Summary
이 원고는 오존에 노출 여부를 결정하기위한 프로토콜을 설명, 기준 대기 오염 물질, 생체 내에서 폐포 대식세포 efferocysis를 손상. 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 시약 및 기술을 활용하고 폐 포상 손상의 여러 모델에 적응하여 폐포 대식세포 효능에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.
Abstract
오존(O3)은 만성 폐질환의 발생률을 악화시키고 증가시키는 대기오염물질이다. O3 노출은 폐 염증을 유도하는 것으로 알려져 있지만, 노출이 염증의 분해에 중요한 과정을 변경하는 방법에 관해서는 거의 알려져 있다. Efferocytosis는 대식세포가 세포 사멸 세포를 세포세포화하는 분해 과정입니다. 이 프로토콜의 목적은O3-유도폐손상 및 염증에 따른 폐포 대식세포 효능을 측정하는 것이다. 몇몇 방법은 efferocytosis를 측정하기 위한 기술되었습니다; 그러나, 대부분은 ex vivo 조작을 요구합니다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은O3 노출 후 생체 내 폐포 대식세포 증 24시간 동안 측정되는 프로토콜로, 이는 대식세포의 생체 내 조작을 피하고 교란을 정확하게 나타내는 데 사용될 수 있는 간단한 기술로 작용한다. 이 해결 프로세스를 참조하십시오. 이 프로토콜은 전신 마취 하에 전신 세포(즉, Jurkat T 세포)의 구인두 포인션에 이어 전신O3 흡입을 수반하는 기술적으로 비집약적이고 비교적 저렴한 방법입니다. 폐포 대식세포 efferocytosis는 기관지 veaolar (BAL) 세척에서 집합된 대식세포의 빛 현미경 평가에 의해 그 때 측정됩니다. Efferocytosis는 마지막으로 efferocytic 지수를 계산하 여 측정됩니다. 집합된 방법은 생체 내 폐에서 의 한 세포 활성을 정량화하는 동시에O3 또는 다른 흡입 된 모욕의 부정적인 건강 효과를 분석하는 역할을합니다.
Introduction
폐는 폐염증을 유발하는 공기미립자, 바이러스, 세균 및 산화제 가스를 포함한 환경적모욕에지속적으로 노출된다1,2,3. 이러한 모욕은 가스 교환을 손상시키고 돌이킬 수없는 조직 손상을 유발할 수 있습니다4,5. 항상성에서 뮤린과 인간 폐에서 발견되는 면역 세포의 약 95%를 구성하는 폐포 대식세포는 환경 적 폐 후 폐 염증의 중요한조절제1,2, 3,4,5. 폐포 대식세포는 병원균을 식세포화하고 제거함으로써 숙주 방어 중에 필수적입니다. 최근에는 폐포 대식세포가 조직 항상성 및 효능 을 통한 염증의 분해를 촉진하는 것으로 나타났다6,7. Efferocytosis는 대식세포가 세포 사멸 세포를 삼키고 제거하는 식세포 과정입니다8,9,10. Efferocytosis는 또한 염증의 분해의 결과로, 더 과정을 증가 시키는 중재제 (즉, IL-10, TGF-β, PGE2,및 산화 질소)의 생산을 초래합니다9,10, 11 ,12,16,18. 이 과정은 이차 괴사를 예방하고 조직 항상성을 촉진하는 데 필요합니다12,13,14. 여러 연구는 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 특발성 폐 섬유증8,9,15,등 다양한 만성 폐 질환과 손상된 성비세포증을 연결한 적이 있다. 16,17.
O3는 만성폐질환의 발생률을 악화시키고 증가시키는 대기오염물질19,20,21이다. O3는 폐염증 및 상해를 유발하고 세균성 병원균의 폐포 대식세포 식균증을 손상시키는 것으로 알려져 있다22,23. 그러나, O3이 폐포 대식세포 효능을 손상시키는지 여부는 알려지지 않았다. 폐포대식세포 efferocytosis에 있는 O 3-유도한 변경을 조사하는 것은 노출이 만성 폐 질병 부각 및 악화로 이끌어 낼 수 있는 방법에 잠재적인 통찰력을 제공할 것입니다. 아래에 기재된 간단한 방법은 급성O3 노출 후 암컷 마우스의 폐에서 폐포 대식세포 효능을 평가하는 간단한 방법이다.
설명된 방법은 값비싼 형광 염료, 광범위한 유동 세포 측정 및 폐포 대식세포의 생체 내 조작(24)의 사용을 제거함으로써 현장에서 일반적으로 사용되는 다른 efferocytosis 프로토콜에 비해 몇 가지 장점을 제시합니다. ,25. 추가적으로, 이 프로토콜은 폐 미세 환경의 맥락에서 폐 포식세포 efferocytosis를 측정합니다, 대식세포 기능에 영향을 미칠 수 있는.
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Protocol
모든 방법은 이스트 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 오존 (O3)및 여과 된 공기 노출 (1 일차)
- 최대 12암컷 C57BL/6J 마우스를 8-12주 된 강철 케이지에 놓고(12개의 분리된 구획이 있음) 와이어 메쉬 뚜껑을O3 노출 챔버에 넣습니다.
- 온도계를 케이지가 있는 노출 챔버에 배치하여 온도와 습도를 정확하게 기록합니다.
- 장치에 부착된 산소및 자외선(UV) 광을 켭니다.
참고: 제어 온도(22-23°C) 및 상대 습도(45%-50%)의 조절된 공기 흐름(>30 공기 변화/h) O3 장치에 의해 얻어진다. O3는 UV 광 발생기를 통해 100% 산소를 지시한 다음 여과된 공기 공급장치와 혼합하여 노출 챔버 내의 시스템에 의해 생성된다. - O3 농도를 1 ppm으로 조정하고 3시간 동안 10분마다 O3 레벨을 정기적으로 기록합니다.
참고: 여과된 공기 노출은 유사한 장치에서 수행되며, 여과된 공기 공급장치만 노출 챔버를 통해 흐르게 됩니다. - O 3/여과 된 공기 노출의 3 시간 후 침구, 음식및 물 광고 libitum와 각각의 케이지에 동물을 반환합니다.
2. 주캇 T 세포주 준비 (2일차)
참고 : 모든 절차는 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.
- 배양 Jurkat T 세포는 24 mL의 기저 세포 배양 배지 + 10% FBS + 37°C에서 페니실린/스트렙토마이신 5% + 5%CO2(재료표)를나타낸다. Jurkat T 세포는 3일마다 미리 온난된 배양 매체로 통과1:6-1:8을 통해 유지될 수 있는 현탁액 세포주이다. 흔들리지 마십시오.
- 세포 사멸 세포를 준비하려면 각 플라스크에서 90 %의 합류로 성장하십시오 (통과 후 달성하기 위해 3-4 일이 걸립니다). 이 연구를 위해, 5개의 T75 플라스크에서 세포를 사용하여 이 프로토콜에 사용된 충분한 수의 세포를 얻었다.
참고 : 결합 플라스크는 약 20-24 백만 세포를 포함합니다. - 각 플라스크(약 24 mL)로부터 피펫 업 셀(전체 플라스크)을 하고 혈청학적 파이펫을 사용하여 멸균된 50 mL 원추형 튜브로 세포를 이송한다. 여러 플라스크에 여러 원추형 튜브를 사용합니다.
- 50 mL 원엽 튜브로부터 세포의 11 μL aliquot를 제거하고 11 μL의 트리판 블루 얼룩 및 피펫 11 μL을 혈세포계 슬라이드상에 혼합하여 세포를 카운트한다.
- 자동화된 셀 카운터에 슬라이드를 삽입하고 각 플라스크에 24mL의 용지가 포함되어 있기 때문에 각 플라스크의 총 셀 수를 24로 곱하여 각 플라스크의 총 셀 수를 계산합니다.
- 271 x g에서 세포 현탁액을 실온(RT)에서 펠릿 세포로 5분 동안 원심분리합니다.
- 포부로 상한액을 버리고 mL당 3.0 x 106 세포를 얻기 위해 매질에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.
- Aliquot 5 mL의 세포는 100 mm x 20 mm 조직 배양 접시 (약 9 개의 접시가 사용되며 각 접시에있는 세포의 총 량은 ~ 15 x 10 6이어야한다).
- 한 접시를 사용하여 제어/노출되지 않은 나머지 요리는 UV에 노출됩니다.
- UV 크로스링커를 올바른 에너지 레벨로 설정하고 에너지 버튼을 누릅니다.
참고 : UV 크로스 링커 에너지 단위는 μJ / cm2 x 100입니다. 따라서 60 밀리줄 /cm2를달성하기 위해 UV 크로스 링커와 일치하도록 장치를 변환하십시오. - UV 크로스링커를 사용하여 60 밀리줄 (mJ)/cm2에서 대조군을 포함하지 않는 세포로 모든 접시를 조사하십시오. UV 광선이 플라스틱 커버에 침투하지 않기 때문에 UV 노출 중에 조직 배양 접시의 상단 덮개를 제거하십시오.
- 4 시간 동안 5 %CO2에서 37 °C에서 미노출 제어를 포함한 세포 배양 인큐베이터에서 모든 접시를 배양합니다.
- 아세포분석법 분석키트를 이용하여 유세포증을 확인하여 아세포증 V와 프로피듐 요오드화물(PI)(각각 세포자멸 및 괴사용 마커)을 함유하고 있는 제조사의 지침26에따라 배양후, 27.
참고 : 600 μJ / cm2의에너지 수준에서 UV 가교 T 세포를 조사, 다음 4 시간 배양 후 -poptotic 세포의 ≥75 %로 이어질 것입니다 (초기 및 후반 모두) 늦은 세포 자멸 표현형보다 더 초기 apoptotic 표현형을 갖는 세포. 이것은 폐포 대식세포가 그(것)들을 인식하고 그들의 막이 타협하지 않기 때문에, 늦은 세포 세포와는 달리, 더 높은 efferocytic 색인 및 폐포 대식세포 efferocytosis의 더 정확한 화상 진찰로 이끌어 내는 이 연구 결과에서 쉽게 만듭니다.- 풀 333 μL (1 x 106 세포) 여러 접시에서 Jurkat T 세포의 (모두 "UV"와 "UV 노출") 함께 보상 분석 튜브에 사용.
- Aliquot 333 μL 의 Jurkat T 세포는 얼룩이 없고, 아넥신 V 단일 얼룩, PI 단일 얼룩, UV 대조군 없음, 및 600 μJ/cm2 UV-노출된 유량 세포 분석 튜브.
- RT에서 5 분 동안 188 x g의 원심 분리튜브와 상류관을 장식합니다.
- 500 μL의 감기, 1x 인산완충식염수(PBS)로 재중단하여 세포를 세척한다.
- 원심분리기 및 펠릿 세포는 RT에서 5분 동안 188 x g에서 원심분리 후 상급자를 버린다.
- 세포가 원심분리되는 동안 증류수로 10x 결합 버퍼를 희석하여 유량 튜브당 1x 결합 버퍼의 400 μL을 준비합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 annexin V 및 PI 인큐베이션 시약(샘플/튜브당 100 μL)을 준비합니다.
- 원심분리 후 상한체를 장식하고 1x 결합 완충액의 400 μL에서 모든 튜브를 부드럽게 재중단한 다음, 각 샘플 튜브에 100 μL의 아넥신 V 인큐베이션 시약을 추가합니다. 마지막으로, 각 튜브에 100 μL의 아넥신 V 단일 얼룩 및 PI 단일 얼룩을 추가하지만, 얼룩이 없는 튜브에 1x 결합 버퍼를 넘어서는 것은 추가하지 않는다.
- RT에서 15 분 동안 어둠 속에서 튜브를 배양하십시오.
- 모든 세포를 RT및 decant 상판에서 5 분 동안 188 x g의 원심 분리기.
- 1x 결합 버퍼의 400 μL에서 세포를 다시 일시 중단한 다음 유세포 분석에 의한 세포 자멸시 샘플을 분석합니다. 염색을 정확하게 표현할 수 있도록 튜브당 최소 10,000개의 이벤트를 수집합니다.
- RT에서 271 x g에서 원심분리하여 접시에서 조사된 모든 세포를 50 mL 원엽 튜브 및 펠릿 세포에 결합합니다.
- 24 mL의 멸균 인산완충식염수(PBS) 및 펠릿 세포에서 포부로 관에서 상류자를 폐기하고 실온에서 5분 동안 원심분리에 의해 펠렛 세포를 폐기하였다.
- IACUC에 의해 승인 된 쥐를 투약하는 데 사용되는 PBS의 양으로 포부 및 재중단 세포에 의해 튜브에서 상류를 폐기. 사용 된 복용량은 사이 5-10 x 106 세포/50 마우스 당 μL; 따라서 10 마우스의 경우 500 μL에서 다시 일시 중단합니다 (각 용량의 세포 수는 조사를 위해 배양되는 셀 수에 따라 다릅니다).
참고 : 피펫 팁의 측면에 달라 붙을 수있는 액체를 고려하여 적어도 두 번의 추가 용량을 메이크업하면 세포가 손실됩니다.
3. 세포 사멸 세포의 뮤린 구인두 점안 (2 일)
- 절차를 촉진하기 위해 마우스를 마취하기 전에 P200 파이펫을 사용하여 세포 사멸 세포의 투약 접종을 준비합니다. 기관 지침에 따라, 약 5-10 x 106 세포를 포함하는 50 μL의 부피는 최상의 결과를 보장하기 위해 구인두 (o.p.) 주입에 사용된다.
- 1 L/min의 유량 또는 기관 지침에 따라 2%의 이소플루란으로 투명한 챔버에서 마우스를 마취시웁트합니다. 한 번에 1~2마리의 마우스를 마취시키는 단계; 숫자는 실험자의 편안함 수준에 의해 결정됩니다. 호흡 패턴을 관찰하고 호흡 사이에 2-3 s 카운트로 심호흡이 보이는지 확인하십시오. 발가락 핀치에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 마우스를 반재기 의 자타석 위치에 놓습니다. 경사진 아크릴 시트 보드에 못 사이에 묶인 수술 문자열을 사용하여 상악 절치에 의해 중단합니다.
- 무딘 비능성 집게를 사용하여 마우스 혀를 가볍게 잡고 당깁니다. P200 파이펫으로 세포 사멸 세포를 구강 내로 주입하십시오. 투약은 마우스가 복용량을 준 후에 딱딱거리는 소음 1-2s를 만들 때 성공합니다.
참고 : 세포 사멸 세포 주입 전에 혀 또는 oropharynx에 외상을 유도하지 않도록주의하십시오. - 장갑을 낀 손가락으로 혀가 후퇴하는 동안 마우스가 흡입 될 때까지 코를 부드럽게 차단하십시오. 구강 내에 액체가 보이지 않고 마우스가 두 개 이상의 흡입을 할 때까지 코를 덮습니다.
참고: 마우스는 의무코 호흡기이기 때문에 코를 덮는 것은 마우스가 폐로 세포 사멸 세포를 흡입할 것을 보장하는 것을 돕습니다. - 접종 보드에서 마우스를 제거하고 마취에서 회복을 허용하기 위해 케이지에 반환합니다. 마우스를 뒷면에 놓아 침구 나 파편이 회수 중에 나레스를 막지 못하게하십시오.
- 모든 마우스가 마취에서 깨어난 후 폐포 대식세포가 세포 사멸 세포의 유입을 삼킬 수 있도록 마우스가 마취에서 회복 한 후 90 분 기다립니다. 일반적으로 마취 후 각성은 1-2 분이 걸리며, 이는 주입의 결과 / 타이밍에 영향을 미치지 않아야합니다.
4. 기관지 세척액 세척액 수집 및 가공 (2일차)
- 마우스가 세포 사멸 세포로 투약에서 마취에서 깨어난 후 90 분 기관 지침 당 각 마우스를 안락사. 여기에서 케타민과 자일라진의 치명적인 주사가 사용됩니다 (각각 90 mg / kg 및 10 mg / kg) 횡격막을 절제합니다.
참고 : 이 시간 포인트는 폐포 대식세포가 세포 사멸 세포(38)를감지하고 삼킬 수있는 충분한 시간을 허용합니다. - 모든 마우스(g)를 체중계로 측정하고 가중치를 기록합니다. 체중을 사용하여 BAL 체적(26.25mL/kg 체중)을 계산합니다.
- 마우스를 등에 대고 70% 에탄올을 뿌려 가슴과 목 부위를 살균합니다.
- 외과 용 가위로 복부 쪽 전체를 따라 흉골 바로 아래 2 "세로 절단을 하고 집게로 흉골을 들고 있는 동안 폐가 흉강으로 다시 떨어질 수 있도록 횡격막을 닉합니다.
- 흉곽의 측면을 따라 옆으로 잘라 서 폐가 용해 할 때 더 많은 공간이 확장 될 수 있도록, 다음 집게로 다시 가슴 구멍을 접어.
- 1" 수직으로 목을 통해 혈관을 따라 잘라 기관을 노출합니다.
- 두 개의 집게를 사용하여 기관에서 근육과 조직을 잡아 당기고 노출하십시오. 추가 잠재적 인 출혈을 피하고 기관을 절단, 그것은 혈관에 둘러싸여 있기 때문에, 세로 근육, 결합 조직.
- 바늘을 사용하여 기관에서 슬릿을 만들고 (머리에서 거리의 약 1/4)를 넣고 1x PBS (26.25 mL / kg 체중, 8-10 주 된 여성 C57 caurac)에 0 ~7-1.0 mL로 미리로드 된 주사기 (18 G x 1.25")를 삽입하십시오. 헤아.
- 폐가 팽창할 수 있도록 천천히 폐로 PBS의 양을 밀어 내고, 주사기로 볼륨을 다시 당깁니다. 이 과정을 총 3번 반복합니다.
- 15 mL 튜브에 있는 각 특정 마우스에서 풀링된 세척 액을 수집합니다.
- 기관지 세척을 610 x g에서 4°C에서 6분 동안 원심분리하고 상급체를 1.5 mL 튜브로 수집하고 -80°C에서 동결한다. 펠릿은 기관지 베올라 공간에서 세포를 나타냅니다.
- 세포 펠릿에 ACK RBC 용해 완충액 1 mL을 추가하여 수집 된 BAL 유체에서 잔류 적혈구를 제거한 다음 소용돌이가 잘 되고 얼음에 1 분 동안 용해하십시오. 그 후, 4 mL의 PBS를 추가하여 라시스 반응을 멈춥니다.
- 펠렛 세포를 610 x g에서 원심분리하여 4°C에서 6분 동안 진공 흡기로 상판을 흡인한다.
- 각 BAL 샘플 튜브에 1 x PBS + 10% FBS의 1 mL에서 세포를 다시 중단합니다. 각 샘플에서 총 영공 세포의 정량화를 위해 혈전계에 세포를 계수 (아니 트리판 블루). 중간 가속도와 사이토 센트리분리기를 사용하여 각 샘플의 원심 분리기 120 μL을 56 x g에서 3분 동안 슬라이드에 밀어. 슬라이드를 밤새 건조시고 말립니다.
5. 폐포 대식세포 efferocytic 지수의 계산 (3 일)
- 헤마톡실린과 에오신으로 슬라이드를 염색하여 각 슬라이드에서 적어도 200개의 세포가 계산된 후, 세포 및 차동 세포 수를 모두 계산할 수 있도록 합니다.
- 생물학적 현미경의 밝은 필드 설정 아래에서 슬라이드를 봅니다(20x 또는 40x 목표가 가장 잘 작동합니다).
- 세포 차동 슬라이드상에서 총 200개의 대식세포 중 에서 세포 사멸 세포 를 취하지 않고 폐포 대식세포에 식세포 Jurkat T 세포를 세포 세포세포로 세포 세포세포가 세포 세포로 이동시킨 폐포 대식세포의 수의 비율을 기준으로 한 efferocytic 지수를 계산한다. 데이터 입력에 대한 비율을 백분율로 변환합니다. 다음 방정식을 사용합니다.
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Representative Results
O3 노출은 폐 염증 및 부상을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 조직 항상성을 유지하기 위해 효능이 요구된다. C57BL/6J 암컷 마우스는 여과된 공기(FA) 또는 1 ppmO3에 3시간 동안 노출되었고, 폐 염증 및 부상을 조사하기 위해 24시간 노출 후 노출을 부검하였다. O3-노출된마우스는 FA 대조군에 비해 영공에서 대식세포 및 호중구의 유의한 증가를 나타냈다(도1A,B). 부가적으로,O3-노출된마우스는 BAL 단백질, 폐포 상피 장벽 기능 장애 24시간 후 노출의 마커에서 유의한 증가를가졌다(도 1C).
O3-유도된 폐 염증이 생체 내 폐포 대식세포 증식의 결함과 연관되어 있는지 확인하기 위해, C57BL/6J 암컷 마우스는 구인두 포부를 통해 사멸 성 Jurkat T 세포를 주입했다 24 시간 포스트 FA 또는 포스트 -O3 노출될 수 있습니다. Jurkat T 세포에서의 세포사멸은 투약 전에 유세포측정에 의해 확인되었고, 초기에 유동 세포분석(annexin V+ PI-및 후기(annexin V + 및 PI+)에서 유의하게 증가하였다(아세포V+및PI+)세포사멸세포(도2A,B). 노출 수준 및 배양 시간은 ~ 75% apoptotic Jurkat T 세포의 반복적인 결과를 초래했습니다. 그림 3A에efferocytic 대식세포로 확인된 무슨의 확대한 심상은 도시성 대식세포. Efferocytic 대식세포는 일반 폐포 대식세포 (흰색 화살표로 표시됨)에 비해 Jurkat T 세포 (검은 색 화살표로 표시됨)를 삼킨 대식세포로 확인되었습니다(그림 3B). 폐포 대식세포 효능이 프로토콜을 이용하여 평가되었을 때, FA 대조군에 비해O3-노출된그룹의 efferocytic 지수가 통계적으로 유의하게 감소하였다(도3B,C). 이러한 데이터는O3-유도된 폐 염증이 폐 손상 및 염증을 연장 시킬 수 있는 세포 사멸 세포의 감소 된 클리어런스와 관련이 있음을 나타냅니다.
그림 1:O3 노출은 폐 염증 및 부상을 유발한다. C57BL/6J 암컷 마우스는 여과된 공기(FA) 또는 1 ppmO3에 3시간 동안 노출되었다. (a)기관지 정맥 세척(BAL) 세포 차동을 계산한 다음, 상피(epi), 호산구(eos), 림프구(림프구), 대식세포(M), 및 호중구(PMN)를 각 슬라이드로부터 계수한 적어도 200개의 세포로 확인하였다. (B)셀룰러 차동의 대표적인 이미지. (C)BAL 유체의 총 단백질. 데이터는 ±SEM(**p< 0.01)으로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 유르캇 T 세포에서 UV 유도 세포자멸의 확인. Jurkat T 세포는 UV 크로스링커(Model1800)를 사용하여 UV(60 mJ/cm2)에 노출되었다. UV 노출 후, Jurkat T 세포를 37°C에서 5%CO2로 4시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, Jurkat T 세포를 아넥신 V 및 프로피듐 요오드화물(PI)으로 염색하고, 세포사멸을 유세포분석으로 평가하였다. 초기 세포사멸, 후기 세포자멸, 및 괴사 세포는 각각 별관 V+/PI- ,별관 V+/PI+, 별관 V-/PI+, 각각으로 식별된다. 대표적인 유동 세포분석 산란플롯(10,000개의 이벤트 기록)의(A)노출되지 않은 Jurkat T 세포 및(B)UV-노출 Jurkat T 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: O3 노출은 폐포 대식세포 효능을 감소시이다. C57BL/6J 암컷 마우스는 여과된 공기(FA) 또는 1 ppmO3에 노출되었고 3시간 동안 24시간 노출후, 마우스는 약 5 x 106 의 세포자멸 유르캇 T 세포를 주입하였다. 1.5 시간 점안 후, 기관지 방베라 세척 (BAL)을 수행하고, 200 대식세포 (n = 그룹 당 11)를 계산 한 후 가벼운 현미경검사법에 의해 BAL 대식세포에서 efferocytic 지수를 계산하였다. (A)세포성 대식세포의 대표적인 이미지. (B)FA 또는 O3 노출 후 폐포 대식세포(흰색 화살표) 및 탈충성 대식세포(검은색 화살표)의 식별. (C)FA 또는 O3 노출 후 의 efferocytic 지수의 계산 (***p & 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 350 nm 의 젖어 있는 전구를 사용하여 최적이 아닌 Jurkat T 세포 세포 세포 사멸. Jurkat T 세포를 UV 크로스링클러를 사용하여 10분 동안 조사하고 1시간 동안 5%CO2에서 37°C에서 배양하였다. UV 노출 후, Jurkat T 세포를 37°C에서 5%CO2로 4시간 동안 배양하였다. 인큐베이션 후, Jurkat T 세포를 아넥신 V 및 프로피듐 요오드화물(PI)으로 염색한 다음, 유세포분석으로 세포사멸을 평가하였다. 초기 세포자멸, 후기 세포자멸 및 괴사 세포는 각각 별관 V+/PI -,및 별관 V-/PI+로식별된다. 350 nm 전구를 가진 UV 드러낸 Jurkat T 세포의 대표적인 유동 세포 분석 플롯 (기록된 10,000개의 이벤트)가 도시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
Efferocytosis는 대식세포가 세포 자멸 세포및 파편을 지우고 다중 항염증제 매개체9,10,11,12,16을 생성하는 항염증 과정입니다 ,18. 여러 모델의 세포세포증은 대식세포가 염증의 분해능에서 어떻게 중요한 세포인가에 대한 통찰력을 제공했다6,7. 최근 만성 폐 질환의 진행은 efferocytosis8,9,15,16,17의결함과 연관되어 있다. 그러나,O3와 같은 대기오염물질에 노출되면, 효능소에 결함이 발생하는지는 현재 불분명하다. 이 프로토콜은O3 노출 후 폐포 대식세포 효능의 평가를 가능하게 한다. 또한 가벼운 현미경을 사용하여 생체 내 효능을 정량화하고 생체 외 조작이나 고가의 형광 염료없이 폐 미세 환경의 맥락에서 efferocytosis의 측정을 허용합니다. 이 프로토콜은 O3 노출의 맥락에서 수행되지만 폐 염증 및 부상의 여러 모델은 폐포 대식세포 효능을 평가하기 위해이 프로토콜과 함께 사용될 수 있습니다.
기존 방법에 비해이 방법의 장점은 생리 적 환경의 맥락에서 폐포 대식세포를 분석 할 수있는 능력입니다. 폐포 대식세포의 생체 내 분석은 세포 사멸 세포를 가진 도금 및 배양을 포함한다. 도금 폐포 대식세포는 efferocytosis28,29,30을바꿀 수 있는 생리적 및 게놈 변화를 유도할 수 있다. 또한 폐에 폐 포시포세포는 대식세포 기능에 영향을 미치는 것으로 알려진 폐 내막 유체의 계면활성제 및 성분을 포함하는 미세 환경에존재하며, 31,32,33, 34,35. 우리의 방법은 더 생리학적으로 관련이 있는 ex vivo 조작 없이 폐에 있는 efferocytosis 측정을 허용합니다. 이 프로토콜의 미래 응용 프로그램은 폐 미세 환경이 폐포 대식세포 efferocytosis를 바꿀 수 있는 방법에 관하여 더 심층적인 연구 결과로 이끌어 낼 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요한 구성 요소는 폐포 대식세포 효능의 평가를 위한 세포사멸 세포의 생성이다. 이것은 괴사가 아닌 apoptosis를 유도하기 위하여 정확한 UV 노출 수준을 낙관하는 관련시킵니다. 당사의 프로토콜은 254 nm 파장 방출 전구와 60 mJ / cm2의노출 수준이있는 UV 크로스 링커를 사용합니다. UV 전구 선택은 괴사가 아닌 사멸을 생성하는 데 중요합니다. 350 nm UV 전구는 단백질 막 가교 및 살균에 우수하지만 세포자멸을 유도하지 못하며35,36,37. 350 nm 전구를 가진 60 mJ/cm2에 드러낸 Jurkat T 세포의 예시 점 플롯은 후기 세포자멸 및 괴사 세포에 있는 중요한 증가와 함께 그림 4에 도시됩니다. 부가적으로, 프로토콜은 UV 노출 후 4시간 배양을 사용한다. 프로토콜의이 부분을 최적화하기 위해, 우리는 이전에 다양한 배양 시간을 조사하고 1.5 및 2 시간 배양 후 노출은 5 % 미만의 efferocytic 지수와 함께 약 40 %의 세포 사멸을 산출한다는 것을 발견했습니다 (데이터는 표시되지 않음). 현재 문헌에 기초하여, ~70%-80%의 총 세포사멸 세포는 세포세포증 측정에 충분하다38.
이 프로토콜의 한계는 FA 또는O3 노출 후 영공에서 모든 대식세포의 세포성 반응을 조사하고 조직 상주 대식세포와 모집된 대식세포와 구별하지 않는다는 것이다. 폐 상주 대식세포는 폐포 대식세포라고 불리는 폐포 대식세포는 태아 간에서 유래한 반면, 모집된 대식세포는 혈액 매개 배아 유래에서 파생됩니다. 상해시, 폐는 독특한 유전학과 세포 표면 마커의 발현을 가진 높게 이질적인 대식세포 집단을 가질 수 있습니다28,29,30,31,32, 33,34,35. 이러한 대식세포 집단의 면역학적 반응과 기능이 다른 것으로 알려져 있다. 그러나, 최근 연구에 의하면 조직 상주 대식세포는 모집된 대식세포29,30,31에비해 더 큰 효능 반응을 갖는다는 것을 나타냈다. 조직 상주 대식세포 대식세포 대치세포대종에 대한 세포성 반응을 결정하는 것은 현재 프로토콜로 평가될 수 있다; 그러나, 대식세포 인구는 FACS에 의해 정화되고 분석을 위해 슬라이드에 도금될 필요가 있습니다. 추가적으로, 이 프로토콜은 근친, 시판마우스의 1개의 긴장에 있는 폐포 대식세포 efferocytic 기능을 평가합니다. 이전에는 생쥐의 상이한 균주가 폐염증39,40을포함하는O3 노출에 대해 상이한 반응을 보이는 것으로 보고되었다. 따라서, 조사된 균주에 기초하여 폐포 대식세포 효능에 차이가 있을 수 있다. 이것은 생체 내 분석에서 이 것을 수행할 때 고려해야 할 변수입니다.
결론적으로, 전술한 프로토콜은 생체 내에서 폐포 대식세포 효능의 평가를 허용한다. 이 프로토콜은 비용 효율적이고 간단하여 널리 활용 될 수있는 분석입니다. 더욱이, 이 방법은 다양한 폐 모욕이 대식세포 효능을 어떻게 바꿀 수 있는지에 대한 이해를 높이기 위해 폐 손상 및/또는 염증의 수많은 모델에 적용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 건강 효과 연구소 월터 A. 로젠 블리스 상과 NIEHS R01ES028829에 의해 투자된다 (K. M. G에). 우리는 폐포 대식세포의 대표적인 이미지를 얻는 그녀의 도움에 대한 박사 다이앤 월터스 (생리학과, ECU)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
| BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
| Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
| Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
| Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
| Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
| Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
| Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |
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