Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hemogenic omprogrammering av Human fibroblaster av tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer

Published: November 4, 2019 doi: 10.3791/60112
Automatic Translation
1,2,3, 3, 4, 5,6, 1,2,3
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Lund Stem Cell Center, Lund University, 2Wallenberg Center for Molecular, Lund University, 3Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 4Skolkovo Institute of Science and Technology, 5Department of Cell, Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokollen demonstrerer induksjon av et hemogenic program i menneskelig dermal fibroblaster ved tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer GATA2, GFI1B og FOS å generere blodkreft stilk og stamceller.

Abstract

Den cellulære og molekylære mekanismer underliggende spesifikasjon av menneskelig blodkreft stamceller (HSCs) forblir unnvikende. Strategier for å recapitulate menneskelige HSC fremveksten in vitro er pålagt å overvinne begrensninger i å studere denne komplekse utviklingsprosessen. Her beskriver vi en protokoll for å generere blodkreft stem og stamfar-lignende celler fra menneskelig dermal fibroblaster ansette en direkte celle omprogrammering tilnærming. Disse cellene transitt gjennom en hemogenic mellomliggende celle-type, likner endothelial-til-blodkreft overgang (EHT) karakteristisk for HSC spesifikasjon. Fibroblaster ble omprogrammeres til hemogenic celler via Transduction med GATA2, GFI1B og FOS transkripsjon faktorer. Denne kombinasjonen av tre faktorer indusert morfologiske endringer, uttrykk for hemogenic og blodkreft markører og dynamisk EHT transcriptional programmer. Omprogrammeres celler generere blodkreft avkom og gjenbefolke immunodeficient mus i tre måneder. Denne protokollen kan tilpasses mot mekanistisk Disseksjon av den menneskelige EHT prosessen som er illustrert her ved å definere GATA2 mål i de tidlige fasene av omprogrammering. Dermed menneskelige hemogenic omprogrammering gir en enkel og medgjørlig tilnærming for å identifisere romanen markører og regulatorer av menneskelig HSC fremveksten. I fremtiden kan trofast induksjon av hemogenic skjebne i fibroblaster føre til generering av pasientspesifikke HSCs for transplantasjon.

Introduction

Definitive blodkreft stem og stamceller (HSPCs) dukker opp i aorta-gonad-mesonephros (AGM) regionen og placenta fra endothelial forløpere med hemogenic kapasitet, gjennom en endothelial-til-blodkreft overgang (EHT)1, 2i det. Hemogenic forløpere (HPs) uttrykker både endothelial og blodkreft markører, men deres presise identifisering er fortsatt unnvikende, spesielt i det menneskelige systemet. Til tross for å være en relativt bevart prosess i pattedyr, blodkreft stem cell (HSC) utvikling fortsatt avviker betydelig mellom mennesker og mus modeller3,4. Derfor, in vitro tilnærminger til RECAPITULATE menneskelige HSC utvikling er nødvendig.

Differensiering av Pluripotent stamceller (PSCer) til HSCs, men lovende, har møtt begrenset suksess i løpet av de siste 20 årene, hovedsakelig på grunn av tilgjengelig differensiering protokoller, som resulterer i primitive blodkreft forfedre med dårlig engraftment evne5,6,7. Alternativt, direkte celle omprogrammering metoder har blitt brukt til å generere HSPC-lignende celler fra flere celletyper, ved hjelp av transkripsjon faktorer (TFs)8,9. Spesielt overuttrykte av tre TFs, Gata2, Gfi1b og cFos, konverterte musen embryonale fibroblaster til HSPCs gjennom en HP mellomliggende med en definert fenotype (Prom1 + SCA-1 + CD34 + CD45-)10. Denne prosessen lignet EHT som oppstår i fosteret og placenta, under spesifikasjon av definitive hematopoiesen. Dette fenotype aktivert identifisering og isolering av en befolkning på HPs i musen placenta at etter kortsiktige kultur og hakk aktivisering generert serielt transplantable HSCs11.

Så langt har ingen fenotype er fastslått at skiller menneskelige HSCs fra sine forløpere, men noen molekyler er kjent for å være uttrykt i nye HSCs. integrin Alpha 6 (ITGA6 eller CD49f) er svært uttrykt i langsiktige repopulating HSCs, den mest umodne celler i HSC kupé12, og angiotensin-konvertering ENZYM (ACE eller CD143) er til STEDE i CD34 negative blodkreft forløpere i embryonale blod-forming vev13.

Nylig har vi vist at menneskelige versjoner av de tre TFs, GATA2, FOS og GFI1B programmere menneskelige dermal fibroblaster (HDFs) i HPs med kortsiktig engraftment kapasitet14. I de innledende fasene av omprogrammering, GATA2 engasjerer åpne kromatin og rekrutterer GFI1B og FOS å undertrykke Fibroblast gener og aktivere endothelial og blodkreft gener. Indusert celler svært uttrykt CD49f og ACE, og inneholdt en liten prosentandel av cellene uttrykker HSPC markør CD34. Den CD9 genet, som er uttrykt i HSCs15 og er viktig for HSC homing16, ble vist å være et direkte mål på GATA2 og blant de mest opp-regulerte gener i omprogrammeres celler14. CD9 kan derfor utgjøre en ekstra markør for HPs av menneskets definitive hematopoiesen.

I denne protokollen beskriver vi generering av HSPC-lignende celler fra menneskelige fibroblaster gjennom tvungen uttrykk for GATA2, GFI1B og FOS, samt en tilpasset metode for kromatin immunutfelling (ChIP)-sekvensering (SEQ) analyse ved utbruddet av Omprogrammere. TFs ble kodet i en Doxycycline (DOX)-induserbart lentiviral vektor (pFUW-tetO) som inneholder en Tetracycline respons element (TRE) og en minimal CMV promoter, og ble transduced sammen med en konstituerende vektor inneholder omvendt Tetracycline transactivator protein (pFUW-M2rtTA). Når DOX (analog av Tetracycline) er lagt til etter Transduction, binder den til rtTA proteinet som samhandler med TRE tillater TF transkripsjon (tet-on system). Prosedyren krever 25 dager å fullføre. For ChIP-SEQ eksperimenter, HDFs ble transduced med merkede versjoner av GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) og GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), pluss pFUW-tetO-FOS og TF binding nettsteder ble analysert to dager etter DOX kosttilskudd.

Til syvende og sist, hemogenic omprogrammering av menneskelig fibroblaster gir et in vitro medgjørlig system for å studere mekanismene underliggende menneskets utviklingsmessige hematopoiesen og en potensiell kilde til pasientspesifikke HSPCs for fremtidig klinisk anvendelse.

Protocol

Denne protokollen ble utført i henhold til Lunds universitets retningslinjer og bør gjøres i samsvar med de enkelte institusjonelle retningslinjer.

1. forberedelse av reagens

  1. For Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM)/20% fosterets storfe serum (FBS), bland høy glukose DMEM inneholder natrium pyruvat med 20% FBS, 1% penicillin-Streptomycin (penn/strep), 1% L-glutamin, 1% ikke-essensielle aminosyrer og 10-4-M 2- mercaptoethanol.
  2. For fullstendig DMEM, bland høyt glukose DMEM som inneholder natrium pyruvat med 10% FBS, 1% penn/strep og 1% L-glutamin.
  3. For blodkreft medium, bland blodkreft medium (tabell av materialer) med 10-6 M Hydrocortisone og 1% penn/strep.
  4. Bruk fosfat-bufret saltvann (PBS) uten kalsium eller magnesium.

2. Human dermal Fibroblast isolasjon

Merk: HDFs kan kjøpes fra sertifiserte leverandører (tabell av materialer). I så fall utvider du fibroblaster og bruker dem direkte i omprogrammering eksperimenter (del 4). Alternativt kan HDFs isoleres fra donorer. Hvis fibroblaster er isolert fra ulike givere, holde prøvene adskilt fra hverandre på alle trinn i protokollen. Etikett plater/brønner og oppsamlings rør med identifikasjonsnummer for hver giver.

  1. Få HDFs fra 3 mm rund hud biopsier utført av kvalifiserte leger.
  2. Coat tre brønner av en vev kultur-behandlet 6-brønn plate med 500 μL av 0,1% gelatin og ruge i 20 min ved 37 ° c.
  3. Aspirer den resterende gelatin løsningen og tilsett 750 μL av DMEM/20% FBS til hver brønn. Hele overflaten av brønnen bør dekkes med medium.
  4. Tilsett 1,5 mL DMEM/20% FBS på innsiden av en steril 100 mm Petri parabol lokk og spre slipp ved hjelp av en 5 mL serologisk pipette.
  5. Plasser huden biopsi i mediet på lokket med sterilisert tang.
  6. Analysere huden biopsi i ni identiske seksjoner, ved hjelp av en sterilisert skalpell å holde biopsi på plass og en andre skalpell å kutte.
  7. Plasser tre biopsi stykker per brønn ved hjelp av spiss tang. Sørg for at brikkene festes til bunnen av brønnen.
  8. Legg en 22 mm dekkglass på toppen av brikkene og påfør litt press.
  9. Ruge platen ved 37 ° c, 5% CO2, for en uke. Kontroller celler daglig og tilsett 200 μL av DMEM/20% FBS hver 2 dager for å erstatte fordampet medium.
  10. Etter en uke, tilsett opp til 2 mL DMEM/20% FBS og erstatte medium hver 2 − 3 dager.
  11. Passage celler på 1:4 ratio når brønnene er confluent (ca 4 − 8 uker).
    1. Forbered 0,1% gelatin belagt vev kultur-behandlet 6-brønn plater.
    2. Aspirer medium fra brønner på 80% confluency og vask en gang med 1 mL PBS.
    3. Fjern dekkglass med steril tang og plasser dekkglass i en ny brønn av en 6-brønn plate, med vevet side opp.
      Merk: Celler som forble festet til dekkglass vil også høstes.
    4. Tilsett 500 μL av dissosiasjon oppløsning (innholdsfortegnelsen) per brønn (inkludert brønner med coverslips) og ruge ved 37 ° c, 5% co2 for 5 − 10 min. Sjekk når cellene begynner å stige fra bunnen av brønnen og Deaktiver den dissosiasjon løsningen ved legge til 500 μL av DMEM/20% FBS til hver brønn.
    5. Samle fibroblaster fra alle brønnene til et 15 mL konisk rør. Legg ekstra medium til brønnene for å samle de resterende cellene. Sentrifuger røret ved 350 x g i 5 min.
    6. I mellomtiden, tilsett 500 μL av DMEM/20% FBS til hver brønn av tidligere gelatin belagte plater.
    7. Aspirer medium og resuspend fibroblaster i 6 mL DMEM/20% FBS.
    8. Tilsett 500 μL av Fibroblast fjæring til hver brønn (to 6-brønn plater per prøve/giver totalt). Ruge celler over natten ved 37 ° c, 5% CO2.
  12. På neste dag, tilsett 1 mL DMEM/20% FBS til hver brønn. Erstatt medium med 2 mL DMEM/20% FBS hver 2 − 3 dager til brønnene er 80% confluent.
  13. Gjenta Seksjon 2,11 for tre confluent brønner inntil tredje passasje er nådd.
  14. Frys fibroblaster fra confluent brønner (passasjer 1 og 3).
    1. Aspirer medium fra brønnene og vask en gang med 1 mL PBS.
    2. Distansere og samle fibroblaster som beskrevet i trinn 2.11.4 og 2.11.5.
    3. Telle celler med en hemocytometer og sentrifuger røret ved 350 x g i 5 min.
    4. Etter sentrifugering, aspirer medium og resuspend fibroblaster i FBS med 10% DMSO i en tetthet på 5 x 105 celler/ml.
    5. Tilsett 1 mL av celle suspensjonen per cryovial og fryse celler over natten ved-80 ° c ved hjelp av en fryse beholder. Flytt hetteglass til-150 ° c (flytende nitrogen) for langtidsoppbevaring.

3. Lentiviral produksjon

  1. Grow HEK293T celler i en 100 mm vev kultur-behandlet parabolen med 10 mL komplett DMEM, ved 37 ° c, 5% CO2, inntil confluency er nådd.
  2. På dagen før transfeksjoner, aspirer medium og vask parabolen forsiktig med 5 mL PBS.
  3. Etter å ha fjernet PBS, tilsett 1,5 mL dissosiasjon oppløsning og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for 5 − 10 min for å distansere celler fra fatet.
    Merk: Det anbefales å varme både PBS og dissosiasjon løsning før du bruker, slik at cellene ikke lide en termisk sjokk.
  4. Deaktiver dissosiasjon løsning med 3 mL komplett DMEM og Overfør celle fjæringen til et 15 mL konisk rør. Vask fatet med 5 mL komplett DMEM for å fjerne gjenværende vedlagte celler og overføre dette volumet til 15 mL konisk rør.
  5. Sentrifuge celle fjæring ved 350 x g i 5 min.
  6. Aspirer supernatanten og del celle pellet jevnt mellom 6 100 mm vev kultur-behandlet retter i et endelig volum på 10 mL av komplett DMEM per fat. Celler bør være omtrent 60% confluent ved tidspunktet for transfeksjoner.
  7. På den neste dagen blander transfect celler med plasmider som følger:
    Merk:     denne delen av protokollen beskriver produksjon av lentiviruses i 1 100 mm vev kultur-behandlet parabolen per plasmider mix. For å få høyere volumer av lentiviral supernatanten for konsentrasjon, bruk minst 4 100 mm HEK293T cellekultur retter per mix.
    1. I et 15 mL konisk rør, tilsett 10 μg av de tre overførings plasmider sammen: 3,33 mikrogram pFUW-tetO-GATA2 (Addgene plasmider #125028)14, 3,33 mikrogram PFUW-TETO-GFI1B (Addgene #125597)14 og 3,33 μg av PFUW-TetO-Fos (Addgene #125598)14, pluss 10 μg av 2nd generasjon psPAX2 emballasje vektor koding av gag, Pol, TAT og rev gener (Addgene #12260) og 5 μg av pMD2. G konvolutt Vector koding VSV-G genet (Addgene #12259). Tilsett vann opptil 500 μL.
    2. I to nye 15 mL koniske rør tilsett 10 μg av FUW-M2rtTA plasmider (Addgene #20342)17, 10 μg av psPAX2 emballasje vektor og 5 μg av PMD2. G konvolutt vektor til hvert rør. Tilsett vann opptil 500 μL. Ett rør skal brukes som en kontroll.
    3. Til hvert rør tilsett 62,5 μL av 2 M CaCl2. Deretter slipper du bobler i hver blanding ved hjelp av en Pasteur-Pipet som er satt inn i en Pipet-kontroller. Mens boblene dannes, Pipetter 500 μL av n, n-BIS(2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES) bufret saltvann (pH 7,1, 25 ° c), med en P1000 pipette, drop-Wise mot Pasteur Pipet og på blandingen.
    4. Ruge rør i romtemperatur i minst 15 min. Den blandinger vises litt skyet etter en tid.
  8. I mellomtiden, aspirer medium fra HEK293T celle retter (passert dagen før) og tilsett 10 mL komplett DMEM uten antibiotika. Vær forsiktig og legge medium sakte som HEK293T celler er semi-tilhenger.
  9. Fordel hver enkelt blanding (ca 1 mL) jevnt og drop-klok i separate retter og ruge over natten ved 37 ° c, 5% CO2.
  10. Bytt medium med 4 mL fullstendig DMEM, 24 h etter inkubasjons. Ruge over natten ved 37 ° c, 5% CO2. Hvis tilgjengelig, ruge i stedet ved 32 ° c, 5% CO2, da den reduserte temperaturen vil øke halveringstiden av de lentiviral partiklene.
  11. Samle supernatanten med lentiviral partikler tre ganger til et 50 mL konisk rør. Ikke bland forskjellige lentiviral partikler på dette punktet. Hver rett vil resultere i 12 mL lentiviral supernatanten. Fire retter av samme viral forberedelse passer inn i 1 50 mL konisk rør.
    FORSIKTIG:     Utfør lentiviral samling i en biosafety nivå-2 laboratorium i en laminær Flow hette dedikert for lentiviral arbeid og sted viral forurenset avfall (rør, tips, retter) i en passende beholder for biologisk farlige materialer.
    1. Gjør den første samlingen 16 timer etter siste inkubasjons og tilsett 4 mL komplett DMEM. Ruge ved 37 ° c, 5% CO2.
    2. Gjør den andre samlingen 8 h etter den første til samme rør, tilsett 4 mL komplett DMEM og ruge ved 37 ° c, 5% CO2.
    3. Gjør den tredje samlingen 16 h etter den andre til samme rør og forkaste rettene.
      Merk: Oppbevar lentiviral supernatanter ved 4 ° c etter hver kolleksjon.
  12. Filtrer hver lentiviral supernatanten ved hjelp av en 0,45 μm lav-proteinbinding filter med en cellulose acetate membran (tabell av materialer) til et rent rør.
  13. Tilsett maksimalt 15 mL filtrert supernatanten til en sentrifugal Filterenhet med en generert cellulosemembran (tabell av materialer) og snurr ved 4 000 x g i 25 min, ved 4 ° c. Kast gjennomstrømning. En viskøs væske som inneholder lentiviruses, blir liggende i filterenheten.
  14. Gjenta trinn 3,13 ved å legge til 15 mL supernatanten oppå filterenheten, til det ikke er mer lentiviral supernatanten igjen.
    Merk: Når det bare er noen få milliliter av supernatanten å konsentrere seg, redusere spinning tiden til 10 min. Hvis det fortsatt er ekstra væske (ikke-viskøs) på filteret, sentrifuger for ytterligere 10 min.
  15. Lag alikvoter (50 − 200 μL, avhengig av det opprinnelige supernatanten volumet) av hver type konsentrert lentiviruses og oppbevar ved-80 ° c for langtidslagring (1 − 2 år) eller ved 4 ° c for kortvarig lagring (1 − 2 uker).
    Merk: Konsentrert eller ikke-konsentrert lentiviruses kan også brukes friskt. Ikke re-fryse og tine som dette resulterer i redusert titer.

4. Hemogenic omprogrammering

Merk: Bruk HDFs med et passasje nummer på tre (P3) eller høyere (til P10) for å utføre omprogrammering eksperimenter.

  1. Coat en 100 mm vev kultur-behandlet parabolen med 5 mL av 0,1% gelatin og ruge ved 37 ° c i 20 min. aspirer den resterende gelatin løsning.
  2. Tin en Fibroblast hetteglass og plate celler i 0,1% gelatin-belagt parabolen. Ruge over natten ved 37 ° c, 5% CO2. Hvis det er nødvendig, utvide fibroblaster for en lengre periode til ønsket passasje og confluency er nådd.
  3. Coat en 6-brønn vev kultur-behandlet plate med 500 μL av 0,1% gelatin løsning og ruge ved 37 ° c i 20 min. Fjern ekstra gelatin.
  4. Plate HDFs i en tetthet på 150 000 celler per plate (25 000 celler per brønn) i 2 mL komplett DMEM per brønn. Ruge over natten ved 37 ° c, 5% CO2, for å tillate celle vedlegg.
  5. Bytt medium med 2 mL komplett DMEM pluss 8 μg/mL polybrene. Forbered et 1:1-forhold blanding av basseng-produsert TF lentiviruses og M2rtTA i en ny mikrosentrifugen tube.
    Merk: I denne protokollen, Pool-produksjon av lentiviruses for de tre TFs utføres, som i forfatternes hender, resulterer i høyere omprogrammering effektivitet. Alternativt er det foreslått å utføre en titrering av de enkelte lentiviral partikler av qPCR18, på en standard cellelinje. Dette vil bli brukt til å definere volumet av enkelte virus er nødvendig for å møte et mangfold av smitte (MOI) optimal for co-Transduction og hemogenic omprogrammering.
  6. Fordel 10 til 100 μL av lentiviral blanding per brønn, til overfører HDFs. Dette er dag-2 av omprogrammering.
    Merk: Å definere det optimale volumet av lentiviral blanding for effektiv omprogrammering, uten at det går ut over celle levedyktigheten, krever optimalisering (se utfyllende figur 1 for mer informasjon). HDFs med mer enn 7 passasjer kan kreve høyere volumer av virus enn celler med lavere passasjer.
  7. Etter 16 h av inkubasjons, fjerne virus og legge komplett DMEM. Tillat at celler gjenopprettes for 6 − 8 timer.
  8. Etter utvinning, aspirer medium og tilsett 2 mL komplett DMEM med 8 μg/mL polybrene.
  9. Gjør en andre Transduction som beskrevet i trinn 4,6 og ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for 16 timer. Dette er dag-1 av omprogrammering. Den lentiviral blandingen kan tilberedes på dag-2 for både transductions og oppbevares ved 4 ° c.
  10. På neste dag, fjerne virus og legge komplett DMEM supplert med 1 μg/mL DOX. Dette er dag 0 av omprogrammering. Ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for 48 h.
  11. På dag 2 av omprogrammering, dele hver brønn på 1:2 ratio.
    1. Aspirer medium og vaske celler med 1 mL PBS.
    2. Aspirer PBS og distansere celler med 500 μL av dissosiasjon løsning. Ruge 5 − 10 min ved 37 ° c, 5% CO2.
    3. Deaktiver den dissosiasjon løsningen med 1 mL komplett DMEM og samle celler i et konisk rør. Sentrifuger på 350 x g i 5 min.
    4. Resuspend pellet i blodkreft medium (se trinn 1,3), supplert med 1 μg/mL DOX, og plate celler i nye vev kultur-behandlet 6-brønn plater belagt med 0,1% gelatin til et endelig volum på 2 mL per brønn.
  12. Endre medium (blodkreft medium pluss DOX) to ganger i uken for varigheten av omprogrammering kulturer (25 dager).
  13. Analyser resulterende omprogrammeres celler på ulike tidspunkt ved brightfield eller fluorescens mikroskopi (se supplerende figur 2), Flow flowcytometri, bulk og Single-Cell RNA sekvensering, og transplantasjon analyser for erverv av blodkreft morfologi, tilstedeværelsen av endothelial og blodkreft markører, oppkjøp av endothelial/blodkreft genuttrykk profil og gjenfødelse kapasitet14.

5. optimering av Fibroblast ekspansjon for flis-SEQ analyse ved utbruddet av Hemogenic omprogrammering

  1. Plate 300 000 HDFs (< P8) i 0,1% gelatin belagt vev kultur-behandlet 6-brønn plater med komplett DMEM til et endelig volum på 2 mL per brønn. Ruge over natten ved 37 ° c, 5% CO2.
  2. Neste dag, Erstatt medium med komplett DMEM supplert med 8 μg/mL polybrene.
  3. Overfører celler med individuelle faktorer: pFUW-tetO-FOS14, PLV-TETO-ha-GFI1B (Addgene #125599)14 og PFUW-TETO-3XFLAG-GATA2 (Addgene #125600)14 eller med en pool av de tre faktorene, pluss FUW-M2rtTA på 1:1 ratio. Bruk 10 − 20 μL total virus (individuelle TF + M2rtTA eller tre TFs + M2rtTA). Ruge celler over natten ved 37 ° c, 5% CO2.
    Merk: Det anbefales å bruke tolv 6-brønn plater per betingelse (for hver enkelt TF og de tre TFs kombinert).
  4. Fjern lentiviruses og Legg til fullstendig DMEM 16 timer etter den første Transduction. La cellene gjenopprette for 6 − 8 t.
  5. Overfører celler en gang med samme mengde virus per tilstand og ruge ved 37 ° c, 5% CO2.
  6. På neste dag fjerne virus og legge komplett DMEM. Ruge ved 37 ° c, 5% CO2 for 24 h.
  7. Re-plate hver brønn i en 0,1% gelatin belagt vev kultur-behandlet 100 mm rett med komplett DMEM til et endelig volum på 10 mL per tallerken. Dette representerer omtrent en 1:6 passasje.
  8. Tillat celler å vokse i 6 dager ved 37 ° c, 5% CO2.
  9. På dag 6 etter re-plating, aspirer medium og tilsett komplett DMEM med 1 μg/mL DOX. Ruge celler ved 37 ° c, 5% CO2 for 2 dager.
  10. Samle fibroblaster og analysere genomisk bindende områder av de tre TFs transduced individuelt eller i kombinasjon, av ChIP-SEQ 2 dager etter DOX kosttilskudd14.
    Merk: De siste 72 100 mm rettene vil inneholde mellom 20 − 50 x 106 celler, som er tilstrekkelig til å utføre ChIP-SEQ-eksperimenter og-replikeres.

Representative Results

En skjematisk fremstilling av omprogrammering tilnærmingen ved hjelp av HDFs er illustrert i figur 1A. Fibroblaster er ervervet fra kommersielle kilder eller samlet inn fra menneskelige donorer og utvidet in vitro tidligere til omprogrammering. Etter plating, celler er transduced to ganger med GATA2, GFI1B og FOS (og M2rtTA) lentiviruses, og Doxycycline legges på dag 0 av omprogrammering. På dag 2, celler er splittet og belagt i blodkreft medium til dag 25 av kulturen. Omprogrammeres celler kan genereres på ulike tidspunkt poeng for flere applikasjoner, inkludert transplantasjon i immunsupprimerte mus, Single-celle RNA-sekvensering (scRNA-SEQ) av renset celle populasjoner (dag 2 usortert, dag 15 CD49f+ CD34 og dag 25 CD49f+CD34+ celler), så vel som mikroskopi og flyt flowcytometri analyse for celleoverflaten markører CD49F, CD34, CD9 og CD143. Representative flowcytometri tomter viser ~ 17% av omprogrammeres celler uttrykker både CD49f og CD9 (figur 1B, venstre panel), etter 25 dager med omprogrammering. Flertallet av doble positive celler uttrykke CD143 (~ 86%), og en liten befolkning uttrykke CD34 (0,9%), noe som tyder på en dynamisk hemogenic skjebne induksjon. Disse markørene er ikke aktivert i M2rtTA transduced HDFs kultivert for 25 dager (figur 1B, høyre panel). Immunofluorescence bilder bekrefter uttrykk for CD9 og CD143 i tilhenger og runde celler, morfologisk forskjellig fra fibroblaster som er negative for disse markørene (figur 1C). Human hemogenic kolonier også uttrykke CD49f og CD3414. ScRNA-SEQ-analyse av HDFs, dag 2 usortert celler og renset omprogrammeres celler ved dag 15 (CD49f+CD34-) og dag 25 (CD49f+CD34+) viser en trinnvis økning i CD49f, CD9 og CD143 uttrykk fra dag 2 til dag 25. CD49f og CD9 positive celler vises først under omprogrammering prosessen, mellom dag 2 og 15, noe som indikerer at disse molekylene kan representere markører for tidlig menneskelig hemogenesis. CD143 uttrykket begynner å bli oppdaget på dag 15 og CD34 uttrykke celler oppdages bare ved senere tidspunkt (dag 25). CD34+ navlestreng blod (UCB) celler ble brukt som referanse (figur 1D).

Figur 2a beskriver en modifisert protokoll for å generere tilstrekkelig antall celler for ChIP-SEQ analyse på den innledende stadier av hemogenic omprogrammering (dag 2). Først HDFs er belagt på en tetthet to ganger høyere enn i standardprotokollen (300 000 celler versus 150 000 celler per plate). Etter Transduction, er hver brønn re-belagt inn i en 100 mm parabolen slik at cellene til å ekspandere i 6 dager før supplere medium med DOX. Celler analyseres 2 dager etter at du har lagt til DOX og påfølgende TF-uttrykk. Figur 2B viser Genova nettleserprofiler av GATA2 binding til genomisk regulatoriske regioner av ITGA6 og ess når cellene er co-transduced med de tre faktorene (3TFs) eller GATA2 individuelt. GATA2 binder seg også til å åpne kromatin regioner av CD9 og CD34 gener14.

Figure 1
Figur 1: induksjon av hemogenic skjebne i humant dermal fibroblaster. (A) eksperimentell strategi for hemogenic omprogrammering av menneskelig dermal fibroblaster (HDFs). Fibroblaster fra hud biopsier samles fra donorer, utvides og transduced med GATA2, GFI1B, FOS og M2rtTA lentiviruses. Doxycycline (DOX) er lagt til kulturen på dag 0 av omprogrammering og celler blir analysert på flere tidspunkter før dag 25. scRNA-SEQ, enkelt celle RNA-sekvensering. FACS, fluorescens-aktivert Cell sortering. (B) gating strategi brukes til å evaluere uttrykk for hemogenic/blodkreft markører ved flyt flowcytometri på dag 25 etter Transduction med de tre transkripsjon faktorer (3TFs). Flowcytometri tomter viser prosentandel av doble positive celler for CD49f og CD9, gated i live-cellen befolkning (DAPI-negative). I den doble positive populasjonen vises uttrykket for CD143 og CD34. HDFs transduced bare med M2rtTA virus under samme kultur forhold brukes som kontroll. (C) Immunofluorescence bilder av dag 25 omprogrammeres kolonier som bekrefter UTTRYKKET av CD9 (øvre panel) og CD143 (nedre panel). Celler ble farget med antistoffer (tabell av materialer) fortynnet 1:100 i PBS/2% FBS med mus serum, inkubert 20 min ved 37 ° c, 5% co2, vasket tre ganger og avbildet i PBS/2% FBS. Fase, fase-gradient kontrast. Skala bars = 50 μm. (D) ScRNA-SEQ analyse av 253 celler på ulike tidspunkt poeng. Uttrykk for ITGA6, CD9, Ace og CD34 aktiveres under omprogrammering. Celler samles inn ved dag 2 (usortert), dag 15 (CD49f+CD34-) og dag 25 (CD49f+CD34+). HDFs og CD34+ navlestreng blod (34 + UCB) celler brukes som referanser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: utvidelse av menneskelig dermal fibroblaster for ChIP-SEQ-analyse. (A) eksperimentell strategi som viser en modifisert protokoll for å generere høyt antall transduced menneskelig dermal fibroblaster (HDFs) for ChIP-SEQ på dag 2 av omprogrammering. 300 000 celler er belagt i 6-brønn plater og transduced to ganger med individuelle faktorer (pFUW-tetO-FOS, pLV-tetO-HA-GFI1B eller pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) eller en kombinasjon av de tre faktorene (pluss M2rtTA). Etter fjerner viruser, fibroblaster er expanded for seks dager inne 100 mm fat. Doxycycline (DOX) er lagt til på dag 0 og celler samles to dager etter DOX tillegg. (B) Genova nettleserprofiler fremhever GATA2-bindende nettsteder (grå bokser) på ITGA6 og Ace Loci to dager etter Transduction med de tre transkripsjon FAKTORENE (3TFs) eller med GATA2 alene. Det totale antallet tilordnede leser representeres på y-aksen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1: definere et optimalisert lentiviral volum for effektiv hemogenic omprogrammering. Økende volum av konsentrert (10 til 100 μL) basseng-produserte lentiviral partikler (3TFs: GATA2, GFI1B og FOS) brukes til å overfører menneskelig dermal fibroblaster (HDFs), sammen med M2rtTA i et forhold på 1:1, følgende trinn 4.5 − 4.12 av protokollen. Omprogrammeres celler er analysert på dag 25 for å definere et optimalt volum av Transduction for hemogenic omprogrammering, gitt av prosentandelen av CD49f+CD9+ celler gated in Live-celler (DAPI-negative). Celle levedyktighet kan vurderes ved Kvantifisere det absolutte antallet levende celler på dag 25. HDFs-transduced med M2rtTA (100 μL) brukes som negativ kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 2
Supplerende figur 2: morfologi endringer under hemogenic omprogrammering av menneskelig dermal fibroblaster. Human dermal Fibroblast (HDF) kulturer er avbildet på dagen av den første Transduction (dag-2), når DOX er lagt til kulturer (dag 0), to dager (dag 2) og femten dager (dag 15) etter DOX kosttilskudd, og på slutten-punktet av eksperimentet (dag 25). Hemogenic kolonier på dag 15 og 25 er uthevet. Skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I denne artikkelen er en metode beskrevet for å generere blodkreft stamceller direkte fra menneskelig fibroblaster, som går gjennom en HP celle mellomliggende, på samme måte som definitive HSCs14.

Pool-produksjon av lentiviral partikler koding GATA2, GFI1B og FOS ble foretrukket over individuell produksjon, siden i våre hender det resulterer i høyere omprogrammering effektivitet (upubliserte data). Lentiviruses, som medlemmer av Retroviridae -familien, inneholder normalt to eksemplarer av positiv enkelt strandet RNA19. Den økte omprogrammering effektivitet kan skyldes pakking av to forskjellige transgenes i samme lentiviral partikkel, noe som resulterer i økt antall celler co-transduced med de tre transkripsjon faktorer. For å sikre suksess for denne protokollen, er det nødvendig å overfører HDFs med tilstrekkelig mengde virus avhengig av celle passasje for å få en optimal balanse mellom omprogrammering effektivitet og celle levedyktighet, som anbefalt i trinn 4,6. Dessuten, frisk ingen-konsentrerte viruser kan brukes. Det anbefales å overfører celler med 0,5-3 mL 3TFs basseng og M2rtTA. I tillegg bør celle tetthet justeres i henhold til programmet. 150 000 HDFs per 6-brønn plate (trinn 4,4) gitt optimal tetthet for å utføre FACS, transplantasjon og flyt flowcytometri analyse av omprogrammeres celler. For eksperimenter med ChIP-SEQ ble det krevd flere celler fra begynnelsen (trinn 5,1). Det er viktig å sjekke celler regelmessig for morfologiske endringer og erstatte blodkreft medium to ganger i uken for å støtte fremveksten av indusert blodkreft celler. Tilsetting av blodkreft cytokiner eller co-kultur i mater lag kan øke omprogrammering effektivitet.

Med denne metoden, kan vi identifisere nye blodkreft markører som er dynamisk uttrykt under hemogenic omprogrammering. CD9, som ble vist å være opp-regulert i omprogrammeres celler på transcriptional nivå14, er raskt uttrykt på celleoverflaten i de innledende fasene av omprogrammering sammen med CD49F og CD143, som fungerer som en ny markør for menneskelige HSC forløpere. Vi viser også at ITGA6 og ess er direkte mål for GATA2 under den innledende stadier av hemogenic omprogrammering, i tillegg til CD9 og CD3414, som gir en direkte mekanistisk kobling mellom menneskelig hemogenic forløperen fenotype og GATA2.

En fordel med dette systemet ligger i bruk av relativt homogene Fibroblast kulturer. Mens PSCer er lett utvides og vedlikeholdes in vitro, differensiering protokoller generere heterogene populasjoner som inkluderer blodkreft forfedre, som engraft dårlig5,6,7. Videre er det en risiko for tumorigenesis når transplantere PSC-avledet HSPCs, siden udifferensierte PSCer kan fortsatt være i kultur selv etter å ansette differensiering protokoller. Alternativt for å fibroblaster, direkte omprogrammering til HSCs har blitt brukt på blod-begått forfedre20 og endothelial celler21. Men starter med blod-begrenset stamceller hindrer terapeutisk anvendelse av den resulterende HSCs Hvis pasienten bærer mutasjoner som påvirker stammen/stamfar blodkreft befolkning22. I tilfelle av endothelial celler, disse er vanskeligere å oppnå i forhold til fibroblaster, og utgjør en svært heterogen celle befolkning i form av fenotype, funksjon og struktur, som er organ-avhengige23. Andre studier har lyktes i omprogrammering mus fibroblaster inn engraftable blodkreft forfedre24,25 ennå, så langt, ingen annen protokoll beskriver generering av HSPC-lignende celler fra menneskelige fibroblaster.

Denne tilnærmingen, kombinert med farmakologisk hemming, gen knock-out, eller knock-Down tillater å definere individuelle eller kombinasjon av faktorer som er nødvendige for å direkte indusere menneskelig HSCs. ansette høy effektivitet screening metoder basert på siste CRISPR-Cas9 teknologier i HDFs før omprogrammering, representerer en spennende oppgave for å definere romanen regulatorer av menneskelig definitive hematopoiesen. I fremtiden, omprogrammering ikke-blod relaterte menneskelige celletyper som fibroblaster vil tjene som en plattform for å generere sunne pasient-skreddersydd blodkreft stamceller for kliniske applikasjoner.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Knut og Alice Wallenberg stiftelse, det medisinske fakultet ved Lunds universitet og region Skåne er anerkjent for sjenerøs finansiell støtte. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Olle Engkvists stiftelse (194-0694 til Filipe Pereira) og PhD stipend fra Fundação para a Ciência e Tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 til Filipe Pereira, og SFRH/BD/135725/2018 og SFRH/BD/51968/2012 til Rita Alves og Andreia Gomes). Denne studien ble også støttet av midler fra NIH og NYSTEM (1R01HL119404 og C32597GG til Kateri A. Moore).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter Corning #430625
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich #M6250
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581 BioLegend #343518
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9 BD Biosciences #557929
BES buffered saline Sigma-Aldrich #14280
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich #449709
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich #UFC903096
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1x) no phenol red Gibco #12604-021
Doxycycline hyclate (DOX) Sigma-Aldrich #D9891
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7 Invitrogen #25-0495-82
FUW-M2rtTA Addgene #20342
Gelatin from Porcine Skin Type A Sigma-Aldrich #G1890
Gibco L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific #25030-024
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher Scientific #11140-035
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100 STEMCELL Technologies #05150
Hexadimethrine bromide (polybrene) Sigma-Aldrich #H9268
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) ScienCell #2320
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) GE Healthcare #SH30243.01
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) GE Healthcare #SV30160.03
HyClone Penicillin Streptomycin 100x Solution (Pen/Strep) GE Healthcare #SV30010
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS) GE Healthcare #SH30256.01 
Hydrocortisone STEMCELL Technologies #7904
Mouse serum Sigma-Aldrich #M5905
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a BioLegend #312105
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 Addgene #125600
pFUW-tetO-FOS Addgene #125598
pFUW-tetO-GATA2 Addgene #125028
pFUW-tetO-GFI1B Addgene #125597
pLV-tetO-HA-GFI1B Addgene #125599
pMD2.G Addgene #12259
psPAX2 Addgene #12260

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ivanovs, A., et al. Highly potent human hematopoietic stem cells first emerge in the intraembryonic aorta-gonad-mesonephros region. Journal of Experimental Medicine. 208, 2417-2427 (2011).
  2. Tavian, M., Biasch, K., Sinka, L., Vallet, J., Péault, B. Embryonic origin of human hematopoiesis. International Journal of Developmental Biology. 1065, 1061-1065 (2010).
  3. Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138, 1017-1031 (2011).
  4. Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
  5. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends in Cell Biology. 26, 202-214 (2016).
  6. Vo, L., Daley, G. De novo generation of HSCs from somatic and pluripotent stem cell sources. Blood. 125, 2641-2648 (2015).
  7. Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121, 770-781 (2013).
  8. Ebina, W., Rossi, D. J. Transcription factor-mediated reprogramming toward hematopoietic stem cells. EMBO Journal. 34, 694-709 (2015).
  9. Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
  10. Pereira, C. F., et al. Induction of a Hemogenic Program in Mouse Fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
  11. Pereira, C. F., et al. Hematopoietic Reprogramming In vitro Informs In Vivo Identification of Hemogenic Precursors to Definitive Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 36, 525-539 (2016).
  12. Notta, F., et al. Isolation of Single Human Hematopoietic Stem Cells Capable of Long-Term Multilineage Engraftment. Science. 333, 218-221 (2011).
  13. Sinka, L., Biasch, K., Khazaal, I., Péault, B., Tavian, M. Angiotensin-converting enzyme (CD143) specifies emerging lympho-hematopoietic progenitors in the human embryo. Blood. 119, 3712-3724 (2012).
  14. Gomes, A. M., et al. Cooperative Transcription Factor Induction Mediates Hemogenic Reprogramming. Cell Reports. 25, 2821-2835 (2018).
  15. Karlsson, G., et al. Report The Tetraspanin CD9 Affords High-Purity Capture of All Murine Hematopoietic Stem Cells. Cell Reports. 4, 642-648 (2013).
  16. Leung, K. T., et al. The tetraspanin CD9 regulates migration, adhesion, and homing of human cord blood CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 117, 1840-1851 (2011).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3, 346-353 (2008).
  18. Kutner, R. H., Zhang, X., Reiser, J. Production concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4, 495-505 (2009).
  19. Suzuki, Y. S., Suzuki, Y. Gene Regulatable Lentiviral Vector System. Viral Gene Therapy. Ke, X. , (2011).
  20. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157, 549-564 (2014).
  21. Lis, R., et al. Conversion of adult endothelium to immunocompetent haematopoietic stem cells. Nature. 545, 439-445 (2017).
  22. Pereira, C., Lemischka, I. R., Moore, K. From blood to blood’: de-differentiation of hematopoietic progenitors to stem cells. EMBO Journal. 33, 1511-1513 (2014).
  23. Nolan, D. J., et al. Molecular Signatures of Tissue-Specific Microvascular Endothelial Cell Heterogeneity in Organ Maintenance and Regeneration. Developmental Cell. 26, 204-219 (2013).
  24. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct Reprogramming of Murine Fibroblasts to Hematopoietic Progenitor Cells. Cell Reports. 9, 1871 (2014).
  25. Cheng, H., et al. Reprogramming mouse fibroblasts into engraftable myeloerythroid and lymphoid progenitors. Nature Communications. 7, 1-15 (2016).

Tags

Utviklingsmessige Biology hemogenic omprogrammering Fibroblast transkripsjon faktorer hematopoiesen blodkreft stem og stamceller endothelial-til-blodkreft overgang

Erratum

Formal Correction: Erratum: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors
Posted by JoVE Editors on 12/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. The author affiliations were updated.

The second author affiliation was updated from:

2Wallenberg Center for Molecular, Lund University

to:

2Wallenberg Center for Molecular Medicine, Lund University

Hemogenic omprogrammering av Human fibroblaster av tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Silvério-Alves, R., Gomes, A.… More

Silvério-Alves, R., Gomes, A. M., Kurochkin, I., Moore, K. A., Pereira, C. F. Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors. J. Vis. Exp. (153), e60112, doi:10.3791/60112 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter