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Immunology and Infection

Évaluation in vivo de l'efférocytose du macrophage alvéolif après l'exposition à l'ozone

Published: October 22, 2019 doi: 10.3791/60109
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 2Research Triangle Park, National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

Ce manuscrit décrit un protocole pour déterminer si l'exposition à l'ozone, un polluant atmosphérique de critères, altère l'efferocytose de macrophage alvéolaire in vivo. Ce protocole utilise des réactifs et des techniques couramment utilisés et peut être adapté à plusieurs modèles de lésions pulmonaires pour déterminer les effets sur l'efférocytose macrophage alvéolaire.

Abstract

L'ozone (O3) est un polluant atmosphérique qui exacerbe et augmente l'incidence des maladies pulmonaires chroniques. O3 l'exposition est connue pour induire l'inflammation pulmonaire, mais peu est connu concernant la façon dont l'exposition modifie les processus importants pour la résolution de l'inflammation. L'eférocytose est un processus de résolution, par lequel les macrophages phagocytize cellules apoptotiques. Le but de ce protocole est de mesurer l'efferocytosis alvéolaire de macrophage suivant o3-blessure et inflammation de poumon d'O 3-induite. Plusieurs méthodes ont été décrites pour mesurer l'efferocytose ; cependant, la plupart exigent des manipulations ex vivo. Décrit en détail voici un protocole pour mesurer in vivo alvéolaire macrophage efferocytosis 24 h après l'exposition O3, qui évite la manipulation ex vivo des macrophages et sert de technique simple qui peut être utilisé pour représenter avec précision les perturbations dans processus de résolution. Le protocole est une méthode techniquement non intensive et relativement peu coûteuse qui implique l'inhalation de l'Ensemble du corps O3 suivie par l'aspiration oropharyngée des cellules apoptotiques (c.-à-d., les lymphocytes T Jurkat) sous anesthésie générale. L'efferocytose de macrophage alvéolaire est alors mesurée par l'évaluation légère de microscopie des macrophages rassemblés du lavage bronchoalveolar (BAL). L'eférocytose est enfin mesurée par le calcul d'un indice efférocytique. Collectivement, les méthodes décrites quantifient l'activité efférocytique dans le poumon in vivo tout en servant également à analyser les effets négatifs sur la santé de O3 ou d'autres insultes inhalées.

Introduction

Le poumon est constamment exposé à des insultes environnementales, y compris les particules d'air, les virus, les bactéries et les gaz oxydants qui déclenchent l'inflammation pulmonaire1,2,3. Ces insultes peuvent compromettre l'échange de gaz et induire des lésions tissulaires irréversibles4,5. Les macrophages alvéolaires, qui constituent environ 95% des cellules immunitaires présentes dans les poumons murins et humains à l'homéostasie, sont des régulateurs critiques de l'inflammation pulmonaire après des insultes environnementales1,2, 3,4,5. Les macrophages alvéolaux sont essentiels pendant la défense hôte en phagocytant et en éliminant les agents pathogènes. Récemment, les macrophages alvéolaires ont été montrés pour favoriser l'homéostasie de tissu et la résolution de l'inflammation par l'efferocytose6,7. L'eférocytose est un processus phagocytique dans lequel les macrophages engloutissent et éliminent les cellules apoptotiques8,9,10. L'eférocytose entraîne également la production de médiateurs (c.-à-d. IL-10, TGF-mD, PGE2, et oxyde nitrique) qui augmentent encore le processus, ce qui entraîne la résolution de l'inflammation9,10,11 ,12,16,18. Ce processus est nécessaire pour prévenir la nécrose secondaire et promouvoir l'homéostasie tissulaire12,13,14. Plusieurs études ont établi un lien entre l'eférocytose altérée et diverses maladies pulmonaires chroniques, y compris l'asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique et la fibrose pulmonaire idiopathique8,9,15, 16,17.

O3 est un polluant atmosphérique de critères qui exacerbe et augmente l'incidence des maladies pulmonaires chroniques19,20,21. O3 induit une inflammation pulmonaire et des blessures et est connu pour altérer la phagocytose macrophage alvéolaire des agents pathogènes bactériens22,23. Cependant, on ne sait pas si O3 altère l'efferocytose macrophage alvéolaure. L'étude des altérations o3-induitesdans l'efferocytosis alvéolaire de macrophage fournira un aperçu potentiel de la façon dont l'exposition peut mener à l'incidence et à l'exacerbation chroniques de la maladie pulmonaire. Décrit ci-dessous est une méthode simple pour évaluer l'efferocytosis alvéolifolité de macrophage dans les poumons des souris femelles après exposition aigue d'O3.

La méthode décrite présente plusieurs avantages par rapport à d'autres protocoles d'eférocytose couramment utilisés sur le terrain en éliminant l'utilisation de colorants fluorescents coûteux, de mesures de cytométrie à débit étendu et de manipulation ex vivo des macrophages alvéolaires24 ,25. En outre, ce protocole mesure l'efférocytose alvéolaire de macrophage dans le contexte du microenvironnement de poumon, qui peut influencer la fonction de macrophage.

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Protocol

Toutes les méthodes ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université de La Caroline de l'Est.

1. Ozone (O3) et expositions à l'air filtré (Jour 1)

  1. Placer un maximum de 12 souris femelles C57BL/6J, âgées de 8 à 12 semaines, dans une cage en acier (avec 12 compartiments séparés) avec des couvercles en treillis métallique dans une chambre d'exposition O3.
  2. Placez le thermomètre dans la chambre d'exposition avec la cage pour enregistrer avec précision la température et l'humidité.
  3. Allumez la lumière d'oxygène et d'ultraviolet (UV) qui est attachée à l'appareil.
    REMARQUE : Flux d'air réglementé (30 changements d'air/h) à température contrôlée (22-23 oC) et humidité relative (45 %-50 %) est obtenu par l'appareil O3. O3 est généré par le système dans la chambre d'exposition en dirigeant 100% d'oxygène à travers un générateur de lumière UV, puis en mélangeant avec un approvisionnement en air filtré.
  4. Ajuster la concentration d'O3 à 1 ppm et enregistrer régulièrement les niveaux d'O3 toutes les 10 min pendant 3 h. Surveiller continuellement la température et l'humidité de l'air de chambre, tout comme la concentration O3 avec un photomètre uv.
    REMARQUE : Les expositions à l'air filtré sont effectuées dans un appareil similaire, avec seulement un approvisionnement en air filtré qui circule dans la chambre d'exposition.
  5. Remettre les animaux dans leurs cages respectives avec de la literie, de la nourriture et de l'eau ad libitum après 3 h d'exposition à l'air o3/filtré.

2. Préparation de la lignée de cellules T Jurkat (Jour 2)

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans un coffret de sécurité biologique de classe II.

  1. Culture Jurkat Lymphocytes T dans 24 mL de milieu de culture cellulaire basale - 10% FBS - 5% pénicilline/streptomycine à 37 oC - 5% CO2 (Tableau de matériel). Les lymphocytes T Jurkat sont une lignée cellulaire de suspension qui peut être maintenue par le passage 1:6-1:8 dans les supports de culture pré-chauffés tous les 3 jours. Ne tremblez pas.
  2. Pour préparer les cellules apoptotiques, les faire passer à 90 % de la consistance de chaque flacon (ce qui prend de 3 à 4 jours après le passage). Pour cette étude, utilisez des cellules de cinq flacons T75 pour obtenir le nombre suffisant de cellules utilisées dans ce protocole.
    REMARQUE : Un flacon confluent contient environ 20-24 millions de cellules.
  3. Pipette vers le haut des cellules (qui est le flacon entier) de chaque flacon (approximativement 24 ml) et les cellules de transfert à un tube conique stérile de 50 ml utilisant une pipette sérologique. Utilisez plusieurs tubes coniques pour plusieurs flacons.
  4. Comptez les cellules en enlevant un aliquot de 11 l de cellules du tube conique de 50 ml et mélangez-les avec 11 l de tache et de pipette bleu trypan 11 l sur des glissières d'hémocytomètre.
  5. Insérez la diapositive dans un compteur cellulaire automatisé et enregistrez le nombre de cellules vivantes pour calculer le nombre total de cellules dans chaque flacon en multipliant le nombre de cellules vivantes par 24, car chaque flacon contient 24 ml de support.
  6. Centrifugelant la suspension cellulaire à 271 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) aux cellules de granule.
  7. Jeter le supernatant par aspiration et resuspendre la pastille cellulaire dans le support pour obtenir 3,0 x 106 cellules par mL.
  8. Aliquot 5 ml de cellules dans des plats de culture tissulaire de 100 mm x 20 mm (environ neuf plats seront utilisés; la quantité totale de cellules dans chaque plat doit être de 15 x 106).
  9. Utilisez un plat pour contrôler/non exposé, et les plats restants seront exposés aux UV.
  10. Définir le lien transversal UV au niveau d'énergie correct, appuyez sur le bouton d'énergie, et entrez "600" à l'aide du bloc-notes, que la machine se lira comme 600 J/cm2 x 100.
    REMARQUE : Les unités d'énergie de liaison transversale UV sont dans 'J/cm2 x 100 ; par conséquent, pour atteindre 60 millijoules/cm2, convertir les unités pour correspondre à la liaison transversale UV.
  11. Irradier tous les plats avec des cellules, sans compter le contrôle, à 60 millijoules (mJ)/cm2 à l'aide du lien transversal UV. Retirez le couvercle supérieur des plats de culture tissulaire pendant l'exposition aux UV, car la lumière UV ne pénètre pas dans le couvercle en plastique.
  12. Incuber tous les plats dans un incubateur de culture cellulaire, y compris le contrôle non exposé, à 37 oC à 5% CO2 pour 4 h.
  13. Confirmer l'apoptose par cytométrie de flux à l'aide d'un kit de détection d'analyse d'apoptose contenant l'annexe V et l'iodure de propidium (PI) (marqueurs pour l'apoptose et la nécrose, respectivement) après 4 h d'incubation, selon les instructions du fabricant26, 27.
    REMARQUE : L'irradiation des lymphocytes T Dejkat dans le lien transversal UV à un niveau d'énergie de 600 J/cm2, après une incubation de 4 h, entraînera une augmentation de 75 % des cellules apoptotiques (précoces et tardives) ayant un phénotype apoptotique plus précoce que le phénotype apoptotique tardif. Il est ainsi plus facile pour les macrophages alvéolaires de les reconnaître et de les engloutir car leurs membranes sont sans compromis, contrairement aux cellules apoptotiques tardives, ce qui conduit à un indice efférocytique plus élevé et une imagerie plus précise de l'efférocytose macrophage alvéolaire dans cette étude.
    1. Piscine 333 L (1 x 106 cellules) de cellules T Jurkat provenant de plusieurs plats (les deux « sans UV » et « uv-exposés ») ensemble pour les utiliser pour les tubes d'analyse de compensation.
    2. Aliquot 333 l de cellules T Jurkat dans une tache unique non tachée, annexine V, PI tache unique, pas de contrôle UV, et 600 'J/cm2 UV-exposés à l'écoulement étiqueté cytométrie tubes.
    3. Tubes centrifugeà 188 x g pour 5 min à RT et décant le supernatant.
    4. Laver les cellules en les rependant dans 500 l de saline (PBS) froide et tamponnée de phosphate.
    5. Centrifugeuse et cellules de granulés à 188 x g pendant 5 min à RT. Jeter le supernatant après centrifugation.
    6. Préparer 400 L de tampon de liaison 1x par tube d'écoulement en diluant le tampon de liaison 10x avec de l'eau distillée pendant que les cellules centrifient.
    7. Préparer le réactif d'incubation de l'annexine V et de l'IP (100 l par échantillon/tube) selon les instructions du fabricant.
    8. Décanter le supernatant après centrifugation et resuspendre doucement tous les tubes dans 400 l de tampon de liaison 1x, puis ajouter 100 l de réactif d'incubation annexin eclaxin V à chaque tube d'échantillon. Enfin, ajoutez 100 L de tache unique d'annexin V et de tache unique PI à leurs tubes respectifs, mais n'ajoutez rien au-delà du tampon de liaison 1x au tube non taché.
    9. Incuber les tubes dans l'obscurité pendant 15 min à RT.
    10. Centrifuge toutes les cellules à 188 x g pendant 5 min à RT et décant supernatant.
    11. Resuspendre les cellules dans 400 l de tampon de liaison 1x, puis analyser des échantillons pour l'apoptose par cytométrie de flux. Recueillir au moins 10 000 événements par tube pour permettre une représentation précise de la coloration.
  14. Combiner toutes les cellules irradiées de la vaisselle dans un tube conique de 50 ml et des cellules de granulés par centrifugation à 271 x g pendant 5 min à RT.
  15. Jetez le supernatant du tube par aspiration et resuspendez les cellules dans 24 ml de phosphate stérile tamponné saline (PBS) et les cellules de granulés par centrifugation à 271 x g pendant 5 min à température ambiante.
  16. Jetez le supernatant du tube par aspiration et resuspendez les cellules dans la quantité de PBS utilisée pour le dosage des souris approuvées par l'IACUC. La dose utilisée se situe entre 5-10 x 106 cellules/50 l par souris; par conséquent, pour 10 souris, la resuspension dans 500 L (le nombre de cellules dans chaque dose varie selon le nombre de cellules cultivées pour l'irradiation).
    REMARQUE : Maquillage au moins deux doses supplémentaires pour tenir compte de tout liquide qui peut coller sur les côtés de la pointe de pipette ayant pour résultat la perte des cellules.

3. Instillation oropharyngée murine des cellules apoptotiques (Jour 2)

  1. Préparer l'inoculum de dosage des cellules apoptotic utilisant une pipette de P200 avant d'anesthésier des souris pour accélérer la procédure. Conformément aux lignes directrices institutionnelles, un volume de 50 L contenant environ 5-10 x 106 cellules est utilisé pour l'instillation oropharyngée (o.p.) afin d'assurer les meilleurs résultats.
  2. Anesthésiez les souris dans une chambre claire avec 2% d'isoflurane à un débit de 1 L/min ou selon les directives institutionnelles. Anesthésier une à deux souris à la fois; le nombre est déterminé par le niveau de confort de l'expérimentateur. Observez le modèle de respiration et confirmez que les respirations profondes sont visibles avec des comptes de 2 à 3 s entre les respirations. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par l'absence de réponse à la pincée d'orteil.
  3. Placez la souris dans une position de supine semi-couchée. Utilisez une ficelle chirurgicale attachée entre les chevilles sur une feuille acrylique inclinée pour suspendre par les inciseurs maxillaires.
  4. À l'aide d'une paire de forceps non sustoridés, saisir et tirer légèrement la langue de souris. Inculquer les cellules apoptotiques dans la cavité buccale avec une pipette P200. Le dosage est réussi lorsque les souris font un bruit crépitant 1/2 s après avoir donné la dose.
    REMARQUE: Prenez soin d'éviter d'induire un traumatisme soit à la langue ou oropharynx avant l'instillation des cellules apoptotiques.
  5. À l'index, bloquer délicatement le nez jusqu'à ce que la souris inhale pendant que la langue est rétractée. Couvrez le nez jusqu'à ce qu'aucun liquide ne soit visible dans la cavité buccale et que la souris ait pris deux inhalations ou plus.
    REMARQUE : Comme les souris sont obligatoires, la couverture du nez permet de s'assurer que la souris inhalera les cellules apoptotiques dans les poumons.
  6. Retirez la souris de la carte d'inoculation et retournez-la dans la cage pour permettre la récupération de l'anesthésie. Placez la souris sur le dos pour empêcher la literie ou les débris de bloquer les nares pendant le revovery.
  7. Attendez 90 min après que la souris se soit remise de l'anesthésie pour permettre aux macrophages alvéolaires d'engloutir l'afflux de cellules apoptotiques après que toutes les souris se sont réveillées de l'anesthésie. Typiquement, le réveil après l'anesthésie prendra 1'2 min, ce qui ne devrait pas affecter les résultats / le moment de l'instillation.

4. Collecte et traitement des fluides de lavage bronchoalveolar (Jour 2)

  1. Euthanasier chaque souris par directives institutionnelles 90 min après que la souris s'est réveillée de l'anesthésie du dosage avec des cellules apoptotiques. Ici, une injection létale de kétamine et de xylazine est utilisée (90 mg/kg et 10 mg/kg, respectivement) suivie de l'excisage du diaphragme.
    REMARQUE: Ce point de temps permet suffisamment de temps pour les macrophages alvéolaires de détecter et d'engloutir les cellules apoptotiques38.
  2. Peser toutes les souris (g) sur une balance et enregistrer les poids. Utilisez le poids corporel pour calculer le volume DE BAL (26,25 ml/kg de poids corporel).
  3. Placez les souris sur le dos et vaporisez 70 % d'éthanol pour stériliser la poitrine et le cou.
  4. Faire une coupe longitudinale de 2 po juste en dessous du sternum le long du côté ventral entier avec des ciseaux chirurgicaux, et tout en tenant le sternum avec des forceps, entailler le diaphragme pour permettre aux poumons de retomber dans la cavité thoracique.
  5. Couper latéralement le long des côtés de la cage thoracique pour permettre aux poumons plus d'espace pour se développer lors de la lavement, puis plier la cavité thoracique avec des forceps.
  6. Faire une coupe verticale de 1 po le long de la vascularisation à travers le cou pour exposer la trachée.
  7. Utilisez deux forceps pour retirer les muscles et les tissus de la trachée et l'exposer. Évitez les saignements potentiels supplémentaires et couper la trachée, car elle est entourée de vascularisation, de muscles longitudinals et de tissus conjonctifs.
  8. Utilisez une aiguille pour faire une émoi dans la trachée (environ un quart de la distance vers le bas de la tête) et insérez une canule (18 G x 1,25") avec une seringue préchargée avec 1x PBS (26,25 mL/kg de poids corporel, 0,7-1,0 ml dans une souris c57Bl/6J femelle de 8-10 semaines) caudally dans le tracdally dans le tracdally dans le trac hea.
  9. Poussez le volume de PBS dans les poumons lentement pour permettre aux poumons de gonfler alors, tirez le volume de nouveau dans la seringue. Répétez ce processus un total de 3 fois.
  10. Recueillir le liquide de lavage mis en commun de chaque souris spécifique dans un tube de 15 ml.
  11. Centrifuger le lavage bronchoalveolar à 610 x g pendant 6 min à 4 oC et recueillir le supernatant dans un tube de 1,5 ml et congeler à -80 oC. La pastille représente les cellules de l'espace bronchoalveolr.
  12. Enlever les globules rouges résiduels dans le liquide BAL recueilli en ajoutant 1 ml de tampon de lyse ACK RBC à la pastille cellulaire, puis vortex bien et lyse pendant 1 min sur la glace. Ensuite, ajouter 4 ml de PBS pour arrêter la réaction de lyse.
  13. Pelleter les cellules par centrifugation à 610 x g pendant 6 min à 4 oC et aspirer le supernatant avec un aspirateur sous vide.
  14. Resuspendre les cellules dans 1 ml de 1x PBS - 10% FBS à chaque tube d'échantillon BAL. Compter les cellules sur un hémocytomètre pour la quantification des cellules totales de l'espace aérien de chaque échantillon (pas de trypan bleu). Centrifuger 120 l de chaque échantillon sur des lames à 56 x g pendant 3 min, à l'aide d'une accélération moyenne et d'un cytocentrifuge. Séchez les toboggans toute la nuit.

5. Calcul de l'indice macrophage efférocytique alvéolaire (Jour 3)

  1. Tainer les diapositives avec de l'hématoxylin et de l'éosine pour permettre le calcul des numérations efférocytiques et différentielles, avec au moins 200 cellules comptées à partir de chaque diapositive.
  2. Afficher les diapositives sous un cadre lumineux sur un microscope biologique (un objectif de 20x ou 40x fonctionnera le mieux).
  3. Calculer l'indice efferocytique basé sur le rapport du nombre de macrophages alvéolaires qui ont phagocytosé les lymphocytes T apoptotiques Jurkat aux macrophages alvéolaires sans prise de cellules apoptotiques sur un total de 200 macrophages sur une diapositive différentielle cellulaire. Convertir le ratio en pourcentage pour l'entrée de données. Utilisez l'équation suivante :

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Representative Results

O3 l'exposition est connue pour induire l'inflammation pulmonaire et les dommages, et l'efferocytose est exigée pour maintenir l'homéostasie de tissu. Les souris femelles c57BL/6J ont été exposées à l'air filtré (FA) ou 1 ppm O3 pendant 3 h et nécropsiées 24 h après l'exposition pour examiner l'inflammation et les dommages pulmonaires. O3- les souris exposées ont montré une augmentation significative des macrophages et des neutrophiles dans l'espace aérien par rapport au groupe témoin FA (Figure 1A,B). En outre, les souris o3-exposéesont eu une augmentation significative de la protéine BAL, un marqueur du dysfonctionnement épithélial de barrière alvéolaire 24 h après l'exposition (figure 1C).

Pour déterminersi l'inflammation pulmonaire O 3-induite est associée à des défauts dans l'efferocytosis alvéolaire de macrophage in vivo, les souris femelles de C57BL/6J ont été inculquées avec les cellules T apoptotic de Jurkat par l'intermédiaire de l'aspiration oropharyngeal 24 h post-FA ou post-O3 l'exposition. L'apoptose dans les cellules T de Jurkat a été confirmée par cytométrie de flux avant le dosage, et il y a eu une augmentation significative dans les cellules apoptotic précoces (annexe Vet PI- et tard (annexin Vet PI)cellules apoptotic (Figure 2A,B). Le niveau d'exposition et le temps d'incubation ont donné des résultats répétitifs de cellules T Apoptotic Jurkat d'environ 75 %. Une image agrandie de ce qui a été identifié comme un macrophage efférocytique est montrée dans la figure 3A. Les macrophages efférocytiques ont été identifiés comme des macrophages qui avaient englouti une cellule T de Jurkat (indiquée par des flèches noires), comparés aux macrophages alvéolaires réguliers (indiqués par des flèches blanches) (figure 3B). Lorsque l'efférocytose de macrophage alvéolaire a été évaluée à l'aide du protocole, il y a eu une diminution statistiquement significative de l'indice efférocytique du groupe O3-exposé par rapport aux contrôles FA (figure 3B,C). Ces données indiquentque l'inflammation pulmonaire O 3-induite est associée à l'dégagement diminué des cellules apoptotic, qui peuvent prolonger des dommages et une inflammation de poumon.

Figure 1
Figure 1 : L'exposition à l'O3 induit une inflammation et des blessures pulmonaires. Les souris femelles C57BL/6J ont été exposées à l'air filtré (FA) ou 1 ppm O3 pendant 3 h. 24 h après l'exposition, les souris ont été nécropsiées pour analyser l'inflammation pulmonaire et les blessures (n - 6 par groupe). (A) Les différentiels de cellules bronchoalvéolveolar (BAL) ont été calculés, puis épithéliales (épi), éosinophiles (eos), lymphocytes (lymphe), macrophages (M) et neutrophiles (PMN) ont été identifiés avec au moins 200 cellules comptées à partir de chaque diapositive. (B) Une image représentative des différentiels cellulaires. (C) Protéines totales dans le fluide BAL. Les données sont exprimées en tant que SEM (p 'lt; 0.01). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Confirmation de l'apoptose induite par les UV dans les lymphocytes T Jurkat. Les lymphocytes T Jurkat ont été exposés aux UV (60 mJ/cm2) à l'aide d'un crosslinker UV (modèle 1800). Après exposition aux UV, les lymphocytes T Jurkat ont été incubés à 37 oC avec 5 % de CO2 pour 4 h. Après l'incubation, les lymphocytes T de Jurkat ont été souillés avec l'annexin evetin V et l'iodure de propidium (PI), et l'apoptose a été évaluée par cytométrie de flux. Les premières cellules apoptotiques, apoptotiques tardives et nécrotiques sont identifiées comme étant l'annexe Vetl'IP,l'annexe Vetl'IP,l'annexe V, l'annexe V,/PI,respectivement. Des parcelles de diffusion de cytométrie représentatives (avec 10 000 événements enregistrés) de (A) de cellules T Jurkat non exposées et (B) de cellules T Jurkat exposées aux UV. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : L'exposition à l'o3 diminue l'efférocytose macrophage alvéolaulée. Les souris femelles C57BL/6J ont été exposées à l'air filtré (FA) ou 1 ppm O3 pendant 3 h. 24 h après l'exposition, les souris ont été inculquées oropharyngeally avec environ 5 x 106 lymphocytes T apoptotiques Jurkat. 1,5 h après l'instillation, le lavage bronchoalvéolar (BAL) a été exécuté, et l'indice efferocytic a été calculé dans les macrophages de BAL par microscopie légère après compter 200 macrophages (n - 11 par groupe). (A) Image représentative d'un macrophage efférocytique. (B) Identification des macrophages alvéolaires (flèches blanches) et des macrophages efférocytiques (flèches noires) après l'exposition fa ou O3. (C) Calcul de l'indice efférocytique après l'exposition à la FA ou à l'O3 (p 'lt; 0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Apoptosis de cellules T Dejkat sous-optimale s'utilisant des ampoules givrées de 350 nm. Les lymphocytes T Jurkat ont été irradiés à l'aide du crosslinker UV pendant 10 min et incubés à 37 oC à 5 % de CO2 pour 1 h. Après exposition aux UV, les lymphocytes T Jurkat ont été incubés à 37 oC avec 5 % de CO2 pour 4 h. Après l'incubation, les lymphocytes T de Jurkat ont été souillés avec l'annexin evetin V et l'iodure de propidium (PI), puis l'apoptose a été évaluée par cytométrie de flux. Les premières cellules apoptotiques, apoptotiques tardives et nécrotiques sont identifiées comme étant l'annexe Vetl'IP,l'annexeVet l'annexe V , et l'annexe V-/PI,respectivement. Des parcelles de cytométrie représentatives de flux (avec 10 000 événements enregistrés) de cellules T Jurkat exposées aux UV avec des ampoules de 350 nm sont montrées. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L'eférocytose est un processus anti-inflammatoire dans lequel les macrophages effacent les cellules apoptotiques et les débris ainsi que produisent de multiples médiateurs anti-inflammatoires9,10,11,12,16 ,18. Plusieurs modèles d'efférocytose ont fourni un aperçu de la façon dont le macrophage est une cellule critique dans la résolution de l'inflammation6,7. Récemment, la progression des maladies pulmonaires chroniques a été associée à des défauts dans l'eférocytose8,9,15,16,17. Cependant, on ne sait pas encore si l'exposition à des polluants atmosphériques comme l'O3 entraîne des défauts d'eférocytose. Ce protocole permet l'évaluation de l'efferocytose de macrophage alvéolaire après exposition d'O3. Il quantifie également l'efférocytose in vivo à l'aide de la microscopie légère et permet de mesurer l'efférocytose dans le contexte du microenvironnement pulmonaire, sans manipulations ex vivo ou colorants fluorescents coûteux. Bien que ce protocole soit exécuté dans le contexte de l'exposition d'O3, des modèles multiples de l'inflammation et des dommages de poumon peuvent être employés avec ce protocole pour évaluer l'efferocytosis alvéolaire de macrophage.

Les avantages de cette méthode par rapport aux méthodes existantes sont sa capacité à analyser les macrophages alvéolaux dans le contexte de l'environnement physiologique. L'analyse ex vivo des macrophages alvéolaires comprend le placage et l'incubation avec des cellules apoptotiques. Le placage des macrophages alvéolaux peut induire des changements physiologiques et génomiques qui peuvent altérer l'eférocytose28,29,30. En outre, dans le poumon, macrophages alvéolaires existent dans un microenvironnement qui contient des surfactants et des composants du liquide de la paroi pulmonaire qui sont connus pour influencer la fonction macrophage31,32,33, 34,35. Notre méthode permet des mesures d'efférocytose dans le poumon sans manipulations ex vivo, ce qui est plus physiologiquement pertinent. Les applications futures de ce protocole peuvent mener à des études plus approfondies sur la façon dont le microenvironnement pulmonaire peut modifier l'efférocytose macrophage alvéolaire.

Un composant critique de ce protocole est la génération des cellules apoptotic pour l'évaluation de l'efferocytosis alvéolaire de macrophage. Il s'agit d'optimiser le bon niveau d'exposition aux UV pour induire l'apoptose, et non la nécrose. Notre protocole utilise le lien transversal UV avec 254 ampoules d'émission de longueur d'onde nm et un niveau d'exposition de 60 mJ/cm2. Les choix d'ampoules UV sont essentiels dans la production d'apoptose, pas de nécrose. Les ampoules UV de 350 nm sont excellentes pour le croisement et la stérilisation de membrane de protéine mais ne parviennent pas à induire l'apoptose35,36,37. Une parcelle de point d'exemple des cellules T de Jurkat exposées à 60 mJ/cm2 avec des ampoules de 350 nm est montrée dans la figure 4 avec une augmentation significative des cellules apoptotiques et nécrotiques tardives. En outre, le protocole utilise une incubation de 4 h après l'exposition aux UV. Pour optimiser cette partie du protocole, nous avons déjà examiné différents temps d'incubation et constaté que 1,5 et 2 h d'incubation après l'exposition n'a donné qu'environ 40% d'apoptose, avec un indice efférocytique de moins de 5% (données non montrées). D'après la littérature actuelle, les cellules apoptotiques totales de 70 % à 80 % sont suffisantes pour mesurer l'eférocytose38.

Une limitation à ce protocole est qu'il examine la réponse efférocytique de tous les macrophages dans l'espace aérien après l'exposition de FA ou o3 et ne distingue pas les macrophages résidant des tissus des macrophages recrutés. Le macrophage résident de poumon appelé macrophage alvéolateur proviennent du foie foetal, tandis que les macrophages recrutés dérivent d'une origine embryonnaire transmise par le sang. Lors des blessures, le poumon peut avoir une population macrophage très hétérogène avec une génétique unique et l'expression des marqueurs de surface cellulaire28,29,30,31,32, 33,34,35. On sait que la réponse immunologique et la fonction de ces populations de macrophages sont différentes; cependant, des études récentes ont indiqué que le macrophage résident de tissu ont une plus grande réponse efferocytic comparée aux macrophages recrutés29,30,31. La détermination de la réponse efférocytique des macrophages résidents de tissu par rapport aux macrophages recrutés peut être évaluée avec le protocole actuel; cependant, les populations de macrophages doivent être purifiées par le FACS et plaquées sur des diapositives pour analyse. En outre, ce protocole évalue seulement la fonction efférocytique de macrophage alvéolaire dans une souche des souris consanguines et disponibles commercialement. Il a déjà été rapporté que différentes souches de souris montrent différentes réponses à l'exposition O3, y compris l'inflammation pulmonaire39,40. Par conséquent, il peut y avoir des différences dans l'efferocytose de macrophage alvéolaire basée sur la souche examinée. Il s'agit d'une variable qui devrait être prise en considération lors de l'exécution de cet exemple in vivo.

En conclusion, le protocole décrit ci-dessus permet l'évaluation de l'efferocytose alvéolaire de macrophage in vivo. Ce protocole est rentable et simple, ce qui en fait un test qui peut être largement utilisé. En outre, cette méthode peut être appliquée à de nombreux modèles de lésions pulmonaires et / ou l'inflammation pour augmenter la compréhension de la façon dont diverses insultes pulmonaires peuvent modifier l'efférocytose macrophage.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Acknowledgments

Cette étude est financée par le Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award et NIEHS R01ES028829 (à K. M. G). Nous tenons à remercier la Dre Dianne Walters (Département de physiologie, ECU) pour son aide dans l'obtention d'images représentatives des macrophages alvéolaux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

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Immunologie et infection numéro 152 pollution atmosphérique ozone poumon inflammation macrophage alvéolaire eférocytose
Évaluation in vivo de l'efférocytose du macrophage alvéolif après l'exposition à l'ozone
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Hodge, M. X., Reece, S. W.,… More

Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

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