Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

Published: November 4, 2019 doi: 10.3791/60112
Automatic Translation
1,2,3, 3, 4, 5,6, 1,2,3
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Lund Stem Cell Center, Lund University, 2Wallenberg Center for Molecular, Lund University, 3Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 4Skolkovo Institute of Science and Technology, 5Department of Cell, Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

ERRATUM NOTICE

Summary

פרוטוקול זה ממחיש את האינדוקציה של תוכנית המטוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות על ידי ביטוי נאכף של הגורמים שעתוק GATA2, GFI1B ו-FOS כדי ליצור גזע המטפאות ובתאי קדמון.

Abstract

המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים שבבסיס תאי הגזע האנושיים (HSCs) נותרים חמקמקים. אסטרטגיות כדי ללכוד הופעתה האנושית HSC בתוך מבחנה נדרשים כדי להתגבר על מגבלות לימוד זה תהליך התפתחותי מורכב. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי לייצר גזע המטפאות ותאים כמו מחולל קדמון מתאי הפנים האנושיים העסקת הגישה הישירה של התא התכנות. תאים אלה עוברים דרך תא ביניים מסוג הומוגניים, הדומה למעבר האנדותל-למטפי (EHT) האופייני למפרט HSC. פיברובטוס מתוכנת לתאי הומוגניים באמצעות התמרה של GATA2, GFI1B ו-FOS שעתוק. שילוב זה של שלושה גורמים המושרה שינויים מורפולוגיים, ביטוי של המטוגניים סמנים המטבטיים ו-EHT דינמי תוכניות הטרנססקריפט. ועכברים מתאכלס מעצמם. במשך שלושה חודשים פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לקראת הניתוח המכונה של תהליך EHT האדם כפי שניתן לGATA2 על ידי הגדרת מטרות במהלך השלבים המוקדמים של תכנות מחודש. כך, מחדש האדם הומוגניים מספק גישה פשוטה ומעקב כדי לזהות סמנים הרומן הרגולטורים של הופעתה האנושית HSC. בעתיד, אינדוקציה נאמנה של הגורל המוגניים בפיברופיצוצים עלול להוביל לדור של HSCs ספציפי למטופל להשתלה.

Introduction

מוחלט גזע ותאים מחולל קדמון (HSPCs) לצאת באזור אב העורקים-gonad-mesonephros (AGM) במחוז והשליה של אנדותל מקדים עם קיבולת הומוגניים, באמצעות מעבר אנדותל המטתית (EHT)1, 2. שתיים. מזהים הומוגניים (HPs) מבטאים את הסימונים האנדותל והמטבטיים, אך הזיהוי המדויק שלהם נשאר חמקמק, במיוחד במערכת האנושית. למרות היותו תהליך שימור יחסית ביונקים, תא גזע המטפאות (hsc) הפיתוח עדיין שונה באופן משמעותי בין האדם ומודלים העכבר3,4. לכן, בגישות מחוץ לתחום הפיתוח האנושי נדרשים התפתחות hsc.

הבידול של תאי גזע פלאוריטי (PSCs) כדי HSCs, למרות מבטיח, פגש הצלחה מוגבלת במהלך 20 השנים האחרונות, בעיקר בשל הפרוטוקולים בידול זמין, אשר התוצאה של המטפאות פרימיטיבי ושלתי עם התאום המסכן . יכולת5,6,7 לחילופין, מתודולוגיות מסוימות של תאים ישירים לתכנות הוחלו כדי ליצור תאים כמו hspc מסוגי תאים מרובים, באמצעות גורמי תמלול (tfs)8,9. במיוחד, ביטוי היתר של שלושה TFs, Gata2, Gfi1b ו-cFos, המרה מעובריים העכבר מתחלקים לתוך HSPCs באמצעות HP ביניים עם פניטיפ מוגדר (Prom1 + סקה -1 + CD34 + CD45-)10. תהליך זה דמה ל-EHT המתרחש העובר והשליה, במהלך המפרט של המטפיאה הסופית. פנוטיפ זה איפשר זיהוי ובידוד של אוכלוסיה של HPs ב השליה של העכבר כי לאחר התרבות לטווח קצר ו הפעלה חריץ שנוצר שתילת הHSCs הטבלה11.

עד כה, אין פנוטיפים הוקמה כי מבדיל בין האדם HSCs מן הסמנים שלהם, אבל כמה מולקולות ידועים להתבטא בHSCs המתעוררים. אינטגרציה אלפא 6 (ITGA6 או CD49f) מתבטאת במידה רבה באכלוס מחדש של HSCs, הילדותית ביותר תאים בתוך תא HSC12, ו אנגיוטנסין-המרת אנזים (ACE או CD143) קיים ב CD34 המטפאות שליליות מראש ברקמות העובאריות דם13.

לאחרונה, הדגמנו כי הגירסאות האנושיות של שלושה TFs, GATA2, FOS ו GFI1B מתכנת מראש את העור האנושי (HDFs) לתוך HPs עם קיבולת מקוצר לטווח קצר14. בשלבים הראשוניים של תכנות משוב, GATA2 עוסקת כרומטין פתוח ומגויסים GFI1B ו FOS לדכא גנים פיברובסט ולהפעיל את הגנים אנדותל והמטפאות. תאים המושרה מאוד מבוטא CD49f ו-ACE, והכיל אחוז קטן של תאים המבטאים את סמן HSPC CD34. הגן CD9, אשר מתבטא ב HSCs15 והוא חשוב עבור hsc ביות16, הוכח להיות מטרה ישירה של GATA2 ובקרב הגנים המווסתים ביותר בתאים מתוכנת-משנה14. CD9 עשוי אפוא להוות סמן נוסף עבור HPs של המטפיאה הסופית האנושית.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הדור של תאים ה-HSPC כמו הגידולים האנושיים באמצעות ביטוי נאכף של GATA2, GFI1B ו-FOS, כמו גם שיטה מותאמת כרומטין immunoprecipitation (שבב)-רצף (seq) ניתוח בתחילתה של תכנות. TFs היו מקודדים ב דוקסיציקלין (חמצון)-inducible וקטור (pFUW-tetO) המכיל את אלמנט התגובה טטרציקלין (TRE) ו מיזם CMV מינימלי, ו היו התמרה יחד עם וקטור מכונן המכיל טטרציקלין הפוכה transactivator חלבון (pFUW-M2rtTA). כאשר החמצון (אנלוגי של טטרציקלין) מתווסף לאחר התמרה, הוא נקשר לחלבון rtTA אשר מקיים אינטראקציה עם TRE המאפשר שעתוק TF (ט-On מערכת). ההליך דורש 25 ימים להשלמת. עבור ניסויים שבב-seq, HDFs הותמרה באמצעות גירסאות מתויגות של GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) ו GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), בתוספת pFUW-tetO-FOS ו-TF אתרים כריכה נותחו יומיים לאחר תוספי החמצון.

בסופו של דבר, הומוגניים מתיכנות מחודש של הגידולים האנושיים מספק מערכת צייתן מבחנה ללמוד את המנגנונים הבסיסיים התפתחותית המין האנושי מקור פוטנציאלי של hspcs ספציפי לחולה עבור יישום קליני עתידי.

Protocol

פרוטוקול זה בוצע על פי ההנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של אוניברסיטת לונד וצריך להיעשות בהתאם להנחיות מוסדיים בודדים.

1. הכנה מגיב

  1. עבור מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM)/20% סרום עוברי (FBS), לערבב הסוכר גבוהה DMEM המכילים נתרן פירובט עם 20% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/דלקת), 1% L-גלוטמין, 1%-חומצות אמינו לא חיוניות ו 10-4-M 2- רקפטואתנול.
  2. עבור dmem לאה, מערבבים הסוכר גבוה DMEM שנה המכילים נתרן פירובט עם 10% FBS, 1% עט/דלקת ו 1% L-גלוטמין.
  3. לתערובת בינונית, מערבבים בינונית (שולחן חומרים) עם 10-6 M הידרוקורטיזון ו-1% עט/דלקת.
  4. השתמש בתמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS) ללא סידן או מגנזיום.

2. האדם בידוד פיברובלסט

הערה: ניתן לרכוש HDFs מספקים מוסמכים (טבלת חומרים). במקרה זה, להרחיב את הפיברופיצוצים ולהשתמש בהם ישירות בניסויים התכנות מתיכנות (סעיף 4). לחילופין, HDFs יכול להיות מבודד תורמים. אם הפיברופיצוצים מבודדים מתורמים שונים, השאר את הדגימות מופרדות זו מזו בכל מדרגות הפרוטוקול. לוחיות תוויות/בארות ושפופרות גבייה עם מספר הזיהוי של כל תורם.

  1. להשיג HDFs מ 3 מילימטר עור עגול אגרוף ביופסיות שבוצעו על ידי רופאים מוסמכים.
  2. מעיל שלוש בארות של התרבות רקמה מטופלת 6-צלחת עם 500 μL של 0.1% ג'לטין ו דגירה עבור 20 דקות ב 37 ° c.
  3. משלחים את הפתרון הנותר ג'לטין ולהוסיף 750 μL של DMEM/20% FBS לכל טוב. כל שטח הבאר צריך להיות מכוסה במדיום.
  4. הוסף 1.5 mL של dמאמ/20% fbs אל המשטח הפנימי של מכסה סטרילי 100 מ"מ צלחת פטרי ולהפיץ את הירידה בעזרת הצינורות 5 מ"ל סרולוגית.
  5. מניחים את הביופסיה בעור בינוני על המכסה עם מלקחיים מעוקר.
  6. לנתח את ביופסיה לעור לתשעה מקטעים זהים, באמצעות אזמל אחד מעוקר להחזיק את הביופסיה במקום אזמל שני לגזור.
  7. המקום שלושה חתיכות ביופסיה לכל טוב באמצעות מלקחיים מחודדים. ודא שהחלקים מתחברים לתחתית הבאר.
  8. הנח שמיכות 22 מ"מ על גבי החלקים ולהפעיל לחץ.
  9. מודקת את הצלחת ב 37 ° c, 5% CO2, במשך שבוע. בדוק את התאים באופן יומיומי והוסף 200 μL של DMEM/20% FBS כל 2 ימים כדי להחליף את המדיום המאדו.
  10. לאחר שבוע, יש להוסיף עד 2 מ ל של DMEM/20% FBS ולהחליף בינוני כל 2-3 ימים.
  11. תאי מעבר ביחס 1:4 כאשר הבארות משתארות (כ-4-8 שבועות).
    1. הכינו 0.1% רקמות מצופה ג'לטין התרבות שטופלו 6-היטב צלחות.
    2. מנקה בינוני מבארות ב 80% שטף ולשטוף פעם אחת עם 1 מ ל של PBS.
    3. הסר שמיכות עם מלקחיים סטרילי והמקום coverslip לתוך באר חדשה של 6-היטב צלחת, עם בצד הרקמה למעלה.
      הערה: תאים שנשארו מחוברים שמיכות גם יהיה לקצור.
    4. הוסף 500 μL של פתרון הדיסוציאציה (טבלת חומרים) לבאר (כולל בארות עם שמיכות) ו-דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 5-10 דקות לבדוק כאשר התאים מתחילים לעלות מהחלק התחתון של הבאר להשבית את פתרון הדיסוציאציה על ידי הוספת 500 μL של DMEM/20% FBS לכל טוב.
    5. לאסוף את הכדורים מכל הבארות לתוך הצינור 15 מ ל חרוט. להוסיף בינוני נוסף לבארות כדי לאסוף את התאים הנותרים. צנטריפוגה את הצינור ב 350 x g עבור 5 דקות.
    6. בינתיים, להוסיף 500 μL של DMEM/20% FBS לכל היטב של צלחות בעבר מצופה ג'לטין.
    7. מנושף בינוני ומשהה את הפיברופיצוצים ב-6 מ ל/20% FBS.
    8. הוסף 500 μL של השעיית פיברובלסט לכל באר (שתי מנות 6-צלחות לכל מדגם/תורם בסך הכל). התאים הדגירה הלילה ב 37 ° c, 5% CO2.
  12. ביום שלמחרת, הוסף 1 מ ל של Dמאמ/20% FBS לכל באר. החלף בינוני עם 2 מ ל של Dמאמ/20% FBS כל 2 עד 3 ימים עד הבארות הם 80% שוטפת.
  13. חזור על סעיף 2.11 לשלוש בארות שוטפת עד למעבר השלישי.
  14. הקפאת הפיברוולים מבארות שוטפת (מעברים 1 ו -3).
    1. מנקה בינוני מבארות ושוטף פעם אחת עם 1 מ ל של PBS.
    2. הנתק ואסוף את הפיברותקיעות כמתואר בשלבים 2.11.4 ו 2.11.5.
    3. לספור תאים עם הומוציטוטומטר ו צנטריפוגה את הצינור ב 350 x g עבור 5 דקות.
    4. לאחר צנטריפוגה, משלחים בינוני ומשהה את הפיברופיצוצים ב-FBS עם 10% DMSO בצפיפות של 5 x 105 תאים/mL.
    5. הוסף 1 מ ל של השעיית התא לקריובקבוקון ולהקפיא את התאים לילה ב-80 ° c באמצעות מיכל קפוא. העבר מבחנות ל-150 ° צ' (חנקן נוזלי) לאחסון לטווח ארוך.

3. הפקת הפקה

  1. לגדול HEK293T תאים בצלחת 100 מ"מ רקמה מטופלת עם 10 מ ל של DMEM מלאה, ב 37 ° צ', 5% CO2, עד שליטה מגיעה.
  2. ביום שלפני החצייה, מנושף בינוני ושוטף את המנה בזהירות עם 5 מ ל של PBS.
  3. לאחר הסרת PBS, להוסיף 1.5 mL של פתרון הדיסוציאציה ו-דגירה ב 37 ° צ', 5% CO2 עבור 5-10 דקות כדי לנתק תאים ממנה.
    הערה: מומלץ לחמם גם את פתרון הערוץ הPBS והדיסוציאציה לפני השימוש, כך שתאים אינם סובלים מהלם תרמי.
  4. הפעל פתרון דיסוציאציה עם 3 מ ל של DMEM מלאה ולהעביר את ההשעיה התא ל 15 מ"ל צינור חרוט. לשטוף את הצלחת עם 5 מ ל של DMEM לאה כדי להסיר את התאים המצורפים הנותרים ולהעביר את הנפח הזה ל 15 מ"ל צינור חרוט.
  5. תא צנטריפוגה מושעה ב 350 x g עבור 5 דקות.
  6. משלחים supernatant ולפצל את הגלולה תא באופן שווה בין 6 100 מ"מ רקמות רקמה מטופלים בנפח הסופי של 10 מ ל של DMEM מלא לכל מנה. התאים אמורים להיות כ-60% שוטפת בזמן ההעברה.
  7. ביום שלמחרת, תאי העברה משני התאים הפלפביניים מתערבב באופן הבא:
    הערה:     חלק זה של הפרוטוקול מתאר את הייצור של וירוסים ב-1 100 מ"מ העור רקמה מטופלת מטופל לערבב באמצע. כדי להשיג כרכים גבוהים יותר של סופרנטאנט הרבה לריכוז, להשתמש לפחות 4 100 mm HEK293T מנות תרבות התא לכל תערובת.
    1. בתוך צינורית חרוט של 15 מ ל, להוסיף 10 μg של שלוש העברת פלסטלינה יחד: 3.33 μg של pFUW-tetO-GATA2 (הוספה גנטית פלמיד #125028)14, 3.33 μg של Pfuw-TETO-GFI1B (addgene #125597)14 ו 3.33 Μg של Pfuw-teto-מרכז (addgene #125598)14, פלוס 10 μg שלהדור 2 psPAX2 אריזה וקטור קידוד מחסום, פול, תאת והפוך גנים (addgene #12260) ו 5 μg של PMD2. G המעטפה וקטור הקידוד vsv-G (addgene #12259). הוסף מים עד 500 μL.
    2. בשני חדש 15 מ"ל צינורות חרוטי להוסיף 10 μg של FUW-M2rtTA באמצע (Addgene #20342)17, 10 Μg של psPAX2 אריזה וקטור ו 5 μg של PMD2. G מעטפה וקטור לכל צינור. הוסף מים עד 500 μL. שפופרת אחת הולכת לשמש כפקד.
    3. לכל צינור להוסיף 62.5 μL של 2 M CaCl2. הבא, לשחרר בועות לתוך כל תערובת באמצעות פסטר המחמד מוכנס לתוך בקר pipet. בעוד בועות מיוצרים, פיפטה 500 μL של n, n-bis(2-הידרולוקסיל) -2-בחומצה עמינח (בס) מלוחים באגירה (PH 7.1, 25 ° c), עם פיפטה P1000, ירידה בתבונה נגד פסטר הכומר ולתוך התערובת.
    4. מודקון צינורות בטמפרטורת החדר לפחות 15 דקות. התערובות יופיעו מעונן מעט לאחר זמן מה.
  8. בינתיים, משלחים בינוני מ HEK293T מנות תא (מעבר ליום לפני) ולהוסיף 10 מ ל של DMEM מלאה ללא אנטיביוטיקה. להיזהר ולהוסיף בינוני לאט כמו תאים HEK293T הם חצי חסיד.
  9. הפץ כל תערובת בודדת (כ 1 מ"ל) באופן שווה ושחרור לתוך מנות נפרדות ו-הדגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2.
  10. החלף בינוני עם 4 מ ל של DMEM מלאה, 24 שעות לאחר הדגירה. דגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2. אם זמין, דגירה במקום 32 ° c, 5% CO2, כמו הטמפרטורה מופחתת יגדיל את מחצית החיים של חלקיקים לנטינגיניים.
  11. לאסוף סופרנטאנט עם חלקיקים לנטינגיליים שלוש פעמים לשפופרת חרוט 50 mL. אין לערבב חלקיקים שונים בשלב זה. כל מנה תגרום ל-12 מ ל של סופרנטאנט. ארבע מנות של הכנה ויראלית זהה להשתלב לתוך צינור 1 50 mL.
    התראה:     ביצוע איסוף ויראלי במעבדת מעבדה ברמת בטיחות ברמה 2, המוקדש לעבודה האנטי-נגיפית ולמקום פסולת נגיפית מזוהמת (צינורות, טיפים, מנות) במיכל מתאים לחומרים ביו-מסוכנים.
    1. לעשות את האוסף הראשון 16 שעות לאחר הדגירה האחרונה ולהוסיף 4 מ ל של DMEM השלם. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2.
    2. לעשות את הקולקציה השנייה 8 h לאחר הראשון לאותו צינור, להוסיף 4 מ ל של DMEM לאה ו-דגירה ב 37 ° c, 5% CO2.
    3. לעשות את הקולקציה השלישית 16 שעות אחרי השני לאותה צינורית ולהשליך את הכלים.
      הערה: שומרים על הסופר-ויראלי ב -4 ° c אחרי כל אוסף.
  12. מסננים כל לעדשה supernatant באמצעות מסנן 0.45 יקרומטר חלבון נמוך עם ממברנה אצטט תאית (לוח חומרים) לצינור נקי.
  13. להוסיף מקסימום 15 מ ל של סופרנטאנט מסוננים ליחידת מסנן צנטריפוגליים עם קרום תאית מחדש (לוח חומרים) ו ספין ב 4,000 x g עבור 25 דקות, ב 4 ° c. התעלם מזרימה. נוזל צמיגי המכיל את הווירוסים יישאר ביחידת הסינון.
  14. חזור על השלב 3.13 על-ידי הוספת 15 מ ל של סופרנטנט על גבי יחידת הסינון, עד שלא יישאר עוד סופרנטנט-על.
    הערה: כאשר יש רק כמה מיליליטר של סופרנטאנט להתרכז, להקטין את זמן הספינינג ל 10 דקות. אם יש עדיין נוזל נוסף (לא צמיגה) על המסנן, צנטריפוגה עבור 10 דקות נוספות.
  15. הפוך את הביטוי (50 ל-200 μL בהתאם לעוצמת הקול הראשונית) של כל סוג של וירוסים מרוכזים ואחסן ב-80 ° c לאחסון לטווח ארוך (1 עד 2 שנים) או ב -4 ° c לאחסון לטווח קצר (1 עד 2 שבועות).
    הערה: ניתן גם להשתמש בווירוסים מרוכזים או לא מרוכזים. אין להקפיא מחדש ולהפשיר כפי שהתוצאות מופחתות.

4. תכנות מ, הומוגניים

הערה: השתמש ב-HDFs עם מספר מעבר של שלושה (P3) או גבוה יותר (עד P10) כדי לבצע ניסויים שעברו תכנות מחודש.

  1. מעיל 100 מ"מ רקמות רקמה מטופלת עם 5 מ ל של 0.1% ג'לטין ו-דגירה ב 37 ° c עבור 20 דקות.. ומלא את הפתרון הנותר
  2. הפשרת בקבוקון פיברובלסט ותאי צלחת בצלחת 0.1% מצופה ג'לטין. דגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2. במידת הצורך, הרחיבו את הריתקיעות למשך פרק זמן ארוך יותר עד לקבלת המעבר הרצוי והשטף.
  3. מעיל 6-היטב רקמות הרקמה מטופלת עם הצלחת עם 500 μL של 0.1% הפתרון ג'לטין ו דגירה ב 37 ° c עבור 20 דקות. הסר ג'לטין נוספת.
  4. HDFs לוחית בצפיפות של 150,000 תאים לצלחת (25,000 תאים לכל טוב) ב 2 מ ל של DMEM מלא לכל טוב. מודטה לילה ב 37 ° c, 5% CO2, כדי לאפשר מצורף לתא.
  5. החלף בינוני עם 2 מ ל של DMEM מלא בתוספת 8 μg/mL polybrene. להכין שילוב 1:1 יחס של הבריכה המיוצר TF M2rtTA וירוסים ו בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
    הערה: בפרוטוקול זה, ייצור הבריכה של הווירוסים עבור שלושת ה-TFs מבוצע, אשר, בידי המחברים, מביא ליעילות גבוהה יותר של התכנות. לחילופין, הוא הציע לבצע טיטור של חלקיקי העדשה האינדיבידואלית על ידי qPCR18, על קו תא סטנדרטי. זה ישמש כדי להגדיר את הנפח של וירוסים בודדים הדרושים כדי לענות על ריבוי של זיהום (המשרד האישי) אופטימלית עבור שיתוף התמרה ותכנות מחודש.
  6. פזר 10 עד 100 μL של תערובת ויראליות לכל טוב, כדי לשנות את HDFs. . זה היום השני של התכנות מראש
    הערה: הגדרת נפח אופטימלי של ערבוב ויראלי לתכנות יעיל, מבלי להתפשר על הכדאיות בתאים, מחייב אופטימיזציה (עיין באיור המשלים 1 לפרטים נוספים). HDFs עם יותר מ -7 מעברים עשויים לדרוש כמויות גבוהות יותר של וירוסים מאשר תאים עם מעברים נמוכים יותר.
  7. לאחר 16 שעות דגירה, להסיר וירוסים ולהוסיף DMEM השלם. אפשר לתאים להתאושש 6-8h.
  8. לאחר ההחלמה, משלחים בינוני ולהוסיף 2 מ ל של DMEM מלאה עם 8 μg/mL polybrene.
  9. בצע התמרה נוספת כמתואר בשלב 4.6 ו-דגירה ב 37 ° צ', 5% CO2 עבור 16 h. . זה היום הראשון של תכנות משנה ניתן להכין את המיקס האנטי-ויראלי ביום-2 לשתי הפרשות ולשמור אותה ב -4 ° c.
  10. ביום למחרת, להסיר את הווירוסים ולהוסיף DMEM שנה מלאה עם החמצון 1 μg/mL. זהו היום הנכון. לתכנות מראש מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 48 h.
  11. ביום 2 של תכנות משני, לפצל כל טוב ב 1:2 יחס.
    1. מנושף בינוני ושוטף תאים עם 1 מ ל של PBS.
    2. מנושף את התאים הPBS ומנתק תאי עם 500 μL של פתרון הדיסוציאציה. מודטה 5-10 דקות ב 37 ° c, 5% CO2.
    3. הפוך את פתרון הדיסוציאציה עם 1 מ ל של DMEM מלא ולאסוף תאים לתוך צינור חרוט. צנטריפוגה ב 350 x g עבור 5 דקות.
    4. השהה מחדש את הגלולה במדיום המטבית (ראה שלב 1.3), שיושלם עם 1 μg/mL חמצון, ואת התאים הצלחת לתוך רקמת רקמה חדשה התייחס 6-היטב צלחות מצופה עם 0.1% ג'לטין לנפח הסופי של 2 mL לכל טוב.
  12. שנה בינונית (בינונית בתוספת חמצון) פעמיים בשבוע למשך התרבויות התכנות משנה (25 ימים).
  13. ניתוח תאים מתוכנת מחדש וכתוצאה מכך בנקודות זמן שונות על-ידי ברייטפילד או מיקרוסקופ פלואורסצנטית (ראה המשלים איור 2), הזרמת cy, בתפזורת ו-תא יחיד ברצף RNA, ו השתלת בחני לרכישת מורפולוגיה, נוכחות של סמנים אנדותל ואת המטטיק, רכישת ביטוי גנטי בפרופיל הדלקת וקיבולת התחדשות14.

5. אופטימיזציה של הרחבת פיברובלסט לניתוח שבבים-seq בתחילת תיכנות מראש של הומוגניים

  1. לוחית 300,000 HDFs (< P8) ב 0.1% מצופה ג'לטין התרבות רקמה-מטופל 6-היטב צלחות עם DMEM להשלים את הנפח הסופי של 2 mL לכל טוב. דגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2.
  2. ביום שלמחרת, החלף את המדיום עם DMEM לאה בתוספת עם 8 μg/mL polybrene.
  3. תאים עם גורמים בודדים: pFUW-tetO-FOS14, plv-TETO-HA-GFI1B (dgene #125599)14 ו Pfuw-Teto-3XFLAG-GATA2 (addgene #125600)14 או עם בריכה של שלושה גורמים, בתוספת fuw-M2rtTA ביחס 1:1. השתמש בווירוס מוחלט של 10 עד 20 (בודדים TF + M2rtTA או שלושה TFs + M2rtTA). התאים הדגירה הלילה ב 37 ° c, 5% CO2.
    הערה: מומלץ להשתמש ב-12 לוחות הבאר לכל תנאי (עבור כל TF ושלושת ה-TFs בשילוב).
  4. הסר וירוסים מלאים והוסף D/MI מלא לאחר התמרה הראשונה. תנו לתאים להתאושש 6-8h.
  5. התאים השני בפעם השנייה עם כמות זהה של וירוס לכל תנאי ו-דגירה ב 37 ° צ', 5% CO2.
  6. ביום הבא הסר וירוסים והוסף DMEM מלאה. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 24 שעות.
  7. מחדש צלחת כל טוב לתוך 0.1% מצופה ג'לטין רקמות התרבות-מטופלים 100 mm צלחת עם DMEM להשלים את הנפח הסופי של 10 מ"ל לכל מנה. הדבר מייצג מעבר 1:6 בקירוב.
  8. אפשר לתאים לצמוח במשך 6 ימים ב 37 ° c, 5% CO2.
  9. ביום 6 לאחר ציפוי מחדש, מולחים בינונית ולהוסיף DMEM לאה עם החמצון 1 μg/mL. התאים הדגירה ב 37 ° צ', 5% CO2 עבור 2 ימים.
  10. לאסוף פיברופיצוצים ולנתח אתרים כריכה גנומית של שלושה TFs התמרה בנפרד או בשילוב, על ידי שבב-seq 2 ימים לאחר תוספת החמצון14.
    הערה: המנות הסופיות 72 100 mm יכילו בין 20-50 x 106 תאים, מספיק כדי לבצע ניסויים שבב-seq ושכפול.

Representative Results

ייצוג סכמטי של גישת התיכנות משנה באמצעות HDFs מומחש באיור 1א. פיברוהכדורים נרכשים ממקורות מסחריים או נאספים מתורמים אנושיים והרחיבו בתוך מבחנה בעבר כדי לתיכנות מוקדם יותר. לאחר הציפוי, תאים מתתמרים פעמיים עם GATA2, GFI1B ו-FOS (ו M2rtTA) מווירוסים, ו דוקסיציקלין מתווסף ביום 0 של תיכנות מראש. ביום 2, התאים מפוצלים ומצופים במדיום המטכיפת עד יום 25 של תרבות. תאים מתוכנת מחדש עשוי להיווצר בנקודות זמן שונות עבור יישומים מרובים כולל השתלת עכברים בסיכון חיסוני, תא יחיד RNA-רצפי (scRNA-seq) של אוכלוסיות תאים מטוהרים (יום 2 unsorted יון, יום 15 CD49f+ CD34 ו יום 25 CD49f+CD34+ תאים), כמו גם מיקרוסקופ וזרימה cy try ניתוח עבור סמני פני השטח של התא CD49F, CD34, CD9 ו CD143. מגרשים הנציג cy, להראות ~ 17% של תאים תיכנתו המבטא הן CD49f ו CD9 (איור 1B, הפאנל השמאלי), לאחר 25 ימים של תכנות משנה. רוב התאים החיוביים הכפולים express CD143 (~ 86%), ואוכלוסייה קטנה express CD34 (0.9%), מרמזת על שדרוג הגורל הדינאמי. סמנים אלה אינם מופעלים ב-HDFs M2rtTA ed במשך 25 ימים (איור 1B, הלוח הימני). התמונות immunofluorescence לאשר ביטוי של CD9 ו CD143 בתאים חסיד ועגול, נבדל מורפולוגית מפני פיברופיצוצים כי הם שליליים עבור סמנים אלה (איור 1ג). גם מושבות הומוגניים של האדם מבטאות CD49f ו-CD3414. ScRNA-seq ניתוח של HDFs, יום 2 תאים ממוינים, ו מטוהרים תאים מתוכנת ביום 15 (CD49f+CD34-) ו-day 25 (CD49f+CD34+) להראות עלייה מתונה ב CD49f, CD9 ו CD143 ביטוי מיום 2 עד יום 25. CD49f ו CD9 תאים חיוביים מופיעים הראשון במהלך תהליך תיכנות מחודש, בין יום 2 ו 15, המציין כי מולקולות אלה עשויים לייצג סמנים של הומוגנזה האנושית הקדומה. CD143 ביטוי מתחיל להתגלות ביום 15 ו CD34 המבטא תאים מזוהים רק בנקודות זמן מאוחרות יותר (יום 25). CD34+ דם טבורי (ucb) תאים שימשו כהפניה (איור 1ד).

איור 2A מתאר פרוטוקול שהשתנה להפקת מספר מספיק של תאים עבור ניתוח שבבים-seq בשלבים ההתחלתיים של תכנות מחודש (יום 2). ראשון, HDFs מצופים בצפיפות פי שניים גבוה יותר מאשר בפרוטוקול רגיל (300,000 תאים לעומת 150,000 תאים לצלחת). לאחר התמרה, כל באר הוא מצופה מחדש לתוך צלחת 100 מ"מ המאפשר לתאים להתרחב למשך 6 ימים לפני להשלים בינוני עם החמצון. תאים מנתחים 2 ימים לאחר הוספת חמצון ביטוי הסוגר. איור 2B מציג את פרופילי דפדפן הגנום של איגוד GATA2 לאזורים הרגולציה גנומית של ITGA6 ו- ACE כאשר התאים הם שיתוף התמרה עם שלושת הגורמים (3tfs) או GATA2 בנפרד. GATA2 מאגד גם לפתוח אזורי כרומטין של CD9 וCD34 גנים14.

Figure 1
איור 1: אינדוקציה של הגורל המוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות. (א) אסטרטגיה ניסויית עבור הומוגניים מתכנות מחודש של הגוף האנושי (hdfs). פיברותקיעות מתוך ביופסיות ניקוב העור נאספים מתורמים, המורחבת והתמרה עם GATA2, GFI1B, FOS ו M2rtTA לוירוסים. דוקסיציקלין (חמצון) מתווסף לתרבות ביום 0 של תכנות מראש ותאים מנותח במספר נקודות זמן עד יום 25. scRNA-seq, תא יחיד לרצפי רנ א. FACS, מיון התא המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית. (ב) האסטרטגיה המשמשת להערכת הביטוי של סמנים המטגניים/מטוניים על ידי זרימה cy, try ביום 25 לאחר התמרה עם שלושת גורמי התמלול (3TFs). מגרשים cy, מראה אחוז מתאים חיוביים כפולים עבור CD49f ו-CD9, מגודרת באוכלוסיית התאים החיים (DAPI-שלילי). בתוך האוכלוסיה החיובית הכפולה, הביטוי של CD143 ו-CD34 מוצג. HDFs השתנה רק עם M2rtTA וירוס תחת אותם תנאים התרבות משמשים כשליטה. (ג) immunofluorescence תמונות של היום 25 מושבות מתוכנת מאשרת את הביטוי של CD9 (הפאנל העליון) ו CD143 (הפאנל התחתון). תאים היו מוכתמים בנוגדנים (טבלה של חומרים) מדולל 1:100 ב PBS/2% fbs עם סרום לעכבר, מודבטים 20 דקות ב 37 ° צ', 5% CO2, שטף שלוש פעמים והתמונה ב-PBS/2% fbs. שלב, ניגוד מעבר פאזה. קנה מידה ברים = 50 μm. (ד) ScRNA-הניתוח seq של 253 תאים בנקודות זמן שונות. ביטוי של ITGA6, CD9, ACE ו- CD34 מופעל במהלך תיכנות משנה. התאים נאספים ביום 2 (לא ממוינים), יום 15 (CD49f+CD34-) ויום 25 (CD49f+CD34+). HDFs ו CD34+ דם טבורי (34 + ucb) תאים משמשים כהפניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התרחבות של פיברוהכדורים של הגוף האנושי לניתוח שבבים-seq. (א) האסטרטגיה הניסיונית המתארת פרוטוקול שונה כדי לייצר מספר גבוה של התמרה בעלי העורי הגוף האנושי (hdfs) עבור שבב-seq ביום 2 של תכנות מחודש. 300,000 תאים מצופים 6-היטב לוחות והתמרה פעמיים עם גורמים בודדים (pFUW-tetO-, pLV-tetO-HA-הGFI1B או pFUW-teto-3xFLAG-GATA2) או שילוב של שלושה גורמים (בנוסף M2rtTA). לאחר הסרת וירוסים, מרחיבים פיברותקיעות במשך שישה ימים במנות 100 מ"מ. דוקסיציקלין (חמצון) מתווסף ביום 0 ותאים נאספים יומיים לאחר התוספת חמצון. (ב) הגנום פרופילים המדגיש אתרים GATA2-כריכה (קופסאות אפורות) ב ITGA6 ו אס הבית יומיים לאחר התמרה עם שלושת גורמי התמלול (3TFS) או עם GATA2 לבד. המספר הכולל של קריאות ממופות מיוצג בציר ה-y. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 1
איור משלים 1: הגדרת אמצעי אחסון ממוטב עבור תכנות הומוגניים יעיל. הגדלת כרכים של מרוכז (10 עד 100 μL) מאגר המיוצר חלקיקים ויראליים (3TFs: GATA2, GFI1B ו-FOS) משמשים כדי לשנות את הגידול האנושי העורי (HDFs), יחד עם M2rtTA ביחס של 1:1, בעקבות שלבים 4.5-4.12 של הפרוטוקול. התאים הניתנים לתכנות מנותח ביום 25 כדי להגדיר נפח אופטימלי של התמרה מראש הומוגניים, הניתנים על ידי אחוז CD49f+CD9+ תאים מגודרת בתאים חיים (dapi-שלילי). הכדאיות של התא יכולה להיות מוערך על ידי כימות המספר המוחלט של תאים חיים ביום 25. HDFs התמרה עם M2rtTA (100 μL) משמשים כפקד שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 2
איור משלים 2: מורפולוגיה שינויים במהלך תכנות משנה של הומוגניים בעלי העורי. תרבויות הגוף (HDF) האדם מותמרים ביום של התמרה הראשונה (יום-2), כאשר החמצון מתווסף לתרבויות (יום 0), יומיים (יום 2) וחמישה עשר ימים (יום 15) לאחר תוספת החמצון, ובנקודת הסיום של הניסוי (יום 25). מושבות הומוגניים בימים 15 ו -25 מודגשות. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

במאמר זה, שיטה מתוארת כדי ליצור תאים מחולל קדמון ישירות מן הפיברוהטיות האנושית, אשר עוברים דרך תא HP ביניים, בדומה HSCs14הסופי.

הבריכה-ייצור של חלקיקים לGATA2, GFI1B ו-FOS היה מועדף על הייצור הפרטי, מאז בידינו זה התוצאות ביעילות גבוהה יותר לתיכנות מחדש (נתונים שלא פורסמו). לאנטי וירוסים, כחברים של המשפחה הרטרוריתיים , בדרך כלל מכילים שני עותקים של ה-RNA החיובי חד-הורית19. יעילות התכנות מוגברת עשוי להיות עקב אריזה של שני שונים transgenes באותו חלקיק ויראלי זהה, וכתוצאה מכך מספר גדל של תאים שיתוף התמרה עם שלושה גורמים שעתוק. כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה, יש צורך לשנות HDFs עם כמות נאותה של וירוס בהתאם למעבר התא כדי לקבל איזון אופטימלי בין יעילות התיכנות מראש והכדאיות התא, כמומלץ בשלב 4.6. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בווירוסים לא מרוכזים טריים. מומלץ להתאים תאים עם 0.5-3 מ ל של בריכת 3TFs ו M2rtTA. כמו כן, צפיפות התא צריכה להיות מותאמת בהתאם ליישום. 150 000 HDFs לכל 6-באר צלחת (שלב 4.4) סיפק את הצפיפות האופטימלית לבצע FACS, השתלת וזרימה cy, לנסות ניתוח תאים מתוכנת. עבור ניסויים שבב-seq, תאים נוספים נדרשו מההתחלה (שלב 5.1). חשוב לבדוק את התאים באופן סדיר עבור שינויים מורפולוגיים ולהחליף מדיום המטבית פעמיים בשבוע כדי לתמוך הופעתה של תאים מזורפי המטטיים. הוספת ציטוקינים או שיתוף תרבות בשכבות ממזין עשויה להגביר את יעילות התיכנות מראש.

בשיטה זו, אנו יכולים לזהות סמנים המטפאות חדשים המובטאים באופן דינאמי במהלך תיכנות מחדש של הומוגניים. CD9, אשר הוכח להיות מוסדר בתאים מתוכנת מחדש ברמת ההמרה14, הוא מתבטא במהירות על פני השטח של התא בשלבים הראשוניים של התכנות יחד עם CD49F ו CD143, המשמש כסמן הרומן של האדם hsc הסמנים הקדם. כמו כן, אנו מראים כי ITGA6 ו- ACE הם יעדים ישירים של GATA2 במהלך השלבים הראשוניים של תכנות משנה, בנוסף CD9 ו- CD3414, מתן קשר ישיר מכניסטי בין הומוגניים האדם פניטיפים וGATA2.

אחד היתרונות של מערכת זו שוכן בשימוש בתרבויות הומוגניות יחסית. בעוד PSCs מורחבים בקלות ומתוחזק בתוך מבחנה, הפרוטוקולים בידול ליצור אוכלוסיות הטרוגנית הכוללים המטפיאה ושלתי, אשר חרט גרוע5,6,7. יתר על כן, יש סיכון של tumorigenesis כאשר שתילת הPSC הנגזרות HSPCs, מאז מובחן PSCs עשוי עדיין להישאר בתרבות גם לאחר שימוש בפרוטוקולים בידול. לחילופין, מתיכנות ישיר של HSCs הוחל על מחויבות דם ושלתי20 ותאי האנדותל21. עם זאת, החל בתאים מוגבלים בדם מעכבת את היישום הטיפולי של HSCs כתוצאה מכך, אם המטופל נושא מוטציות המשפיעות על האוכלוסייה המטטית גזע/מחולל קדמון22. במקרה של תאי האנדותל, קשה יותר להשיג זאת בהשוואה לפיברומופיצוצים, ומהווים אוכלוסיית תאים הטרוגנית מאוד במונחים של פנוטיפים, תפקוד ומבנה, התלויים באיברים23. מחקרים אחרים הצליחו לתיכנות מראש של עכברים לתוך המטפיאה ושלתי24,25 עדיין, עד כה, אין פרוטוקול אחר מתאר את הדור של תאים hspc-כמו מתוך פיברופיצוצים אנושיים.

גישה זו, ביחד עם עיכוב תרופתי, גן נוק אאוט, או להפיל היתרים להגדיר בודדים או שילוב של גורמים הנדרשים ישירות לגרום לאדם HSCs. העסקת יעילות גבוהה ההקרנה מתודולוגיות מבוסס על האחרונים CRISPR-Cas9 טכנולוגיות HDFs לפני תכנות מחדש, מייצגת מאמץ מלהיב להגדרת הרגולטורים הרומן של המטפיאה הסופית האנושית. בעתיד, מתיכנות מחודש של סוגי תאים אנושיים שאינם קשורים בדם כגון הפיברוביטים ישמשו כפלטפורמה להפקת תאים בריאים המותאמים לחולה בתאי מחולל ביישומים קליניים.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

הקרן של קנוט ואליס ולנברג, הפקולטה לרפואה באוניברסיטת לונד ואזור סיינה מודעים לתמיכה כספית נדיבה. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענק Olle Engkvists Stiftelse (194-0694 כדי פיליפה פריירה) ו PhD מלגות מ-Fundação פארה a Ciência e Tecnoלוגיה (לפטין/בים-מד/0075/2014 לפיליפה פריירה, ו SFRH/BD/135725/2018 ו SFRH/BD/51968/2012 לריטה אלבס ואנדראיה גומז). מחקר זה היה נתמך גם על ידי כספים מ NIH ו NYSTEM (1R01HL119404 ו C32597GG לקאטרי א. מור).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter Corning #430625
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich #M6250
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581 BioLegend #343518
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9 BD Biosciences #557929
BES buffered saline Sigma-Aldrich #14280
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich #449709
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich #UFC903096
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1x) no phenol red Gibco #12604-021
Doxycycline hyclate (DOX) Sigma-Aldrich #D9891
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7 Invitrogen #25-0495-82
FUW-M2rtTA Addgene #20342
Gelatin from Porcine Skin Type A Sigma-Aldrich #G1890
Gibco L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific #25030-024
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher Scientific #11140-035
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100 STEMCELL Technologies #05150
Hexadimethrine bromide (polybrene) Sigma-Aldrich #H9268
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) ScienCell #2320
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) GE Healthcare #SH30243.01
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) GE Healthcare #SV30160.03
HyClone Penicillin Streptomycin 100x Solution (Pen/Strep) GE Healthcare #SV30010
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS) GE Healthcare #SH30256.01 
Hydrocortisone STEMCELL Technologies #7904
Mouse serum Sigma-Aldrich #M5905
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a BioLegend #312105
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 Addgene #125600
pFUW-tetO-FOS Addgene #125598
pFUW-tetO-GATA2 Addgene #125028
pFUW-tetO-GFI1B Addgene #125597
pLV-tetO-HA-GFI1B Addgene #125599
pMD2.G Addgene #12259
psPAX2 Addgene #12260

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ivanovs, A., et al. Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region. Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).
  2. Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., Péault, B. Embryonic origin of human hematopoiesis. International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).
  3. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138, 1017-1031 (2011).
  4. Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
  5. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends in Cell Biology. 26, 202-214 (2016).
  6. Vo, L., Daley, G. De novo generation of HSCs from somatic and pluripotent stem cell sources. Blood. 125, 2641-2648 (2015).
  7. Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121, 770-781 (2013).
  8. Ebina, W., Rossi, D. J. Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells. EMBO Journal. 34, 694-709 (2015).
  9. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
  10. Pereira, C. F., et al. Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
  11. Pereira, C. F., et al. Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).
  12. Notta, F., et al. Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment. Science. 333, 218-221 (2011).
  13. Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., Péault, B., Tavian, M. Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo. Blood. 119, 3712-3724 (2012).
  14. Gomes, A. M., et al. Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming. Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).
  15. Karlsson, G., et al. Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells. Cell Reports. 4, 642-648 (2013).
  16. Leung, K. T., et al. The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 117, 1840-1851 (2011).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).
  18. Kutner, R. H., Zhang, X., Reiser, J. Production concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4, 495-505 (2009).
  19. Suzuki, Y. S., Suzuki, Y. Gene Regulatable Lentiviral Vector System. Viral Gene Therapy. Ke, X. , (2011).
  20. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157, 549-564 (2014).
  21. Lis, R., et al. Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells. Nature. 545, 439-445 (2017).
  22. Pereira, C., Lemischka, I. R., Moore, K. From blood to blood’: de-differentiation of hematopoietic progenitors to stem cells. EMBO Journal. 33, 1511-1513 (2014).
  23. Nolan, D. J., et al. Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration. Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).
  24. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells. Cell Reports. 9, 1871 (2014).
  25. Cheng, H., et al. Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors. Nature Communications. 7, 1-15 (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 153 הומוגניים מתיכנות מהונדס פיברובלסט גורמי שעתוק המטפיאה גזע המטפאות ותאי קדמון מעבר אנדותל-למטפי

Erratum

Formal Correction: Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors
Posted by JoVE Editors on 12/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. The author affiliations were updated.

The second author affiliation was updated from:

2Wallenberg Center for Molecular, Lund University

to:

2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silvério-Alves, R., Gomes, A.… More

Silvério-Alves, R., Gomes, A. M., Kurochkin, I., Moore, K. A., Pereira, C. F. Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. J. Vis. Exp. (153), e60112, doi:10.3791/60112 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter