Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון

Published: October 22, 2019 doi: 10.3791/60109
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 2Research Triangle Park, National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לקביעת האם חשיפה לאוזון, קריטריון מזהם אוויר, פוגע מכתשי מקרופאג efferocytosis בvivo. פרוטוקול זה מנצל בדרך כלל ריאגנטים וטכניקות והוא יכול להיות מותאם מודלים מרובים של פגיעה בריאות כדי לקבוע את ההשפעות על מכתשי מקרופאג efferocytosis.

Abstract

אוזון (O3) הוא קריטריון מזהם אוויר המגדילה ומגביר את השכיחות של מחלות ריאות כרוניות. O3 חשיפה ידוע לגרום לדלקת בריאות, אבל מעט ידוע לגבי איך חשיפה משנה תהליכים חשובים הרזולוציה של דלקת. Efferocytosis הוא תהליך החלטה, לפיו מקרופאגים מפאגים בתאי האפוטוטיים. המטרה של פרוטוקול זה היא למדוד מכתשי מקרופאג efferocytosis בעקבות המושרה הנגרמת פציעה ריאה ודלקת. מספר שיטות תוארו עבור מדידת efferocytosis; עם זאת, רוב דורשים מניפולציות vivo ex. מתוארים בפירוט כאן הוא פרוטוקול למדוד vivo מכתשי מקרופאג efferocytosis 24 שעות אחרי החשיפה O3 , אשר נמנעת מניפולציה vivo ex של מקרופאגים ומשמש כטכניקה פשוטה שניתן להשתמש בו כדי לייצג במדויק רטבאליות תהליך החלטה זה. הפרוטוקול הוא שיטה מבחינה טכנית שאינה אינטנסיבית וזולה יחסית המערבת שאיפת גוף שלם3 ולאחריה שאיפה לוע של תאים אפוטוטיים (כלומר, התאים של ג'ורקאט T) תוך כדי הרדמה כללית. מכתשיים מקרופאג efferocytosis נמדד לאחר מכן על ידי הערכת מיקרוסקופ אור של מקרופאגים שנאספו מתוך ברונשיים (BAL) ששטיפה. Efferocytosis נמדד לבסוף על-ידי חישוב אינדקס efferocytic. באופן קולקטיבי, שיטות מיתאר לכמת פעילות efferocytic בריאה ב vivo תוך שהיא משרתת גם לנתח את ההשפעות הבריאותיות השליליות של O3 או עלבונות אחרים שאפו.

Introduction

הריאה נחשפת כל הזמן לעלבונות סביבתיים, כולל חלקיקים אוויריים, וירוסים, חיידקים, וגזים חמצון המפעילות דלקת ריאות1,2,3. העלבונות האלה יכולים להתפשר על החלפת גזולגרום לפציעה הרקמהבלתי הפיכה 4,5. מכתשי מקרופאגים, המהווים כ 95% של התאים החיסוניים נמצא מורנה והריאות האנושית ב הומאוסטזיס, הם הרגולטורים קריטיים של דלקת ריאות לאחר עלבונות סביבתיים1,2, .שלוש,ארבע,חמש מקרופאגים מכתשיים חיוניים במהלך ההגנה המארחת על ידי phagocytizing וסילוק פתוגנים. לאחרונה, מכתשי מקרופאגים הוכחו לקדם את הומאוסטזיס רקמות ואת הרזולוציה של דלקת דרך efferocytosis6,7. Efferocytosis הוא תהליך phagocytic שבו מקרופאגים המפרץ לחסל תאים אפוטוטיים8,9,10. Efferocytosis גם תוצאות ייצור של מגשרים (כלומר, IL-10, tgf-β, pge2, ו תחמוצת החנקן) כי עוד להגדיל את התהליך, וכתוצאה מכך הרזולוציה של דלקת9,10,11 ,12,16,18. תהליך זה הכרחי למניעת נמק משני וקידום הומאוסטזיס הרקמות12,13,14. מספר מחקרים המקושרים efferocytosis לקוי עם מחלות ריאה כרוניות שונות, כולל אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, ו פיברוזיס ריאות אידיופטית8,9,15, 16,17.

O3 הוא קריטריון מזהם אוויר כי מגביר בייטס ומגדיל את השכיחות של מחלות ריאות כרוניות19,20,21. O3 מעורר דלקת הריאות פציעה והוא ידוע לפגוע מכתשי מקרופאג phagocyציטוזה של פתוגנים חיידקיים22,23. עם זאת, זה לא ידוע אם3 או 2 פוגע מכתשי מקרופאג efferocytosis. חקירת O3שינויים המושרה ב מכתשי מקרופאג efferocytosis יספק תובנה פוטנציאלית לתוך כמה חשיפה יכולה להוביל לשכיחות מחלת הריאות כרונית והחרפה. המתואר להלן היא שיטה פשוטה להערכת מכתשי מקרופאג efferocytosis בריאות של עכברים נקבה לאחר החשיפה החדה O3 .

השיטה מחולקת על מספר יתרונות על פני פרוטוקולים efferocytosis אחרים בשימוש נפוץ בתחום על-ידי ביטול השימוש של צבעי פלורסנט יקר, מדידות הזרימה הנרחבת cy, ולשעבר vivo מניפולציה של מכתשי מקרופאגים24 ,25. בנוסף, פרוטוקול זה מודד מכתשיים מקרופאג efferocytosis בהקשר של מיקרו הסביבה הריאה, אשר יכול להשפיע על מקרופאג פונקציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מזרח קרוליינה.

1. אוזון (O3) וחשיפות אוויר מסוננים (יום 1)

  1. מקום מקסימום של 12 נקבה C57BL/6J עכברים, 8-12 בן שבועות, בכלוב פלדה (עם 12 תאים נפרדים) עם חוט שינוי מכסים לתוך חדר חשיפה O3 .
  2. מניחים את מד החום בחדר החשיפה עם הכלוב כדי להקליט במדויק את הטמפרטורה והלחות.
  3. מדליקים את החמצן והאולטרה-סגול (UV) המחובר למנגנון.
    הערה: זרימת אוויר מוסדרת (> 30 שינויי אוויר/h) עם טמפרטורה מבוקרת (22-23 ° c) ולחות יחסית (45%-50%) מושגת על ידי מכשיר O3 . O3 מופק על ידי המערכת בחדר החשיפה על ידי הנחיית 100% חמצן דרך גנרטור אור UV, ולאחר מכן ערבוב עם אספקת אוויר מסוננים.
  4. להתאים את הריכוז O3 כדי 1 ppm ו להקליט באופן קבוע o3 רמות כל 10 דקות עבור 3 h. ברציפות לפקח על הטמפרטורה והלחות של אוויר החדר, כמו הריכוז O3 עם אור UV פומטר.
    הערה: חשיפות אוויר מסוננות מבוצעות במנגנון דומה, כאשר רק אספקת אוויר מסוננת זורמת בחדר החשיפה.
  5. להחזיר את החיות לכלובים בהתאמה שלהם עם מצעים, מזון, ומים libitum המים לאחר 3 h of O3/מסוננים החשיפה האוויר.

2. הכנת קו התאים של ג'ורקאט T (יום 2)

הערה: יש לנהל את כל ההליכים בארון בטיחות ביולוגי מסוג II.

  1. התרבות בתאי T בתאים 24 מ ל של התרבות הבזליים בינונית בינוני + 10% FBS + 5% פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° צ' + 5% CO2 (לוח החומר). התאים של ג'ורקאט T הם קו תא השעיה שניתן לתחזק דרך passaging 1:6-1:8 לתוך מדיה טרום מחומם מראש מדי 3 ימים. . אל תלחץ
  2. כדי להכין תאים אפוטוטיים, לגדל אותם 90% השטף בכל בקבוקון (אשר לוקח 3-4 ימים כדי להשיג לאחר הפסיית). עבור מחקר זה, להשתמש בתאים מתוך חמישה מבחנות T75 כדי לקבל את מספר מספיק של תאים בשימוש בפרוטוקול זה.
    הערה: בקבוקון שוטף מכיל כ-20-24 מיליון תאים.
  3. פיפטה למעלה תאים (שהוא הבקבוקון כולו) מכל בקבוקון (כ -24 מ ל) ותאי העברה לצינורית חרוטית מ50 mL באמצעות פיפטה סרוולוגית. השתמש צינורות חרוט מרובים עבור מספר מבחנות.
  4. ספירת תאים על-ידי הסרת 11 μl סדרת מחלקים של תאים מתוך שפופרת חרוט 50 mL ולערבב עם 11 μl של טריקון כחול כתם ופיפטה 11 μl על מגלשות הומוציטומטר.
  5. הכנס שקופית למונה תאים אוטומטי והקלט את מספר התאים החיים כדי לחשב את ספירת התאים הכוללת בכל בקבוקון על-ידי הכפלת מספר התאים החיים ב-24, כאשר כל בקבוקון מכיל 24 מ ל של מדיה.
  6. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 271 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי התאים גלולה.
  7. להיפטר על ידי השאיפה ולהשעות מחדש את הגלולה תא במדיה כדי להשיג 3.0 x 106 תאים לכל mL.
  8. מערך 5 מ ל של תאים ב 100 מ"מ x 20 מ"מ מנות תרבות רקמה (כ -9 מנות ישמשו; הכמות הכוללת של תאים בכל מנה צריכה להיות ~ 15 x 106).
  9. השתמשו במנה אחת לשליטה/חשיפה, והמנות הנותרות ייחשפו לאולטרא-סגול.
  10. הגדר את הרובי UV לרמת האנרגיה הנכונה, לחץ על כפתור האנרגיה, ולהזין "600" באמצעות מקלדת מספר, אשר המכונה ייקרא כמו 600 μJ/cm2 x 100.
    הערה: קרינת UV מקשר יחידות אנרגיה הוא μJ/cm2 x 100; לכן, כדי להשיג 60 מיליג'לס/cm2, להמיר יחידות כדי להתאים את הרובי UV המקשר.
  11. להקרין את כל הכלים עם תאים, לא כולל את השליטה, ב 60 מיליז'לס (mJ)/cm2 באמצעות מקשר UV. הסר את המכסה העליון של מנות תרבות הרקמה במהלך החשיפה UV, כמו אור UV לא לחדור את העטיפה פלסטיק.
  12. מכללת מודטה את כל הכלים בחממה לתרבות התא, כולל שליטה בלתי נחשפת, ב 37 ° c ב 5% CO2 עבור 4 h.
  13. לאשר אפופטוזיס על ידי הcy, הזרמת הזרם באמצעות ערכת זיהוי ואפופטוזיס המכילה את הגרסה השנייה של אנשין ו propidium יודיד (PI) (סמנים עבור אפופטוזיס ו נמק, בהתאמה) לאחר 4 h של דגירה, לפי הוראות היצרן של26, . עשריםואחד
    הערה: הקרנת התאים של הזרם האולטרא סגול ברמת האנרגיה של 600 μJ/cm2, בעקבות דגירה של 4 שעות תוביל ל ≥ 75% של האפוטוטיק (הן מוקדם ומאוחר) תאים שיש יותר האפוטוטיים מוקדם יותר פנוטיפים לעומת האפוטוטיק מאוחר. זה מקל על מכתשי מקרופאגים לזהות אותם ולהיות מפרץ כמו הקרומים שלהם הם ללא פשרות, בניגוד לתאי האפוטוטיק מאוחר, המוביל מדד efferocytic גבוה יותר הדמיה מדויקת יותר של מכתשי מקרופאג efferocytosis במחקר זה.
    1. בריכה 333 μL (1 x 106 תאים) של התאים של ג'ורקאט T ממספר מנות (הן "לא uv" ו "uv-חשופים") יחד כדי להשתמש עבור שפופרות ניתוח הפיצוי.
    2. Aliquot 333 μL של התאים של כוכי T ב בלתי מוכתם, הכתם היחיד בודד, הכתם בודדת PI, אין שליטה UV, ו 600 μJ/cm2 UV-חשוף הזרימה הצינורות cy, מנורות.
    3. צינורות צנטריפוגה ב 188 x g עבור 5 דקות ב RT ו decant הסופרנטאנט.
    4. לשטוף את התאים על ידי השעיית מחדש ב 500 μL של קר, 1 x פוספט באגירה מלוחים (PBS).
    5. צנטריפוגה ואת התאים גלולה ב 188 x g עבור 5 דקות ב RT. להיפטר supernatant לאחר צנטריפוגה.
    6. הכן 400 μL של מאגר איגוד של 1x לכל צינור זרימה על-ידי דילול מאגר איגוד של 10x עם מים מזוקקים בזמן שתאים מתפרידו.
    7. הכן מגיב לדגירה של אנשין V ו-PI (100 μL לדוגמה/שפופרת) לכל הוראות היצרן.
    8. Decant הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה ובעדינות מחדש את כל הצינורות ב 400 μL של מאגר כריכה של 1x, לאחר מכן להוסיף 100 μL של הדגירה השנייה של אנשין מגיב לכל צינור לדוגמה. לבסוף, להוסיף 100 μL של הכתם היחיד של אנשין ו-PI כתם יחיד לצינורות המתאימים שלהם, אבל לא להוסיף שום דבר מעבר מאגר איגוד 1x אל הצינור המוכתמת.
    9. מודטה צינורות בחושך עבור 15 דקות ב RT.
    10. צנטריפוגה את כל התאים ב 188 x g עבור 5 דקות ב RT ו decant סופרנט.
    11. השהה את התאים מחדש ב-400 μL של מאגר כריכת כריכה של 1x, ולאחר מכן נתח דגימות עבור אפופטוזיס באמצעות הזרימה cy, try. לאסוף לפחות 10,000 אירועים לכל שפופרת כדי לאפשר ייצוג מדויק של כתמים.
  14. לשלב את כל התאים לקרינה מפני מנות לתוך שפופרת 50 mL וכלי גלולה בתאים על ידי צנטריפוגה ב 271 x g עבור 5 דקות ב RT.
  15. להיפטר supernatant מן הצינור על ידי השאיפה ולהשעות מחדש את התאים 24 מ ל של מלוחים סטרילית פוספט באגירה (PBS) ו גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 271 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  16. להיפטר supernatant מן הצינור על ידי השאיפה ולהשעות מחדש את התאים בסכום של PBS המשמש עכברים מינון אושרה על ידי IACUC. המינון המשמש הוא בין 5-10 x 106 תאים/50 μl לכל עכבר; לכן, עבור 10 עכברים, להשעות מחדש ב-500 μL (מספר התאים בכל מינון משתנה בהתאם למספר התאים המתורנים להקרנה).
    הערה: האיפור לפחות שתי מינונים נוספים לחשבון עבור כל נוזל שעשוי לדבוק הצדדים של טיפ פיפטה וכתוצאה מכך אובדן של תאים.

3. מורנה לוע הדסטיציה של תאים אפוטוטיים (יום 2)

  1. הכינו מינון של תאים אפוטוטיים בעזרת פיפטה P200 לפני שעכברים מעקרים את השגרה כדי לזרז את התהליך. לפי ההנחיות המוסדיות, נפח של 50 μL המכיל כ 5-10 x 106 תאים מנוצל עבור לוע (o.p.) המערכת כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר.
  2. עכברים מורדם בחדר ברור עם 2% isof, בקצב הזרימה של 1 L/min או לפי ההנחיות המוסדיות. מורדם אחד לשני עכברים בכל פעם; המספר נקבע לפי רמת הנוחות של הנסזנה. שימו לב לדפוס הנשימה ואשרו שנשימות עמוקות גלויות בין 2 ל -3 ספירות של נשימות. בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר התגובה צביטה הבוהן.
  3. למקם את העכבר בעמדה למחצה שכיבה. השתמש מחרוזת כירורגית קשורה בין יתדות על לוח אקרילי משופע גיליון להשעות את חותכות הלסת הראשית.
  4. בעזרת זוג מלקחיים לא מוחשים, לתפוס קלות ולמשוך את לשון העכבר. הגבר את התאים האפוטוטיים לחלל הפה עם פיפטה P200. מינון מוצלח כאשר העכברים לעשות רעש פצפוץ 1-2 לאחר מתן המינון.
    הערה: הימנעו מגרימת טראומה ללשון או לoropharynx לפני שהתא האפוטוטי מתאים.
  5. עם אצבע כדורית, לחסום בעדינות את האף עד שהעכבר שואף בזמן הלשון הוא מוכי. כסו את האף עד ששום נוזל אינו גלוי בחלל הפה והעכבר לקח שני הפסקות או יותר.
    הערה: כאשר עכברים הם מכשירי נשימה באף, כיסוי האף מסייע להבטיח שהעכבר ינשום את התאים האפוטוטיים לתוך הריאות.
  6. להסיר את העכבר מהלוח החיסון ולהחזיר אותו לכלוב כדי לאפשר התאוששות מהרדמה. מניחים את העכבר על גבו כדי למנוע מצעים או פסולת מחסימת נארס במהלך שחזור מאוד.
  7. המתן 90 דקות לאחר העכבר מתאושש מהרדמה כדי לאפשר מכתשי מקרופאגים לזרם הזרע של תאים אפוטוטיים לאחר כל העכברים יש מאוד הרדמה. בדרך כלל, התעוררות לאחר ההרדמה ייקח 1 – 2 דקות, אשר לא צריך להשפיע על התוצאה/עיתוי של חוסר החלטיות.

4. ברונכתשיים ששטיפה איסוף ועיבוד נוזלים (יום 2)

  1. המתת חסד כל עכבר לכל הנחיות מוסדי 90 דקות אחרי העכבר התעורר מהרדמה מינון עם תאים אפוטוטיים. כאן, זריקה קטלנית של קטמין ו xylazine משמש (90 מ"ג/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה) ואחריו לאחר הסרעפת.
    הערה: נקודה זו מאפשרת זמן מספיק עבור מקרופאגים מכתשי כדי לחוש והואמ38תאים מפוטוטיים.
  2. שוקלים את כל העכברים (גר') בקנה מידה ומשקולות שיא. השתמש במשקל הגוף כדי לחשב את הנפח BAL (26.25 mL/ק"ג משקל גוף).
  3. מניחים עכברים על גבם ולרסס 70% אתנול כדי לעקר את החזה ואת האזור הצוואר.
  4. לעשות 2 "לחתוך האורך ממש מתחת לעצם החזה לאורך הצד הגחוני כולו עם מספריים כירורגית, ובעוד מחזיק את עצם החזה עם מלקחיים, ניק את הסרעפת כדי לאפשר את הריאות ליפול בחזרה לחלל החזה.
  5. לחתוך מהצד השני לאורך הצדדים של כלוב הצלעות כדי לאפשר לריאות יותר מקום להתרחב כאשר הזדקנות, ואז לקפל את חלל החזה בחזרה עם מלקחיים.
  6. לעשות 1 "לחתוך אנכית לאורך הצוואר באמצעות לצווארו כדי לחשוף את קנה הנשימה.
  7. השתמש שני מלקחיים כדי למשוך שרירים ורקמות מקנה הנשימה ולחשוף אותו. הימנעו מדימום פוטנציאלי נוסף וגזירת קנה הנשימה, שכן היא מוקפת באמצעות ואצלב, שרירי האורך ורקמת החיבור.
  8. השתמש במחט כדי לעשות חתך בקנה הנשימה (כרבע המרחק למטה מהראש) ולהכניס צינורית (18 G x 1.25) עם מזרק טעון מראש עם 1x PBS (26.25 mL/ק"ג משקל הגוף, ~ 0.7-1.0 mL בשבוע 8-10 בת C57Bl/6J העכבר) מכניס לתוך הזנב האה.
  9. לחץ על נפח של PBS לתוך הריאות לאט כדי לאפשר את הריאות כדי לנפח אז, למשוך את עוצמת הקול בחזרה אל המזרק. חזור על תהליך זה בסך הכל 3 פעמים.
  10. לאסוף את נוזל ששטיפה במאגר מכל עכבר ספציפי בצינור 15 מ ל.
  11. צנטריפוגה את ששטיפה ברונמישיים ב 610 x g עבור 6 דקות ב 4 ° צ' ולאסוף supernatant לתוך שפופרת 1.5 mL ו להקפיא ב-80 ° c. הגלולה מייצגת תאים. מהחלל הסימפלשיים
  12. הסרת כדוריות דם אדומות שיורית שנאספו נוזל BAL על ידי הוספת 1 מ ל של מאגר הליזה ACK RBC לתוך הגלולה התא, ולאחר מכן מערבולת היטב ו lyse עבור 1 דקות על הקרח. לאחר מכן, להוסיף 4 מ ל של PBS להפסיק את תגובת הפירוק.
  13. גלולה בתאים על ידי צנטריפוגה ב 610 x g עבור 6 דקות ב 4 ° c ומייבש את supernatant עם שואב אבק.
  14. השהה תאים מחדש ב-1 מ ל של 1x PBS + 10% FBS לכל שפופרת לדוגמה BAL. ספירת תאים על הומוציטומטר עבור כימות התאים האווירי הכולל מכל מדגם (אין טריקון כחול). צנטריפוגה 120 μL של כל דוגמה אל שקופיות ב-56 x g עבור 3 דקות, באמצעות האצת בינונית ומעבר ציטוצנטריפוגה. . תייבש את השקופיות בלילה

5. חישוב מכתשיים מקרופאג efferocytic מדד (יום 3)

  1. הכתם את השקופיות עם המטאוקסילין ואאוזין כדי לאפשר חישוב של שניהם efferocytic וספירות תאים משלימים, עם לפחות 200 תאים הנספרים מכל שקופית.
  2. הצגת שקופיות תחת הגדרת שדה בהיר במיקרוסקופ ביולוגי (מטרת 20x או 40x תפעל במיטבו).
  3. לחשב את המדד efferocytic בהתבסס על היחס של מספר מכתשי הקרופאגים כי מאפוטוטיק התאים הפוקאט T מכתשי מקרופאגים ללא קליטת התא הקליטה של מקרופאגים בסך הכל 200 בשקופית דיפרנציאלית תא. המר את היחס לאחוזים עבור קלט נתונים. השתמש במשוואה הבאה:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

O3 חשיפה ידוע לגרום לדלקת הריאות פציעה, ו efferocytosis נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות. C57BL/6J עכברים נקבה נחשפו לאוויר מסוננים (הפא) או 1 ppm O3 עבור 3 h ו נמק 24 h לאחר החשיפה כדי לבחון דלקת ריאות ופציעה. O3-עכברים חשופים הציגו עלייה משמעותית מקרופאגים ו נויטרופילים במרחב האווירי לעומת קבוצת בקרת הפא (איור 1a, B). בנוסף, O3-חשופים עכברים היו עלייה משמעותית בחלבון BAL, סמן של מכתשי האפיתל המכשול בתפקוד 24 h לאחר החשיפה (איור 1ג).

כדי לקבוע אם או3דלקת הריאות המושרה משויך פגמים מכתשיים מקרופאג efferocytosis בvivo, C57BL/6j עכברים נקבה החדירו עם מאפוקת התאים T באמצעות לוע השאיפה 24 h פוסט-FA או Post-O3 חשיפה. אפופטוזיס בתאי מג T אושרה על ידי הזרמת cy, לפני מינון, והיה עלייה משמעותית בתחילת (מוקדם (מידי המאה החמישי+ pi - ומאוחר (אנשין v+ ו-pi+) תאים האפוטוטיים (איור 2א, ב). רמת החשיפה וזמן הדגירה הביאו לתוצאות חוזרות ונשנות של ~ 75% האפוטוטית בתאי הג. תמונה מוגדלת של מה שזוהה כמו efferocytic מקרופאג מוצג באיור 3א. מקרופאגים Efferocytic זוהו כמו מקרופאגים שהיו מוכי החוליה השחורה T (המצוין על ידי חיצים שחורים), בהשוואה מקרופאגים רגילים (המצוין על ידי חיצים לבנים) (איור 3ב). כאשר מכתשיים מקרופאג efferocytosis העריכו ניצול הפרוטוקול, היתה ירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית במדד efferocytic של הקבוצה O3חשוף בהשוואה לבקרי הפא (איור 3ב, ג). נתונים אלה מצביעים על כך שדלקת הריאות O3המושרה קשורה לשחרור ירד של תאים אפוטוטיים, אשר עשוי להאריך את פגיעת ריאה ודלקת.

Figure 1
איור 1: O3 חשיפה גורמת לדלקת בריאות ופציעה. C57BL/6J עכברים נקבה נחשפו אוויר מסונן (הפא) או 1 ppm O3 עבור 3 כ ' 24 h לאחר החשיפה, עכברים היו נמק לנתח דלקת ריאות ופציעה (n = 6 לכל קבוצה). (א) שאיפה ברונסישיים (BAL) הפרשי תאים חושבו, לאחר מכן אפיתל (אפינפרין), אאוזיפרלס (eos), לימפוציטים (לימפה), מקרופאגים (Mɸ), ו נויטרופילים (pmn) זוהו עם לפחות 200 תאים שנספרו מכל שקופית. (ב) דמות ייצוגית של הפרשי הסלולר. (ג) חלבון מוחלט בנוזל בל. נתונים מבוטאים כ-± SEM (* * p < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אישור של אפופטוזיס הנגרמת על ידי המושרה בתאי T של ג'ורקאט. התאים של ג'ורקאט T נחשפו ל-UV (60 mJ/cm2) באמצעות מקשר UV (דגם 1800). בעקבות חשיפה UV, התאים הג T מודרט ב 37 ° c עם 5% CO2 עבור 4 h. בעקבות הדגירה, התאים של ג'ורקאט T היו מוכתמים עם V ו-propidium יודיד (PI), ו אפופטוזיס הוערך על ידי הזרימה cy, try. מתחילת האפוטוטיק, האפוטוטיק המאוחרות, ותאי נמק מזוהים כ-אנשין V+/pi-, אנשין וי+/pi+, אנשין v-/pi+, בהתאמה. תזרים מייצג cy, לנסות מגרשים (עם 10,000 אירועיםשנרשמו) של תאים לא חשופים של ג'ורקאט t ו-(ב) קרני UV חשופים לתאי t. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: O3 חשיפה פוחתת מכתשי מקרופאג efferocytosis. C57BL/6J עכברים נקבה נחשפו אוויר מסונן (הפא) או 1 ppm O3 עבור 3 כ ' 24 h לאחר החשיפה, עכברים היו oropharyngeally החדירו עם כ 5 x 106 האפוטוטית בתאי T. 1.5 h לאחר המניפולציה, ששטיפה ברונבשיים (BAL) בוצע, ואת מדד efferocytic היה מחושב באל מקרופאגים על ידי מיקרוסקופ אור לאחר ספירת 200 מקרופאגים (n = 11 לכל קבוצה). (א) דמות ייצוגית של efferocytic מקרופאג. (ב) זיהוי מכתשי מקרופאגים (חיצים לבנים) ו efferocytic מקרופאג (חיצים שחורים) לאחר החשיפה פא או O3 . (ג) החישוב של מדד efferocytic לאחר החשיפה פא או O3 (* * * p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: משנה הטובה ביותר התאים ואפופטוזיס T שימוש 350 ננומטר נורות. התאים של ג'ורקאט T נחשפו לקרינה באמצעות ה-UV Crosslinker קשר עבור 10 דקות ו-הדגירה ב 37 ° c ב 5% CO2 עבור 1 h. בעקבות חשיפה UV, התאים הג T מודרט ב 37 ° c עם 5% CO2 עבור 4 h. בעקבות דגירה, התאים של ג'ורקאט T היו מוכתמים עם V ו propidium יודיד (PI), אז אפופטוזיס הוערך על ידי הזרם cy, לנסות. האפוטוטיק המוקדמת, האפוטוטיק המאוחרות, ותאי הנמק מזוהים כ-אנשין V+/pi-, אנשין וי+/Pi+, ואנשין v-/pi+, בהתאמה. תזרים מייצגים של מגרשים (עם 10,000 אירועים שנרשמו) של תאים מבוססי UV חשופים עם 350 נורות ננומטר מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efferocytosis הוא תהליך אנטי דלקתי שבו מקרופאגים ברורים תאים ופסולת ברור כמו גם לייצר מגשרים אנטי דלקתיות מרובים9,10,11,12,16 ,18. מודלים מרובים של efferocytosis סיפקו תובנה כיצד מקרופאג הוא תא קריטי ברזולוציה של דלקת6,7. לאחרונה, ההתקדמות של מחלות ריאה כרוניות נקשר עם פגמים ב efferocytosis8,9,15,16,17. עם זאת, כרגע לא ברור אם החשיפה למזהמים אוויריים כגון O3, גורמת לפגמים בefferocytosis. פרוטוקול זה מאפשר הערכה של מכתשיים מקרופאג efferocytosis לאחר החשיפה O3 . הוא גם מכמת efferocytosis באמצעות מיקרוסקופ אור ומאפשר את המדידה של efferocytosis בהקשר של מיקרואקולוגיה הריאה, ללא מניפולציות vivo לשעבר או צבעי פלורסנט יקר. למרות פרוטוקול זה מבוצע בהקשר של O3 חשיפה, מודלים מרובים של דלקת ריאות ופציעה ניתן להשתמש עם פרוטוקול זה כדי להעריך מכתשי מקרופאג efferocytosis.

היתרונות של שיטה זו על השיטות הקיימות הם היכולת לנתח מכתשי מקרופאגים בהקשר של הסביבה הפיסיולוגית. ניתוח vivo לשעבר של מקרופאגים מכתשי כולל ציפוי ודגירה עם תאים אפוטוטיים. ציפוי מכתשי מקרופאגים יכול לגרום לשינויים פיסיולוגיים וגנומית העשויים לשנות efferocytosis28,29,30. בנוסף, בריאות, מכתשי מקרופאגים קיימים במיקרוסביבה המכילה חומרים מתכלים ורכיבים של נוזל הבטנה הריאה הידועים השפעות מקרופאג פונקציה31,32,33, 34,35. השיטה שלנו מאפשרת מדידות efferocytosis בריאות ללא מניפולציות לשעבר vivo, אשר רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית. יישומים עתידיים של פרוטוקול זה יכול להוביל למחקרים מעמיקים יותר על איך מיקרוסביבה ריאה יכול לשנות מכתשי מקרופאג efferocytosis.

רכיב קריטי של פרוטוקול זה הוא הדור של תאים אפוטוטיים להערכת מכתשיים מקרופאג efferocytosis. זה כרוך אופטימיזציה רמת החשיפה UV נכון כדי לגרום אפופטוזיס, לא נמק. הפרוטוקול שלנו עושה שימוש ברובי UV עם 254 לפליטת גל ורמת חשיפה של 60 mJ/cm2. הבחירה הנורה UV הם קריטיים להפקת אפופטוזיס, לא נמק. 350 ננומטר נורות UV מצוינים עבור ממברנה חלבון חוצה קישורים ועיקור אך להיכשל כדי לגרום אפופטוזיס35,36,37. מגרש לדוגמה נקודה של התאים של ג'ורקאט T נחשף 60 mJ/cm2 עם 350 נורות ננומטר מוצג באיור 4 עם גידול משמעותי בתאי האפוטוטיק מאוחר נמק. בנוסף, הפרוטוקול משתמש בחשיפה לפוסט-UV של 4 שעות. כדי לייעל את החלק הזה של הפרוטוקול, בדקנו בעבר פעמים הדגירה שונים ומצא כי 1.5 ו 2 הדגירה לאחר החשיפה הניב רק כ 40% אפופטוזיס, עם מדד efferocytic של פחות מ 5% (נתונים לא מוצגים). מבוסס על הספרות הנוכחית, ~ 70%-80% סה כ תאים האפוטוטיים מספיקים עבור מדידת efferocytosis38.

הגבלה על פרוטוקול זה היא כי הוא בוחן את התגובה efferocytic של כל מקרופאגים במרחב האווירי לאחר החשיפה פא או O3 ואינו מבחין מקרופאגים של תושב הרקמה של מקרופאגים מגויס. מקרופאג תושב הריאה כינה מכתשיים מקרופאג מקורם הכבד עוברי, בעוד מקרופאגים מגויס נובעים ממוצא מעובריים הנישאים בדם. עם הפציעה, הריאה יכולה להיות אוכלוסיה מקרופאג הטרוגנית מאוד עם גנטיקה ייחודית וביטוי של פני שטח תא סמנים28,29,30,31,32, 33,34,35. ידוע כי התגובה והתפקוד האימונולוגיים של אוכלוסיות מקרופאג אלה שונות; עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה ציינו כי מקרופאג הרקמה התושבת יש תגובה efferocytic גדולה יותר לעומת מגויס מקרופאגים29,30,31. קביעת התגובה efferocytic של מקרופאגים שוכני הרקמה נגד מקרופאגים ניתן להעריך את הפרוטוקול הנוכחי; עם זאת, אוכלוסיות מקרופאג צריך להיות מטוהרים על ידי FACS ומצופה על שקופיות לניתוח. בנוסף, פרוטוקול זה רק מעריך מכתשיים מקרופאג efferocytic פונקציה בתוך זן אחד של עכברים, זמינים מסחרית. בעבר דיווחו כי זנים שונים של עכברים להראות תגובות שונות O3 חשיפה, כולל דלקת ריאות39,40. לכן, ייתכנו הבדלים בכתשיים מקרופאג efferocytosis על בסיס המתח שנבדק. זהו משתנה שיש לשקול בעת ביצוע פעולה זו בvivo.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר הערכה של מכתשיים מקרופאג efferocytosis בvivo. פרוטוקול זה הוא חסכוני ופשוט, מה שהופך אותו לתשובה שניתן לעשות בו שימוש נרחב. יתר על כן, שיטה זו ניתן להחיל מודלים רבים של פגיעה בריאות ו/או דלקת כדי להגדיל את ההבנה של כמה עלבונות הריאות שונים יכולים לשנות מקרופאג efferocytosis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

מחקר זה ממומן על ידי המכון לאפקטים בריאותיים וולטר א. רוזנבליט ו-הR01ES028829 (ק. מ. ג). אנו רוצים להודות לד ר דיאן וולטרס (המחלקה לפיזיולוגיה, ECU) על עזרתה בהשגת תמונות מייצגות של מקרופאגים מכתשיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
  2. Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
  3. Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
  4. Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
  5. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
  6. Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
  7. Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
  8. Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
  9. Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
  10. Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
  11. Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
  12. O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
  13. Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
  14. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  15. Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
  16. Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
  17. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
  18. Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
  19. Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
  20. Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
  21. Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
  22. Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
  23. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  24. Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
  25. Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
  26. Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
  27. Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
  28. Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
  29. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  30. Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
  31. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
  32. Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
  33. Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
  34. Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
  35. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  36. Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
  37. Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
  38. Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
  39. Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
  40. Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 152 זיהום אוויר אוזון ריאות דלקת מכתשיים מקרופאג efferocytosis
בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hodge, M. X., Reece, S. W.,… More

Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter