Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Enkelt synapse indikatorer for glutamat frigivelse og optagelse i akut hjerne skiver fra normal og Huntington Mus

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60113
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

Summary

Vi præsenterer en protokol til at evaluere balancen mellem glutamat frigivelse og clearance på enkelt korticostriatal glutamatergic synapser i akutte skiver fra voksne mus. Denne protokol bruger fluorescerende sensor iGluu til glutamat detektion, en sCMOS kamera til signal erhvervelse og en enhed til fokal laser belysning.

Abstract

Synapser er stærkt opdelte funktionelle enheder, der fungerer uafhængigt på hinanden. Ved Huntingtons Sygdom (HS) og andre neurodegenerative lidelser kan denne uafhængighed blive kompromitteret på grund af utilstrækkelig glutamatclearance og de deraf følgende udslips- og udslipseffekter. Ændret astrocytisk dækning af de presynaptiske terminaler og/eller dendritiske pigge samt en reduceret størrelse af glutamattransporterklynger på glutamatfrigivelsessteder har været involveret i patogenesen af sygdomme, der resulterer i symptomer på dys-/hyperkinesi. Men de mekanismer, der fører til dysfunktion af glutamatergic synapser i HS, er ikke godt forstået. Forbedring og anvendelse synapse imaging vi har fået data kaste nyt lys over de mekanismer, der hindrer indledningen af bevægelser. Her beskriver vi de vigtigste elementer i en relativt billig tilgang til at opnå en enkelt synapse opløsning ved hjælp af den nye genetisk kodede ultrahurtige glutamat sensor iGluu, wide-field optik, en videnskabelig CMOS (sCMOS) kamera, en 473 nm laser og en laser positionering system til at vurdere tilstanden af korticostriatal synapser i akutte skiver fra alder passende sunde eller syge mus. Glutamattransienter blev konstrueret ud fra enkelte eller flere pixels for at opnå skøn over i) glutamatfrigivelse baseret på den maksimale højde af glutamatkoncentrationen [Glu] ved siden af den aktive zone og ii) glutamatoptagelse som afspejlet i tidskonstanten af henfald (TauD) af perisyaptisk [Glu]. Forskelle i hvilebouton størrelse og kontrasterende mønstre af kortsigtede plasticitet tjente som kriterier for identifikation af korticostital terminaler som tilhører intratelencephalic (IT) eller pyramideformede tarmkanalen (PT) vej. Ved hjælp af disse metoder opdagede vi, at i symptomatiske HS-mus ~ 40% af PT-type korticostriatal synapser udviste utilstrækkelig glutamat clearance, hvilket tyder på, at disse synapser kan være i risiko for excitotoksiske skader. Resultaterne understreger nytten af TauD som en biomarkør for dysfunktionelle synapser hos HS-mus med en hypokinetisk fænotype.

Introduction

Den relative virkning af hver synaptisk terminal, der tilhører en "enhedsforbindelse" (dvs. forbindelsen mellem 2 nerveceller) vurderes typisk ved dens indflydelse på det oprindelige segment af den postsynaptiske neuron1,2. Somatiske og/eller dendritiske optagelser fra postsynaptiske neuroner udgør de mest almindelige og indtil nu også de mest produktive midler til at afklare informationsbehandling under et top-down eller vertikalt perspektiv3,4,5. Tilstedeværelsen af astrocytter med deres diskrete og (i gnavere) ikke-overlappende områder kan imidlertid bidrage med et horisontalt perspektiv , der er baseret på lokale mekanismer for signaludveksling, integration og synkronisering på synaptiske steder6,7,8,9,10.

Fordi det er kendt, at astroglia spiller, i almindelighed, en stor rolle i patogenesen af neurodegenerative sygdomme11,12 og især en rolle i vedligeholdelse og plasticitet af glutamatergic synapser13,14,15,16, er det tænkeligt, at ændringer i synaptiske ydeevne udvikler sig i overensstemmelse med tilstanden af astrocytter i det fælles målområde af ferente fibre med forskellig oprindelse. For yderligere at undersøge de mål-/astroglia-afledte lokale reguleringsmekanismer inden for sundhed og sygdom er det nødvendigt at evaluere individuelle synapser. Denne tilgang blev udarbejdet for at vurdere rækken af funktionelle glutamat frigivelse og clearance indikatorer og til at definere kriterier, der kan anvendes til at identificere dysfunktionelle (eller genvundne) synapser i hjernen områder tættest relateret til bevægelse indledning (dvs. først og fremmest i den motoriske cortex og dorsale striatum).

Striatum mangler iboende glutamatergic neuroner. Derfor er det relativt let at identificere glutamatergic afferents af extrastriatal oprindelse. Sidstnævnte stammer for det meste i den mediale thalamus og i hjernebarken (se17,18,19,20 for mere). Korticostriatal synapser dannes af axoner af pyramideformede neuroner lokaliseret i kortikale lag 2/3 og 5. De respektive axoner danner bilaterale intra-telencephalic (IT) forbindelser eller ipsilaterale forbindelser via et fibersystem, der mere caudally udgør den pyramideformede tarmkanalen (PT). Det er endvidere blevet foreslået , at it- og PT-typeterminaler er forskellige med hensyn til deres frigivelseskarakteristika og størrelse21,22. I lyset af disse data kunne man også forvente visse forskelle i håndteringen af glutamat.

Striatum er det hårdest ramte hjerneområde ved Huntingtons Sygdom (HS)5. Human HS er en alvorlig genetisk arvelig neurodegenerativ lidelse. Q175-musemodellen giver mulighed for at undersøge det cellulære grundlag af den hypokinetiske stive form for HS, en tilstand, der har meget til fælles med parkinsonisme. Starter i en alder af omkring 1 år, homozygote Q175 mus (HOM) udviser tegn på hypokinesi, som det fremgår ved at måle den tid, der bruges uden bevægelse i et åbent felt23. De nuværende forsøg med heterozygote Q175-mus (HET) bekræftede de tidligere motoriske underskud, der blev observeret i HOM, og viste desuden, at de observerede motoriske underskud var ledsaget af et reduceret niveau af den astrocytiske eksterionsyretransportør 2 protein (EAAT2) i umiddelbar nærhed af korticostiriatal synaptiske terminaler24. Det har derfor været en hypotese , at et underskud i udbredelsen af astrocytisk glutamat kan føre til dysfunktion eller endog tab af respektive synapser25,26.

Her beskriver vi en ny tilgang, der gør det muligt at evaluere enkelt synapse glutamat clearance i forhold til mængden af den frigivne neurotransmitter. Den nye glutamat sensor iGluu blev udtrykt i korticostriatal pyramideformede neuroner. Det blev udviklet af Katalin Török27 og repræsenterer en ændring af den tidligere indførte høj-affinitet, men langsom glutamat sensor iGluSnFR28. Begge sensorer er derivater af det forbedrede grønne fluorescerende protein (EGFP). For spektrale og kinetiske egenskaber, se Helassa et al.27. Kort, iGluu er en lav-affinitet sensor med hurtig de-aktivering kinetik og derfor særligt velegnet til at studere glutamat clearance på glutamat-releasing synaptiske terminaler. Dissociationstidskonstanten for iGluu blev bestemt i en stop-flow-anordning, som afgjorde enTau-offværdi på 2,1 ms ved 20 °C, men 0,68 ms, når den ekstrapoleres til en temperatur på 34 °C27. Enkelt Schaffer sikkerhedsstillelse terminaler undersøgt ved 34 °C med spiral laserscanning i CA1 regionen organotypic hippocampal kulturer under en 2-foton mikroskop udstillet en gennemsnitlig tid konstant af henfald på 2,7 ms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt arbejde er udført i overensstemmelse med EU-direktiv 2010/63/EU for dyreforsøg og blev registreret på Kontoret for Sundhedsbeskyttelse og Teknisk Sikkerhed i Berlin (G0233/14 og G0218/17).

BEMÆRK: Optagelser fra Q175 wild-type (WT) og heterozygoter (HETs) kan udføres i alle aldre og køn. Her studerede vi mænd og kvinder i en alder af 51 til 76 uger.

1. Injektion af glutamatsensoren iGluu for udtryk i korticostriatal axoner

  1. Brug pipettepulleren (et trinstilstand) til at forberede borosilikatglaspipetter til injektion af virus. Efter træk brydes pipetten manuelt for at opnå en spidsdiameter på 30-50 μm. Autoklave pipette- og kirurgiske instrumenter, herunder boret til åbning af kraniet.
  2. Opbevar virussen AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/ml) ved -80 °C i 10 μL aliquots. Hvis injektionerne udføres kort tid efter virusproduktionen (inden for 6 måneder), opbevares ved 5 °C. Før operationen, tage hætteglasset og vedligeholde det ved stuetemperatur.
  3. Fyld glaspipetten og fjern eventuelle bobler.
  4. Bedøve dyret med en intraperitoneal injektion af en opløsning, der indeholder 87,5 mg/kg ketamin og 12,5 mg/kg xylazine. Subkutant injicere 0,25% bupivacain (8 mg/ kg) for yderligere smertelindring. Kontroller dybden af anæstesi ved at overvåge muskeltonus og observere fraværet af smerte-induceret reflekser.
  5. Barber huden på hovedet og steriliser det med 70% alkohol. Sæt musen ind i den stereotaxic ramme.
  6. Brug en skalpel til at fjerne huden og en høj hastighed (38.000 rpm) boremaskine til at gøre en 1,2 mm hul i knoglen over den motoriske cortex.
  7. Monter sprøjten med den påsatte injektionspipette i holderen på en præcisionsmanipulator. Sæt den vertikalt orienterede pipette ind i cortex på 4 forskellige steder. Injektionskoordinaterne er, med hensyn til bregma (i mm): foran 1,5, lateral 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. Dybden med hensyn til dura mater er (i mm): 1,5-1,7.
  8. Ved hjælp af injektionssystemet indsprøjtes 0,3 μL pr. sted af den ufortyndede virusopløsning med en hastighed på 0,05 μL/min. Efter hver injektion skal pipetten være på plads i 1 minut, før den trækkes langsomt tilbage (1 mm/min. ).
  9. Afslut ved at lukke det kirurgiske sår med en nylonsutur.
  10. Lad musen være 0,5 til 1 time på en varmepude i et rent bur, før den returneres til det oprindelige bur.
  11. Hold musen på en 12 h dag-nat cyklus i 6 til 8 uger før udarbejdelsen af akutte hjerne skiver.
    BEMÆRK: For at undgå immunreaktioner, der resulterer i celleskader og synapsetab, skal injektion af flere virale konstruktioner udføres samtidigt eller inden for 2-3 timer efter den primære injektion. Koordinaterne for iGluu injektion blev udvalgt i henhold til Paxinos og Franklin29 hjerne atlas. De svarer til M1 motorcortex. Immunfarvning af injicerede hjerner visualiserede mange, men for det meste godt isolerede axoner og axonvaricosities i ipsi- og kontralaterale striatum og i de kontralaterale M1 og S1 cortices.

2. Søg efter glutamaterge terminaler, der udtrykker glutamatsensoren iGluu

  1. Kalibreringstilstand
    1. Forbered sCMOS-kameraet og kamerastyringssoftwaren med følgende indstillinger. På udlæsningssiden indstillepixeludlæsningshastighed:560 MHz (= hurtigste udlæsning), Følsomhed / Dynamisk område: bit, Spurious Noise Filter: Ja, Overlap Readout: Ja. Vælg Fuld skærm på siden Binning/ROI.
    2. Der tilberedes et glasglasmed en dråbe på 5 mg/ml Lucifer Yellow (LY) under en dæksel.
    3. Placer LY-diaset under en 63x-målsætning, åbn laserlukkeren, og udfør en seriel erhvervelse ved hjælp af følgende indstillinger: Pixel Binning: 1x1, Trigger-tilstand:Intern, Eksponeringstid: Minimal (skal bestemmes).
    4. Juster lasereffekten for at frembringe en fluorescensplet på 4 μm i diameter (billedet må ikke indeholde mættede pixel).
    5. Hvis du vil udføre en kalibrering af laserpositioneringssystemet, skal du vælge følgende indstillinger i laserpositioneringssoftwaren: Spot-størrelsediameter:10, Scanningshastighed: 43.200 kHz. Klik på knappen Start billedanskaffelse i højre panel. Angiv Kørsler: 0, Kør forsinkelse: 0, og vælg indstillingen Kør ved TTL på siden Sekvens. Klik på knappen Kalibrer på kalibreringssiden, og kalibrer laserstyringssoftwaren i overensstemmelse med instruktionerne i øverste venstre hjørne af anskaffelsesskærmen.
    6. Hvis opsætningen bruger uafhængig software til kamera og laser kontrol, erhverve screenshots fra kameraet erhvervelse vinduet og sende den til laser kontrol software til en re-beregning af XY koordinater. Hvis softwaren er installeret på forskellige computere, skal du bruge en videograbber til at importere billedet til laserstyringssoftwaren. Laserkontrolsoftwaren skal bruge oplysninger om XY-skaleringsfaktorerne og forskydningerne. Til dette formål skal du bestemme koordinaterne for de øverste venstre, nederste venstre og nederste højre hjørner af billedet i anskaffelsesvinduet for laserkontrolprogrammet. Beregn skaleringsfaktorerne i henhold til følgende ligninger: X-faktor = (X nederst til højre – X nederst til venstre)/2048, X-forskydning = X nederst til venstre, Y-faktor = (Y øverst til venstre – Y nederst til venstre)/2048, Y-forskydning = Y nederst til venstre.
    7. Når kalibreringsproceduren er afsluttet, skal du oprette et rektangulært interesseområde (ROI) på 267 x 460 pixel, flytte det til midten af skærmen og klikke på knappen Startsekvens.
    8. Gå tilbage til følgende indstillinger for kamerakontrolsoftware: Binning: 2x2, Trigger-tilstand: Ekstern eksponering, Eksponeringstid: Minimal (skal bestemmes).
  2. Autofluorescenskorrektionstilstand
    BEMÆRK: Hvileniveauet for [Glu] i miljøet af aktive synaptiske terminaler er typisk under 100 nM14,30,31,32,33,34. Derfor vil enhver sensor af glutamat, især en lav affinitet sensor som iGluu være temmelig svag i mangel af synaptisk glutamat frigivelse. Ikke desto mindre kan nogle iGluu fluorescens endda påvises i hvile, men skal skelnes fra væv autofluorescens. 473 nm belysning fremkalder både iGluu fluorescens og autofluorescens (Figur 1A-C). Sidstnævnte indtager en bred vifte af bølgelængder, mens iGluu fluorescens er begrænset til 480-580 nm (med et maksimum på 510 nm). Korrektionen for autofluorescens er baseret på erhvervelse af to billeder med forskellige high-pass filtre.
    1. Forbered hjerneskiver på forhånd som beskrevet andetsteds35. Hold klid skiver klar.
    2. Udsnittene overføres til optagekammeret og nedsænkes i iltet kunstig cerebrospinalvæske (ACSF), der indeholder 125 mM NaCl 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4,25 mM NaHCO3,2 mM CaCl2,1 mM MgCl2,10 mM glucose (pH 7.3, 303 mOsm/L), suppleret med 0,5 mM natriumpyruvat, 2,8 mM natriumascorbat og 0,005 mM glutathion. Brug en strømningshastighed på 1-2 ml/min. Hold badetemperaturen ved 28-30 °C.
    3. Find dorsal striatum under en 20x vand nedsænkning mål. Fix skiverne med en nylon gitter på en platin harpe for at minimere væv bevægelse. Skift til målet 63x /NA 1.0 vandnedsænkning. Vælg filtre, der reflekterer lys ved 473 nm (dichroic mirror) og passerer lys med bølgelængder >510 nm (emissionsfilter).
    4. Synkroniser belysning, stimulering og billederhvervelse ved hjælp af et AD/DA-board med den respektive styringssoftware. Indstil udløserprogrammet til at styre anskaffelsen med en lasereksponeringstid på 180 ms og en billedanskaffelsestid på 160 ms. Brug laserpositionsenheden til at sende laserstrålen til et forudbestemt antal punkter og definere indstillingerne for scanningshastighed og staffagestørrelse.
    5. Anskaf et billede af både autofluorescens og iGluu-positivestrukturer ved hjælp af et højpasfilter ved 510 nm ("gult billede").
    6. Anskaf et billede med autofluorescens alene ved hjælp af et højpasfilter ved 600 nm ("rødt billede").
    7. Skaler de røde og gule billeder ved hjælp af middelintensiteterne for de 10 lyseste og de 10 mørkeste pixel for at definere området. Udfør en subtraktion "gul minus rødt billede" og skaler det fratrukket billede igen for at generere en standard 8-bit tif-fil for nem visualisering af den interessante kamp (Figur 1D). Den indeholder de lyse pixels fra iGluu-positivestrukturer, grå pixels fra baggrunden og mørke pixels fra strukturer med autofluorescens.
      BEMÆRK: Med det givne udstyr vil den gennemsnitlige hvilefluorescens (F) være under 700 E.U.
  3. Bouton søgetilstand
    BEMÆRK: iGluu-positivepixels kan tilhøre funktionelt forskellige elementer i aksonalt træet, såsom axongrene af forskellig rækkefølge, steder af tofurcation, varicosities efter vesikeludtynding eller fuldt aktive varicosities. Det er dog næsten umuligt at identificere funktionelle synaptiske terminaler blot ved visuel inspektion. Derfor skal hver glutamatergic synaptisk terminal identificeres ved sin reaktionsevne over for elektrisk depolarisering. Websteder, der ikke reagerer på stimulering, skal kasseres. De fysiologiske midler til at fremkalde glutamat frigivelse fra korticostriatal axoner er at fremkalde en handling potentiale. Dette kan enten opnås ved hjælp af en kanal rhodopsin af passende spektrale egenskaber eller ved elektrisk stimulation af en axon visualiseret af iGluu selv. For at undgå utilsigtet opsin aktivering, foretrak vi sidstnævnte approastep
    1. Brug mikropipettepulleren (i firetrinstilstand) til at producere stimuleringspipetter fra borosilikatglaskapillærer. Den indvendige spidsdiameter skal være ca. 1 μm. Når elektrodemodstanden er fyldt med ACSF, skal den være ca. 10 MΩ.
    2. For at fremkalde den potentielt afhængige frigivelse af glutamat fra et sæt synaptiske boutoner, der er fastgjort til den samme axon, skal du bruge 63x forstørrelse, 510 nm-emissionsfilteret og det fratrukne billede for at placere en glasstimuleringselektrode ved siden af en fluorescerende varicositet . Undgå nærheden af yderligere axoner.
    3. Tænd stimulatoren for at levere depolariserende strømimpulser til stimuleringspipetteringen. Brug strømintensiteter på ca. 2 μA (højst 10 μA).
    4. Tænd for multikanalsbadapplikationssystemet, hvor den ene kanal leverer standardbadopløsningen, og de andre kanaler leverer de nødvendige blokkere af ionkanaler, transportører eller membranreceptorer. Styre strømmen på optagelsesstedet, og skift derefter til tetrodotoxinkanalen (TTX) (badopløsning plus 1 μM TTX). Efter 2-3 min, stimulere bouton af interesse igen, men nu i mangel af handling potentielle generation. Frigivelsen er direkte på grund af calcium tilstrømning gennem spænding-afhang calcium kanaler.
    5. Ved at dreje intensitetsnøglen på stimulatoren skal du justere stimuleringsstrømmen for at opnå reaktioner svarende til dem, der fremkaldes via handlingspotentialer. Typisk vil stimuleringsstrømmen være omkring 6 μA for en 0,5 ms depolarisering.
    6. Anvendes 0,5 mM CdCl2til grundlæggende afprøvning af præparatet. Tilstedeværelsen af denne calcium kanal blocker glutamat frigivelse helt forhindrer synaptisk glutamat frigivelse og dermed validere calcium afhængighed af direkte fremkaldtglutamat signal.
      BEMÆRK: Følgende generelle anbefaling kan bidrage til at øge succesraten for enkelt synapse eksperimenter i striatum. For at vælge glutamaterge synaptiske terminaler med intakt frigivelse maskiner, bør en varicosity: (i) Har en glat spindel-lignende form; ii) Ikke være forbundet med en aksonbifurcation iii) være lysere end andre konstruktioner på det "gule billede" (iv) Ophold i striatal neuropil snarere end i fiber skrifter; v) Ophold på en meget tynd axon-gren vi) Ikke opholde sig i de dybere dele af skiven.

3. Visualisering af glutamat frigivelse og clearance

  1. Optagetilstand
    BEMÆRK: Efter subtraktion af autofluorescens (trin 2.2) og et par indledende test for lydhørhed af bouton af interesse (Trin 2.3), dataindsamling kan begynde. Reaktionerne på elektrisk aktivering af glutamatfrigivelse fra enkelte axonterminaler kan observeres direkte i billedet (figur 2) uden at anvende yderligere analyseværktøjer. Det viste sig imidlertid at være meget bekvemt straks at udtrække nogle grundlæggende indikatorer for synapseydeevne (figur 3). Disse oplysninger er nødvendige for at træffe beslutninger om efterfølgende forsøgsforløb, såsom udvælgelse af bestemte terminaltyper, hurtig vurdering af HS-relaterede ændringer, antallet og hyppigheden af forsøg eller lægemidler, der skal anvendes sammen med superfusionssystemet. Det kan også være nødvendigt at beskæftige sig med i sidste ende optræder artefakter. For det første er standardindstillingerne for dataoptagelse beskrevet.
    1. Brug mikroskopet XY drev, placere den testede iGluu-positivebouton tæt på viewfield center. Stop billedanskaffelsen med knappen Afbryd anskaffelse. På det sidst erhvervede billede skal du bestemme XY-positionen for hvileanfaldscentret ved at klikke på det med venstre museknap. XY-koordinaterne for den indstillede markør vises på det nederste statuspanel i anskaffelsesvinduet.
    2. Ved hjælp af kalibreringsdataene (trin 2.1.6) beregnes koordinaterne for det sted, hvor laserstrålen skal sendes, for excitation af iGluu fluorescens. Brug følgende ligninger: X laser = X kamera * X-faktor + X offset, Y laser = Y offset – Y kamera * Y faktor. Mens du udfører denne genberegning, skal du være opmærksom på kameraets lodrette eller vandrette flipindstillinger.
    3. Opret en etpunktssekvens i laserstyringssoftwaren ved hjælp af de beregnede koordinater. Til dette formål skal du vælge Punkt i feltet Føj til sekvens på sekvenssiden for laserstyringssoftwaren. Vælg 10 μs, for at forsinkelsen kan udløse debut og 180 ms for laserpulstiden. Flyt musen til de beregnede koordinater, og klik på venstre knap.
    4. Vælg følgende indstillinger i laserstyringssoftwaren: Kører: 0, Kør forsinkelse: 0, Sekvens: Kør på TTL. Klik derefter på Start sekvens.
    5. I kameraet kontrol software, skal du vælge følgende indstillinger: På Binning / ROI side, sæt Billede Område:Custom, Pixel Binning:2x2, Højde:20, Bredde: 20, Venstre:X-koordinat af hvile iGluu-positivespot minus 10 px, Bund: Y-koordinat af hvilende iGluu-positivestedet minus 10 px, Erhvervelse Mode: Kinetisk Serie Længde:400, Eksponering Stid: 0,0003744s (minimal værdi). Med sådanne indstillinger, vil erhvervelsen sats være 2,48 kHz.
    6. Vælg udløsertilstand: Ekstern. Klik på Tag signal i kamerastyringssoftwaren. Start den eksperimentelle protokol, der er fastsat for udløserenheden.
    7. Implementer forsøgsprotokollen Forsøg med følgende tidslinje: 0 ms – start forsøg, 1 ms – start laserbelysning, 20 ms – start billederhvervelse med kamera, 70 ms – start elektrisk stimulation 1, 120 – start elektrisk stimulation 2, 181 ms – slutforsøg (laser og kamera slukket). Således under en retssag kameraet erhverver 400 billeder med en frekvens på 2,48 kHz. Se trin 2.3.3 og 2.3.5. for yderligere oplysninger om elektrisk stimulation.
    8. For at muliggøre tilstrækkelig genopretning af prædigynaptic vesikelpuljer skal protokolforsøget anvendes med en gentagelsesfrekvens på 0,1 Hz eller derunder.
  2. Off-line konstruktion af glutamat forbigående og hurtig vurdering af glutamat frigivelse og clearance til identifikation af patologiske synapser
    1. Slå evalueringsrutinerne til. Her bruger vi en intern-skriftlig software SynBout v. 3.2. (forfatter: Anton Dvorzhak). Følgende trin er nødvendige for at konstruere en ΔF/F-transient fra pixel med forhøjetfluorescens som i videoen af figur 2.
    2. For at afgrænse bouton-størrelsen skal middel- og standardafvigelsen (SD) af ROI-fluorescensintensiteten i hvile (F) beregnes, inden stimuleringen begynder. Bestem og boks det område, der er optaget af pixel med F>middelværdi + 3 SD (Figur 3A). Der bestemmes en virtuel diameter (i μm) under forudsætning af en cirkulær form af supratærskelområdet.
    3. Antag ΔF som forskellen mellem topintensitetsværdien og F. Afbilde den stimulerende strøm og ΔF/F mod tiden (figur 3B). SD'en for ΔF/F beregnes i hvile (før stimuleringens indtræden) og "Peak amplitude". Brug pixel med topamplitude på mere end 3 SD ΔF/F til at udføre monoeksponentiel tilpasning til henfaldet fra toppen. Tidskonstanten for henfald Staud af ΔF/F bestemmes.
    4. Hvis du vil estimere "Maksimal amplitude" ved en given synapse, skal du vælge pixlen med den højeste ΔF/F-værdi. Det er typisk placeret inden for eller ved siden af grænserne for den hvilende bouton iGluu fluorescens. Den "Maksimal amplitude" ville være den bedste indikator for glutamat belastning præsenteres for clearance maskiner af en enkelt synaps.
    5. For at anslå denu rumlige forlængelse af iGlu u-signalet bestemmes diameteren af området for alle supratærskelpixel kombineret til en virtuel cirkel. Den respektive diameter kaldes "Spread". Udtrykket "Peak spread" henviser derefter til topværdien af den gennemsnitlige transient(figur 3C, forskellen mellem punkterede røde linjer).
  3. Rettelser af mulige artefakter
    BEMÆRK: Elektrisk depolarisering er forbundet med en udadgående strøm af intrapipetteopløsningen. Dette kan resultere i en lille vævsforskydning. For at skelne mellem stimulationsinducerede ændringer af iGluu og forskydninger i billedet uden for fokus kunne man bruge følgende fremgangsmåde til at identificere og eliminere forskydningsartefakter (figur 4).
    1. Analysér de rumlige karakteristika for de overtærskelpixel, der er afledt af et investeringsafkast, med tegn på forskydning (Figur 4F-H).
    2. Find pixel uden for de oprindeligt bestemte grænser for kampen i hvile(Figur 4F-H, pakket i rødt).
    3. Identificer i sidste ende eksisterende negative pixelintensitetsværdier (Figur 4 I,J). ΔF/F i den negative retning med en amplitude, der er større end forstimuleringsgennemsnittet ± 3 SD, skal betragtes som artefakt, og posten skal kasseres.
    4. For at undgå artefakter uden for fokus skal stimuleringselektroden placeres på den antero-laterale side af den synaptiske bouton, brug bipasisk elektrisk stimulation og minimere stimuleringsintensiteten/varigheden.
      BEMÆRK: Artefakter, der ikke er i fokus, kan også udledes af kameraet. Hvis sidstnævnte ikke er optimalt fastgjort til mikroskopet, kan det producere svingninger, sandsynligvis på grund af små vibrationer i kameraets kølesystem. Sådanne vibrationer skaber et "yin og yang" mønster i ΔF/ F-billederne, der roterer med en frekvens på 50 Hz. Vibrationerne kan trækkes matematisk fra fluorescenssignalet, men den endelige kvalitet af målingerne vil så i høj grad afhænge af optagetiden.
    5. Fastgør kameraet til mikroskopet, således at vibrationer er fraværende. Hvis sidstnævnte forbliver, skal du placere en gummipakning mellem kameraet og mikroskopadapteren.
      BEMÆRK: Man kan ikke forsømme muligheden for, at striatal neuropil omkring synapsen af interesse indeholder glutamatergic varicosities, der ikke udtrykker iGluu og derfor forblive usynlige. I tilfælde af samaktivering (mere sandsynligt i mangel af TTX) kan de forbigående personer, der er opnået fra de interesseanfald, blive påvirket af afsmittende virkninger. Det samme gælder for iGluu-udtrykketerminaler, der var ude af fokus. Et karakteristisk fænomen ville i dette tilfælde være, at fluorescenstransienter stammer fra et meget større område. Da dette svar er elimineret af TTX, kan man fortolke det som en uspecifik reaktion induceret af uberettiget multi-fiber aktivering.
    6. For at korrigere for denne uspecifikke multi-fiber respons, skal du følge den procedure, der er skitseret i figur 5. Brug fluorescenssignalet fra pixel ved afgrænsningen af viewfield. For at minimere baggrundsrespons skal du minimere stimuleringsintensiteten og varigheden eller bruge TTX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifikation af to typer korticostital glutamaterge varicosities
IT og PT afferentes stammer fra henholdsvis lag 2/3 og 5 og udviser differensforgrenings- og termineringsmønstre i det ipsilaterale og kontralaterale (kun IT-terminaler) striatum. Der vides stadig kun lidt om egenskaberne af glutamatfrigivelse og clearance under gentagne aktiveringsbetingelser som observeret under påbegyndelse af bevægelser, men det er veldokumenteret, at de respektive glutamat-releasing varicosities varierer i størrelse22. Ved anvendelse af et størrelseskriterium blev det konstateret, at it- og PT-terminaler udviser kontrasterende former for kortsigtet plasticitet24. Med en stimulus intervaller på 50 ms, de mindre it-terminaler var tilbøjelige til parret puls depression (PPD), mens de større PT terminaler viste parret puls lettelse. Denne forskel blev også observeret med kortere intervaller (20 ms) og gennem en serie på 6 impulser. Figur 3 og figur 6 illustrerer disse forsøg, hvor synaptisk glutamatfrigivelse blev fremkaldt via handlingspotentialemekanismen ved fysiologiskca. 2+/Mg2+-koncentration.

Identifikation af dysfunktionelle synapser hos mus med fremskreden Huntingtons Sygdom
Neurodegenerative sygdomme som Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons Sygdom er karakteriseret ved et stadigt fremadskridende tab af glutamatergic synapser36. Nye behandlingsformer har til formål at hindre eller endda vende denne fatale progression. Hvad der præcist udløser forsvinden af en synapse, og hvornår, er stort set ukendt. Yderligere indsigt kan forventes fra undersøgelser, der tilbyder kriterier for (a) den vitale identifikation af en bestemt klasse af glutamatergic synapser og (b) påvisning af dysfunktionelle versus normalt udfører kontakter. Her vil det blive vist, hvordan TauD værdier opnået fra PT-type terminaler blev brugt til at vurdere den fraktion af dysfunktionelle synapser i Q175 heterozygoter med en identificeret motor fænotype.

Forud for de enkelte synapsebilleddannelsesforsøg blev musene underkastet en hurtig, men temmelig robust test for ændringer i deres sonderende adfærd. Denne test kaldes "step-over test". Dyret blev placeret i midten af en petriskål (med en diameter på 185 mm og 28 mm væghøjde). Testen blev optaget med et videokamera. Ved hjælp af offline analyse, kan man bestemme tiden mellem start af eksperimentatorens hånd og det øjeblik, hvor dyret har alle 4 meter ud af fadet. Plotning af data fra over 100 WT og Q175 HET i alderen mellem 12 og 18 måneder tyder på, at mus med en step-over latenstid på > 300 s kan diagnosticeres som hypokinetisk. Figur 7A illustrerer en signifikant positiv korrelation mellem de opnåede resultater for den samlede sti, der køres i det åbne felt, og trin-over-ventetiden.

Enkelt synapse iGluu-billeddannelse viste, at disse symptomatiske HS-mus udviste et underskud i hastigheden af sammensynaptisk glutamatforfald som afspejlet i TauD-værdierne fra enkelt (eller først i en sekvens) stimuli ( Figur7B,C). Ved WT blev en sådan forlængelse først observeret efter anvendelse af en selektiv ikke-transportabel hæmmer af glutamatoptagelse — DL-threo-β-benzyloxyaspartisyre (TBOA, figur 7D,E). Dette tyder på en rolle astrocytisk glutamat transportører i reguleringen af synaptisk glutamat clearance. Ændringer i spredningen af Glu i det perisynaptiske rum er ikke blevet fundet24. Men der er naturligvis behov for meget mere arbejde for rent faktisk at identificere årsagen til langsommere glutamatclearance i HS såvel som i andre former for parkinsonisme. Bortset fra ændringer i astrocyt nærhed9 og reduceret slc1A2 udtryk37, man kan lige så godt overveje sygdomsrelateret ustabilitet af EAAT2 i plasmamembranen i perisynaptic astrocyt processer (PAPs). Dette kan skyldes ændringer i EAAT2-interaktionen. Faktisk, seneste masse spektroskopi eksperimenter i laboratoriet peger på et tab af EAAT2-dystrophin interaktion i tværsnittære astrocytter (Hirschberg, Dvorzhak, Kirchner, Mertins og Grantyn, ikke offentliggjort).

Meget lidt er kendt med hensyn til tidslinjen for synaptisk dysfunktion med progression af HS, men det er meget sandsynligt, at sunde synapser sameksisterer med allerede svækket dem. Da vi søgte efter et klassificeringskriterium, undersøgte vi TauD-dataene fra forskellige mus. Til dette formål blev amplituden- og TauD-værdierne fra 3 parrede forsøg i træk normaliseret til det første respons (se figur 6F for en forsøgsordning), og sandsynligheden for forekomst af en given TauD-værdi blev sammenlignet i aldersmatchet WT versus Q175 HET (Figur 6G). Det blev konstateret, at i WT TauD aldrig overskredet 15 ms, mens der i symptomatisk Q175 HET, 40% af synapserne udstillet TauD værdier mellem 16 og 58 ms, på trods af en tendens til en reduktion i mængden af frigivet glutamat (Figur 6H,I). TauD kan derefter betragtes som en biomarkør for dysfunktionelle synapser i HS og anvendes yderligere til at verificere funktionel genopretning i forsøg rettet mod astrocytisk glutamattransport.

Figure 1
Figur 1: Identifikation af iGluu-positivevaricosities. (A) Fluorescensbillede opnået med et 510 nm højpasfilter ("gult billede"). (B) Samme visningsfelt anskaffet med et 600 nm højpasfilter ("rødt billede"). Bemærk, at det sted, der er markeret med sort pilespids, er forsvundet i (B). Overlejring af (A) og (B). Hvid pil = autofluorescens, sort pil = iGluu-positiv varicosity. (D) Billede opnået ved subtraktion af (B) fra (A). De autofluorescerende pletter er mørke og iGluu+ stedet er lyst. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Film stadig fra en slow-motion video (afmatning faktor 1240x). Øverste række: Billeder fra WT (venstre), Q175 HET (i midten) og HOM (til højre). Nederste række: Respektive iGluu transienter fra pixel med den højeste glutamathøjde (Maximal ΔF/F). Den røde markør angiver det punkt på det forbigående, der svarer til billedet over sporingen. bemærk langvarig stigning af iGluu fluorescens (røde pixels og ΔF/F-transienter). Ændret og genoptrykt med tilladelse fra Dvorzhak et al.24Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Ekstraktion af funktionelle indikatorer fra enkeltsynapsebilleder af den genetisk kodede ultrahurtige Glu-sensor iGluu i korticostriatale neuroner. (A, D) Eksempel på en PT (A) og IT (D) bouton med de respektive iGluu fluorescens i hvile (venstre) og på toppen af en AP-medieret iGluu respons (højre). (B, C, E, F) iGluu svar registreret fra bouton vist i (A, D); Eksperimentér i 2 mM Ca2+ og 1 mM Mg2+. (B) Samtidig registrering af stimuleringsstrømmen (øvre spor) og gennemsnitlig intensitet af overtærskelpixel (bundspor). Samme tidsskala for alle spor. Spidsamplituder (mellem punkterede røde vandrette linjer) og en monoeksponentiel funktion, der er monteret på henfaldet fra denne top (rød overlejring). De tilsvarende TauD-værdier (t) vises ved siden af tilpasningskurverne. (E, F) Plot af spredning mod tiden. Spidsdist: Forskel mellem punkterede røde vandrette linjer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Karakteristik af en glutamat-induceret iGluu forbigående (A-E) i modsætning til en forskydning artefakt (F-J). (A, B) og (F, G) viser den absolutte fluorescensintensitet i hvile (A, F) og efter stimulering (B, G) i vilkårlige enheder (au). cC, H) Fluorescensændring i procent af hvilefluorescensen før stimulering (ΔF/F%). (D, I) Superposition af iGluu transienter fra alle pixels i vilkårlige enheder. (E, J) Superposition af iGluu transienter fra alle pixels i ΔF/F %. I tilfælde af synaptisk glutamatfrigivelse udviser pixels ved siden af hvileterminalen en fluorescensstigning efter stimulering, mens den lyseste pixel i hvile i tilfælde af manglende fokus blot ændrer deres position i investeringsafkastet uden en ledsagende stigning i visningsfeltets overallfluorescensintensitet. En forskydningsart kan også genkendes ved fremkomsten af negative ΔF/F-signaler (J). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Korrektion foru uspecifik iGlu u-respons. (A-D) Eksempel på parret synaptisk respons, der er forurenet med et uspecifikt baggrundsrespons. (E-H) Samme efter korrektion. (A, E) Før stimulering. (B, F) Under stimulering. cC, G) Efter stimulering. (D, H) Tilsvarende overlejret intensitetstransienter (i ΔF/F) fra alle pixels i investeringsafkastet. Tidspunktet for erhvervelse af billederne er markeret med tilsvarende små bogstaver over pilespidserne. Bemærk, at baggrundsresponset i panel C er meget udbredt og langsomt rådnende. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Forskellige størrelses- og størrelsesrelaterede forskelle i amplitudeparretu pulsforhold (PPR) for iGlu u-transienten. (A) Forenklet ordning for korticostital kredsløb22, der illustrerer begrebet præferenceprojektion af pyramideformede tarmkanalen (PT) neuroner til indirekte vej striatal projektion neuroner (iSPNs) og intratelencephalic (IT) neuroner til direkte vej SPNs (dSPNs), med størrelsesforskelle mellem IT og PT terminaler. bB) Bimodal fordeling af boutondiametre som bestemt af overtærskelværdien hvilende fluorescens før stimulering. Boutons med diameter ≥0,63 μm blev defineret som "Store" og antages at være udstedt af PT axoner. For originale billeder og prøvespor fra PT- og IT-type synapser se figur 3. (C) Der ses en signifikant positiv korrelation mellem PPR for spidsamplitudes og boutondiametrene. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet fra de første 3 forsøg med hver bouton. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Identifikation af dysfunktionelle synapser i Q175-mus med hypokinetisk fænotype. (A) Resultater af motortest på dagen for enkelt synapsebilleddannelse. Sted-over-ventetider >300 ms blev betragtet som patologiske. I den testede alder (gennemsnit 16 måneder) udviste 17/54 HET en udtalt fænotype i trin-over-testen. Med hensyn til hypokinesi synes step-over-testen at være mere følsom end den åbne felttest. Ikke desto mindre var der en signifikant sammenhæng mellem resultatet af step-over-testen (tid mellem placering og barriere krydset med alle fire fødder) og åben felttest (dvs. samlet kørsel på den samlede bane på 5 min). Y = -0,01511X + 458,7; P = 0,0044 (simpel regression). (B) Gennemsnitlig fremkaldt enkelt synapse iGluu transienter normaliseret til samme peak amplitude for at illustrere HS-relaterede forskelle i clearance af synaptically frigivet glutamat. De respektive monteringskurver fremhæver forskellene i varigheden af glutamattransienterne. cC) Kvantificering af resultaterne af vildtype (grå), HET (rød) og HOM (magenta). (D, E) Inkubation af WT-skiver i 100 nM TFB-TBOA simulerede depressionen af glutamatclearance observeret i HOM. (F) Ordning for synapse aktivering og data organisation. (G) Kumulative histogrammer af #1 TauD-værdier. (H, I) Parceller af normaliserede #2 svar. Data fra 31 WT og 30 HET synapser (alle PT type). I WT-prøven var alle TauDmax-værdier ≤15 ms. I HET-prøven udviste 40 % af synapserne TauDmax-værdier, der oversteg den tærskel på 15 ms, der er defineret af den længste TauDmax i WT. Disse grafer fremhæver de HD-relaterede forskelle i intervallerne for maksimal amplitude (dvs. værdien fra pixel med den højeste iGluu fluorescensstigning) og TauDmax (TauD-værdien af pixel med den højeste højde). TauDmax-værdier, der udelukkende findes i HET, vises med rødt, og amplitudeværdier, der udelukkende ses i WT, vises med gråt. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. De anvendte statistiske test er angivet ved siden af den respektive graf. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forsøgene vedrører et spørgsmål af almen interesse — synapse uafhængighed og dens mulige tab i løbet af neurodegeneration, og vi beskriver en ny tilgang til at identificere berørte synapser i akutte hjerneskiver fra alderen (>1 år) mus. Drage fordel af de forbedrede kinetiske egenskaber af den nyligt indførte glutamat sensor iGluu eksperimenterne belyse forholdet mellem synaptisk glutamat frigivelse og optagelse på en måde, der ikke har været muligt før.

Indflydelsen af glutamat clearance på funktionen og vedligeholdelse af synapser er ikke særlig godt belyst, selv om hypotesen om, at glutamat-induceret excitotoksicitet kan forårsage neuron tab og synapse beskæring er nævnt i næsten alle relevante gennemgang af epilepsi, slagtilfælde og neurodegenerative sygdomme38,39,40,41. Den foreliggende dokumentation er imidlertid mere begrænset end forventet af litteraturen. Forvirringen tilføjes yderligere ved , at de udvalgte forsøgsværktøjer kan være utilstrækkelige i betragtning af de problemer , der er forbundet med lav rumlig og tidsmæssig opløsning ved fortolkningen af de resultater , der er opnået med bruttostimulerings - ogregistreringsteknikker42,43. Dette kan føre til, at falske negativer afskrækker yderligere forskning, hvilket er mere end uheldigt i betragtning af neurologiske lidelser, der er lige så alvorlige som Huntingtons Sygdom. Den nuværende tilgang sikrer bedre signaldiskrimination og derfor stærkere støtte til tanken om, at en betydelig brøkdel af korticostriatalsynapser i HS udviser tegn på nedsat glutamatrydning.

De nuværende resultater afslørede forskelle i kortsigtet plasticitet inden for korticostriatal vej. Selv om sidstnævnte havde været i fokus i talrige undersøgelser17,44, har det ikke været forventet, at afferents stammer fra de øvre kortikale lag ville udvise frekvensafhængige depression, i modsætning til pyramideformede tarmkanalen afferents med oprindelse i lag 5. Sidstnævnte viste fortrinsvis en frekvensafhængig potensering af frigivelsen og kan derfor have større risiko for glutamatoptagelsesinsufficiens.

Forsøg med akutte hjerneskiver fra voksne mus er vigtige for at belyse synaptiske forandringer i en passende alder af livet. Præparatets alder og funktionelle tilstand er særlig relevant, hvis astrocytter var involveret i den pågældende mekanisme. Her er det vigtigt, at astrocytter er modne nok til at udstille voksne niveauer af glutamat transporter aktivitet og relaterede klorid homøostase45.

Enkeltsynapseanalyser vil bane vejen mod en bedre forståelse af HS-relaterede ændringer af glutamatergic synaptisk transmission i den intakte hjerne46. Det har vist sig, at enkelt synapsis opløsning også kan opnås i den intakte hjerne, forudsat at synapser af interesse er lokaliseret i de overfladiske lag af hjernebarken47.

Endelig har den nuværende eksperimentelle tilgang den appel, at den kan bruges af mange tilhængere, da det nødvendige udstyr stadig er på den billige side.

Kort sagt kan fluorescenssignaler, der rapporterer glutamatfrigivelse, og de sammentæneraaptiske ændringer i koncentrationen af glutamat i den intakte hjerne give data, der ikke kan opnås ved enhver elektrofysiologisk metode. Men som med enhver ny metode har denne tilgang sine begrænsninger og ulemper, som til dels er blevet behandlet i trin 2.2 og 3.3. Den lave hvilefluorescens af den hurtige og høje affinitet iGluu sensor kræver en smule motion / erfaring til at identificere egnede varicosities for yderligere test. Med co-udtryk for en genetisk kodet calcium indikator (GECI) såsom XCaMP-R48 og mindst to koordinerede lasere belysning systemer, ville søgningen af funktionelle axon terminaler blive meget lettere. Under alle omstændigheder er det afgørende at udsætte præparatet så lidt som muligt for det spændende lys før og under iGluu optagelse.

Brugen af en 473 nm laser (i stedet for den regelmæssige hele feltet elimination) at fremkalde iGluu fluorescens er en forudsætning for at opnå tilstrækkelig emission, men vil også forårsage blegning. Under de givne betingelser blev iGluu fuldt bleget efter 10 stimulations-/erhvervelsesforsøg (10 stimuluspar med et inter-stimulus interval på 50 ms og en gentagelseshastighed på 1/10 s). Den maksimale samlede belysningstid for steady-state dataindsamling med det aktuelt anvendte 1 foton laser system og den beskrevne indstilling var ca. 2 s. Blegning af iGluu er eksponentiel, er meget stærk i løbet af de første 20 ms efter belysning start og meget langsommere derefter. Det er derfor tilrådeligt at undgå signalerhvervelse i løbet af de første 20 ms af hvert forsøg og at erhverve ikke mere end i alt 10 responspar. Respons på enkelte stimuli kunne registreres med eksponeringstider på 60-80 ms i stedet for de aktuelt anvendte 180 ms.

Et andet kritisk spørgsmål er udtryksniveauet for iGluu. I den banebrydende undersøgelse af Helassa et al.27, de virale konstruktioner blev anvendt ved elektroporation til kulturanvist neuroner27, som producerer højere udtryk niveauer af sensoren og formentlig også mindre blegning især hvis en to-foton laser scanning enhed kan bruges i stedet for en one-foton mikroskop. Dürst et al.49 rapporterer rutinemæssig erhvervelse af postsynaptisk udtryk for iGluu i CA1 pyramideformede neuroner i ~ 100 forsøg (hver eksponeret for kun 80 ms). Men, kultiveret hjernevæv er ikke en mulighed, når forsøgene har til formål at afklare astrocyt-afhængige synaptiske funktioner i den aldrende hjerne. Et CaMKII-Cre-afhængigt udtryk for iGluu ved hjælp af en stærkere promotor kan give præparaterne et stærkere udtryk i færre celler, hvorved metodens opløsning øges, og der gives mulighed for at erhverve flere forsøg pr. synapse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af CHDI (A-12467), den tyske forskningsfond (Exc 257/1 og DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) og intramural Research Funds of the Charité. Vi takker K. Török, St. George's, University of London, og N. Helassa, University of Liverpool, for iGluu plasmid og mange nyttige diskussioner. D. Betances og A. Schönherr ydede fremragende teknisk bistand.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Tags

Neurovidenskab glutamat frigivelse glutamat clearance glutamat spredning presynaptic terminal astrocyte glutamat optagelse henfald kinetik spill-over optogenetics iGluu sCMOS
Enkelt synapse indikatorer for glutamat frigivelse og optagelse i akut hjerne skiver fra normal og Huntington Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single… More

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter