Summary
Dit manuscript beschrijft een protocol om te bepalen of blootstelling aan ozon, een criterium luchtverontreinigende stof, in vivo alveolaire macrofaag-efferocytose belemmert. Dit protocol maakt gebruik van veelgebruikte reagentia en technieken en kan worden aangepast aan meerdere modellen van long letsel om de effecten op alveolaire macrofaag efferocytose te bepalen.
Abstract
Ozon (O3) is een criterium luchtverontreiniging die de incidentie van chronische longziekten vererveert en verhoogt. O3 blootstelling is bekend voor het induceren van pulmonale ontsteking, maar er is weinig bekend over hoe blootstelling processen belangrijk voor de resolutie van ontsteking verandert. Efferocytose is een proces van de afwikkeling, waarbij macrofagen fagocytize apoptotic cellen. Het doel van dit protocol is het meten van alveolaire macrofaag efferocytose na O3-geïnduceerde long letsel en ontsteking. Er zijn verschillende methoden beschreven voor het meten van efferocytose; echter, de meeste vereisen ex vivo manipulaties. In detail beschreven hier is een protocol voor het meten in vivo alveolaire macrofaag efferocytose 24 h na O3 blootstelling, die ex vivo manipulatie van macrofagen vermijdt en dient als een eenvoudige techniek die kan worden gebruikt om nauwkeurig te vertegenwoordigen perturbaties in Dit afwikkelingsproces. Het protocol is een technisch niet-intensieve en relatief goedkope methode waarbij hele lichaam O3 inademing gevolgd door orofaryngeale aspiratie van apoptotic cellen (dat wil zeggen, Jurkat T cellen) terwijl onder algemene anesthesie. Alveolaire macrofaag efferocytose wordt vervolgens gemeten aan de hand van een lichte microscopie van de macrofagen verzameld uit bronchoalveolaire (bal) lavage. Efferocytose wordt uiteindelijk gemeten door berekening van een efferocytische index. Collectief, de beschreven methoden kwantificeren efferocytische activiteit in de longen in vivo terwijl ook dienen voor het analyseren van de negatieve gezondheidseffecten van O3 of andere geïnhaleerde insulten.
Introduction
De Long wordt voortdurend blootgesteld aan milieu-beledigingen, waaronder lucht deeltjes, virussen, bacteriën en oxidanten gassen die leiden tot pulmonale ontstekingen1,2,3. Deze beledigingen kunnen gas uitwisseling in gevaar brengen en induceren onomkeerbaar weefsel letsel4,5. Alveolaire macrofagen, die ongeveer 95% van de immuuncellen in de muriene en menselijke longen in de homeostase vormen, zijn kritische regulatoren van pulmonale ontsteking na milieu-insulten1,2, 3,4,5. Alveolaire macrofagen zijn essentieel tijdens de host verdediging door fagocytizing en elimineren van pathogenen. Onlangs, alveolaire macrofagen is aangetoond dat het bevorderen van weefselhomeostase en de resolutie van ontsteking door efferocytose6,7. Efferocytose is een fagocytisch proces waarbij macrofagen de apoptotische cellen8,9,10overspoelen en elimineren. Efferocytose resulteert ook in de productie van mediatoren (dat wil zeggen, Il-10, TGF-β, PGE2, en stikstofmonoxide) die het proces verder vergroten, resulterend in de resolutie van de ontsteking9,10,11 ,12,16,18. Dit proces is noodzakelijk voor het voorkomen van secundaire necrose en bevordering van weefselhomeostase12,13,14. Verschillende studies hebben een verstoorde efferocytose met verschillende chronische longziekten, waaronder astma, chronische obstructieve longziekte, en idiopathische pulmonale fibrose8,9,15, 16,17.
O3 is een criterium luchtverontreiniging die de incidentie van chronische longziekten19,20,21vererveert en verhoogt. O3 induceert pulmonale ontsteking en letsel en is gekend om de aantasting van alveolaire macrofaag fagocytose van bacteriële pathogenen22,23. Het is echter niet bekend of O3 de alveolaire macrofaag efferocytose schaadt. Onderzoeken van O3-geïnduceerde veranderingen in alveolaire macrofaag efferocytose zal potentiële inzicht geven in hoe blootstelling kan leiden tot chronische longziekte incidentie en exacerbatie. Hieronder beschreven is een eenvoudige methode om alveolaire macrofaag efferocytose in de longen van vrouwelijke muizen te evalueren na blootstelling aan acute O3 .
De beschreven methode bezit verschillende voordelen ten opzichte van andere efferocytose-protocollen die vaak worden gebruikt in het veld door het elimineren van het gebruik van dure fluorescerende kleurstoffen, uitgebreide Flowcytometrie-metingen en ex vivo-manipulatie van alveolaire macrofagen24 ,25. Daarnaast meet dit protocol alveolaire macrofaag efferocytose in de context van de Long microomgeving, die de macrofaag functie kan beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van de East Carolina University.
1. ozon (O3) en gefilterde lucht blootstellingen (dag 1)
- Plaats een maximum van 12 vrouwelijke C57BL/6J muizen, 8-12 weken oud, in een stalen kooi (met 12 afzonderlijke compartimenten) met gaas deksels in een O3 belichtings kamer.
- Plaats de thermometer in de belichtings kamer met de kooi om de temperatuur en vochtigheid nauwkeurig op te nemen.
- Schakel het zuurstof-en ultraviolette (UV-) licht dat aan het apparaat is bevestigd in.
Opmerking: gereguleerde luchtstroom (> 30 luchtwisselingen/h) met gecontroleerde temperatuur (22-23 °C) en relatieve luchtvochtigheid (45%-50%) wordt verkregen door het O3 -apparaat. O3 wordt door het systeem in de belichtings kamer gegenereerd door 100% zuurstof door een UV-licht generator te sturen en vervolgens te mengen met een gefilterde luchttoevoer. - Stel de O3 -concentratie in op 1 ppm en noteer regelmatig elke 10 minuten o3 -niveaus gedurende 3 uur. Bewaak continu de temperatuur en vochtigheid van kamerlucht, evenals de o3 -concentratie met een UV-licht fotometer.
Opmerking: gefilterde lucht blootstellingen worden uitgevoerd in een soortgelijk apparaat, waarbij alleen een gefilterde luchttoevoer door de belichtings kamer stroomt. - Retourneer de dieren naar hun respectieve kooien met beddengoed, voedsel en water ad libitum na 3 h van O3/gefilterde lucht blootstelling.
2. voorbereiding van Jurkat T Cell line (dag 2)
Opmerking: alle procedures moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast van klasse II.
- Cultuur Jurkat T cellen in 24 mL van de basale celcultuur medium + 10% FBS + 5% penicileen/streptomycine bij 37 °C + 5% CO2 (materiaallijst). Jurkat T cellen zijn een suspensie cellijn die kan worden gehandhaafd door het passeren van 1:6-1:8 in pre-warmed kweekmedia elke 3 dagen. Niet schudden.
- Om apoptotische cellen voor te bereiden, groeien ze tot 90% confluentie in elke kolf (die 3-4 dagen duurt om te bereiken na de passage). Gebruik voor deze studie cellen uit vijf T75 kolven om het voldoende aantal cellen te verkrijgen dat in dit protocol wordt gebruikt.
Opmerking: een confluente kolf bevat ongeveer 20-24 miljoen cellen. - Pipetteer cellen (de volledige kolf) uit elke kolf (ongeveer 24 mL) en breng cellen over in een steriele 50 mL conische buis met behulp van een serologische pipet. Gebruik meerdere conische buizen voor meerdere kolven.
- Tel cellen door het verwijderen van een hoeveelheid van 11 μL cellen uit de conische buis van 50 mL en meng met 11 μL trypan blauwe vlek en Pipetteer 11 μL op hemocytometer glaasjes.
- Plaats een dia in een geautomatiseerd cel-item en noteer het aantal levende cellen voor het berekenen van de totale celtelling in elke kolf door het aantal levende cellen te vermenigvuldigen met 24, aangezien elke kolf 24 mL media bevat.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 271 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) tot pellet cellen.
- Gooi het supernatant door aspiratie en regeer de celpellet in media om 3,0 x 106 cellen per ml te verkrijgen.
- Aliquot 5 mL cellen in 100 mm x 20 mm weefselcultuur gerechten (ongeveer negen gerechten zullen worden gebruikt; de totale hoeveelheid cellen in elk gerecht moet ~ 15 x 106).
- Gebruik een schotel voor controle/onbelicht, en de resterende gerechten zullen worden blootgesteld aan UV.
- Stel de UV-als op het juiste energieniveau in, druk op de energie knop en voer "600" in met behulp van het numerieke toetsenblok, dat de machine als 600 μj/cm2 x 100 zal lezen.
Opmerking: UV-als energie-eenheden is in μj/cm2 x 100; dus om 60 millijoules/cm2te bereiken, zet je eenheden om in de UV-Crosslinker. - Bestraleren alle gerechten met cellen, niet inclusief de controle, op 60 millijoules (mJ)/cm2 met behulp van de UV Crosslinker. Verwijder de bovenklep van de weefselkweek gerechten tijdens blootstelling aan UV-straling, omdat UV-licht de plastic afdekking niet zal binnendringen.
- Inculeer alle gerechten in een celkweek incubator, inclusief onbelichte controle, bij 37 °C bij 5% CO2 voor 4 uur.
- Bevestig apoptosis door flow flowcytometrieonderzoeken met behulp van een apoptosis assay Detection Kit met annexin V en propidium jodide (PI) (markers voor apoptosis en necrose, respectievelijk) na 4 h van incubatie, volgens de instructies van de fabrikant26, 27.
Opmerking: het bestreren van jurkat T-cellen in de UV-als op een energieniveau van 600 μj/cm2, na een incubatie van 4 h zal leiden tot ≥ 75% van de apoptotic (zowel vroege als late) cellen met meer vroege apoptotic fenotype dan het late apoptotic fenotype. Dit maakt het gemakkelijker voor alveolaire macrofagen om ze te herkennen en te verzwaren als hun membranen zijn compromisloos, in tegenstelling tot late apoptotische cellen, wat leidt tot een hogere efferocytische index en nauwkeurigere beeldvorming van alveolaire macrofaag efferocytose in deze studie.- Zwembad 333 μL (1 x 106 cellen) van Jurkat T-cellen van verschillende gerechten (zowel "geen UV" en "UV-belicht") samen om te gebruiken voor compensatie analyse buizen.
- Aliquot 333 μL Jurkat T-cellen in een onbevlekt, annexin V enkelvoudige vlek, PI enkelvoudige vlek, geen UV-regeling, en 600 μJ/cm2 UV-blootliggende gelabelde flow cytometrie buizen.
- Centrifuge buizen bij 188 x g gedurende 5 minuten bij RT en decanten het supernatant.
- Spoel cellen door opnieuw op te schorten in 500 μL koude, 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Centrifuge-en pellet cellen bij 188 x g gedurende 5 minuten bij RT. Gooi het supernatant na centrifugeren weg.
- Bereid 400 μL 1x bindings buffer per stroom buis door de 10x-bindings buffer met gedestilleerd water te verdunen terwijl de cellen centrifugeren.
- Bereiding van Annexine V en PI incubatie reagens (100 μL per monster/buis) volgens de instructies van de fabrikant.
- Decanter het supernatant na centrifugeren en breng alle buisjes in 400 μL 1-bindende buffer voorzichtig om en voeg vervolgens 100 μL annexin V-incubatie reagens toe aan elke monsterbuis. Voeg ten slotte 100 μL annexin V enkelvoudige vlek en PI enkele vlek toe aan hun respectieve buizen, maar Voeg niets toe dan de 1x bindings buffer aan de Onbevlekte buis.
- Inincuberen van buisjes in het donker gedurende 15 minuten bij RT.
- Centrifugeer alle cellen op 188 x g gedurende 5 minuten bij RT en decanterende supernatant.
- Respendeer cellen in 400 μL van 1x bindings buffer en analyseer vervolgens samples voor apoptosis door flow cytometrie. Verzamel ten minste 10.000 gebeurtenissen per buis om een accurate weergave van vlekken mogelijk te maken.
- Combineer alle bestraalde cellen van gerechten tot een conische buis en pellet cellen van 50 mL door centrifugeren bij 271 x g gedurende 5 minuten bij RT.
- Gooi het supernatant van de buis door aspiratie en respendeer cellen in 24 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en pellet cellen door centrifugeren bij 271 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant van de buis door aspiratie en respendeer cellen in de hoeveelheid PBS die wordt gebruikt voor het doseren van muizen die zijn goedgekeurd door IACUC. De gebruikte dosis ligt tussen 5-10 x 106 cellen/50 μL per muis; Daarom, voor 10 muizen, respenderen in 500 μL (aantal cellen in elke dosis varieert afhankelijk van hoeveel cellen zijn gekweekt voor bestraling).
Opmerking: make-up ten minste twee extra doses om rekening te houden met elke vloeistof die kan vasthouden aan de zijkanten van de pipetpunt resulterend in het verlies van cellen.
3. Murine orofaryngeale instillatie van apoptotische cellen (dag 2)
- Bereid doseren entmateriaal van apoptotic cellen met behulp van een P200 pipet voorafgaand aan anesthetiserende muizen om de procedure te versnellen. Volgens de institutionele richtlijnen wordt een volume van 50 μL met ongeveer 5-10 x 106 cellen gebruikt voor orofaryngeale (o.p.) instillatie om de beste resultaten te garanderen.
- Anesthetiseer muizen in een heldere kamer met 2% Isofluraan met een debiet van 1 L/min of volgens de institutionele richtlijnen. Anesthetiseer één tot twee muizen tegelijk; het aantal wordt bepaald door het comfortniveau van de experimenteerder. Observeer het ademhalingspatroon en bevestig dat diepe ademhalingen zichtbaar zijn met 2 – 3 s tellingen tussen ademhalingen. Controleer op de diepte van de anesthesie door het gebrek aan reactie op de teen pinch.
- Plaats de muis in een semi-liggende rugpositie. Gebruik een chirurgische snaar die is gebonden tussen de pinnen op een schuine acrylaat plaat om op te schorten door de maxillaire snijtanden.
- Met behulp van een paar stompe niet-geribbelde Tang, voorzichtig grijpen en trek de muis tong. Instill de apoptotische cellen in de mondholte met een P200 pipet. De dosering is succesvol wanneer de muizen een krakende ruis maken 1 – 2 s na het geven van de dosis.
Let op: Vermijd het inducerende trauma van de tong of orofarynx voordat de apoptotic Cell instillatie. - Met een gehandschoende vinger blokkeert u de neus zachtjes totdat de muis inhaleert terwijl de tong wordt teruggetrokken. Bedek de neus totdat er geen vloeistof zichtbaar is in de mondholte en de muis twee of meer inhalaties heeft ingenomen.
Opmerking: als muizen zijn verplicht neus belukkers, het bedekken van de neus helpt ervoor te zorgen dat de muis de apoptotic cellen in de longen inhaleert. - Verwijder de muis van het inoculatie bord en keer het terug naar de kooi om het herstel van de anesthesie mogelijk te maken. Plaats de muis op de achterkant om te voorkomen dat beddengoed of vuil de Nares blokkeert tijdens de revovery.
- Wacht 90 min nadat de muis herstelt van anesthesie om alveolaire macrofagen toe te laten de instroom van apoptotische cellen na alle muizen zijn gewekt door anesthesie. Meestal, ontwaken na anesthesie zal nemen 1 – 2 min, die niet van invloed op de uitkomst/timing van instillatie.
4. bronchoalveolaire spoeling vloeistof inzameling en verwerking (dag 2)
- Euthanize elke muis per institutionele richtlijnen 90 min nadat de muis is gewekt van anesthesie van doseren met apoptotic cellen. Hier wordt een dodelijke injectie met ketamine en xylazine gebruikt (respectievelijk 90 mg/kg en 10 mg/kg), gevolgd door het membraan te exciseren.
Opmerking: dit tijdpunt maakt voldoende tijd voor alveolaire macrofagen te voelen en verzwelgen apoptotic cellen38. - Weeg alle muizen (g) op een weegschaal en record gewichten. Gebruik het lichaamsgewicht om het BAL volume te berekenen (26,25 mL/kg lichaamsgewicht).
- Plaats muizen op hun rug en spray 70% ethanol om de borst-en nekzone te steriliseren.
- Maak een 2 "longitudinale snede net onder het borstbeen langs de hele ventrale zijde met chirurgische schaar, en terwijl het borstbeen met een tang vasthoudt, Nick het diafragma om de longen terug te vallen in de borstholte.
- Snijd lateraal langs de zijkanten van de ribbenkast zodat de longen meer ruimte hebben om uit te breiden bij het lavaging, en vouw vervolgens de borstholte terug met een tang.
- Maak een 1 "verticaal uitgesneden langs vasculatuur door de nek om de luchtpijp bloot.
- Gebruik twee tang om spieren en weefsels van de luchtpijp te trekken en bloot te leggen. Vermijd extra potentiële bloeden en snijden van de luchtpijp, omdat het is omgeven door vasculatuur, longitudinale spieren, en bindweefsel.
- Gebruik een naald om een spleet in de luchtpijp te maken (ongeveer een kwart van de afstand van het hoofd) en plaats een canule (18 G x 1,25 ") met een voorgevulde spuit met 1x PBS (26,25 mL/kg lichaamsgewicht, ~ 0.7-1,0 mL in een 8-10 week oude vrouwelijke C57Bl/6J muis) caudally in de trac hea.
- Duw het volume van PBS langzaam in de longen om de longen vervolgens te laten opblazen en trek het volume terug in de spuit. Herhaal dit proces in totaal 3 keer.
- Verzamel de gepoolde spoeling vloeistof van elke specifieke muis in een buis van 15 ml.
- Centrifugeer de bronchoalveolaire spoeling bij 610 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c en verzamel supernatant in een buis van 1,5 ml en Vries bij-80 °c. De pellet staat voor cellen uit de bronchoalveolaire ruimte.
- Verwijder resterende rode bloedcellen in verzamelde BAL vloeistof door 1 mL ACK RBC lysis-buffer toe te voegen aan de celpellet, vervolgens goed Vortex en lyse voor 1 minuut op ijs. Voeg daarna 4 mL PBS toe om de lysisreactie te stoppen.
- Pellet cellen door centrifugeren bij 610 x g gedurende 6 minuten bij 4 °c en aspireren de supernatant met een vacuüm aspirator.
- Respendeer cellen in 1 mL 1x PBS + 10% FBS aan elke BAL monsterbuis. Tel cellen op een hemocytometer voor de kwantificering van de totale luchtruim cellen uit elk monster (geen trypan Blue). Centrifugeer 120 μL van elk monster gedurende 3 minuten op een dia van 56 x g , met behulp van middelmatige acceleratie en een cytocentrifuge. Droog de dia's 's nachts.
5. berekening van de alveolaire macrofaag efferocytische index (dag 3)
- Vlekken op de dia's met hematoxyline en eosine voor de berekening van zowel efferocytische en differentiële celtellingen, met ten minste 200 cellen geteld van elke dia.
- Bekijk dia's onder een heldere veld instelling op een biologische Microscoop (een 20x-of 40x-doelstelling zal het beste werken).
- Bereken de efferocytische index op basis van de verhouding van het aantal alveolaire macrofagen dat phagocytosed apoptotic Jurkat T cellen aan alveolaire macrofagen zonder apoptotische celopname uit een totaal 200 macrofagen op een cel differentiële dia. Converteer de ratio naar een percentage voor gegevensinvoer. Gebruik de volgende vergelijking:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O3 blootstelling is bekend voor het opwekken van pulmonale ontsteking en letsel, en efferocytose is vereist voor het handhaven van weefselhomeostase. C57BL/6j vrouwelijke muizen werden blootgesteld aan gefilterde lucht (FA) of 1 ppm O3 voor 3 uur en geobduceerd 24 h na-blootstelling om pulmonale ontsteking en letsel te onderzoeken. O3-blootgestelde muizen hebben een significante toename van macrofagen en neutrofielen in het luchtruim weergegeven in vergelijking met de FA-controlegroep (Figuur 1a, B). Bovendien hadden O3-blootgestelde muizen een significante toename van het bal eiwit, een marker van alveolaire epitheliale barrière dysfunctie 24 h na blootstelling (Figuur 1C).
Om te bepalen of O3-geïnduceerde pulmonale ontsteking wordt geassocieerd met defecten in alveolaire macrofaag efferocytose in vivo, werden C57BL/6j vrouwelijke muizen geïnduceerd met apoptotische Jurkat T-cellen via orofaryngeale aspiratie 24 h post-FA of post-O3 blootstelling. Apoptosis in Jurkat T cellen werd bevestigd door flowcytometry voorafgaand aan de toediening, en er was een significante toename in het begin (annexin V+ Pi- en laat (annexin v+ en Pi+) apoptotic cellen (Figuur 2a, B). Het blootstellingsniveau en de incubatietijd resulteerden in repetitieve resultaten van ~ 75% apoptotic Jurkat T-cellen. Een vergrote afbeelding van wat werd geïdentificeerd als een efferocytische macrofaag wordt weergegeven in Figuur 3A. Efferocytische macrofagen werden geïdentificeerd als macrofagen die een Jurkat-T-cel (aangeduid met zwarte pijlen) hadden gekregen, vergeleken met reguliere alveolaire macrofagen (aangeduid met witte pijlen) (Figuur 3B). Wanneer alveolaire macrofaag efferocytose werd beoordeeld met behulp van het Protocol, was er een statistisch significante afname in de efferocytische index van de O3-blootgestelde groep vergeleken met FA-besturingselementen (Figuur 3B, C). Deze gegevens geven aan dat O3-geïnduceerde pulmonale ontsteking wordt geassocieerd met een verminderde klaring van apoptotische cellen, die long letsel en ontsteking kunnen verlengen.
Figuur 1: O3 blootstelling induceert longontsteking en letsel. C57BL/6j vrouwelijke muizen werden blootgesteld aan gefilterde lucht (FA) of 1 ppm O3 voor 3 h. 24 h na blootstelling, muizen werden geobduceerd om longontsteking en letsel te analyseren (n = 6 per groep). A) celdifferentiëlen van bronchoalveolaire spoeling (bal) werden berekend, vervolgens werden epitheel (epi), eosinofielen (EOS), lymfocyten (lymfe), macrofagen (Mɸ) en neutrofielen (PMN) geïdentificeerd met ten minste 200 cellen geteld van elke dia. B) een representatief beeld van cellulaire differentiëlen. C) totaal eiwit in de bal vloeistof. De gegevens worden uitgedrukt als ± SEM (* * p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: bevestiging van UV-geïnduceerde apoptosis in Jurkat T-cellen. Jurkat T-cellen werden blootgesteld aan UV (60 mJ/cm2) met behulp van een UV-Crosslinker (model 1800). Na blootstelling aan UV-straling werden de Jurkat T-cellen geïnincubeerd bij 37 °C met 5% CO2 voor 4 uur. Na incubatie werden Jurkat T cellen bevlekt met annexin V en propidium jodide (PI), en apoptosis werd geëvalueerd door Flowcytometrie. Vroege apoptotic, late apoptotic, en necrotische cellen worden geïdentificeerd als annexin V+/Pi-, annexin v+/Pi+, annexin v-/Pi+, respectievelijk. Representatieve stroom cytometrie spreidings plots (met 10.000 gebeurtenissen opgenomen) van (a) Onblootgestelde jurkat t-cellen en (B) UV-blootgestelde jurkat t-cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: O3 blootstelling vermindert alveolaire macrofaag efferocytose. C57BL/6J vrouwelijke muizen werden blootgesteld aan gefilterde lucht (FA) of 1 ppm O3 voor 3 h. 24 h na blootstelling, muizen waren orofaryngeingelegd met ongeveer 5 x 106 apoptotic jurkat T-cellen. 1,5 h na instillatie werd bronchoalveolaire spoeling (bal) uitgevoerd, en de efferocytaire index werd berekend in bal macrofagen door Lichtmicroscopie na telling 200 macrofagen (n = 11 per groep). A) representatief beeld van een efferocytaire macrofaag. B) identificatie van alveolaire macrofagen (witte pijlen) en efferocytaire macrofaag (zwarte pijlen) na de blootstelling aan FA of O3 . C) berekening van de efferocytaire index na FA-of O3 -blootstelling (* * * p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: suboptimale Jurkat T cel apoptosis met behulp van 350 nm Frosted bollen. Jurkat T-cellen werden gedurende 10 minuten bestraald met behulp van de UV-Crosslinker en geïnineerd bij 37 °C bij 5% CO2 voor 1 uur. Na blootstelling aan UV-straling werden de Jurkat T-cellen geïnincubeerd bij 37 °C met 5% CO2 voor 4 uur. Na incubatie werden Jurkat T-cellen bevlekt met annexin V en propidium jodide (PI), waarna apoptosis werd geëvalueerd door Flowcytometrie. Vroege apoptotic, late apoptotic, en necrotische cellen worden geïdentificeerd als annexin V+/Pi-, annexin v+/Pi+, en annexin v-/Pi+, respectievelijk. Representatieve flow cytometrie plots (met 10.000 gebeurtenissen opgenomen) van UV-blootgestelde Jurkat T-cellen met 350 nm lampen worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Efferocytose is een ontstekingsremmend proces waarbij macrofagen de apoptotische cellen en het puin duidelijk maken en meerdere ontstekingsremmende mediatoren9,10,11,12,16 ,18. Meerdere modellen van efferocytose hebben inzicht gegeven in hoe de macrofaag een kritieke cel is in de resolutie van ontsteking6,7. Onlangs is de progressie van chronische longziekten geassocieerd met defecten in efferocytose8,9,15,16,17. Het is echter momenteel onduidelijk of blootstelling aan luchtverontreinigende stoffen zoals O3, resulteert in defecten in efferocytose. Dit protocol maakt de evaluatie van alveolaire macrofaag efferocytose mogelijk na blootstelling van O3 . Het kwantificeert ook efferocytose in vivo met behulp van Lichtmicroscopie en maakt de meting van efferocytose in de context van de Long microomgeving mogelijk, zonder ex vivo manipulaties of dure fluorescerende kleurstoffen. Hoewel dit protocol wordt uitgevoerd in de context van blootstelling aan O3 , kunnen meerdere modellen van longontsteking en letsel worden gebruikt met dit protocol om alveolaire macrofaag efferocytose te evalueren.
Voordelen van deze methode over bestaande methoden zijn de mogelijkheid om te analyseren van alveolaire macrofagen in de context van fysiologische omgeving. Ex vivo-analyse van alveolaire macrofagen omvat beplating en incubatie met apoptotische cellen. Het plateren van alveolaire macrofagen kan zowel fysiologische als genomische veranderingen veroorzaken die de efferocytose28,29,30kunnen veranderen. Bovendien bestaan er in de longen alveolaire macrofagen in een micro-omgeving die oppervlakteactieve stof bevat en componenten van de Long Lining vloeistof waarvan bekend is dat ze invloed hebben op de macrofaag functie31,32,33, 34,35. Onze methode maakt efferocytose metingen in de longen mogelijk zonder ex vivo manipulaties, wat fysiologisch relevant is. Toekomstige toepassingen van dit protocol kunnen leiden tot meer diepgaande studies over hoe de Long micro alveolaire macrofaag efferocytose kan veranderen.
Een essentieel onderdeel van dit protocol is de generatie van apoptotische cellen voor de evaluatie van alveolaire macrofaag efferocytose. Dit omvat het optimaliseren van de juiste UV-blootstellingsniveau voor het opwekken van apoptosis, niet necrose. Ons protocol maakt gebruik van de UV-als met 254 nm golflengte emissie lampen en een belichtingsniveau van 60 MJ/cm2. De UV-lamp keuzes zijn essentieel in het produceren van apoptosis, niet necrose. 350 nm UV-lampen zijn uitstekend voor het cross-linking en steriliseren van eiwit membraan, maar niet voor het opwekken van apoptosis35,36,37. Een voorbeeld puntplot van Jurkat T cellen blootgesteld aan 60 mJ/cm2 met 350 nm bollen wordt weergegeven in Figuur 4 met een aanzienlijke toename van de late apoptotic en necrotische cellen. Bovendien gebruikt het protocol een incubatie na UV-blootstelling van 4 h. Om dit deel van het protocol te optimaliseren, onderzochten we eerder verschillende incubatie tijden en ontdekten we dat 1,5 en 2 uur incubatie na blootstelling slechts ongeveer 40% apoptosis leverden, met een efferocytaire index van minder dan 5% (gegevens niet weergegeven). Op basis van de huidige literatuur, ~ 70%-80% totaal apoptotic cellen zijn voldoende voor het meten van efferocytose38.
Een beperking van dit protocol is dat het de efferocytische respons van alle macrofagen in het luchtruim na FA of O3 blootstelling onderzoekt en geen onderscheid maakt tussen weefsel Resident macrofagen en gerekruteerde macrofagen. De Long Resident macrofaag genaamd alveolaire macrofaag komt voort uit de foetale lever, terwijl gerekruteerde macrofagen afkomstig zijn van een door bloed overgedragen embryonale oorsprong. Bij letsel kan de Long een zeer heterogene macrofaag populatie hebben met unieke genetica en expressie van celoppervlak markeringen28,29,30,31,32, 33,34,35. Het is bekend dat de immunologische respons en functie van deze macrofaag populaties verschillend zijn; uit recente studies is echter gebleken dat het weefsel Resident macrofaag een grotere efferocytaire respons heeft vergeleken met gerekruteerde macrofagen29,30,31. Het bepalen van de efferocytische respons van weefsel Resident macrofagen vs. gerekruteerde macrofagen kunnen worden beoordeeld met het huidige protocol; echter, de macrofaag populaties moeten worden gezuiverd door FACS en geplateerd op dia's voor analyse. Daarnaast beoordeelt dit protocol alleen de alveolaire macrofaag efferocytische functie in één stam van inteelt, in de handel verkrijgbare muizen. Het is eerder gemeld dat verschillende stammen van muizen vertonen verschillende reacties op O3 blootstelling, met inbegrip van pulmonale ontsteking39,40. Daarom kunnen er verschillen zijn in alveolaire macrofaag efferocytose op basis van de onderzochte stam. Dit is een variabele die moet worden overwogen bij het uitvoeren van deze in vivo test.
Concluderend, het hierboven beschreven protocol maakt de evaluatie mogelijk van alveolaire macrofaag efferocytose in vivo. Dit protocol is kostenbesparend en eenvoudig, waardoor het een test is die op grote schaal kan worden gebruikt. Bovendien kan deze methode worden toegepast op talrijke modellen van long letsel en/of ontsteking om het begrip te verhogen van hoe verschillende pulmonale insulten macrofaag efferocytose kunnen veranderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Deze studie wordt gefinancierd door het Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award en NIEHS R01ES028829 (naar K. M. G). We willen Dr. Dianne Walters (departement fysiologie, ECU) bedanken voor haar hulp bij het verkrijgen van representatieve beelden van alveolaire macrofagen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
References
- Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
- Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
- Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
- Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
- Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
- Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
- Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
- Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
- Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
- Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
- Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
- O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
- Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
- Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
- Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
- Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
- Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
- Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
- Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
- Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
- Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
- Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
- Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
- Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
- Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
- Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
- Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
- Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
- Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
- Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
- Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
- Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
- Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).
