Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hemogen omprogrammering af humane fibroblaster ved tvungen ekspression af transkriptionsfaktorer

Published: November 4, 2019 doi: 10.3791/60112
Automatic Translation
1,2,3, 3, 4, 5,6, 1,2,3
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Lund Stem Cell Center, Lund University, 2Wallenberg Center for Molecular, Lund University, 3Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 4Skolkovo Institute of Science and Technology, 5Department of Cell, Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokol viser induktion af et hemogen program i humane Dermal fibroblaster ved tvungen ekspression faktorer GATA2, GFI1B og FOS til at generere hæmatopoietisk stilk og stamceller.

Abstract

De cellulære og molekylære mekanismer, som er underliggende specifikation af humane hæmatopoietiske stamceller (HSCs), er fortsat undvigende. Strategier til at rekapitulere Human HSC fremkomsten in vitro er forpligtet til at overvinde begrænsninger i at studere denne komplekse udviklingsmæssige proces. Her beskriver vi en protokol til generering af hæmatopoietisk stilk og stamceller fra humane Dermal fibroblaster, som anvender en direkte celle omprogrammering. Disse celler transit gennem en hemogen mellemliggende celle-type, der ligner Endothelial-til-hæmatopoietiske overgang (EHT) karakteristisk for HSC specifikation. Fibroblaster blev omprogrammeret til hæmatogene celler via transduktion med GATA2, GFI1B og FOS transkriptionsfaktorer. Denne kombination af tre faktorer induceret morfologiske ændringer, udtryk for hæmatogen og hæmatopoietiske markører og dynamiske EHT transkriptionelle programmer. Omprogrammerede celler genererer hæmatopoietisk afkom og genbefolker immundefekt mus i tre måneder. Denne protokol kan tilpasses til den mekanistiske dissektion af den menneskelige EHT-proces som eksemplificeret her ved at definere GATA2 mål i de tidlige faser af omprogrammeringen. Således, Human hemogenic omprogrammering giver en enkel og Tractable tilgang til at identificere nye markører og lovgivere af menneskelig HSC fremkomsten. I fremtiden kan trofast induktion af hemogen skæbne i fibroblaster føre til dannelse af patientspecifikke HSCs til transplantation.

Introduction

Endegyldig hæmatopoietisk stamcelle-og progenitorceller (Hspc'er) opstår i aorta-gonad-mesonephros-regionen (AGM) og placenta fra endotelprækursorer med hæmatogen kapacitet gennem en endotelal-til-hæmatopoietisk overgang (EHT)1, 2. Hemogenic prækursorer (HPs) udtrykker både endotelale og hæmatopoietiske markører, men deres præcise identifikation forbliver flygtige, især i det menneskelige system. Selv om det er en relativt bevaret proces hos pattedyr, er udviklingen af hæmatopoietiske stamceller (HSC) stadig signifikant forskellig mellem mennesker og musemodeller3,4. Der er derfor behov for in vitro -tilgange til at rekapitulere menneskelig HSC-udvikling.

Differentiering af pluripotente stamceller (kvikskranker) til HSCs, selv om lovende, har mødt begrænset succes i løbet af de sidste 20 år, hovedsagelig på grund af de tilgængelige differentierings protokoller, som resulterer i primitive hæmatopoietiske progenitorer med dårlig engraftment evne5,6,7. Alternativt, direkte celle omprogrammering metoder er blevet anvendt til at generere HSPC-lignende celler fra flere celletyper, ved hjælp af transkriptionsfaktorer (TFS)8,9. Især over ekspression af tre TFs, Gata2, Gfi1b og cFos, konverterede mus embryonale fibroblaster i Hspc'er gennem en HP mellemprodukt med en defineret fænotype (Prom1 + SCA-1 + CD34 + CD45-)10. Denne proces lignede EHT, der opstår i embryonet og placenta, under specifikation af definitive hæmatopoiese. Denne fænotype gjorde det muligt at identificere og isolation af en population af HPS i muse placenta, at efter kortsigtede kultur og notch aktivering genereret serielt planteres hscs11.

Hidtil er der ikke blevet etableret nogen fænotype, der skelner mellem humane HSCs fra deres prækursorer, men nogle molekyler er kendt for at være udtrykt i nye HSCs. integrin Alpha 6 (ITGA6 eller CD49f) er stærkt udtrykt i langsigtede genbefolkende HSCs, den mest umodne cellerne i HSC-segmentet12og angiotensin-konverterings enzymet (ACE eller CD143) findes i CD34 negative hæmatopoietiske prækursorer i embryonale bloddannende væv13.

For nylig har vi vist, at menneskelige versioner af de tre TFs, GATA2, FOS og GFI1B omprogrammere humane Dermal fibroblaster (Hdf'er) til HPs med kortvarig engraftment kapacitet14. I de indledende faser af omprogrammering, GATA2 engagerer åben kromatin og rekrutter GFI1B og FOS til at undertrykke fibroblast gener og aktivere endotelale og hæmatopoietiske gener. Inducerede celler højt udtrykt CD49f og ACE, og indeholdt en lille procentdel af celler, der udtrykker HSPC markør CD34. CD9-genet, der udtrykkes i HSCs15 og er vigtigt for HSC homing16, viste sig at være et direkte mål for GATA2 og blandt de mest opregulerede gener i omprogrammerede celler14. CD9 kan derfor udgøre en yderligere markør for HPs af humant endegyldigt hæmatopoiese.

I denne protokol beskriver vi genereringen af HSPC-lignende celler fra humane fibroblaster gennem tvungen ekspression af GATA2, GFI1B og FOS samt en tilpasset metode til kromatin-immunopræcipitation (ChIP)-sekventering (SEQ)-analyse ved begyndelsen af Omprogrammering. TFs blev kodet i en doxycyclin (DOX)-inducerbar lentiviral vektor (pFUW-tetO), der indeholder et tetracyclin-respons element (TRE) og en minimal CMV-promotor, og blev transduceret sammen med en konstitutiv vektor, der indeholdt den omvendte tetracyclin transaktivator protein (pFUW-M2rtTA). Når DOX (analog af tetracyclin) tilsættes efter transduktion, binder det sig til rtTA-proteinet, som interagerer med TRE, der tillader TF-transkriptionen (tet-on-systemet). Proceduren kræver 25 dage at fuldføre. For ChIP-SEQ-eksperimenter blev HDFs transduceret med mærkede versioner af GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) og GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), plus pFUW-tetO-FOS-og TF-bindingssteder blev analyseret to dage efter DOX-tilskud.

I sidste ende, hemogenic omprogrammering af humane fibroblaster giver en in vitro Tractable system til at studere de mekanismer underliggende menneskelig udviklingsmæssige hæmatopoiese og en potentiel kilde til patientspecifikke Hspc'er til fremtidig klinisk anvendelse.

Protocol

Denne protokol er blevet gennemført i henhold til Lunds Universitets retningslinjer for det etiske udvalg for human forskning og bør ske i overensstemmelse med individuelle institutionelle retningslinjer.

1. klargøring af reagens

  1. For Dulbecco's modificerede ørne medium (DMEM)/20% føtal bovin serum (FBS) blandes højt glucosedmem indeholdende natriumpyruvat med 20% FBS, 1% penicillin-streptomycin (pen/STREP), 1% L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 10-4-M 2- mercaptoethanol.
  2. For komplet DMEM blandes højt glucose DMEM indeholdende natriumpyruvat med 10% FBS, 1% pen/STREP og 1% L-glutamin.
  3. For hæmatopoietisk medium blandes hæmatopoietisk medium (tabel over materialer) med 10-6 M hydrocortison og 1% pen/STREP.
  4. Brug fosfat-bufferet saltvand (PBS) uden calcium eller magnesium.

2. Human Dermal fibroblast isolation

Bemærk: HDFs kan købes hos certificerede leverandører (tabel over materialer). I så fald skal du udvide fibroblaster og bruge dem direkte ved omprogrammering af eksperimenter (afsnit 4). Alternativt kan Hdf'er isoleres fra donorer. Hvis fibroblaster isoleres fra forskellige donorer, skal prøverne holdes adskilt fra hinanden på alle trin i protokollen. Etiket plader/brønde og opsamlings slanger med identifikationsnummeret for hver donor.

  1. Få HDFs fra 3 mm rund hudpunch biopsier udført af kvalificerede læger.
  2. Coat tre brønde af en vævskultur-behandlet 6-brønd plade med 500 μL 0,1% gelatine og inkubere i 20 min ved 37 °C.
  3. Aspirer den resterende gelatineopløsning og tilsæt 750 μL DMEM/20% FBS til hver brønd. Hele overfladen af brønden bør dækkes med medium.
  4. Der tilsættes 1,5 mL DMEM/20% FBS til indersiden af et sterilt 100 mm petriskål låg, og faldet spredes ved hjælp af en 5 mL serologisk pipette.
  5. Anbring hudbiopsien i mediet på låget med steriliseret tang.
  6. Dissekere huden biopsi i ni identiske sektioner, ved hjælp af en steriliseret skalpel at holde biopsi på plads og en anden skalpel at skære.
  7. Placer tre biopsi stykker per brønd ved hjælp af spidde pincet. Sørg for, at brikkerne Fastgør til bunden af brønden.
  8. Læg en 22 mm dækseddel oven på brikkerne og Påfør lidt tryk.
  9. Pladen inkubates ved 37 °C, 5% CO2, i en uge. Kontroller cellerne dagligt, og tilsæt 200 μL DMEM/20% FBS hver 2.
  10. Efter en uge tilsættes op til 2 mL DMEM/20% FBS og udskiftes mellem hver 2 − 3 dage.
  11. Passage celler ved 1:4 ratio når brønde er konflydende (ca. 4 − 8 uger).
    1. Forbered 0,1% gelatine belagt vævskultur-behandlede 6-brønd plader.
    2. Aspirer medium fra brønde ved 80% konfluency og vaskes én gang med 1 mL PBS.
    3. Fjern dækglas med sterile pincet, og Placer coveret i en ny brønd af en 6-brønd plade, med vævet side opad.
      Bemærk: Celler, der forblev knyttet til dækglas vil også blive høstet.
    4. Tilsæt 500 μL dissociations opløsning (tabel over materialer) pr. brønd (herunder brønde med dæksedlerne), og inkubér ved 37 °c, 5% Co2 i 5 − 10 min. Kontroller, hvornår cellerne begynder at stige fra bunden af brønden, og inaktivér dissociations opløsningen ved tilsætning af 500 μL DMEM/20% FBS til hver brønd.
    5. Saml fibroblaster fra alle brøndene i et 15 mL konisk rør. Tilsæt ekstra medium til brøndene for at indsamle de resterende celler. Centrifuger røret ved 350 x g i 5 min.
    6. I mellemtiden tilsættes 500 μL DMEM/20% FBS til hver brønd af tidligere gelatine belagte plader.
    7. Aspirér medium og resuspension af fibroblaster i 6 mL DMEM/20% FBS.
    8. Tilsæt 500 μL fibroblast suspension til hver brønd (to 6-brønd plader pr. prøve/donor i alt). Inkubatceller natten over ved 37 °C, 5% CO2.
  12. På den næste dag tilsættes 1 mL DMEM/20% FBS til hver brønd. Udskift mediet med 2 mL DMEM/20% FBS hver 2 − 3 dage, indtil brøndene er 80% flydende.
  13. Gentag afsnit 2,11 for tre konflydende brønde, indtil tredje passage er nået.
  14. Fastfryse fibroblaster fra flydende brønde (afsnit 1 og 3).
    1. Aspirer mediet fra brøndene, og vask en gang med 1 mL PBS.
    2. Dissociere og indsamle fibroblaster som beskrevet i trin 2.11.4 og 2.11.5.
    3. Tæl celler med en hemocytometer og centrifuge røret ved 350 x g i 5 min.
    4. Efter centrifugering, Aspirér medium og resuspension fibroblaster i FBS med 10% DMSO ved en densitet på 5 x 105 celler/ml.
    5. Der tilsættes 1 mL af cellesuspensionen pr. cryovial og fryse celler natten over ved-80 °C ved hjælp af en fryse beholder. Flyt hætteglassene til-150 °C (flydende nitrogen) til langtidsopbevaring.

3. lentiviral produktion

  1. Vokse HEK293T celler i en 100 mm vævskultur-behandlet fad med 10 mL komplet DMEM, ved 37 °C, 5% CO2, indtil confluency er nået.
  2. På dagen før transfection, aspirere medium og vaske skålen omhyggeligt med 5 mL PBS.
  3. Efter fjernelse af PBS tilsættes 1,5 mL dissociations opløsning og inkuberer ved 37 °C, 5% CO2 i 5 − 10 minutter for at adskille cellerne fra skålen.
    Bemærk: Det anbefales at varme både PBS og dissociations opløsning før brug, så cellerne ikke lider et termisk chok.
  4. Inaktivér dissociations opløsning med 3 mL komplet DMEM, og Overfør cellesuspensionen til et 15 mL konisk rør. Skålen vaskes med 5 mL komplet DMEM for at fjerne de resterende tilsluttede celler og overføre dette volumen til 15 mL konisk slange.
  5. Centrifuge cellesuspension ved 350 x g i 5 min.
  6. Opsug supernatanten og Opdel celle pellet jævnt mellem 6 100 mm vævskultur behandlede retter i et endeligt volumen på 10 mL komplet DMEM pr. skål. Cellerne bør være ca. 60% flydende på tidspunktet for transfection.
  7. På den næste dag, transficere celler med plasmid blander som følger:
    Bemærk:     denne del af protokollen beskriver produktionen af lentivira i 1 100 mm vævskultur behandlet fad pr. plasmid mix. For at opnå større mængder af lentiviral supernatanten for koncentration, brug mindst 4 100 mm HEK293T cellekultur retter per mix.
    1. I et 15 mL konisk rør tilsættes 10 μg af de tre overførsels plasmider sammen: 3,33 μg pFUW-tetO-GATA2 (Addgene plasmid #125028)14, 3,33 μg Pfuw-TETO-GFI1B (addgene #125597)14 og 3,33 μg Pfuw-TetO-FOS (addgene #125598)14, plus 10 μg af 2nd generation psPAX2 emballage vektor kodning af gag, pol, Tat og rev gener (addgene #12260) og 5 μg pMD2. G konvolut vektor kodning VSV-G genet (addgene #12259). Tilsæt vand op til 500 μL.
    2. I to nye 15 mL koniske rør tilsættes 10 μg FUW-M2rtTA plasmid (Addgene #20342)17, 10 μg psPAX2 emballage vektor og 5 μg PMD2. G konvolut vektor til hvert rør. Tilsæt vand op til 500 μL. Et rør vil blive brugt som kontrol.
    3. Til hvert rør tilsættes 62,5 μL af 2 M CaCl2. Frigør derefter bobler i hver blanding ved hjælp af et Pasteur-pipet indsat i en pipet-controller. Mens der dannes bobler, pipetteres 500 μL n, n-bis(2-hydroxyethyl) -2-AMINOETHANSULFONSYRE (BES) i bufferet saltopløsning (pH 7,1, 25 °C) med en P1000-pipette, drop-Wise mod Pasteur-pipetten og på blandingen.
    4. Inkubér rørene ved stuetemperatur i mindst 15 minutter. Blandingerne vises lidt overskyet efter et stykke tid.
  8. I mellemtiden aspirere medium fra HEK293T Cell retter (passaged dagen før) og tilsæt 10 mL komplet DMEM uden antibiotika. Vær forsigtig og tilsæt medium langsomt, da HEK293T celler er semi-tilhængere.
  9. Distribuer hver enkelt blanding (ca. 1 mL) jævnt og drop-Wise i separate retter og Inkuber natten over ved 37 °C, 5% CO2.
  10. Udskift mediet med 4 mL komplet DMEM, 24 timer efter inkubation. Inkuber natten over ved 37 °C, 5% CO2. Hvis det er muligt, Inkuber i stedet ved 32 °C, 5% CO2, da den reducerede temperatur vil øge halveringstiden for lentiviral partikler.
  11. Supernatanten opsamles med lentiviral partikler tre gange til et 50 mL konisk rør. Bland ikke forskellige lentivirale partikler på dette tidspunkt. Hver skål vil resultere i 12 mL lentiviral supernatant. Fire retter af samme virale præparat passer ind i 1 50 mL konisk rør.
    Forsigtig:     Udfør lentiviral indsamling i et biosikkerhedsniveau-2 laboratorium i en laminar flow hætte dedikeret til lentiviral arbejde og Placer viral forurenet affald (rør, spidser, fade) i en passende beholder til biologisk farlige materialer.
    1. Udfør den første samling 16 timer efter den sidste inkubation, og tilsæt 4 mL komplet DMEM. Inkubere ved 37 °C, 5% CO2.
    2. Gør den anden samling 8 h efter den første til samme tube, tilsæt 4 mL komplet DMEM og Inkuber ved 37 °C, 5% CO2.
    3. Gør den tredje samling 16 h efter den anden til det samme rør og kassere retterne.
      Bemærk: Opbevar lentiviral supernatanter ved 4 °c efter hver samling.
  12. Hver lentiviral supernatanten filtreres ved hjælp af et 0,45 μm lavprotein bindende filter med en celluloseacetat membran (tabel over materialer) til et rent rør.
  13. Der tilsættes maksimalt 15 mL filtreret supernatanten til en centrifugal filterenhed med en regenereret cellulose membran (tabel over materialer) og spin ved 4.000 x g i 25 min. ved 4 °c. Kassér gennemstrømning. En viskøs væske, der indeholder lentivira, vil forblive i filterenheden.
  14. Gentag trin 3,13 ved at tilsætte 15 mL supernatanten oven på filterenheden, indtil der ikke er mere lentiviral supernatanten tilbage.
    Bemærk: Når der kun er et par milliliter supernatanten at koncentrere sig, reducere spinning tid til 10 min. Hvis der stadig er ekstra væske (ikke-viskøs) på filteret, centrifugeres i yderligere 10 min.
  15. Aliquoter (50 − 200 μL afhængigt af den oprindelige supernatanten volumen) af hver type koncentreret lentivira og opbevares ved-80 °C ved langtidsopbevaring (1 − 2 år) eller ved 4 °C ved kort tids opbevaring (1 − 2 uger).
    Bemærk: Koncentrerede eller ikke-koncentrerede lentivira kan også anvendes frisk. Må ikke re-fryse og tø som dette resulterer i reduceret titer.

4. hemogen omprogrammering

Bemærk: Brug Hdf'er med et passage nummer på tre (P3) eller højere (indtil P10) for at udføre omprogrammering af eksperimenter.

  1. Coat en 100 mm vævskultur-behandlet skål med 5 mL 0,1% gelatine og Inkuber ved 37 °C i 20 min. Aspirér den resterende gelatineopløsning.
  2. Tø et hætteglas med fibroblast og plade celler i 0,1% gelatine belagt skål. Inkuber natten over ved 37 °C, 5% CO2. Hvis det er nødvendigt, Udvid fibroblaster i en længere periode, indtil den ønskede passage og konflughed er nået.
  3. Frakke en 6-brønd vævskultur behandlet plade med 500 μL 0,1% gelatineopløsning og Inkuber ved 37 °C i 20 min. Fjern ekstra gelatine.
  4. Plade Hdf'er ved en densitet på 150.000 celler pr. plade (25.000 celler pr. brønd) i 2 mL komplet DMEM pr. brønd. Inkuber natten over ved 37 °C, 5% CO2, for at tillade celle fastgørelse.
  5. Udskift mediet med 2 mL komplet DMEM plus 8 μg/mL polybrene. Forbered en 1:1 ratio blanding af poolproducerede TF lentivira og M2rtTA i et nyt mikrocentrifuge glas.
    Bemærk: I denne protokol, pulje-produktion af lentivira for de tre TFs udføres, som i forfatternes hænder, resulterer i højere omprogrammering effektivitet. Alternativt foreslås det at udføre en titrering af de enkelte lentivirale partikler ved qPCR18på en standard cellelinje. Dette vil blive brugt til at definere mængden af individuelle vira, der er nødvendige for at opfylde en mangfoldighed af infektion (MOI) optimal for Co-transduktion og hæmatogen omprogrammering.
  6. Fordel 10 til 100 μL lentiviral blanding pr. brønd, til transduce-Hdf'er. Dette er dag-2 af omprogrammering.
    Bemærk: At definere den optimale volumen af lentiviral mix for effektiv omprogrammering, uden at kompromittere cellernes levedygtighed, kræver optimering (Se supplerende figur 1 for flere detaljer). Hdf'er med mere end 7 passager kan kræve større mængder af vira end celler med lavere passager.
  7. Efter 16 timer inkubation, fjerne vira og tilføje komplet DMEM. Lad cellerne komme sig i 6 − 8 timer.
  8. Efter genvinding, aspirere medium og tilsættes 2 mL komplet DMEM med 8 μg/mL polybrene.
  9. Gør en anden transduktion som beskrevet i trin 4,6 og Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 for 16 timer. Dette er dag-1 af omprogrammering. Lentiviral mix kan tilberedes på dag-2 for begge transducinger og opbevares ved 4 °C.
  10. På den næste dag, fjerne virus og tilføje komplet DMEM suppleret med 1 μg/mL DOX. Dette er dag 0 af omprogrammering. Inkuber ved 37 °C, 5% CO2 for 48 h.
  11. På dag 2 af omprogrammering, split hver brønd på 1:2 ratio.
    1. Aspirere medium og vaske celler med 1 mL PBS.
    2. Aspirere PBS og dissociere celler med 500 μL dissociations opløsning. Inkuber 5 − 10 min ved 37 °C, 5% CO2.
    3. Inaktivér dissociations opløsningen med 1 mL komplet DMEM, og saml cellerne i et konisk rør. Centrifugeres ved 350 x g i 5 min.
    4. Resuspension af pellet i hæmatopoietisk medium (Se trin 1,3), suppleret med 1 μg/mL DOX, og plade celler i nye væv kultur-behandlede 6-brønd plader belagt med 0,1% gelatine til en endelig volumen på 2 mL pr brønd.
  12. Skift medium (hæmatopoietisk medium plus DOX) to gange om ugen for varigheden af omprogrammering kulturer (25 dage).
  13. Analysér resulterende omprogrammerede celler på forskellige tidspunkter ved lysfelt eller Fluorescens mikroskopi (Se supplerende figur 2), flow cytometri, bulk-og enkeltcellerna-sekvensering og transplantations analyser for erhvervelse af hæmatopoietisk morfologi, tilstedeværelse af endotelale og hæmatopoietiske markører, erhvervelse af endotel/hæmatopoietisk genekspressions profil og regenereringskapacitet14.

5. optimering af fibroblast ekspansion til spån-SEQ-analyse ved udbrud af hæmatogen omprogrammering

  1. Plade 300.000 HDFs (< P8) i 0,1% gelatine belagt vævskultur-behandlede 6-brønds plader med komplet DMEM til et endeligt volumen på 2 mL pr. brønd. Inkuber natten over ved 37 °C, 5% CO2.
  2. På den følgende dag erstattes mediet med komplet DMEM suppleret med 8 μg/mL polybrene.
  3. Transduce celler med individuelle faktorer: pFUW-tetO-FOS14, PLV-TETO-ha-GFI1B (addgene #125599)14 og Pfuw-TetO-3XFLAG-GATA2 (addgene #125600)14 eller med en pulje af de tre faktorer, plus fuw-M2rtTA ved 1:1 ratio. Brug 10 − 20 μL total virus (individuelle TF + M2rtTA eller tre TFs + M2rtTA). Inkubatceller natten over ved 37 °C, 5% CO2.
    Bemærk: Det anbefales at bruge tolv 6-brønds plader pr. betingelse (for hver enkelt TF og de tre TFs tilsammen).
  4. Fjern lentivira og tilsæt komplet DMEM 16 h efter første transduktion. Lad cellerne komme sig i 6 − 8 timer.
  5. Transduce celler en anden gang med den samme mængde virus per tilstand og inkubere ved 37 °C, 5% CO2.
  6. På den næste dag fjerne virus og tilføje komplet DMEM. Inkubere ved 37 °C, 5% CO2 i 24 timer.
  7. Re-Plate hver brønd i en 0,1% gelatine belagt vævskultur-behandlet 100 mm skål med komplet DMEM til en endelig volumen på 10 mL per skål. Dette repræsenterer ca. en 1:6 passage.
  8. Lad cellerne vokse i 6 dage ved 37 °C, 5% CO2.
  9. På dag 6 efter re-plating, aspirere medium og tilsæt komplet DMEM med 1 μg/mL DOX. Inkubatceller ved 37 °C, 5% CO2 i 2 dage.
  10. Indsamle fibroblaster og analysere genombindende steder af de tre TFs transduceret individuelt eller i kombination, ved ChIP-SEQ 2 dage efter DOX tilskud14.
    Bemærk: De endelige 72 100 mm retter vil indeholde mellem 20 − 50 x 106 celler, tilstrækkelig til at udføre spån-SEQ eksperimenter og replikater.

Representative Results

En skematisk gengivelse af omprogrammerings metoden ved hjælp af Hdf'er er illustreret i figur 1A. Fibroblaster er erhvervet fra kommercielle kilder eller indsamlet fra menneskelige donorer og udvidet in vitro tidligere til omprogrammering. Efter plating, er cellerne transduceret to gange med GATA2, GFI1B og FOS (og M2rtTA) lentivira, og doxycyclin tilsættes på dag 0 af omprogrammering. På dag 2, celler er opdelt og belagt i hæmatopoietisk medium indtil dag 25 i kulturen. Omprogrammerede celler kan genereres på forskellige tidspunkter for flere applikationer, herunder transplantation i immunkompromitterede mus, enkelt celle-RNA-sekventering (scRNA-SEQ) af rensede cellepopulationer (dag 2 usorteret, dag 15 CD49f+ CD34 og dag 25 CD49f+CD34+ celler), samt mikroskopi og flow flowcytometri analyse for cellen overflade markører CD49f, CD34, CD9 og CD143. Repræsentative cytometriske parceller viser ~ 17% af de omprogrammerede celler, som udtrykker både CD49f og CD9 (figur 1B, venstre panel) efter 25 dages omprogrammering. De fleste af dobbelte positive celler Express CD143 (~ 86%), og en lille population Express CD34 (0,9%), hvilket tyder på en dynamisk hæmatogen skæbne induktion. Disse markører er ikke aktiveret i M2rtTA transducerede Hdf'er, der dyrkes i 25 dage (figur 1B, højre panel). Immunofluorescens billeder bekræfter ekspression af CD9 og CD143 i vedsiddende og runde celler, Morfologisk adskiller sig fra fibroblaster, der er negative for disse markører (figur 1C). Humane hæmatogene kolonier udtrykker også CD49f og CD3414. ScRNA-SEQ analyse af HDFs, dag 2 usandterede celler og rensede omprogrammerede celler på dag 15 (CD49f+CD34-) og dag 25 (CD49f+CD34+) viser en trinvis stigning i CD49f, CD9 og CD143 udtryk fra dag 2 til dag 25. CD49f og CD9 positive celler vises først under omprogrammerings processen, mellem dag 2 og 15, hvilket indikerer, at disse molekyler kan repræsentere markører for tidlig menneskelig hemogenesen. CD143 ekspression begynder at blive detekteret på dag 15, og CD34 udtrykker celler registreres kun på senere tidspunkter (dag 25). CD34+ navlestrengsblod (UCB) celler blev anvendt som reference (figur 1D).

Figur 2a beskriver en modificeret protokol for at generere tilstrækkeligt antal celler til spån-SEQ-analyse i de indledende stadier af hæmatogen omprogrammering (dag 2). For det første er HDFs belagt ved en densitet to gange højere end i standardprotokollen (300.000 celler versus 150.000 celler pr. plade). Efter transduktion, hver brønd er re-forgyldt i en 100 mm parabol tillader celler at ekspandere i 6 dage før supplering medium med DOX. Cellerne analyseres 2 dage efter tilsætning af DOX og deraf følgende TF-udtryk. Figur 2B viser genom browser profiler af GATA2 binding til genomregulerende regioner af ITGA6 og Ace , når cellerne er co-transduced med de tre faktorer (3tfs) eller GATA2 individuelt. GATA2 binder også til åbne kromatin regioner af CD9 og CD34 gener14.

Figure 1
Figur 1: induktion af hæmatogen skæbne i humane Dermal fibroblaster. A) eksperimentel strategi for hemogen omprogrammering af humane Dermal fibroblaster (hdf'er). Fibroblaster fra hud punch biopsier er indsamlet fra donorer, udvidet og transduceret med GATA2, GFI1B, FOS og M2rtTA lentivira. Doxycyclin (DOX) tilsættes til kulturen på dag 0 i omprogrammering, og cellerne analyseres på flere tidspunkter indtil dag 25. scRNA-SEQ, enkelt celle-RNA-sekventering. FACS, fluorescens-aktiveret celle sortering. B) gating-strategi, der anvendes til at evaluere ekspression af hæmatopoietiske markører ved flowcytometri på dag 25 efter transduktion med de tre transkriptionsfaktorer (3TFs). Cytometriske parceller viser procentdelen af dobbelte positive celler for CD49f og CD9, gated i levende celle populationen (DAPI-negativ). Inden for den dobbelte positive population vises udtrykket CD143 og CD34. HDFs transduceret kun med M2rtTA virus under de samme dyrkningsbetingelser anvendes som kontrol. C) immunofluorescens billeder af dag 25 omprogrammerede kolonier, som bekræfter CD9 (øverste panel) og CD143 (nederste panel). Celler blev farvet med antistoffer (tabel over materialer) fortyndet 1:100 i PBS/2% FBS med muse serum, inkuberet 20 min ved 37 °c, 5% Co2, vasket tre gange og afbildet i PBS/2% FBS. Fase, fase-gradient kontrast. Skala stænger = 50 μm. (D) scrna-SEQ analyse af 253 celler på forskellige tidspunkter. Ekspression af ITGA6, CD9, Ace og CD34 aktiveres under omprogrammering. Cellerne samles på dag 2 (ussorteret), dag 15 (CD49f+CD34-) og dag 25 (CD49f+CD34+). HDFs og CD34+ navlestrengsblod (34 + UCB) celler anvendes som referencer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: udvidelse af humane Dermal fibroblaster til spån-SEQ-analyse. A) eksperimentel strategi, der skildrer en modificeret protokol til at generere et stort antal transducerede humane Dermal fibroblaster (hdf'er) til ChIP-SEQ på dag 2 i omprogrammering. 300.000 celler er belagt i 6-brønd plader og transduceret to gange med individuelle faktorer (pFUW-tetO-FOS, pLV-tetO-HA-GFI1B eller pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) eller en kombination af de tre faktorer (plus M2rtTA). Efter fjernelse af virus, fibroblaster er udvidet til seks dage i 100 mm retter. Doxycyclin (DOX) tilsættes på dag 0, og cellerne opsamles to dage efter tilsætning af DOX. (B) Genome-browser profiler, som fremhæver GATA2-bindingssteder (grå bokse) på ITGA6 og Ace loci to dage efter transduktion med de tre transkriptionsfaktorer (3TFS) eller med GATA2 alene. Det samlede antal kortlagte læsninger repræsenteres på y-aksen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: definition af en optimeret lentiviral volumen til effektiv hæmatogen omprogrammering. Stigende mængder af koncentrerede (10 til 100 μL) poolproducerede lentivirale partikler (3TFs: GATA2, GFI1B og FOS) anvendes til at transducere humane Dermal fibroblaster (Hdf'er) sammen med M2rtTA i et forhold på 1:1, efter trin 4.5-4.12 i protokollen. Omprogrammerede celler analyseres på dag 25 for at definere en optimal volumen af transduktion til hemogen omprogrammering, givet ved procentdelen af CD49f+CD9+ celler gated i levende celler (dapi-negative). Cellernes levedygtighed kan vurderes ved at kvantificere det absolutte antal levende celler på dag 25. HDFs, der er transduceret med M2rtTA (100 μL), anvendes som negativ kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: morfologi ændringer under hæmatogen omprogrammering af humane Dermal fibroblaster. Humane dermal fibroblast (HDF) kulturer er afbildet på dagen for den første transduktion (dag-2), når DOX tilsættes til kulturerne (dag 0), to dage (dag 2) og femten dage (dag 15) efter DOX tilskud, og i slutningen af forsøget (dag 25). Hæogene kolonier ved dag 15 og 25 er fremhævet. Skala stænger = 100 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I denne artikel beskrives en metode til at generere hæmatopoietiske stamceller direkte fra humane fibroblaster, som går gennem en HP-celle mellemprodukt, på samme måde som definitive HSCs14.

Pool-produktion af lentiviral partikler kodning GATA2, GFI1B og FOS blev foretrukket frem for individuel produktion, da der i vores hænder det resulterer i højere omprogrammering effektivitetsgevinster (ikke-offentliggjorte data). Som medlemmer af Retroviridae -familien indeholder lentivira normalt to eksemplarer af positiv enkeltstrenget RNA19. Den forøgede omprogrammering effektivitet kan skyldes emballering af to forskellige transgener i samme lentiviral partikel, hvilket resulterer i øget antal celler Co-transduced med de tre transkriptionsfaktorer. For at sikre, at denne protokol bliver en succes, er det nødvendigt at overføre Hdf'er med tilstrækkelig mængde virus afhængigt af celle passagen for at opnå en optimal balance mellem omprogrammering af effektivitet og cellelevedygtighed, som anbefalet i trin 4,6. Desuden kan friske ikke-koncentrerede vira anvendes. Det anbefales at transduce celler med 0,5-3 mL 3TFs pool og M2rtTA. Også, celletæthed bør justeres i henhold til ansøgningen. 150 000 HDFs pr. 6-brønd plade (trin 4,4) gav den optimale tæthed til at udføre FACS, transplantation og flow cytometri analyse af omprogrammerede celler. For spån-SEQ-eksperimenter var der behov for flere celler fra begyndelsen (trin 5,1). Det er vigtigt at kontrollere celler regelmæssigt for morfologiske ændringer og erstatte hæmatopoietisk medium to gange om ugen for at støtte fremkomsten af inducerede hæmatopoietiske celler. Tilsætning af hæmatopoietiske cytokiner eller co-kultur i feeder lag kan øge omprogrammering effektivitet.

Med denne metode kan vi identificere nye hæmatopoietiske markører, der er dynamisk udtrykt under hæmatogen omprogrammering. CD9, som blev påvist at være opreguleret i omprogrammerede celler på det transkriptionelle niveau14, udtrykkes hurtigt ved cellens overflade i de indledende faser af omprogrammeringen sammen med CD49F og CD143 og tjener som en ny markør for humane HSC-prækursorer. Vi viser også, at ITGA6 og Ace er direkte mål for GATA2 i de indledende stadier af hæmatogen omprogrammering, foruden CD9 og CD3414, hvilket giver en direkte mekanistisk forbindelse mellem humane hæmatogene prækursorer fænotype og GATA2.

En fordel ved dette system ligger i brugen af relativt homogene fibroblast kulturer. Mens kvikskranker er let udvides og vedligeholdes in vitro, differentierings protokoller genererer heterogene populationer, der omfatter hæmatopoietiske progenitorer, som forankret dårligt5,6,7. Desuden er der risiko for tumor ved Trans plantering af PSC-afledte hspc'er, da udifferentierede kvikskranker stadig kan forblive i kulturen selv efter anvendelse af differentierings protokoller. Alternativt til fibroblaster, direkte omprogrammering til HSCs er blevet anvendt på blod-engagerede stamceller20 og endotelcellerne21. Men begyndende med blod-begrænset stamcelle celler hindrer terapeutisk anvendelse af de resulterende HSCs, hvis patienten bærer mutationer, der påvirker stammen/stamfader hæmatopoietisk population22. I tilfælde af endotelceller, disse er vanskeligere at opnå i forhold til fibroblaster, og udgør en meget heterogen cellepopulation med hensyn til fænotype, funktion og struktur, som er organ-afhængige23. Andre undersøgelser har formået at omprogrammere mus fibroblaster i engraftable hæmatopoietiske stamceller24,25 endnu, indtil videre ingen anden protokol beskriver generering af HSPC-lignende cellerne fra humane fibroblaster.

Denne tilgang, kombineret med farmakologisk hæmning, gen knock-out, eller knock-down tilladelser til at definere individuelle eller kombination af faktorer, der er nødvendige for at direkte fremkalde menneskelige HSCs. anvende højeffektive screeningsmetoder baseret på nylige CRISPR-Cas9 teknologier i HDFs forud for omprogrammering, repræsenterer en spændende bestræbelse for at definere nye regulatorer af menneskelig definitiv hæmatopoiese. I fremtiden, omprogrammering ikke-blod relaterede menneskelige celletyper såsom fibroblaster vil tjene som en platform til at generere sunde patient-skræddersyede hæmatopoietiske stamceller til kliniske anvendelser.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Knut og Alice Wallenberg Foundation, det medicinske fakultet ved Lunds Universitet og Region Skåne er anerkendt for generøs økonomisk støtte. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Olle Engkvists stiftelse (194-0694 til Filipe Pereira) og ph. d.-stipendier fra Fundação para a Ciência e tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 til Filipe Pereira og SFRH/BD/135725/2018 og SFRH/BD/51968/2012 til Rita Alves og Andreia Gomes). Denne undersøgelse blev også støttet af midler fra NIH og NYSTEM (1R01HL119404 og C32597GG til Kateri A. Moore).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter Corning #430625
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich #M6250
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581 BioLegend #343518
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9 BD Biosciences #557929
BES buffered saline Sigma-Aldrich #14280
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich #449709
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich #UFC903096
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1x) no phenol red Gibco #12604-021
Doxycycline hyclate (DOX) Sigma-Aldrich #D9891
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7 Invitrogen #25-0495-82
FUW-M2rtTA Addgene #20342
Gelatin from Porcine Skin Type A Sigma-Aldrich #G1890
Gibco L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific #25030-024
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher Scientific #11140-035
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100 STEMCELL Technologies #05150
Hexadimethrine bromide (polybrene) Sigma-Aldrich #H9268
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) ScienCell #2320
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) GE Healthcare #SH30243.01
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) GE Healthcare #SV30160.03
HyClone Penicillin Streptomycin 100x Solution (Pen/Strep) GE Healthcare #SV30010
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS) GE Healthcare #SH30256.01 
Hydrocortisone STEMCELL Technologies #7904
Mouse serum Sigma-Aldrich #M5905
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a BioLegend #312105
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 Addgene #125600
pFUW-tetO-FOS Addgene #125598
pFUW-tetO-GATA2 Addgene #125028
pFUW-tetO-GFI1B Addgene #125597
pLV-tetO-HA-GFI1B Addgene #125599
pMD2.G Addgene #12259
psPAX2 Addgene #12260

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ivanovs, A., et al. Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region. Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).
  2. Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., Péault, B. Embryonic origin of human hematopoiesis. International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).
  3. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138, 1017-1031 (2011).
  4. Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
  5. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends in Cell Biology. 26, 202-214 (2016).
  6. Vo, L., Daley, G. De novo generation of HSCs from somatic and pluripotent stem cell sources. Blood. 125, 2641-2648 (2015).
  7. Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121, 770-781 (2013).
  8. Ebina, W., Rossi, D. J. Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells. EMBO Journal. 34, 694-709 (2015).
  9. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
  10. Pereira, C. F., et al. Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
  11. Pereira, C. F., et al. Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).
  12. Notta, F., et al. Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment. Science. 333, 218-221 (2011).
  13. Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., Péault, B., Tavian, M. Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo. Blood. 119, 3712-3724 (2012).
  14. Gomes, A. M., et al. Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming. Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).
  15. Karlsson, G., et al. Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells. Cell Reports. 4, 642-648 (2013).
  16. Leung, K. T., et al. The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 117, 1840-1851 (2011).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).
  18. Kutner, R. H., Zhang, X., Reiser, J. Production concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4, 495-505 (2009).
  19. Suzuki, Y. S., Suzuki, Y. Gene Regulatable Lentiviral Vector System. Viral Gene Therapy. Ke, X. , (2011).
  20. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157, 549-564 (2014).
  21. Lis, R., et al. Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells. Nature. 545, 439-445 (2017).
  22. Pereira, C., Lemischka, I. R., Moore, K. From blood to blood’: de-differentiation of hematopoietic progenitors to stem cells. EMBO Journal. 33, 1511-1513 (2014).
  23. Nolan, D. J., et al. Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration. Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).
  24. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells. Cell Reports. 9, 1871 (2014).
  25. Cheng, H., et al. Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors. Nature Communications. 7, 1-15 (2016).

Tags

Udviklingsmæssige biologi hæmatogen omprogrammering fibroblast transkriptionsfaktorer hæmatopoiese hæmatopoietisk stilk og stamceller Endothelial-til-hæmatopoietisk overgang

Erratum

Formal Correction: Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors
Posted by JoVE Editors on 12/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. The author affiliations were updated.

The second author affiliation was updated from:

2Wallenberg Center for Molecular, Lund University

to:

2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

Hemogen omprogrammering af humane fibroblaster ved tvungen ekspression af transkriptionsfaktorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silvério-Alves, R., Gomes, A.… More

Silvério-Alves, R., Gomes, A. M., Kurochkin, I., Moore, K. A., Pereira, C. F. Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. J. Vis. Exp. (153), e60112, doi:10.3791/60112 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter