايا لبلعوم (منطوق) تقطير لضمان أفضل النتائج.
  2. تخدير الفئران في غرفه واضحة مع 2 ٪ ايزوفلواني بمعدل تدفق 1 لتر/دقيقه أو وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. تخدير واحد إلى اثنين من الفئران في كل مره. يتم تحديد الرقم بمستوي الراحة لمجرب. مراقبه نمط التنفس وتاكيد الأنفاس العميقة مرئية مع 2-3 ليالي التهم بين الأنفاس. التحقق من عمق التخدير بسبب عدم وجود استجابه لقرصه اصبع القدم.
  3. وضع الماوس في موقف ضعيف شبه recumbent. استخدام سلسله الجراحية تعادل بين أوتاد علي لوحه مائله الأكريليك ورقه لتعليق من قبل القواطع الفك العلوي.
  4. باستخدام زوج من الملقط غير الحاد غير المثبت ، وانتزاع بخفه وسحب اللسان الماوس. غرس الخلايا ابوتوتيك في تجويف الفم مع ماصه P200. الجرعات ناجحه عندما الفئران جعل الضوضاء طقطقه 1 – 2 ق بعد إعطاء الجرعة.
    ملاحظه: رعاية لتجنب حمل الصدمة اما إلى اللسان أو بلعوم قبل تقطير الخلية ابوتوتيك.
  5. مع اصبع القفاز ، ومنع بلطف الأنف حتى يستنشق الماوس في حين تراجع اللسان. تغطيه الأنف حتى لا يكون السائل مرئيا في تجويف الفم والماوس قد اتخذت اثنين أو أكثر من الاستنشاق.
    ملاحظه: كما الفئران هي التي تلزم الأنف التنفس ، وتغطي الأنف يساعد علي ضمان ان الماوس سوف يستنشق الخلايا ابوتوتيك في الرئتين.
  6. أزاله الماوس من مجلس التلقيح والعودة إلى القفص للسماح الانتعاش من التخدير. ضع الماوس علي ظهره لمنع الفراش أو الحطام من عرقله فتحتي خلال revovery.
  7. الانتظار 90 دقيقه بعد الماوس يتعافى من التخدير للسماح الضامة السنخيه لابتلاع تدفق الخلايا ابوتوتيك بعد كل الفئران قد استيقظت من التخدير. عاده ، الصحوة بعد التخدير سوف يستغرق 1-2 دقيقه ، والتي لا ينبغي ان تؤثر علي نتيجة/توقيت تقطير.

4-جمع السوائل القصبية ومعالجتها (اليوم الثاني)

  1. موت ببطء كل الماوس لكل المبادئ التوجيهية المؤسسية 90 دقيقه بعد الماوس قد استيقظ من التخدير من الجرعات مع الخلايا ابوتوتيك. هنا ، يتم استخدام حقنه مميته من الكيتامين و اكسيليازين (90 ملغم/كغ و 10 ملغم/كغم ، علي التوالي) متبوعه باستئصال الحجاب الحاجز.
    ملاحظه: هذه النقطة الزمنيه يسمح الوقت الكافي ل الضامة السنخيه للشعور وابتلاع الخلايا ابوتوتيك38.
  2. تزن جميع الفئران (ز) علي مقياس وسجل الأوزان. استخدام وزن الجسم لحساب حجم BAL (26.25 mL/kg وزن الجسم).
  3. وضع الفئران علي ظهورهم ورذاذ 70 ٪ الايثانول لتعقيم منطقه الصدر والرقبة.
  4. جعل 2 "قطع طوليه فقط تحت القص علي طول الجانب البطني بأكمله مع مقص الجراحية ، واثناء عقد القص مع ملقط ، نك الحجاب الحاجز للسماح للرئتين بالسقوط مره أخرى في تجويف الصدر.
  5. قطع جانبيا علي طول الجانبين من القفص الصدري للسماح للرئتين مساحة أكبر لتوسيع عندما lavaging ، ثم اضعاف تجويف الصدر مره أخرى مع ملقط.
  6. جعل 1 "قطع عمودي علي طول الاوعيه الدموية من خلال الرقبة لفضح القصبة الهوائية.
  7. استخدم ملقطين لسحب العضلات والانسجه من القصبة الهوائية وفضحها. تجنب النزيف المحتمل اضافيه وقطع القصبة الهوائية ، لأنه محاط بالاوعيه الدموية ، والعضلات الطولية ، والنسيج الضام.
  8. استخدام ابره لجعل فتحه في القصبة الهوائية (حوالي ربع المسافة إلى أسفل من الراس) وادراج قني (18 G x 1.25 ") مع حقنه محمله مسبقا مع 1x تلفزيوني (26.25 ml/kg وزن الجسم ، ~ 0.7-1.0 ml في 8-10 الأسبوع الإناث القديمة C57Bl/6j الماوس) أتحرك في البند hea.
  9. دفع حجم من تلفزيوني في الرئتين ببطء للسماح الرئتين لتضخيم ثم ، سحب حجم العودة إلى الحقنه. كرر هذه العملية ما مجموعه 3 مرات.
  10. جمع السائل غسل المجمعة من كل ماوس محدده في أنبوب 15 مل.
  11. الطرد المركزي غسل البرونزية في 610 x ز ل 6 دقيقه في 4 درجه مئوية وجمع ماده طافي في أنبوب 1.5 mL وتجميد في-80 درجه مئوية. بيليه يمثل الخلايا من الفضاء البرونزي.
  12. أزاله خلايا الدم الحمراء المتبقية في السائل BAL التي تم جمعها عن طريق أضافه 1 مل من ACK ربك تحلل العازلة إلى بيليه الخلية ، ثم دوامه جيدا و lyse لمده 1 دقيقه علي الجليد. بعد ذلك ، أضافه 4 مل من تلفزيوني لوقف رد فعل تحلل.
  13. الخلايا بيليه بواسطة طرد في 610 x ز ل 6 دقيقه في 4 درجه مئوية ويستنشق ماده طافي مع الشفط فراغ.
  14. أعاده التعليق الخلايا في 1 مل من 1x تلفزيوني + 10 ٪ لكل أنبوب عينه BAL. عد الخلايا علي مقياس الكريات الدموية للقياس الكمي لإجمالي خلايا المجال الجوي من كل عينه (لا التريلا الأزرق). الطرد المركزي 120 μL من كل عينه علي الشرائح في 56 x ز لمده 3 دقائق ، وذلك باستخدام التسارع المتوسطة والطارد الخلوي. جفف الشرائح بين عشيه وضحيها.

5. حساب مؤشر افيروسيتيك الضامة السنخيه (اليوم 3)

  1. وصمه عار الشرائح مع الهييوكسيلين و يوزين للسماح لحساب كل من افيروسيتيك والفرق الخلايا التفاضلية ، مع ما لا يقل عن 200 خلايا تحسب من كل شريحة.
  2. عرض الشرائح تحت اعداد الحقل الساطع علي المجهر البيولوجي (هدف 20x أو 40x سوف تعمل بأفضل).
  3. حساب مؤشر افيروسيتيك استنادا إلى نسبه عدد من الضامة السنخيه التي الخلايا التائية الخلوية جوركات T إلى الضامة السنخيه دون امتصاص الخلايا ابوتوتيك من إجمالي 200 الضامة علي شريحة التفاضلية الخلية. تحويل النسبة إلى نسبه مئوية لإدخال البيانات. استخدم المعادلة التالية:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

O3 التعرض هو معروف للحث علي التهاب الرئة والاصابه ، ومطلوب افيروسيتوسيس للحفاظ علي التوازن الانسجه. C57BL/6J الفئران الإناث تعرضت لتصفيه الهواء (FA) أو 1 جزء في المليون O3 لمده 3 ساعات والانحلال 24 ساعة بعد التعرض لفحص التهاب الرئة والاصابه. O أظهرت الفئران3المكشوفة زيادة كبيره في الضامة والعدلات في المجال الجوي مقارنه مع مجموعه التحكم FA (الشكل 1ا ، ب). بالاضافه إلى ذلك ، O3-الفئران المكشوفة كان لها زيادة كبيره في البروتين BAL ، علامة من الخلل ظهاري السنخيه 24 ساعة بعد التعرض (الشكل 1ج).

لتحديد ما إذا كان O3-الناجمة عن التهاب رئوي يرتبط مع العيوب في الضامة السنخيه افيروسيتوسيس في الجسم الفيفو ، تم غرسها الفئران C57BL/6j مع الخلايا التائية الدموية التي جوكات بلعوم عن طريق الطموح 24 ساعة بعد FA أو ما بعد O3 تعرض. وأكد المبرمج في الخلايا T Jurkat من قبل تدفق الخلوية قبل الجرعات, وكان هناك زيادة كبيره في وقت مبكر (المرفقالخامس + pi-وفي وقت متاخر (المرفقالخامس + وpi +)الخلايا ابوتوتيك (الشكل 2ا, ب). ادي مستوي التعرض ووقت الحضانة في النتائج المتكررة للخلايا ~ 75 ٪ ابوتوتيك جوكات. ويرد في الشكل 3اصوره مكبره لما تم تحديده علي انه افيروسيتيك بلضام. تم التعرف علي الضامة افيروسيتيك الضامة التي اجتاحت خليه المحلفين T (المشار اليها بواسطة السهام السوداء) ، مقارنه بالضامة السنخيه العادية (المشار اليها بواسطة السهام البيضاء) (الشكل 3ب). عندما تم تقييم افيروسيتوسيس الضامة السنخيه باستخدام البروتوكول ، كان هناك انخفاض كبير إحصائيا في المؤشر الافيروسيتيك للمجموعة O3المكشوفة مقارنه بضوابط FA (الشكل 3ب ، ج). وتشير هذه البيانات إلى ان O3-الناجمة عن التهاب رئوي يرتبط مع انخفاض أزاله الخلايا ابوتوتيك, التي قد تطيل أصابه الرئة والتهاب.

Figure 1
الشكل 1: O3 يؤدي التعرض للالتهاب الرئوي والاصابه. C57BL/6J الفئران الإناث تعرضت لتصفيه الهواء (FA) أو 1 جزء في المليون O3 ل 3 ح. 24 ح بعد التعرض ، كانت الفئران necحبال لتحليل التهاب الرئة والاصابه (ن = 6 لكل مجموعه). (ا) تم حساب الفوارق الخلويةلغسلالقصبات (BAL) ، ثم طلائي (epi) ، الحمضات (eos) ، الخلايا الليمفاوية (الليمفاوية) ، الضامة (mɸ) ، و العدلات (pmn) تم تحديدها مع ما لا يقل عن 200 خليه تحسب من كل شريحة. (ب) صوره تمثيليه للفروق الخلوية. (ج) البروتين الكلي في السائل BAL. ويتم التعبير عن البيانات باعتبارها ± SEM (* * p < 0.01). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تاكيد الاشعه فوق البنفسجية المستحثة المبرمج في الخلايا T Jurkat. وقد تعرضت الخلايا T jurkat إلى الاشعه فوق البنفسجية (60 مللي جول/سم2) باستخدام الاشعه فوق البنفسجية Crosslinker (نموذج 1800). بعد التعرض للاشعه فوق البنفسجية ، تم احتضان الخلايا التائية في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 لمده 4 ساعات. بعد الحضانة ، تم تلطيخ الخلايا التائية مع المرفق الخامس ويوديد بروبيديوم (PI) ، وتم تقييم المبرمج من قبل تدفق الخلوي. ويتم تحديد الخلايا الميتة في وقت مبكر ، ابوتوتيك في وقت متاخر ، والخليات نخريه كما الضمv +/pi-، المرفقاتv +/pi +، المرفقات v-/pi +، علي التوالي. المخططات التمثيلية للتدفق الخلوي المبعثر (مع تسجيل احداث 10,000) من (ا) الخلايا التائية غير المكشوفة و (ب) الخلايا التائية المكشوفة للاشعه فوق البنفسجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: O3 التعرض يقلل الضامة السنخيه افيروسيتوسيس. C57BL/6J الفئران الإناث تعرضت لتصفيه الهواء (FA) أو 1 جزء في المليون O3 ل 3 ح. 24 ح بعد التعرض ، تم أوروفارينجيلي غرس الفئران مع ما يقرب من 5 × 106 ابوتوتيك الخلايا التائية. 1.5 h بعد تقطير ، تم تنفيذ غسل البرونزية (BAL) ، وتم حساب مؤشر افيروسيتيك في الضامة BAL بواسطة المجهر الضوئي بعد احتساب 200 الضامة (ن = 11 لكل مجموعه). (ا) صوره تمثيليه لافيروسيتيك الضامة. (B) تحديد الضامة السنخيه (السهام البيضاء) و افيروسيتيك بلبلاجي (السهام السوداء) بعد FA أو O3 التعرض. (ج) حساب الرقم القياسي لافيروسيتيك بعد التعرض لل FA أو O3 (* * * p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: شبه الأمثل Jurkat T الخلية المبرمج باستخدام 350 nm المصابيح متجمد. تم المشع الخلايا T jurkat باستخدام الرابط الاشعه فوق البنفسجية لمده 10 دقيقه وحضنت في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2 لمده 1 ساعة. بعد التعرض للاشعه فوق البنفسجية ، تم احتضان الخلايا التائية في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 لمده 4 ساعات. بعد الحضانة ، تم تلطيخ الخلايا التائية مع الملحق V و بروبيديوم يوديد (PI) ، ثم تم تقييم المبرمج من قبل تدفق الخلوي. وتعرف الخلايا الميتة المبكرة ، والتي كانت في وقت متاخر من الموت ، والخلية النخريه علي انها المرفقالخامس +/pi-، والضمv +/pi +، والضم v-/pi +، علي التوالي. تمثيليه تدفق المؤامرات الخلوية (مع 10,000 الاحداث المسجلة) من الاشعه فوق البنفسجية المكشوفة Jurkat T الخلايا مع المصابيح 350 nm وتظهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

افيروسيتوسيس هو عمليه مضاده للالتهابات التي الضامة واضحة خلايا ابوتوتيك والحطام ، فضلا عن إنتاج متعددة الوسطاء المضادة للالتهابات9،10،11،12،16 ،18. وقد قدمت نماذج متعددة من افيروسيتوسيس نظره ثاقبه كيف الضام هو خليه حرجه في حل التهاب6,7. في الاونه الاخيره ، وقد ارتبط تطور امراض الرئة المزمنة مع العيوب في افيروسيتوسيس8،9،15،16،17. غير انه من غير الواضح حاليا ما إذا كان التعرض للملوثاتالهوائية مثل O 3 يؤدي إلى عيوب في الافيروسيتوسيس. هذا البروتوكول يمكن تقييم الضامة السنخيه افيروسيتوسيس بعد O3 التعرض. كما انه ثبت قيمه الافيروسيتوسيس في الجسم المجري باستخدام المجهر الضوئي ويسمح بقياس الافيروسيتوسيس في سياق البيئة المجهرية الرئوية ، دون تلاعبات الجسم السابق أو الاصباغ الفلورية المكلفة. علي الرغم من ان يتم تنفيذ هذا البروتوكول في سياق O3 التعرض ، يمكن استخدام نماذج متعددة من التهاب الرئة والاصابه مع هذا البروتوكول لتقييم الضامة السنخيه افيروسيتوسيس.

مزايا هذا الأسلوب علي الطرق القائمة هي قدرته علي تحليل الضامة السنخيه في سياق البيئة الفسيولوجية. التحليل المجري السابق من الضامة السنخيه ويشمل الطلاء والحضانة مع الخلايا ابوتوتيك. تصفيح الضامة السنخيه يمكن ان تحفز كل من التغييرات الفسيولوجية والجينية التي قد تغير افيروسيتوسيس28،29،30. بالاضافه إلى ذلك ، في الرئة ، توجد الضامة السنخيه في البيئة المجهرية التي تحتوي علي السطحي ومكونات السائل بطانة الرئة التي من المعروف ان التاثيرات وظيفة الضامة31،32،33، 34,35. طريقتنا يسمح قياسات افيروسيتوسيس في الرئة مع اي التلاعب السابقين الجسم الآخر ، والتي هي أكثر اهميه من الناحية الفسيولوجية. التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول يمكن ان يؤدي إلى مزيد من الدراسات المتعمقة حول كيفيه البيئة المجهرية الرئة يمكن ان يغير افيروسيتوسيس الضامة السنخيه.

ومن المكونات الحاسمة لهذا البروتوكول هو توليد خلايا ابوتوتيك لتقييم الضامة السنخيه افيروسيتوسيس. وهذا ينطوي علي تحسين مستوي التعرض الصحيح للاشعه فوق البنفسجية للحث علي موت الخلايا المبرمج ، وليس نخر. بروتوكولنا يستخدم الاشعه فوق البنفسجية crosslinker مع 254 nm المصابيح الموجية الانبعاثات ومستوي التعرض من 60 mJ/cm2. الخيارات لمبة الاشعه فوق البنفسجية هي حاسمه في إنتاج المبرمج ، وليس نخر. 350 nm لمبات الاشعه فوق البنفسجية هي ممتازة لغشاء البروتين عبر ربط والتعقيم ولكن تفشل للحث علي المبرمج35،36،37. مثال نقطه مؤامرة من الخلايا T Jurkat تعرض ل 60 مللي جول/سم2 مع 350 nm المصابيح هو مبين في الشكل 4 مع زيادة كبيره في الخلايا المتاخره ابوتوتيك ونخريه. بالاضافه إلى ذلك ، يستخدم البروتوكول 4 h حضانة بعد التعرض للاشعه فوق البنفسجية. لتحسين هذا الجزء من البروتوكول ، ونحن سابقا درست أوقات الحضانة المختلفة وجدت ان 1.5 والحضانة 2 ح بعد التعرض فقط أسفرت تقريبا 40 ٪ المبرمج ، مع مؤشر افيروسيتيك اقل من 5 ٪ (البيانات لم تظهر). استنادا إلى الأدبيات الحالية ، ~ 70 ٪-80 ٪ مجموع الخلايا ابوتوتيك كافيه لقياس افيروسيتوسيس38.

القيود علي هذا البروتوكول هو انه يفحص الاستجابة الافيروسيتيكه لجميع الضامة في المجال الجوي بعد FA أو O3 التعرض ولا يميز الضامة الانسجه المقيمين من الضامة المعينة. الضامة المقيم الرئة تسمي الضامة السنخيه تنشا من الكبد الجنيني ، في حين ان الضامة المعينة تستمد من أصل جنيني المنقولة بالدم. عند الاصابه ، يمكن ان يكون الرئة السكان الضامة غير المتجانسة للغاية مع علم الوراثة فريدة من نوعها والتعبير عن علامات سطح الخلية28،29،30،31،32، 33،34،35. ومن المعروف ان الاستجابة المناعية ووظيفة هذه السكان البلبلسن مختلفه; ومع ذلك, وقد أشارت الدراسات الاخيره إلى ان الضامة المقيم الانسجه لديها استجابه افيروسيتيك أكبر مقارنه بالضامة المعينة29,30,31. تحديد الاستجابة الافيروسيتيكه من الضامة المقيمين الانسجه مقابل الضامة المعينة يمكن تقييمها مع البروتوكول الحالي ؛ ومع ذلك ، السكان البلبلاج تحتاج إلى تنقيه من قبل FACS ومطلي علي الشرائح للتحليل. بالاضافه إلى ذلك ، هذا البروتوكول فقط يقيم الضامة السنخيه افيروسيتيك الدالة في سلاله واحده من الفئران المتاحة تجاريا. وقد سبق الإبلاغ عن ان سلالات مختلفه من الفئران تظهر استجابات مختلفه ل O3 التعرض, بما في ذلك التهاب الرئة39,40. ولذلك ، قد يكون هناك اختلافات في الضامة السنخيه افيروسيتوسيس استنادا إلى سلاله فحصها. هذا هو المتغير الذي ينبغي ان تؤخذ في الاعتبار عند تنفيذ هذا في الفحص المجري.

وفي الختام ، فان البروتوكول الموصوف أعلاه يسمح بتقييم الضامة السنخيه افيروسيتوسيس في الجسم المجري. هذا البروتوكول هو فعاله من حيث التكلفة وبسيطه ، مما يجعلها المقايسة التي يمكن استخدامها علي نطاق واسع. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة علي نماذج عديده من أصابه الرئة و/أو التهاب لزيادة فهم كيفيه الشتائم الرئوية المختلفة يمكن ان يغير الضامة افيروسيتوسيس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم تمويل هذه الدراسة من قبل معهد الآثار الصحية والتر ا. روزنبليث جائزه و NIEHS R01ES028829 (إلى k. m. G). ونود ان نشكر الدكتورة ديان والترز (قسم فسيولوجيا ، ECU) لمساعدتها في الحصول علي صور تمثيليه من الضامة السنخيه.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
  2. Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
  3. Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
  4. Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
  5. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
  6. Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
  7. Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
  8. Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
  9. Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
  10. Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
  11. Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
  12. O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
  13. Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
  14. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  15. Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
  16. Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
  17. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
  18. Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
  19. Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
  20. Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
  21. Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
  22. Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
  23. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  24. Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
  25. Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
  26. Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
  27. Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
  28. Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
  29. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  30. Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
  31. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
  32. Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
  33. Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
  34. Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
  35. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  36. Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
  37. Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
  38. Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
  39. Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
  40. Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).

Tags

المناعة والعدوى ، العدد 152 ، تلوث الهواء ، الأوزون ، الرئة ، التهاب ، الضامة السنخيه ، افيروسيتوسيس
في تقييم فيفو الضامة السنخيه افيروسيتوسيس بعد التعرض للأوزون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hodge, M. X., Reece, S. W.,More

Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter