Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hemogena omprogrammering av humana fibroblaster genom påtvingat uttryck av transkriptionsfaktorer

Published: November 4, 2019 doi: 10.3791/60112
Automatic Translation
1,2,3, 3, 4, 5,6, 1,2,3
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Lund Stem Cell Center, Lund University, 2Wallenberg Center for Molecular, Lund University, 3Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 4Skolkovo Institute of Science and Technology, 5Department of Cell, Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta protokoll visar induktion av en hemogena program i human dermal fibroblaster genom påtvingat uttryck av transkriptionsfaktorerna GATA2, GFI1B och FOS för att generera hematopoietiska Stem och progenitorceller.

Abstract

De cellulära och molekylära mekanismerna bakom specificering av humana hematopoetiska stamceller (HSCs) förblir svårfångade. Strategier för att recapitulate mänskliga HSC uppkomst in vitro krävs för att övervinna begränsningar i att studera denna komplexa utvecklingsprocess. Här, vi beskriver ett protokoll för att generera hematopoietiska Stem och stamceller-liknande celler från Human dermal fibroblaster anställa en direkt cell omprogrammering metod. Dessa celler transitering genom en hemogenic mellanliggande cell-typ, som liknar endothelial-till-hematopoietisk övergång (EHT) karakteristiska för HSC specifikation. Fibroblaster omprogrammerades till hemogenic celler via transduktion med GATA2, GFI1B och FOS transkriptionsfaktorer. Denna kombination av tre faktorer inducerade morfologiska förändringar, uttryck för hemogena och hematopoietiska markörer och dynamiska EHT transkriptionella program. Omprogrammerade celler genererar hematopoietisk avkomma och återbefolkar immunbrist möss i tre månader. Detta protokoll kan anpassas mot den mekanistiska dissektion av Human EHT processen som exemplifieras här genom att definiera GATA2 mål under de tidiga faserna av omprogrammering. Sålunda, mänskliga hemogena omprogrammering ger en enkel och tractable metod för att identifiera nya markörer och regulatorer av mänskliga HSC uppkomst. I framtiden kan trogen induktion av hemogena öde i fibroblaster leda till generering av patientspecifika HSCs för transplantation.

Introduction

Slutgiltiga hematopoietiska stamceller och stamceller (hspcs) uppstår i aorta-gonad-mesonephros (AGM) region och moderkakan från endoteliala prekursorer med hemogena kapacitet, genom en endotelial-till-hematopoietisk övergång (EHT)1, 2. Hemogena prekursorer (HPs) uttrycker både endoteliala och hematopoietiska markörer, men deras exakta identifiering förblir svårfångade, särskilt i det mänskliga systemet. Trots att en relativt bevarad process hos däggdjur, hematopoietisk stamcells utveckling (HSC) fortfarande skiljer sig avsevärt mellan människor och musmodeller3,4. Därför behövs in vitro -metoder för att rekapitulera mänsklig HSC-utveckling.

Differentiering av pluripotenta stamceller (PSC) till HSCs, även lovande, har uppnått begränsad framgång under de senaste 20 åren, främst på grund av de tillgängliga differentierings protokollen, vilket resulterar i primitiva hematopoietiska progenitorer med dålig engraftelse förmåga5,6,7. Alternativt har direkta cell omprogrammering metoder tillämpats för att generera HSPC-liknande celler från flera celltyper, med hjälp av transkriptionsfaktorer (TFS)8,9. I synnerhet överuttryck av tre TFs, Gata2, Gfi1b och cFos, konverterade mus embryonala fibroblaster till HSPCs genom en HP-intermediär med en definierad fenotyp (Prom1 + SCA-1 + CD34 + CD45-)10. Denna process liknade EHT som förekommer i embryot och moderkakan, under specificering av definitiva hematopoies. Denna fenotyp möjliggjorde identifiering och isolering av en population av HPs i mus moderkakan som efter kortsiktig kultur och notch aktivering genererade seriellt transplanable hscs11.

Hittills har ingen fenotyp fastställts som särskiljer mänskliga hscs från deras föregångare, men vissa molekyler är kända för att uttryckas i framväxande hscs. integrin alpha 6 (ITGA6 eller CD49f) är starkt uttryckt i långsiktiga återinplantering hscs, den mest omogen celler i HSC-facket12, och angiotensinkonverterande ENZYM (ACE eller CD143) finns i CD34 negativa hematopoietiska prekursorer i embryonala blodbildande vävnader13.

Nyligen har vi visat att mänskliga versioner av de tre TFs, GATA2, FOS och GFI1B programmera Human dermal fibroblaster (HDFs) i HPs med kortsiktig inympningsförmåga kapacitet14. I de inledande faserna av omprogrammering, GATA2 engagerar öppna kromatin och rekryterar GFI1B och FOS för att förtrycka fibroblast gener och aktivera endoteliala och hematopoietiska gener. Inducerad celler högt uttryckt CD49f och ACE, och innehöll en liten andel av celler som uttrycker HSPC markör CD34. Den CD9 genen, som uttrycks i HSCs15 och är viktig för HSC homing16, visades vara ett direkt mål för GATA2 och bland de mest upp-reglerade gener i omprogrammerade celler14. CD9 kan därför utgöra en ytterligare markör för HPs av humant definitiv hematopoies.

I detta protokoll beskriver vi generering av HSPC-liknande celler från humana fibroblaster genom påtvingat uttryck av GATA2, GFI1B och FOS, samt en anpassad metod för analys av kromatin immunoprecipitation (ChIP)-sekvensering (SEQ) vid uppkomsten av Omprogrammering. TFs kodats i en doxycyklin (DOX)-inducerbar lentiviral vektor (pFUW-tetO) som innehåller en tetracyklinrespons element (TRE) och en minimal CMV promotor, och var omvandlades tillsammans med en konstitutiv vektor som innehåller omvänd tetracyklin transactivator protein (pFUW-M2rtTA). När DOX (analog av tetracyklin) tillsätts efter transduktion binder den till rtTA-proteinet som samverkar med den TRE som medger TF-transkription (tet-on-systemet). Proceduren kräver 25 dagar att slutföra. För chip-SEQ experiment, var HDFS sensorik med taggade versioner av GATA2 (pfuw-Teto-3xflag-GATA2) och GFI1B (PLV-Teto-ha-GFI1B), plus pfuw-Teto-FOS och TF bindnings platser analyserades två dagar efter DOX tillskott.

I slutändan, hemogena omprogrammering av mänskliga fibroblaster ger en in vitro -tractable system för att studera mekanismerna bakom mänsklig utveckling hematopoies och en potentiell källa till patientspecifika HSPCs för framtida klinisk tillämpning.

Protocol

Detta protokoll har utförts i enlighet med Lunds universitets riktlinjer för mänskliga forskningsetiska kommittén och bör ske enligt individuella institutionella riktlinjer.

1. beredning av reagens

  1. För Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM)/20% foster bovint serum (FBS), blanda hög glukos DMEM som innehåller natriumpyruvat med 20% FBS, 1% penicillin-streptomycin (penna/STREP), 1% L-glutamin, 1% icke-essentiella aminosyror och 10-4-M 2- merkaptoetanol.
  2. För komplett DMEM, blanda hög glukos DMEM innehållande natriumpyruvat med 10% FBS, 1% penna/STREP och 1% L-glutamin.
  3. För hematopoietiska medium, blanda hematopoietiska medium (tabell över material) med 10-6 M hydrokortison och 1% penna/STREP.
  4. Använd fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium eller magnesium.

2. Human dermal fibroblast isolering

Anmärkning: HDFs kan köpas från certifierade leverantörer (tabell över material). I så fall, expandera fibroblaster och använda dem direkt i omprogrammering experiment (avsnitt 4). Alternativt kan HDFs isoleras från givare. Om fibroblaster isoleras från olika givare, hålla proverna åtskilda från varandra i alla steg i protokollet. Etikett plattor/brunnar och uppsamlings rör med identifikationsnumret för varje givare.

  1. Få HDFs från 3 mm runda hudpunsch biopsier utförs av kvalificerade läkare.
  2. Coat tre brunnar av en vävnad kultur-behandlade 6-brunn tallrik med 500 μL av 0,1% gelatin och inkubera i 20 min vid 37 ° c.
  3. Aspirera resterande gelatinlösning och tillsätt 750 μL av DMEM/20% FBS till varje brunn. Hela ytan av brunnen bör täckas med medel.
  4. Tillsätt 1,5 ml DMEM/20% FBS på insidan av en steril 100 mm petriskål och fördela dropparna med hjälp av en serologiska pipett på 5 ml.
  5. Placera hudbiopsi i mediet på locket med steriliserade pinps.
  6. Dissekera hudbiopsi i nio identiska avsnitt, med hjälp av en steriliserad skalpell att hålla biopsi på plats och en andra skalpell att skära.
  7. Placera tre biopsi bitar per brunn med spetsiga pinvor. Se till att bitarna fäster på botten av brunnen.
  8. Lägg en 22 mm täckslip ovanpå bitarna och tillämpa vissa tryck.
  9. Inkubera plattan vid 37 ° c, 5% CO2, för en vecka. Kontrollera celler dagligen och tillsätt 200 μL av DMEM/20% FBS varje 2 dagar för att ersätta avdunstade mediet.
  10. Efter en vecka, tillsätt upp till 2 mL DMEM/20% FBS och ersätt medium varje 2 − 3 dagar.
  11. Passage celler vid 1:4 förhållandet när brunnar är konflytande (ca 4 − 8 veckor).
    1. Förbered 0,1% gelatin belagd vävnad kultur-behandlade 6-well tallrikar.
    2. Aspirera medium från brunnar vid 80% confluency och tvätta en gång med 1 mL PBS.
    3. Ta bort täckslip med sterila Pinkett och placera täckplattan i en ny brunn på en 6-brunn tallrik, med vävnaden Sidan upp.
      Anmärkning: Celler som förblev knutna till täckslip kommer också att skördas.
    4. Tillsätt 500 μL dissociationslösning (tabell över material) per brunn (inklusive brunnar med täckglas) och inkubera vid 37 ° c, 5% Co2 för 5 − 10 min. Kontrollera när cellerna börjar stiga från botten av brunnen och inaktivera dissociationslösningen genom att lägga till 500 μL av DMEM/20% FBS till varje brunn.
    5. Samla fibroblaster från alla brunnar i ett 15 mL koniskt rör. Lägg till extra medium till brunnarna för att samla de återstående cellerna. Centrifugera röret vid 350 x g i 5 min.
    6. Under tiden, tillsätt 500 μL av DMEM/20% FBS till varje brunn av tidigare gelatin belagda plattor.
    7. Aspirate medium och Omsuspendera fibroblaster i 6 mL DMEM/20% FBS.
    8. Tillsätt 500 μL fibroblast suspension till varje brunn (två 6-brunn plattor per prov/givare totalt). Inkubera celler över natten vid 37 ° c, 5% CO2.
  12. På nästa dag, tillsätt 1 mL DMEM/20% FBS till varje brunn. Byt ut mediet mot 2 mL DMEM/20% FBS varje 2 − 3 dagar tills brunnarna är 80% confluent.
  13. Upprepa avsnitt 2,11 för tre konflytande brunnar tills tredje passage har uppnåtts.
  14. Frysa fibroblaster från konfluenta brunnar (passager 1 och 3).
    1. Sug upp mediet från brunnarna och tvätta en gång med 1 mL PBS.
    2. Dissociera och samla fibroblaster som beskrivs i steg 2.11.4 och 2.11.5.
    3. Räkna celler med en hemocytometern och centrifugera röret vid 350 x g i 5 min.
    4. Efter centrifugering, aspirera medium och Omsuspendera fibroblaster i FBS med 10% DMSO vid en densitet av 5 x 105 celler/ml.
    5. Tillsätt 1 mL av cellsuspensionen per kryovial och frys celler över natten vid-80 ° c med frys behållare. Flytta injektionsflaskor till-150 ° c (flytande kväve) för långtidsförvaring.

3. lentiviral produktion

  1. Odla HEK293T celler i en 100 mm vävnadskultur-behandlad maträtt med 10 mL komplett DMEM, vid 37 ° c, 5% CO2, tills confluency uppnås.
  2. På dagen före transfektion, aspirera medium och tvätta skålen försiktigt med 5 mL PBS.
  3. Efter att ha avlägsnat PBS, tillsätt 1,5 mL dissociationslösning och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för 5 − 10 min för att separera cellerna från skålen.
    Anmärkning: Det rekommenderas att värma både PBS och dissociation lösning innan du använder, så att cellerna inte drabbas av en termisk chock.
  4. Inaktivera dissociationslösning med 3 mL komplett DMEM och överför cellsuspensionen till ett 15 mL koniskt rör. Tvätta skålen med 5 mL komplett DMEM för att ta bort kvarvarande fästa celler och överföra denna volym till det koniska 15 mL-röret.
  5. Centrifugera cellsuspension vid 350 x g i 5 min.
  6. Aspirera supernatanten och dela cellpelleten jämnt mellan 6 100 mm vävnadskultur-behandlade rätter i en slutlig volym av 10 mL komplett DMEM per maträtt. Cellerna bör vara cirka 60% konfluenta vid tidpunkten för transfektion.
  7. På nästa dag, transfect celler med plasmid blandar enligt följande:
    Anmärkning:     denna del av protokollet beskriver produktionen av lentivirus i 1 100 mm vävnad kultur-behandlade skålen per plasmid mix. För att få högre volymer av lentiviral supernatanten för koncentration, Använd minst 4 100 mm HEK293T cellkultur rätter per blandning.
    1. I ett 15 mL koniskt rör, tillsätt 10 μg av de tre överföringsplasmiderna tillsammans: 3,33 μg pFUW-tetO-GATA2 (Addgene plasmid #125028)14, 3,33 μg Pfuw-TETO-GFI1B (addgene #125597)14 och 3,33 μg Pfuw-Teto-FOS (addgene #125598)14, plus 10 μg av 2nd generation psPAX2 förpackning vektor kodning av gag, pol, Tat och rev gener (addgene #12260) och 5 μg PMD2. G kuvert vektor kodning av VSV-G genen (addgene #12259). Tillsätt vatten upp till 500 μL.
    2. I två nya 15 mL koniska rör tillsätt 10 μg FUW-M2rtTA plasmid (Addgene #20342)17, 10 μg psPAX2 förpacknings vektor och 5 μg PMD2. G kuvert vektor till varje tub. Tillsätt vatten upp till 500 μL. En tub kommer att användas som kontroll.
    3. Till varje tub tillsätt 62,5 μL 2 M CaCl2. Nästa, släppa bubblor i varje blandning med hjälp av en Pasteur Pipettera in i en Pipettera Controller. Medan bubblor bildas, Pipettera 500 μL av n, n-BIS(2-hydroxyethyl) -2-aminoetanesulfonic Acid (bes) buffrad saltlösning (pH 7,1, 25 ° c), med en P1000 pipett, Drop-Wise mot Pasteur Pipettera och på blandningen.
    4. Inkubera rören i rumstemperatur i minst 15 min. Blandningarna kommer att synas något molnigt efter en tid.
  8. Samtidigt aspirera medium från HEK293T cell rätter (passaged dagen innan) och tillsätt 10 mL komplett DMEM utan antibiotika. Var försiktig och tillsätt medel långsamt som HEK293T celler är semi-anhängare.
  9. Fördela varje enskild blandning (ca 1 mL) jämnt och Drop-Wise i separata rätter och inkubera över natten vid 37 ° c, 5% CO2.
  10. Byt ut mediet med 4 mL komplett DMEM, 24 h efter inkubering. Inkubera över natten vid 37 ° c, 5% CO2. Om tillgängligt, inkubera istället vid 32 ° c, 5% CO2, eftersom den reducerade temperaturen kommer att öka halveringstiden för lentivirala partiklar.
  11. Samla supernatanten med lentivirala partiklar tre gånger till ett 50 mL koniskt rör. Blanda inte olika lentivirala partiklar på denna punkt. Varje maträtt kommer att resultera i 12 mL lentiviral supernatant. Fyra rätter av samma viral beredning passar in i 1 50 mL koniskt rör.
    Varning:     utför lentiviral insamling i en biosäkerhetsnivå-2 laboratorium i ett laminärt flöde huva dedikerad för lentiviral arbete och plats viral förorenat avfall (rör, tips, rätter) i en lämplig behållare för biologiskt farliga material.
    1. Gör den första samlingen 16 h efter den sista inkuberingen och tillsätt 4 mL komplett DMEM. Inkubera vid 37 ° c, 5% CO2.
    2. Gör den andra kollektionen 8 h efter den första till samma tub, tillsätt 4 mL komplett DMEM och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2.
    3. Gör den tredje samlingen 16 h efter den andra till samma rör och kasta disken.
      Anmärkning: Förvara lentivirala samman supernatanterna vid 4 ° c efter varje kollektion.
  12. Filtrera varje lentiviral supernatanten med ett 0,45 μm Low-proteinbindnings filter med ett cellulosaacetat membran (tabell över material) till ett rent rör.
  13. Tillsätt maximalt 15 mL filtrerat supernatanten till en centrifugalfilterenhet med regenererad cellulosa membran (tabell över material) och snurra på 4 000 x g i 25 min, vid 4 ° c. Kassera genomflöde. En trögflytande vätska som innehåller lentivirus kommer att finnas kvar i filterenheten.
  14. Upprepa steg 3,13 genom att tillsätta 15 mL supernatanten ovanpå filterenheten, tills det inte finns någon mer lentiviral supernatanten kvar.
    Anmärkning: När det bara finns några milliliter supernatanten att koncentrera sig, minska spinn tiden till 10 min. Om det fortfarande finns extra vätska (icke-trögflytande) på filtret, Centrifugera i ytterligare 10 min.
  15. Gör alikvoter (50 − 200 μL beroende på den ursprungliga supernatanten volymen) av varje typ av koncentrerade lentivirus och lagra vid-80 ° c för långtidslagring (1 − 2 år) eller vid 4 ° c för korttidsförvaring (1 − 2 veckor).
    Anmärkning: Koncentrerade eller icke-koncentrerade lentivirus kan också användas färska. Inte re-Freeze och Tina eftersom detta resulterar i minskad titer.

4. hemogenic omprogrammering

Anmärkning: Använd HDFs med ett passage nummer på tre (P3) eller högre (fram till P10) för att utföra omprogrammering av experiment.

  1. Täck en 100 mm vävnadskultur-behandlad maträtt med 5 mL 0,1% gelatin och inkubera vid 37 ° c i 20 min. Aspirera resterande gelatinlösning.
  2. Tina en fibroblast injektionsflaska och plattceller i 0,1% gelatin-belagd maträtt. Inkubera över natten vid 37 ° c, 5% CO2. Om det behövs, expandera fibroblaster för en längre tid tills önskad passage och confluency uppnås.
  3. Coat en 6-brunn vävnad kultur-behandlade plattan med 500 μL av 0,1% gelatin lösning och inkubera vid 37 ° c i 20 min. ta bort extra gelatin.
  4. Platthdfs med en densitet av 150 000 celler per platta (25 000 celler per brunn) i 2 mL komplett DMEM per brunn. Inkubera över natten vid 37 ° c, 5% CO2, för att tillåta cell infästning.
  5. Byt ut medlet med 2 mL komplett DMEM plus 8 μg/mL polybrene. Förbered en 1:1 ratio blandning av pool-producerade TF upphov och M2rtTA i en ny microcentrifug Tube.
    Anmärkning: I detta protokoll, pool-produktion av lentivirus för de tre TFs utförs, som i författarnas händer, resulterar i högre omprogrammering effektivitet. Alternativt, det föreslås att utföra en titrering av de enskilda lentivirala partiklarna genom qPCR18, på en standard cellinjer. Detta kommer att användas för att definiera volymen av enskilda virus som krävs för att möta en mångfald av infektion (MOI) optimal för co-Transduction och hemogenic omprogrammering.
  6. Fördela 10 till 100 μL av lentiviral blandning per brunn, till transduce HDFs. Detta är dag-2 av omprogrammering.
    Anmärkning: Definiera den optimala volymen av lentiviral mix för effektiv omprogrammering, utan att kompromissa med cellernas lönsamhet, kräver optimering (se kompletterande figur 1 för mer information). HDFs med mer än 7 passager kan kräva högre volymer av virus än celler med lägre passager.
  7. Efter 16 h av inkubering, ta bort virus och tillsätt komplett DMEM. Låt cellerna återhämta sig i 6 − 8 timmar.
  8. Efter återhämtning, aspirera medium och tillsätt 2 mL komplett DMEM med 8 μg/mL polybrene.
  9. Gör en andra transduktion enligt beskrivningen i steg 4,6 och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för 16 h. Detta är dag-1 av omprogrammering. Den lentivirala blandningen kan förberedas på dag-2 för båda transduktionerna och förvaras vid 4 ° c.
  10. På nästa dag, ta bort virus och tillsätt komplett DMEM kompletteras med 1 μg/mL DOX. Detta är dag 0 av omprogrammering. Inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för 48 h.
  11. På dag 2 av omprogrammering, dela varje brunn på 1:2 ratio.
    1. Sug upp medel och tvätta celler med 1 mL PBS.
    2. Sug upp PBS och separera celler med 500 μL dissociationslösning. Inkubera 5 − 10 min vid 37 ° c, 5% CO2.
    3. Inaktivera dissociationslösningen med 1 mL komplett DMEM och samla in celler i ett koniskt rör. Centrifugera vid 350 x g i 5 min.
    4. Omsuspendera pelleten i hematopoietiskt medium (se steg 1,3), kompletterad med 1 μg/mL DOX, och plattceller till nya vävnadskulturer-behandlade 6-well-plattor belagda med 0,1% gelatin till en slutlig volym på 2 mL per brunn.
  12. Ändra medium (hematopoietiska medium plus DOX) två gånger i veckan under den tid som omprogrammering kulturer (25 dagar).
  13. Analysera resulterande omprogrammerade celler vid olika tidpunkter genom brightfield eller fluorescens mikroskopi (se kompletterande figur 2), flödescytometri, bulk-och enkelcellig RNA-sekvensering och transplantations analyser för förvärv av hematopoietisk morfologi, förekomst av endoteliala och hematopoietiska markörer, förvärv av endotelial/hematopoietisk gen uttrycks profil och regenereringskapacitet14.

5. optimering av fibroblast expansion för ChIP-SEQ analys vid uppkomsten av Hemogenic omprogrammering

  1. Platta 300 000 HDFs (< P8) i 0,1% gelatin belagd vävnad kultur-behandlade 6-well plattor med komplett DMEM till en slutlig volym av 2 mL per brunn. Inkubera över natten vid 37 ° c, 5% CO2.
  2. På följande dag, Ersätt medium med komplett DMEM kompletteras med 8 μg/mL polybrene.
  3. Transduce celler med individuella faktorer: pFUW-tetO-FOS14, PLV-TETO-ha-GFI1B (addgene #125599)14 och Pfuw-Teto-3xflag-GATA2 (addgene #125600)14 eller med en pool av de tre faktorerna, plus FUW-M2rtTA på 1:1 förhållande. Använd 10 − 20 μL totalt virus (individuell TF + M2rtTA eller tre TFs + M2rtTA). Inkubera celler över natten vid 37 ° c, 5% CO2.
    Anmärkning: Det rekommenderas att använda tolv 6-well plattor per skick (för varje enskild TF och de tre kombinerade TFs).
  4. Ta bort upphov och tillsätt komplett DMEM 16 h efter den första Transduction. Låt cellerna återhämta sig för 6 − 8 h.
  5. Transduce celler en andra gång med samma mängd virus per tillstånd och inkubera vid 37 ° c, 5% CO2.
  6. Nästa dag ta bort virus och lägga till kompletta DMEM. Inkubera vid 37 ° c, 5% CO2 för 24 h.
  7. Re-plattan varje brunn i en 0,1% gelatin belagd vävnad kultur-behandlade 100 mm skålen med komplett DMEM till en slutlig volym av 10 mL per maträtt. Detta motsvarar ungefär en 1:6 passage.
  8. Låt cellerna växa i 6 dagar vid 37 ° c, 5% CO2.
  9. På dag 6 efter omplätering, aspirera medium och tillsätt komplett DMEM med 1 μg/mL DOX. Inkubera celler vid 37 ° c, 5% CO2 för 2 dagar.
  10. Samla fibroblaster och analysera genomiska bindningsställen av de tre TFS sensorik individuellt eller i kombination, med chip-SEQ 2 dagar efter DOX tillskott14.
    Anmärkning: De slutliga 72 100 mm-rätterna kommer att innehålla mellan 20 − 50 x 106 celler, tillräckligt för att utföra chip-SEQ-experiment och replikat.

Representative Results

En schematisk representation av metoden för omprogrammering med HDFs illustreras i figur 1A. Fibroblaster förvärvas från kommersiella källor eller samlas in från mänskliga donatorer och expanderat in vitro -tidigare till omprogrammering. Efter plätering, celler är sensorik två gånger med GATA2, GFI1B och FOS (och M2rtTA) lentiviruses, och doxycyklin läggs till dag 0 av omprogrammering. På dag 2, celler är uppdelade och pläterade i hematopoietiska medium tills dag 25 av kulturen. Omprogrammerade celler kan genereras vid olika tidpunkter för flera tillämpningar, inklusive transplantation hos immunsupprimerade möss, encellig RNA-sekvensering (scRNA-SEQ) av renade cellpopulationer (dag 2 osorterade, dag 15 CD49f+ CD34 och dag 25 CD49f+CD34+ celler), samt mikroskopi och flödescytometri analys för CELLYTAN markörer CD49F, CD34, CD9 och CD143. Representativa flödescytometrianalys tomter visar ~ 17% av omprogrammerade celler uttrycker både CD49f och CD9 (figur 1B, vänster panel), efter 25 dagar av omprogrammering. Majoriteten av dubbel positiva celler Express CD143 (~ 86%), och en liten population Express CD34 (0,9%), vilket tyder på en dynamisk hemogenic öde induktion. Dessa markörer aktiveras inte i M2rtTA-omvandlade HDFs-kultiverade i 25 dagar (figur 1B, höger panel). Immunofluorescensbilder bekräftar uttrycket av CD9 och CD143 i anhängare och runda celler, morfologiskt åtskilda från fibroblaster som är negativa för dessa markörer (figur 1C). Human hemogenic kolonier uttrycker också CD49f och CD3414. ScRNA-SEQ-analys av HDFs, dag 2 osorterade celler, och renade omprogrammerade celler dag 15 (CD49f+CD34-) och dag 25 (CD49f+CD34+) visar en stegvis ökning av CD49f, CD9 och CD143 uttryck från dag 2 till dag 25. CD49f och CD9 positiva celler visas först under omprogrammering processen, mellan dag 2 och 15, vilket indikerar att dessa molekyler kan representera markörer för tidig mänsklig hemogenes. CD143-uttrycket börjar upptäckas vid dag 15 och CD34 att uttrycka celler upptäcks endast vid senare tidpunkter (dag 25). CD34+ navelsträngsblod (UCB) celler användes som referens (figur 1D).

Figur 2a beskriver ett modifierat protokoll för att generera tillräckligt antal celler för chip-SEQ-analys i inledningsskedet av hemogenic omprogrammering (dag 2). Först, HDFs är klädd i en densitet två gånger högre än i standardprotokollet (300 000 celler jämfört med 150 000 celler per tallrik). Efter Transduction, varje brunn är re-pläterad i en 100 mm skålen tillåter celler att expandera för 6 dagar före komplettering medium med DOX. Celler analyseras 2 dagar efter tillsats av DOX och därav TF-uttryck. Figur 2B visar genom webb läsar profiler för GATA2 bindning till genomiska reglerings regioner i ITGA6 och ACE när celler Samomvandlas med de tre faktorerna (3tfs) eller GATA2 individuellt. GATA2 binder också till öppna kromatin regioner CD9 och CD34 gener14.

Figure 1
Figur 1: induktion av hemogeniskt öde i human dermal fibroblaster. (A) experimentell strategi för hemogenic omprogrammering av humana dermal fibroblaster (HDFS). Fibroblaster från Skin Punch biopsier samlas in från givare, expanderat och omvandlas med GATA2, GFI1B, FOS och M2rtTA lentiviruses. Doxycyklin (DOX) läggs till kulturen på dag 0 av omprogrammering och celler analyseras vid flera tidpunkter till dag 25. scRNA-SEQ, Single cell RNA-sekvensering. FACS, Fluorescensaktiverad cell sortering. (B) gating strategi som används för att utvärdera uttrycket av hemogenic/hematopoietiska markörer med flödescytometri vid dag 25 efter transduktion med de tre transkriptionsfaktorerna (3tfs). Cytometry tomter visar procent av dubbla positiva celler för CD49f och CD9, gated i levande cellpopulation (DAPI-negativ). Inom den dubbla positiva populationen visas uttrycket CD143 och CD34. HDFS sensorik endast med M2rtTA virus under samma odlingsförhållanden används som kontroll. C) immunofluorescensbilder av dag 25 omprogrammerade kolonier som bekräftar uttrycket av CD9 (övre panelen) och CD143 (nedre panelen). Celler färgas med antikroppar (tabell över material) utspädd 1:100 i PBS/2% FBS med mus serum, inkuberade 20 min vid 37 ° c, 5% Co2, tvättas tre gånger och avbildas i PBS/2% FBS. Fas lutning kontrast. Skalstreck = 50 μm.Dscrna-SEQ-analys av 253 celler vid olika tidpunkter. Uttryck för ITGA6, CD9, ACE och CD34 aktiveras under omprogrammering. Celler samlas in dag 2 (osorterade), dag 15 (CD49f+CD34-) och dag 25 (CD49f+CD34+). HDFs och CD34+ navelsträngsblod (34 + UCB) celler används som referenser. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: expansion av humana dermal fibroblaster för chip-SEQ analys. (A) experimentell strategi som skildrar ett modifierat protokoll för att generera ett stort antal sensorik humana dermal fibroblaster (HDFS) för chip-SEQ vid dag 2 av omprogrammering. 300 000 celler är pläterade i 6-brunnen plattor och sensorik två gånger med individuella faktorer (pfuw-Teto-FOS, PLV-Teto-ha-GFI1B eller pfuw-Teto-3xflag-GATA2) eller en kombination av de tre faktorerna (plus M2rtTA). Efter avlägsnande av virus, fibroblaster utvidgas för sex dagar i 100 mm rätter. Doxycyklin (DOX) tillsätts dag 0 och celler samlas två dagar efter DOX addition. (B) genom webb läsar profiler som belyser GATA2-bindande platser (gråa rutor) vid ITGA6 och ACE loci två dagar efter transduktion med de tre transkriptionsfaktorerna (3TFS) eller med enbart GATA2. Det totala antalet mappade läsningar representeras på y-axeln. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 1
Kompletterande figur 1: definiera en optimerad lentiviral volym för effektiv hemogenic omprogrammering. Ökande volymer av koncentrerade (10 till 100 μL) poolproducerade lentivirala partiklar (3TFs: GATA2, GFI1B och FOS) används för att transduce humant dermal fibroblaster (HDFs), tillsammans med M2rtTA vid ett förhållande av 1:1, följer steg 4.5 − 4.12 av protokollet. Omprogrammerade celler analyseras vid dag 25 för att definiera en optimal volym av transduktion för hemogena omprogrammering, givet av andelen CD49f+CD9+ celler gated in Live-Cells (DAPI-negativ). Cellernas lönsamhet kan bedömas genom att kvantifiera det absoluta antalet levande celler vid dag 25. HDFS-sensorik med M2rtTA (100 μl) används som negativ kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 2
Kompletterande figur 2: morfologi förändringar under hemogena omprogrammering av Human dermal fibroblaster. Human dermal fibroblast (HDF) kulturer avbildas på dagen för den första transduktion (dag-2), när DOX läggs till kulturer (dag 0), två dagar (dag 2) och femton dagar (dag 15) efter DOX tillskott, och vid slutpunkten av experimentet (dag 25). Hemogena kolonier vid dag 15 och 25 är markerade. Skalstreck = 100 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I denna artikel är en metod som beskrivs för att generera hematopoietiska stamceller direkt från mänskliga fibroblaster, som går igenom en HP cell Intermediate, på samma sätt som definitiva HSCs14.

Pool-produktion av lentivirala partiklar kodning GATA2, GFI1B och FOS var att föredra framför individuell produktion, eftersom i våra händer det resulterar i högre omprogrammering effektivitetsvinster (opublicerade data). Lentivirus, som medlemmar i familjen Retroviridae , innehåller normalt två kopior av positiva enkelsträngade RNA19. Den ökade omprogrammeringen effektivitet kan bero på förpackning av två olika transgener i samma lentiviral partikel, vilket resulterar i ökat antal celler Co-transduced med de tre transkriptionsfaktorerna. För att säkerställa detta protokolls framgång är det nödvändigt att transduce HDFs med adekvat mängd virus beroende på cell passage för att uppnå en optimal balans mellan omprogrammering effektivitet och cellernas lönsamhet, som rekommenderas i steg 4,6. Dessutom kan färska icke-koncentrerade virus användas. Det rekommenderas att transduce celler med 0.5-3 mL av 3TFs pool och M2rtTA. Också, celltäthet bör justeras enligt ansökan. 150 000 HDFs per 6-brunn plattan (steg 4,4) förutsatt att den optimala densiteten för att utföra FACS, transplantation och flödescytometri analys av omprogrammerade celler. För ChIP-SEQ-experiment krävdes fler celler från början (steg 5,1). Det är viktigt att kontrollera celler regelbundet för morfologiska förändringar och ersätta hematopoietiska medium två gånger i veckan för att stödja uppkomsten av inducerad hematopoietiska celler. Tillsats av hematopoietiska cytokiner eller co-kultur i matar skikt kan öka omprogrammering effektivitet.

Med denna metod kan vi identifiera nya hematopoietiska markörer som uttrycks dynamiskt under hemogena omprogrammering. CD9, som visades vara upp-reglerad i omprogrammerade celler på transkriptionella nivå14, uttrycks snabbt på cellytan i de inledande faserna av omprogrammering tillsammans med CD49F och CD143, som fungerar som en ny markör för mänskliga HSC-prekursorer. Vi visar också att ITGA6 och ACE är direkta mål för GATA2 under de inledande stadierna av hemogena omprogrammering, förutom CD9 och CD3414, vilket ger en direkt mekanistisk koppling mellan mänskliga hemogenic prekursor fenotyp och GATA2.

En fördel med detta system är bosatt i användningen av relativt homogena fibroblastkulturer. Medan PSCs lätt utökas och upprätthålls in vitro, differentierings protokoll generera heterogena populationer som inkluderar hematopoietiska stamceller, som att dåligt5,6,7. Dessutom finns det en risk för tumorigenes vid transplantation av PSC-derived HSPCs, eftersom odifferentierade gemensamma kontaktpunkter kan fortfarande kvar i kulturen även efter att ha anställande differentiering protokoll. Alternativt till fibroblaster, direkt omprogrammering till HSCs har tillämpats på blodengagerade stamceller20 och endotelceller21. Men, börjar med blodbegränsade stamceller hindrar terapeutisk tillämpning av de resulterande HSCs om patienten bär mutationer som påverkar stam/stamceller hematopoietiska befolkningen22. När det gäller endotelceller, dessa är svårare att få jämfört med fibroblaster, och utgör en mycket heterogena cellpopulation i termer av fenotyp, funktion och struktur, som är organ beroende23. Andra studier har lyckats omprogrammering mus fibroblaster i engraftable hematopoietiska progenitorer24,25 ännu, hittills, inget annat protokoll beskriver generering av HSPC-liknande celler från mänskliga fibroblaster.

Detta tillvägagångssätt, i kombination med farmakologisk hämning, Gene knock-out, eller knock-down tillstånd att definiera enskilda eller kombination av faktorer som krävs för att direkt inducera mänskliga HSCs. användning av metoder för effektiv screening baserad på CRISPR-Cas9 Technologies i HDFs före omprogrammering, representerar en spännande strävan för att definiera nya regulatorer av mänskliga definitiva hematopoies. I framtiden, omprogrammering icke-blodrelaterade mänskliga celltyper såsom fibroblaster kommer att fungera som en plattform för att generera hälsosamma patientanpassade hematopoietiska stamceller för kliniska tillämpningar.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Knut och Alice Wallenbergs stiftelse, medicinska fakulteten vid Lunds universitet och Region Skåne är erkända för generöst finansiellt stöd. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Olle Engkvists stiftelse (194-0694 till Filipe Pereira) och doktors stipendier från Fundação para a Ciência e Tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 till Filipe Pereira, och SFRH/BD/135725/2018 och SFRH/BD/51968/2012 till Rita Alves och Andreia Gomes). Denna studie stöddes också av fonder från NIH och NYSTEM (1R01HL119404 och C32597GG till Kateri A. Moore).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter Corning #430625
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich #M6250
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581 BioLegend #343518
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9 BD Biosciences #557929
BES buffered saline Sigma-Aldrich #14280
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich #449709
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich #UFC903096
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1x) no phenol red Gibco #12604-021
Doxycycline hyclate (DOX) Sigma-Aldrich #D9891
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7 Invitrogen #25-0495-82
FUW-M2rtTA Addgene #20342
Gelatin from Porcine Skin Type A Sigma-Aldrich #G1890
Gibco L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific #25030-024
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher Scientific #11140-035
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100 STEMCELL Technologies #05150
Hexadimethrine bromide (polybrene) Sigma-Aldrich #H9268
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) ScienCell #2320
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) GE Healthcare #SH30243.01
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) GE Healthcare #SV30160.03
HyClone Penicillin Streptomycin 100x Solution (Pen/Strep) GE Healthcare #SV30010
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS) GE Healthcare #SH30256.01 
Hydrocortisone STEMCELL Technologies #7904
Mouse serum Sigma-Aldrich #M5905
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a BioLegend #312105
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 Addgene #125600
pFUW-tetO-FOS Addgene #125598
pFUW-tetO-GATA2 Addgene #125028
pFUW-tetO-GFI1B Addgene #125597
pLV-tetO-HA-GFI1B Addgene #125599
pMD2.G Addgene #12259
psPAX2 Addgene #12260

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ivanovs, A., et al. Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region. Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).
  2. Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., Péault, B. Embryonic origin of human hematopoiesis. International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).
  3. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138, 1017-1031 (2011).
  4. Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
  5. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends in Cell Biology. 26, 202-214 (2016).
  6. Vo, L., Daley, G. De novo generation of HSCs from somatic and pluripotent stem cell sources. Blood. 125, 2641-2648 (2015).
  7. Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121, 770-781 (2013).
  8. Ebina, W., Rossi, D. J. Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells. EMBO Journal. 34, 694-709 (2015).
  9. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
  10. Pereira, C. F., et al. Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
  11. Pereira, C. F., et al. Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).
  12. Notta, F., et al. Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment. Science. 333, 218-221 (2011).
  13. Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., Péault, B., Tavian, M. Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo. Blood. 119, 3712-3724 (2012).
  14. Gomes, A. M., et al. Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming. Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).
  15. Karlsson, G., et al. Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells. Cell Reports. 4, 642-648 (2013).
  16. Leung, K. T., et al. The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 117, 1840-1851 (2011).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).
  18. Kutner, R. H., Zhang, X., Reiser, J. Production concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4, 495-505 (2009).
  19. Suzuki, Y. S., Suzuki, Y. Gene Regulatable Lentiviral Vector System. Viral Gene Therapy. Ke, X. , (2011).
  20. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157, 549-564 (2014).
  21. Lis, R., et al. Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells. Nature. 545, 439-445 (2017).
  22. Pereira, C., Lemischka, I. R., Moore, K. From blood to blood’: de-differentiation of hematopoietic progenitors to stem cells. EMBO Journal. 33, 1511-1513 (2014).
  23. Nolan, D. J., et al. Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration. Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).
  24. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells. Cell Reports. 9, 1871 (2014).
  25. Cheng, H., et al. Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors. Nature Communications. 7, 1-15 (2016).

Tags

Utvecklingsbiologi hemogena omprogrammering fibroblast transkriptionsfaktorer hematopoies hematopoietiska Stem och stamceller endotelial-till-hematopoietisk övergång

Erratum

Formal Correction: Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors
Posted by JoVE Editors on 12/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. The author affiliations were updated.

The second author affiliation was updated from:

2Wallenberg Center for Molecular, Lund University

to:

2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

Hemogena omprogrammering av humana fibroblaster genom påtvingat uttryck av transkriptionsfaktorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silvério-Alves, R., Gomes, A.… More

Silvério-Alves, R., Gomes, A. M., Kurochkin, I., Moore, K. A., Pereira, C. F. Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. J. Vis. Exp. (153), e60112, doi:10.3791/60112 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter