Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

В Vivo Оценка Альвеолярного макрофажа Эффероцитоз после воздействия озона

Published: October 22, 2019 doi: 10.3791/60109
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 2Research Triangle Park, National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

Данная рукопись описывает протокол для определения того, является ли воздействие озона, критерия загрязнителя воздуха, ухудшает альвеолярный макрофаг энеррозитоз in vivo. Этот протокол использует широко используемые реагенты и методы и может быть адаптирован к нескольким моделям легочной травмы, чтобы определить влияние на альвеолярный макрофage эпрероцитоз.

Abstract

Озон (O3) является критерием загрязнителя воздуха, который усугубляет и увеличивает заболеваемость хроническими легочными заболеваниями. O3 воздействия, как известно, вызывают воспаление легких, но мало известно о том, как воздействие изменяет процессы, важные для разрешения воспаления. Эффероцитоз является процесс разрешения, в котором макрофаги фагоцитации апоптотические клетки. Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы измерить альвеолярный макрофаг эпрероцитоз после O3индуцированной травмы легких и воспаления. Было описано несколько методов измерения эффоцитоза; однако, большинство из них требуют манипуляций ex vivo. Описано в деталях здесь протокол для измерения в vivo альвеолярный макрофage efferocytosis 24 ч после O3 воздействия, который избегает ex vivo манипуляции макрофагов и служит простой метод, который может быть использован для точного представления возмущений в этот процесс разрешения. Протокол является технически неинтенсивным и относительно недорогим методом, который включает в себя ингаляцию всего тела O3 с последующим аспириальным аспирированием апоптотических клеток (т.е. юркат Т-клеток) в то время как под общим наркозом. Альвеолярный макрофage efferocytosis затем измеряется световой микроскопии оценки макрофагов, собранных из бронхоальвеолярной (BAL) лаважа. Эффероцитоз, наконец, измеряется путем расчета энемероцитарного индекса. В совокупности, изложенные методы количественно эвэроцитической активности в легких in vivo, а также выступающей для анализа негативных последствий для здоровья O3 или других ингаляционных оскорблений.

Introduction

Легкое постоянно подвергается воздействию экологических оскорблений, в том числе частиц воздуха, вирусов, бактерий и окислительных газов, которые вызывают воспаление легких1,2,3. Эти оскорбления могут поставить под угрозу газообмен и вызвать необратимые повреждения тканей4,5. Альвеолярные макрофаги, которые составляют примерно 95% иммунных клеток, найденных в мурин и легких человека при гомеостазах, являются критическими регуляторами воспаления легких после экологических оскорблений1,2, 3,4,5. Альвеолярные макрофаги имеют важное значение во время защиты хозяина путем фагоцитизации и устранения патогенных микроорганизмов. В последнее время альвеолярные макрофаги были показаны для содействия ткани гомеостаза и разрешения воспаления через эффоцитоз6,7. Эффроцитоз является фагоцитарный процесс, в котором макрофаги поглотить и устранить апоптотические клетки8,9,10. Эфтероцитоз также приводит к производству посредников (т.е., IL-10, TGF-я, PGE2, и оксида азота), что еще больше увеличить процесс, в результате чего разрешение воспаления9,10,11 ,12,16,18. Этот процесс необходим для профилактики вторичного некроза и содействия ткани гомеостаза12,13,14. Несколько исследований связали нарушения эвнерозитоза с различными хроническими заболеваниями легких, включая астму, хроническую обструктивную болезнь легких, и идиопатический легочный фиброз8,9,15, 16,17.

O3 является критерием загрязнителя воздуха, который усугубляет и увеличивает заболеваемость хроническими легочными заболеваниями19,20,21. O3 вызывает воспаление легких и травмы и, как известно, ухудшить альвеолярный макрофаг фагоцитоз бактериальных патогенов22,23. Тем не менее, неизвестно, является ли O3 ухудшает альвеолярный макрофаг энероцитоза. ИсследованиеO 3-индуцированных изменений в альвеолярных макрофаг эпрероцитоз даст потенциальное представление о том, как воздействие может привести к хронической заболеваемости легочнымзаболеванием и обострение. Ниже описан простой метод оценки альвеолярного макрофага эффоцитоза в легких самок мышей после острого воздействия O3.

Изложенный метод обладает рядом преимуществ по сравнению с другими протоколами эневоцитоза, обычно используемыми в этой области, устраняя использование дорогостоящих флуоресцентных красителей, обширные измерения цитометрии потока и манипуляции ex vivo альвеолярных макрофагов24 ,25. Кроме того, этот протокол измеряет альвеолярный макрофаг энероцитоз в контексте микроокружения легких, который может влиять на функцию макрофагов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Восточной Каролины.

1. Озон (O3) и отфильтрованное воздействие воздуха (День 1)

  1. Поместите максимум 12 самок C57BL/6J мышей, 8-12 недель, в стальной клетке (с 12 отдельными отсеками) с проволочной сеткой крышки в O3 экспозиции камеры.
  2. Поместите термометр в камеру экспозиции с клеткой, чтобы точно зафиксировать температуру и влажность.
  3. Включите кислород и ультрафиолетовый (УФ) свет, который крепится к аппарату.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируемый воздушный поток (Зgt;30 изменения воздуха/ч) с контролируемой температурой (22-23 градусов по Цельсию) и относительной влажностью (45%-50%) получено аппаратом O3. O3 генерируется системой в камере экспозиции, направляя 100% кислорода через генератор УЛЬТРАВ-свет, а затем смешивается с фильтрованным воздухоснабжением.
  4. Отрегулируйте концентрацию O3 до 1 промилле и регулярно записывайте уровни O3 каждые 10 минут в течение 3 ч. Постоянно следите за температурой и влажностью камерного воздуха, как и концентрация O3 с фотометром УФ-света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрованное воздействие воздуха выполняется в аналогичном аппарате, и только фильтрованное поступление воздуха проходит через камеру экспозиции.
  5. Вернуть животных в их соответствующих клетках с постельными принадлежностями, питание, и вода объявление libitum после 3 ч O3/ фильтрованного воздействия воздуха.

2. Подготовка линии клеток Jurkat T (День 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться в кабинете биологической безопасности класса II.

  1. Культура Jurkat Т-клеток в 24 мл базально-клеточной культуры среднего - 10% FBS 5% пенициллина / стрептомицина при 37 КС и 5% CO2 (Таблица Материала). Jurkat T клетки подвесной линии ячейки, которые могут быть сохранены путем пропуска 1:6-1:8 в предварительно разогретых культивирования средств каждые 3 дня. Не трясите.
  2. Чтобы подготовить апоптотические клетки, вырастить их до 90% стопроцентной в каждой колбе (которая занимает 3-4 дней, чтобы достичь после прохождения). Для этого исследования, использовать клетки из пяти t75 колбы для получения достаточного количества клеток, используемых в этом протоколе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сопливоеля колба содержит около 20-24 миллионов клеток.
  3. Pipette вверх клетки (которая вся колба) от каждой колбы (приблизительно 24 mL) и переносить клетки к стерильной конической трубке 50 mL используя серологический пипетка. Используйте несколько конических труб окональных труб окональных колб.
  4. Подсчитайте клетки, удалив 11-й аликот клеток из конической трубки 50 мл и смешайте с 11 злицу мипанов синего пятна и пипетки 11 Зл на гемоцитометрические слайды.
  5. Вставьте слайд в автоматизированный счетчик ячейки и запишите количество живых ячеек, чтобы вычислить общее количество клеток в каждой колбе, умножив количество живых ячеек на 24, так как каждая колба содержит 24 мл носителей.
  6. Центрифуги яточной подвески на 271 х г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT) для пеллетных клеток.
  7. Откажитесь от супернатанта путем аспирации и повторно йетю в средствах массовой информации, чтобы получить 3,0 х 106 ячеек на мл.
  8. Aliquot 5 мл клеток в 100 мм х 20 мм ткани культуры блюда (примерно девять блюд будет использоваться; общее количество клеток в каждом блюде должно быть 15 х 106).
  9. Используйте одно блюдо для контроля / неэкспонированных, а остальные блюда будут подвергаться УФ.
  10. Установите ультрафиолетовый кросслинкер на правильный энергетический уровень, нажмите энергетическую кнопку и введите "600" с помощью номерной площадки, которую машина будет читать как 600 j/cm2 х 100.
    ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-кросслинкерные энергоблоки в "J/cm2 х 100; таким образом, для достижения 60 millijoules / см2, конвертировать единицв в соответствии с УФ-кросслинкер.
  11. Облучать все блюда клетками, не включая контроль, на 60 миллиджоулей (мДж)/см2 с помощью УФ-кросслинкера. Удалите верхнюю крышку ткани культуры блюда во время ВОЗДЕЙСТВИЯ УФ-излучения, как УФ-излучение не будет проникать в пластиковую крышку.
  12. Инкубировать все блюда в инкубаторе клеточной культуры, включая неэкспонированный контроль, при 37 градусах По цельсии при 5% CO2 на 4 ч.
  13. Подтвердить апоптоз потокциометрии с помощью апоптоза ассса обнаружения комплект, содержащий аннексию V и пропидий йодид (PI) (маркеры для апоптоза и некроза, соответственно) после 4 ч инкубации, в инструкции производителя26, 27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Облучение юркат Т-клеток в УЛЬТРА-кросслинкер на энергетическом уровне 600 J /cm2, после 4 ч инкубации приведет к 75% апоптотические (как ранние, так и поздние) клетки, имеющие более ранний апоптотический фенотип, чем поздний апоптотический фенотип. Это облегчает для альвеолярных макрофагов распознать их и поглотить, как их мембраны бескомпромиссны, в отличие от поздних апоптотарных клеток, что приводит к более высокому энемероцитарного индекса и более точной визуализации альвеолярного макрофафаээнероцитоза в этом исследовании.
    1. Бассейн 333 Зл (1 х 106 клеток) юркат Т-клеток из нескольких блюд (как "без УФ" и "УФ-экспонированных") вместе, чтобы использовать для анализа компенсации труб.
    2. Aliquot 333 Зл юркат Т-клеток в неокрашенных, приложение V одно пятно, PI одно пятно, не УФ-контроля, и 600 "J/cm2 УФ-экспонированных кислотированных цитометрии труб.
    3. Центрифуга трубки на 188 х г в течение 5 мин на RT и decant супернатант.
    4. Вымойте клетки, повторно приостановив в 500 л холодного, 1x фосфат-буфера сольников (PBS).
    5. Центрифуга и пеллетные клетки при 188 х г в течение 5 мин на RT. Отбросьте супернатант после центрифугации.
    6. Подготовьте 400 qL 1x связывающего буфера на трубку потока путем разбавления 10x связывающий буфер с дистиллированной водой в то время как клетки центрифугирования.
    7. Подготовьте инкубационный реагент приложения V и PI (100 л на образец/трубку) в соответствии с инструкциями производителя.
    8. Декант супернатант после центрифугации и аккуратно resuspend все трубы в 400 зл. L 1x связывающий буфер, а затем добавить 100 qL аннексии V инкубационный реагент для каждого образца трубки. Наконец, добавить 100 злиц из приложения V одно пятно и PI одно пятно на их соответствующих труб, но не добавляйте ничего за 1x связывающий буфер к неокрашенной трубки.
    9. Инкубировать трубки в темноте в течение 15 минут на RT.
    10. Центрифуга все клетки на 188 х г в течение 5 мин на RT и декант супернатант.
    11. Resuspend клетки в 400 злиц 1x связывающий буфер, а затем проанализировать образцы для апоптоза по потоку цитометрии. Соберите не менее 10 000 событий на трубку, чтобы обеспечить точное представление окрашивания.
  14. Объедините все облученные клетки из посуды в коническую трубку 50 мл и клетки гранул центруляцией при 271 х г в течение 5 мин на РТ.
  15. Откажитесь от супернатанта из трубки путем аспирации и повторного отвода клеток в 24 мл стерильного фосфатного буферного солевой солевой раствора (PBS) и пеллетных клеток центрифугированием при температуре 271 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  16. Откажитесь от супернатанта из трубки путем аспирации и повторной работы клеток в количестве PBS, используемых для дозирования мышей, утвержденных IACUC. Используемая доза составляет от 5-10 х 106 клеток/50 л на мышь; таким образом, для 10 мышей, повторно притяжаться в 500 ЗЛ (количество клеток в каждой дозе варьируется в зависимости от того, сколько клеток культивируется для облучения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Макияж по крайней мере две дополнительные дозы для учета любой жидкости, которая может прилипнуть к сторонам кончика пипетки в результате потери клеток.

3. Морин ротоглотки засиливание апоптотические клетки (День 2)

  1. Подготовка дозирования инокулум апоптотические клетки с помощью пипетки P200 до анестезии мышей, чтобы ускорить процедуру. В соответствии с институциональными руководящими принципами, объем 50 кЛ, содержащий приблизительно 5-10 х 106 клеток, используется для зависания ротоглотки (o.p.) для обеспечения наилучших результатов.
  2. Анестезия мышей в ясной камере с 2% изофлуран на скорости потока 1 л / мин или в соответствии с институциональными руководящими принципами. Анестезия от одного до двух мышей одновременно; число определяется уровнем комфорта экспериментатора. Наблюдайте картину дыхания и подтвердите глубокие вдохи видимы с отсчетами 2-3 s между вдохами. Проверьте глубину анестезии на отсутствие реакции на щепотку ног.
  3. Расположите мышь в полулежачем положении на спине. Используйте хирургическую строку, связанную между колышками на наклонной акриловой листовой доске, чтобы приостановить на верхнечелюстные резцы.
  4. Используя пару тупых не-шедрищи щипки, слегка захватить и потяните мышь язык. Привить апоптотические клетки в полость рта с пипеткой P200. Дозировка является успешным, когда мыши делают треск шум 1-2 с после предоставления дозы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь, чтобы избежать индуцирования травмы либо языка или ротоглотки до апоптотической клетки застоя.
  5. С перчатками палец, осторожно блокировать нос, пока мышь вдыхает в то время как язык убирается. Обложка нос, пока жидкость не видна в полости рта и мышь приняла два или более ингаляций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как мыши обязывают нос передышки, покрытие носа помогает гарантировать, что мышь будет вдыхать апоптотические клетки в легкие.
  6. Снимите мышь с доски для прививки и верните ее в клетку, чтобы можно было восстановиться после анестезии. Поместите мышь на спину, чтобы предотвратить постельные принадлежности или мусора от блокирования nares во время отзыва.
  7. Подождите 90 минут после мыши восстанавливается после анестезии, чтобы альвеолярные макрофаги поглотить приток апоптотические клетки после того, как все мыши проснулись от анестезии. Как правило, пробуждение после анестезии займет 1-2 мин, что не должно повлиять на исход/время застоя.

4. Сбор и переработка бронхоальвеолярной жидкости для лаважа (День 2)

  1. Эвтаназия каждой мыши в институциональных руководящих принципов 90 минут после мыши проснулся от анестезии от дозирования с апоптотические клетки. Здесь используется смертельная инъекция кетамина и ксилазина (90 мг/кг и 10 мг/кг соответственно), за которой следует выделение диафрагмы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта точка времени позволяет достаточно времени для альвеолярных макрофагов, чтобы чувствовать и поглотить апоптотические клетки38.
  2. Взвешивать всех мышей (g) по шкале и рекордные веса. Используйте вес тела для расчета объема BAL (26,25 мл/кг массы тела).
  3. Поместите мышей на спину и спрей 70% этанола для стерилизации груди и шеи области.
  4. Сделать 2 "продольный разрез чуть ниже грудины вдоль всей брюшной стороны с хирургическими ножницами, и, держа грудину с щипками, ник диафрагмы, чтобы легкие, чтобы упасть обратно в грудную полость.
  5. Вырезать боковой по бокам грудной клетки, чтобы легкие больше места, чтобы расширить при вращывания, а затем сложить грудной полости обратно с щипками.
  6. Сделать 1 "вертикальный разрез вдоль сосуды через шею, чтобы разоблачить трахеи.
  7. Используйте два щипча, чтобы вытащить мышцы и ткани от трахеи и разоблачить его. Избегайте дополнительных потенциальных кровотечений и резки трахеи, так как она окружена сосуды, продольные мышцы, и соединительной ткани.
  8. Используйте иглу, чтобы сделать щель в трахеееи (около одной четверти расстояния вниз от головы) и вставить канюлю (18 G х 1,25") с шприцем предварительно загружены с 1x PBS (26,25 мл / кг массы тела, 0,7-1,0 мл в 8-10 недель женщина C57Bl/6J) Hea.
  9. Нажмите объем PBS в легкие медленно, чтобы легкие, чтобы раздуть то, вытащить объем обратно в шприц. Повторите этот процесс в общей сложности 3 раза.
  10. Соберите объединенную жидкость для промывки с каждой конкретной мыши в трубке длиной 15 мл.
  11. Centrifuge бронхоальвеолярной лавировки на 610 х г в течение 6 мин при 4 c и собирать супернатант в трубку 1,5 мл и заморозить при -80 градусов по Цельсию. Гранулы представляют клетки из бронхоальвеолярного пространства.
  12. Удалите остаточные эритроциты в собранной жидкости BAL, добавив 1 мл буфера лиза ACK RBC в клеточную гранулу, затем хорошо вихрь и лиза в течение 1 мин на льду. После этого добавьте 4 мл PBS, чтобы остановить реакцию лиза.
  13. Пеллетные клетки центрифугированием при центру в 610 х г в течение 6 мин при 4 градусах По Цельсию и аспирируют супернатант с помощью вакуумного аспиратора.
  14. Resuspend клетки в 1 мл 1x PBS и 10% FBS к каждой трубе образца BAL. Подсчитайте клетки на гемоситометре для количественной оценки общего количества воздушных камер из каждого образца (без трипансиного синего). Центрифуга 120 л каждого образца на слайды на 56 х г в течение 3 мин, используя среднее ускорение и цитоцентрифуге. Сухие горки на ночь.

5. Расчет альвеолярного макрофафа энероцитетного индекса (День 3)

  1. Пятно слайды с гематоксилином и эозином, чтобы для расчета как энероцитных и дифференциальных клеток рассчитывается, по крайней мере 200 клеток, подсчитанных с каждого слайда.
  2. Просмотр слайдов под настройками яркого поля на биологическом микроскопе (лучше всего будет работать цель 20x или 40x).
  3. Рассчитайте энероцитарный индекс на основе соотношения числа альвеолярных макрофагов, которые фагитозааа апоптотические юркат Т-клетки альвеолярных макрофагов без поглощения апоптотической клетки из общего числа 200 макрофагов на скольдении ячейки. Преобразуйте соотношение в процент для ввода данных. Используйте следующее уравнение:

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

O3 воздействия, как известно, вызывают воспаление легких и травмы, и эвнеросцитоз необходим для поддержания ткани гомеостаза. C57BL/6J самок мышей подверглись воздействию фильтрованного воздуха (FA) или 1 промилле O3 для 3 ч и некропсии 24 ч после воздействия для изучения легочного воспаления и травмы. O3-экспонированных мышей отображается значительное увеличение макрофагов и нейтрофилов в воздушном пространстве по сравнению с группой управления FA (Рисунок 1A,B). Кроме того, O3-экспонированных мышей было значительное увеличение белка BAL, маркер альвеолярной эпителиальной дисфункции барьера 24 ч после экспозиции(рисунок 1C).

Чтобы определить,если O 3-индуцированного легочного воспаления связано с дефектами в альвеолярных макрофаг эвнероцитоз in vivo, C57BL/6J женские мыши были привиты с апоптотической Jurkat T клеток через ротогловские аспирации 24 ч после FA или после O3 воздействия. Апоптоз в клетках Jurkat T был подтвержден цитометрией потока до дозирования, и произошло значительное увеличение в начале (аннексия Vи PI- и поздно (аннексияV и PI)апоптотические клетки(Рисунок 2A, B). Уровень воздействия и время инкубации привели к повторяющимся результатам апоптотической клетки Jurkat T . Увеличенное изображение того, что было определено как энемероцитарный макрофаг, показано на рисунке 3A. Эфероцитарные макрофаги были определены как макрофаги, которые охватили ickat T-клетки (указанные черными стрелками), по сравнению с обычными альвеолярными макрофагами (указанными белыми стрелками) (Рисунок 3B). Когда альвеолярный макрофаг эвнероцитоз был оценен с использованием протокола, было статистически значимоеснижение энефроцитарного индекса O 3-экспонированных группы по сравнению с FA управления(Рисунок 3B, C). Эти данныепоказывают, что O 3-индуцированное воспаление легких связано со снижением очистки апоптотические клетки, которые могут продлить травмы легких и воспаление.

Figure 1
Рисунок 1: O3 воздействие вызывает воспаление легких и травмы. C57BL/6J самки мышей подверглись воздействию фильтрованного воздуха (FA) или 1 промилле O3 для 3 ч. 24 ч после воздействия, мыши были некропсии для анализа легочного воспаления и травмы (n No 6 в группе). (A) Бронхоальвеолярная лаважная (BAL) дифференциалы клеток были рассчитаны, затем эпителиальные (эпи), эозинофилы (эос), лимфоциты (лимфа), макрофаги (МЗ) и нейтрофилы (ПМН) были идентифицированы по крайней мере с 200 клеток, подсчитанных с каждого слайда. (B) Репрезентативное изображение сотовых дифференцианов. (C) Всего белка в жидкости BAL. Данные выражаются в виде индекса SEM (Зп злт; 0,01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Подтверждение УФ индуцированного апоптоза в клетках Jurkat T. Клетки Jurkat T подверглись воздействию УФ-излучения (60 мДж/см2)с помощью УФ-кросслинкера (модель 1800). После воздействия УФ-излучения, Юркат Т-клетки были инкубированы при 37 кв с 5% CO2 на 4 ч. После инкубации, юркат Т-клетки были окрашены аннексией V и пропидий йодид (PI), а апоптоз был оценен цитометрией потока. Ранние апоптотические, поздние апоптотические и некротические клетки идентифицируются как аннексия V/PI-, приложениеV/PI, приложение V-/PI, соответственно. Представитель потока цитометрии рассеяния участков (с 10000 зарегистрированных событий) из (A) неэкспонированных юркат Т-клеток и (B) УФ-экспонированных Юркат Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: O3 воздействия уменьшает альвеолярный макрофаг энефроцитоз. C57BL/6J самки мышей подверглись воздействию фильтрованного воздуха (FA) или 1 промилле O3 для 3 ч. 24 ч после экспозиции, мыши были ротогарингеально привиты примерно 5 х 106 апоптотические клетки Jurkat T. 1,5 ч после зависания была выполнена бронхоальвеолярная лаважка (BAL), а энемероцитарный индекс был рассчитан в макрофагах BAL по световой микроскопии после подсчета 200 макрофагов (n - 11 на группу). (A) Представитель изображение энероцитарного макрофага. (B) Идентификация альвеолярных макрофагов (белые стрелы) и энероцитарного макрофаг (черные стрелы) после FA или O3 воздействия. (C) Расчет энероцитарного индекса после воздействия FA или O3 (зп злт; 0.0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Субоптимальный апоптоз юркат Т-клеток с использованием 350 нм матовые луковицы. Клетки Jurkat T облучались с помощью УФ-кросслинкера в течение 10 мин и инкубировали при 37 градусах Цельсия при 5% CO2 на 1 ч. После воздействия УФ-излучения, Юркат Т-клетки были инкубированы при 37 кв с 5% CO2 на 4 ч. После инкубации, юркат Т-клетки были окрашены аннексией V и пропидий йодид (PI), затем апоптоз был оценен цитометрией потока. Ранние апоптотические, поздние апоптотические и некротические клетки идентифицируются как аннексия V/PI-, приложениеV/PI, и приложение V-/PI, соответственно. Показаны представительные участки цитометрии потока (с 10 000 зарегистрированных событий) УФ-экспонированных ячеек Jurkat T с 350 нм лампами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эффероцитоз является противовоспалительным процессом, в котором макрофаги очистить апоптотические клетки и мусор, а также производить несколько противовоспалительных посредников9,10,11,12,16 ,18. Несколько моделей эвнероцитоза дали представление о том, как макрофаг является критической клеткой в разрешении воспаления6,7. В последнее время прогрессирование хронических заболеваний легких было связано с дефектами в эвнероцитоз евтероцитоз8,9,15,16,17. Однако в настоящее время неясно, приводит ли воздействие загрязнителей воздуха, таких как O3, к дефектам в эвнероцитозах. Этот протокол позволяет оценить альвеолярный макрофаг эпреноцитоз после воздействия O3. Он также количественно efferocytosis in vivo с помощью световой микроскопии и позволяет измерения эвнероцитоза в контексте микросреды легких, без манипуляций ex vivo или дорогих флуоресцентных красителей. Хотя этот протокол выполняется в контексте воздействия O3, несколько моделей воспаления легких и травмы могут быть использованы с этим протоколом для оценки альвеолярного макрофафага эпрероцитоза.

Преимуществами этого метода перед существующими методами являются его способность анализировать альвеолярные макрофаги в контексте физиологической среды. Анализ ex vivo альвеолярных макрофагов включает покрытие и инкубацию апоптотические клетки. Покрытие альвеолярных макрофагов может вызвать как физиологические, так и геномные изменения, которые могут изменить эффоцитоз28,29,30. Кроме того, в легких, альвеолярные макрофаги существуют в микроокружении, которое содержит сурфактант и компоненты жидкости подкладка легких, которые, как известно, влияет на функцию макрофага31,32,33, 34,35. Наш метод позволяет измерения энефроцитоза в легких без каких-либо манипуляций ex vivo, что более физиологически актуально. Будущие применения этого протокола могут привести к более углубленным исследованиям о том, как микросреда легких может изменить альвеолярный эпрероцитоз макрофага.

Важнейшим компонентом этого протокола является генерация апоптотарных клеток для оценки альвеолярного эффоцитоза макрофага. Это включает в себя оптимизацию правильного уровня воздействия УФ, чтобы вызвать апоптоз, а не некроз. Наш протокол использует уф-кросслинкер с 254 нм лампы волнеи и уровень экспозиции 60 мДж /см2. Выбор УФ-лампы имеют решающее значение в производстве апоптоза, а не некроза. 350 нм УФ-лампы отлично подходят для протеиновой мембраны перекрестной связи и стерилизации, но не вызывают апоптоза35,36,37. Пример точечного участка клеток Jurkat T, подвергающихся воздействию 60 мДж/см2 с 350 нм луковиц, показан на рисунке 4 со значительным увеличением поздних апоптотических и некротических клеток. Кроме того, протокол использует 4 ч инкубационного воздействия после УФ-облучения. Для оптимизации этой части протокола мы ранее изучили различные инкубационные сроки и обнаружили, что 1,5 и 2 ч инкубационного послеэкспозиции только дали около 40% апоптоза, с энероцитарным индексом менее 5% (данные не показаны). Основываясь на современной литературе, всего апоптотических клеток в 70%-80% достаточно для измерения эффоцитоза38.

Ограничением этого протокола является то, что он исследует эмероцитную реакцию всех макрофагов в воздушном пространстве после воздействия FA или O3 и не отличает макрофаги резидентов тканей от набранных макрофагов. Макрофаг, называемый альвеолярным макрофагом, происходит от печени плода, в то время как завербованные макрофаги происходят из кровеносного эмбрионального происхождения. После травмы, легкие могут иметь очень неоднородные макрофаг населения с уникальной генетикой и выражением маркеров поверхности клеток28,29,30,31,32, 33,34,35. Известно, что иммунологическая реакция и функция этих популяций макрофагов различны; Однако, недавние исследования показали, что ткани резидентов макрофаг имеют большую энероцитарную реакцию по сравнению с набранных макрофагов29,30,31. Определение энемероцитарной реакции макрофагов резидентов тканей против набранных макрофагов можно оценить с помощью текущего протокола; однако популяции макрофагов должны быть очищены FACS и покрыты на слайдах для анализа. Кроме того, этот протокол оценивает альвеолярную макрофагную энероцитетную функцию в одном штамме инбредных, коммерчески доступных мышей. Ранее сообщалось, что различные штаммы мышей показывают различные реакции на воздействие O3, в том числе воспаление легких39,40. Таким образом, могут быть различия в альвеолярных макрофаг эффоцитоз на основе штамма исследуются. Это переменная, которая должна быть рассмотрена при выполнении этого in vivo асссе.

В заключение, описанный выше протокол позволяет оценить альвеолярный макрофег эпрероцитоз in vivo. Этот протокол является экономически эффективным и простым, что делает его анализ, который может быть широко использован. Кроме того, этот метод может быть применен к многочисленным моделям травмлегких и / или воспаление, чтобы увеличить понимание того, как различные легочные оскорбления могут изменить макрофаг эпреноцитоза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgments

Это исследование финансируется Институтом воздействия на здоровье Уолтера А. Розенблита премии и NIEHS R01ES028829 (к K. M. G). Мы хотели бы поблагодарить д-р Дайан Уолтерс (Департамент физиологии, ECU) за ее помощь в получении репрезентативных изображений альвеолярных макрофагов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Puttur, F., Gregory, L. G., Lloyd, C. M. Airway macrophages as the guardians of tissue repair in the lung. Immunology and Cell Biology. , (2019).
  2. Gregoire, M., et al. Impaired efferocytosis and neutrophil extracellular trap clearance by macrophages in ARDS. European Respiratory Journal. 52 (2), (2018).
  3. Fan, E. K. Y., Fan, J. Regulation of alveolar macrophage death in acute lung inflammation. Respiratory Research. 19 (1), 50 (2018).
  4. Michlewska, S., McColl, A., Rossi, A. G., Megson, I. L., Dransfield, I. Clearance of dying cells and autoimmunity. Autoimmunity. 40 (4), 267-273 (2007).
  5. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Seminars in Immunopathology. 38 (4), 461-469 (2016).
  6. Donnelly, L. E., Barnes, P. J. Defective phagocytosis in airways disease. Chest. 141 (4), 1055-1062 (2012).
  7. Morimoto, K., Janssen, W. J., Terada, M. Defective efferocytosis by alveolar macrophages in IPF patients. Respiratory Medicine. 106 (12), 1800-1803 (2012).
  8. Vandivier, R. W., et al. Dysfunctional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibits phagocytosis of apoptotic cells with proinflammatory consequences. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 297 (4), L677-L686 (2009).
  9. Grabiec, A. M., et al. Diminished airway macrophage expression of the Axl receptor tyrosine kinase is associated with defective efferocytosis in asthma. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 1144-1146 (2017).
  10. Chen, W., Frank, M. E., Jin, W., Wahl, S. M. TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu. Immunity. 14 (6), 715-725 (2001).
  11. Gao, Y., Herndon, J. M., Zhang, H., Griffith, T. S., Ferguson, T. A. Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis. Journal of Experimental Medicine. 188 (5), 887-896 (1998).
  12. O'Brien, B. A., Fieldus, W. E., Field, C. J., Finegood, D. T. Clearance of apoptotic beta-cells is reduced in neonatal autoimmune diabetes-prone rats. Cell Death and Differentiation. 9 (4), 457-464 (2002).
  13. Shen, Z. X., et al. Mineralocorticoid Receptor Deficiency in Macrophages Inhibits Atherosclerosis by Affecting Foam Cell Formation and Efferocytosis. Journal of Biological Chemistry. 292 (3), 925-935 (2017).
  14. Allard, B., Panariti, A., Martin, J. G. Alveolar Macrophages in the Resolution of Inflammation, Tissue Repair, and Tolerance to Infection. Frontiers in Immunology. 9, 1777 (2018).
  15. Hamon, R., et al. Bushfire smoke is pro-inflammatory and suppresses macrophage phagocytic function. Science Reports. 8 (1), 13424 (2018).
  16. Angsana, J., Chen, J., Liu, L., Haller, C. A., Chaikof, E. L. Efferocytosis as a regulator of macrophage chemokine receptor expression and polarization. European Journal of Immunology. 46 (7), 1592-1599 (2016).
  17. Karaji, N., Sattentau, Q. J. Efferocytosis of Pathogen-Infected Cells. Frontiers in Immunology. 8, 1863 (2017).
  18. Brouckaert, G., et al. Phagocytosis of necrotic cells by macrophages is phosphatidylserine dependent and does not induce inflammatory cytokine production. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1089-1100 (2004).
  19. Gonzalez-Guevara, E., et al. Exposure to ozone induces a systemic inflammatory response: possible source of the neurological alterations induced by this gas. Inhalation Toxicology. 26 (8), 485-491 (2014).
  20. Robertson, S., et al. CD36 mediates endothelial dysfunction downstream of circulating factors induced by O3 exposure. Toxicological Sciences. 134 (2), 304-311 (2013).
  21. Kilburg-Basnyat, B., et al. Specialized Pro-Resolving Lipid Mediators Regulate Ozone-Induced Pulmonary and Systemic Inflammation. Toxicological Sciences. 163 (2), 466-477 (2018).
  22. Jakab, G. J., Spannhake, E. W., Canning, B. J., Kleeberger, S. R., Gilmour, M. I. The effects of ozone on immune function. Environ Health Perspect. 103 Suppl 2, 77-89 (1995).
  23. Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
  24. Nayak, D. K., Mendez, O., Bowen, S., Mohanakumar, T. Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages. Journal of Visualized Experiments. 10 (134), (2018).
  25. Tao, H., et al. Macrophage SR-BI mediates efferocytosis via Src/PI3K/Rac1 signaling and reduces atherosclerotic lesion necrosis. Journal of Lipid Research. 56 (8), 1449-1460 (2015).
  26. Coe, L. M., et al. FGF-23 is a negative regulator of prenatal and postnatal erythropoiesis. Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9795-9810 (2014).
  27. Yong, W. K., Abd Malek, S. N. Xanthohumol induces growth inhibition and apoptosis in ca ski human cervical cancer cells. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. , 921306 (2015).
  28. Van de Laar, L., et al. Yolk Sac Macrophages, Fetal Liver, and Adult Monocytes Can Colonize an Empty Niche and Develop into Functional Tissue-Resident Macrophages. Immunity. 44 (4), 755-768 (2016).
  29. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  30. Beattie, L., et al. Bone marrow-derived and resident liver macrophages display unique transcriptomic signatures but similar biological functions. Journal of Hepatology. 65 (4), 758-768 (2016).
  31. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. , (2019).
  32. Crowther, J. E., et al. Pulmonary surfactant protein a inhibits macrophage reactive oxygen intermediate production in response to stimuli by reducing NADPH oxidase activity. Journal of Immunology. 172 (11), 6866-6874 (2004).
  33. Silveyra, P., Floros, J. Genetic variant associations of human SP-A and SP-D with acute and chronic lung injury. Frontiers in Bioscience. 17, 407-429 (2012).
  34. Schagat, T. L., Wofford, J. A., Wright, J. R. Surfactant protein A enhances alveolar macrophage phagocytosis of apoptotic neutrophils. Journal of Immunology. 166 (4), 2727-2733 (2001).
  35. Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
  36. Nebbioso, A., et al. Time-resolved analysis of DNA-protein interactions in living cells by UV laser pulses. Scientific Reports. 7 (1), 11725 (2017).
  37. Novak, Z., et al. Efficacy of different UV-emitting light sources in the induction of T-cell apoptosis. Photochemistry and Photobiology. 79 (5), 434-439 (2004).
  38. Park, Y. J., et al. PAI-1 inhibits neutrophil efferocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11784-11789 (2008).
  39. Kleeberger, S. R., Reddy, S., Zhang, L. Y., Jedlicka, A. E. Genetic susceptibility to ozone-induced lung hyperpermeability: role of toll-like receptor 4. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 22 (5), 620-627 (2000).
  40. Wesselkamper, S. C., Chen, L. C., Kleeberger, S. R., Gordon, T. Genetic variability in the development of pulmonary tolerance to inhaled pollutants in inbred mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281 (5), L1200-L1209 (2001).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 152 загрязнение воздуха озон легкие воспаление альвеолярный макрофаг эпрероцитоз
В Vivo Оценка Альвеолярного макрофажа Эффероцитоз после воздействия озона
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hodge, M. X., Reece, S. W.,… More

Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter