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Neuroscience

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60113
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

Summary

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Abstract

As sinapses são unidades funcionais altamente compartimentadas que operam independentemente umas nas outras. Na doença de Huntington (HD) e outras doenças neurodegenerativas, essa independência pode ser comprometida devido à falta de glutamato insuficiente e aos efeitos resultantes de derramamento e derramamento. A cobertura ascrótica alterada dos terminais pré-sinápticos e/ou espinhas dendríticas, bem como um tamanho reduzido de aglomerados transportadores de glutamato em locais de liberação de glutamato foram implicadas na patogênese de doenças que resultam em sintomas de diss/hiperciesia. No entanto, os mecanismos que levam à disfunção das sinapses glutamatergicas em HD não são bem compreendidos. Melhorando e aplicando imagens sinapses, obtivemos dados que lançaram uma nova luz sobre os mecanismos que impedem o início dos movimentos. Aqui, descrevemos os elementos principais de uma abordagem relativamente barata para alcançar uma resolução de sinapse única usando o novo sensor de glutamato ultrarrápido geneticamente codificado iGluu, óptica de campo largo, uma câmera CMOS (sCMOS) científica, um laser de 473 nm e um sistema de posicionamento a laser para avaliar o estado das sinapses corticostriatais em fatias agudas de idade saudável ou doente. Os transientes de glutamato foram construídos a partir de pixels únicos ou múltiplos para obter estimativas de i) liberação de glutamato com base na elevação máxima da concentração de glutamato [Glu] ao lado da zona ativa e ii) absorção de glutamato, como refletido na constante temporal de decaimento (TauD) do perissináptico [Glu]. As diferenças no tamanho do bouton de repouso e nos padrões contrastantes da plasticidade de curto prazo serviram como critérios para a identificação de terminais corticostriatais como pertencentes à via intratelencefálica (TI) ou ao tratado piramidal (PT). Usando esses métodos, descobrimos que em camundongos HD sintomáticos ~40% das sinapses corticostriatais do tipo PT apresentaram liberação suficiente de glutamato, sugerindo que essas sinapses poderiam estar em risco de dano excitotóxico. Os resultados sublinham a utilidade do TauD como um biomarcador de sinapses disfuncionais em camundongos de Huntington com um fenótipo hipocinético.

Introduction

O impacto relativo de cada terminal sináptico pertencente a uma "conexão unitária" (ou seja, a conexão entre 2 células nervosas) é tipicamente avaliado pela sua influência no segmento inicial do neurônio postynaptico1,2. Gravações somáticas e/ou dendríticas de neurônios postynapticos representam os mais comuns e, até agora, também os meios mais produtivos para esclarecer o processamento de informações uma perspectiva de cima para baixo ou vertical3,4,5. No entanto, a presença de astrócitos com seus territórios discretos e (em roedores) não sobrepostos pode contribuir para uma perspectiva horizontal baseada em mecanismos locais de troca de sinais, integração e sincronização em sítios sinápticos6,7,8,9,10.

Por se saber que a astroglia desempenha, em geral, um papel importante na patogênese da doença neurodegenerativa11,12 e, em particular, um papel na manutenção e plasticidade das sinapses glutamatergicas13,14,15,16, é concebível que as alterações no desempenho sináptico evoluam de acordo com o estado dos astrócitos na área alvo compartilhada de fibras afetivas com diversas fibras de origem. Para explorar melhor os mecanismos regulatórios locais derivados da meta/astroglia em saúde e doença, é necessário avaliar as sinapses individuais. A presente abordagem foi trabalhada para estimar a gama de indicadores funcionais de liberação e desembaraço do glutamato e definir critérios que possam ser utilizados para identificar sinapses disfuncionais (ou recuperadas) em áreas cerebrais mais intimamente relacionadas à iniciação do movimento (ou seja, em primeiro lugar no córtex motor e estriado dorsal).

O estriado não tem neurônios glutamatergicos intrínsecos. Portanto, é relativamente fácil identificar afrents glutamatergicos de origem extrastriatal. Este último se originou principalmente no tálamo medial e no córtex cerebral (ver17,18,19,20 para mais). As sinapses corticostriatais são formadas pelos axôntos de neurônios piramidais localizados em camadas corticais 2/3 e 5. Os respectivos axôonos formam conexões intratelêlicas bilaterais (TI) ou conexões ipsilaterais através de um sistema de fibras que constitui mais caudalmente o trato piramidal (PT). Foi ainda sugerido que os terminais do tipo TI e PT diferem em suas características de liberação e tamanho21,22. Em vista desses dados, pode-se também esperar algumas diferenças no manuseio do glutamato.

O estriado é a área cerebral mais afetada na doença de Huntington (HD)5. Hd humano é uma grave doença neurodegenerativa geneticamente herdada. O modelo de mouse Q175 oferece uma oportunidade para investigar a base celular da forma hipocinética-rígida do HD, um estado que tem muito em comum com o parkinsonismo. A partir de uma idade de cerca de 1 ano, os camundongos homozigos Q175 (HOM) apresentam sinais de hipocinenésia, como revelado pela medição do tempo gasto sem movimento em campo aberto23. Os presentes experimentos com camundongos heterozigos Q175 (HET) confirmaram os déficits motores anteriores observados em HOM e, além disso, mostraram que os déficits motores observados foram acompanhados por um nível reduzido da proteína aminoácido excitatória astrocítica 2 (EAAT2) nas proximidades dos terminais sinápticos corticostriatais24. Por conseguinte, foi hipótese de que um déficit na captação de glutamato ascrócitico poderia levar a disfunção ou mesmo perda de respectivas sinapses25,26.

Aqui, descrevemos uma nova abordagem que permite avaliar a liberação de glutamato sinapse única em relação à quantidade do neurotransmissor liberado. O novo sensor de glutamato iGluu foi expresso em neurônios piramidais corticostriatais. Foi desenvolvido por Katalin Török27 e representa uma modificação do sensor de alta afinidade, mas lento, iGluSnFR28. Ambos os sensores são derivados da proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP). Para características espectrais e cinéticas, consulte Helassa et al.27. Resumidamente, iGluu é um sensor de baixa afinidade com cinética de desativação rápida e, portanto, particularmente adequado para estudar a liberação de glutamato em terminais sinápticos liberadores de glutamato. A constante de tempo de dissociação de iGluu foi determinada em um dispositivo de fluxo parado, o que fez com que um Taufora do valor de 2,1 ms a 20 °C, mas 0,68 ms quando extrapolado a uma temperatura de 34 °C27. Os terminais colaterais schaffer únicos sondados a 34 °C com escaneamento a laser em espiral na região CA1 de culturas organotípicas hipocampais um microscópio de 2 fótons exibiram uma média de tempo constante de decomposição de 2,7 ms.

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Protocol

Todo o trabalho foi realizado de acordo com a Diretiva 2010/63/UE da UE para experimentos com animais e foi registrado no Escritório de Proteção e Segurança Técnica de Berlim (G0233/14 e G0218/17).

NOTA: Gravações do tipo selvagem Q175 (WT) e heterozigotes (HETs) podem ser realizadas em qualquer idade e sexo. Aqui estudamos homens e mulheres com idades entre 51 e 76 semanas.

1. Injeção do sensor de glutamato iGluu para expressão em axôns corticostriatais

  1. Use o puxador de pipeta (modo de um passo) para preparar pipetas de vidro borossilicato para a injeção do vírus. Depois de puxar, quebre a pipeta manualmente para obter um diâmetro de ponta de 30-50 μm. Autoclave a pipeta e instrumentos cirúrgicos, incluindo a broca para abrir o crânio.
  2. Armazene o vírus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) a -80 °C em alíquotas de 10 μL. Se as injeções forem realizadas logo após a produção do vírus (dentro de 6 meses), mantenha a 5 °C. Antes da cirurgia, tire o frasco e mantenha-o em temperatura ambiente.
  3. Encha a pipeta de vidro e remova as bolhas.
  4. Anestesiar o animal com injeção intraperitoneal de uma solução contendo 87,5 mg/kg de cetamina e 12,5 mg/kg de xilazina. Subcutâneamente injeta0,25% de bupivacaína (8 mg/kg) para alívio adicional da dor. Verifique a profundidade da anestesia monitorando o tônus muscular e observando a ausência de reflexos induzidos pela dor.
  5. Raspe a pele da cabeça e esterilize-a com 70% de álcool. Coloque o mouse na armação estereotaxica.
  6. Use um bisturi para remover a pele e uma broca de alta velocidade (38.000 rpm) para fazer um furo de 1,2 mm no osso acima do córtex motor.
  7. Monte a seringa com a pipeta de injeção anexada no suporte de um manipulador de precisão. Insira a pipeta orientada verticalmente no córtex em 4 locais diferentes. As coordenadas de injeção são, no que diz respeito à bregma (em mm): anterior 1,5, lateral 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. A profundidade em relação à dura mater é (em mm): 1,5-1,7.
  8. Usando o sistema de injeção, injete 0,3 μL por local da solução de vírus não diluída com uma velocidade de 0,05 μL/min. Após cada injeção, deixe a pipeta no lugar por 1 min antes de retirá-la lentamente (1 mm/min).
  9. Finalize fechando a ferida cirúrgica com uma sutura de nylon.
  10. Deixe o mouse por 0,5 a 1 h em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa antes de devolvê-lo à sua gaiola original.
  11. Mantenha o mouse em um ciclo diurno de 12 horas por 6 a 8 semanas antes da preparação de fatias cerebrais agudas.
    NOTA: Para evitar reações imunológicas que resultem em danos celulares e perda de sinapse, a injeção de construtos virais múltiplos deve ser realizada simultaneamente ou dentro de 2-3 horas após a injeção primária. As coordenadas para injeção iGluu foram selecionadas de acordo com o atlas cerebral Paxinos e Franklin29. Correspondem ao córtex motor M1. A imunocoloração de cérebros injetados visualizou numerosos, mas principalmente bem isolados axôntos e varizes de axôno no estriado ipsi e contralateral e nos cortices contralaterais M1 e S1.

2. Procure terminais glutamatergicos expressando o sensor glutamato iGluu

  1. Modo de calibração
    1. Prepare a câmera sCMOS e o software de controle da câmera com as seguintes configurações. Na página De leitura definida taxa de leitura pixel: 560 MHz (= leitura mais rápida), Sensibilidade/Faixa Dinâmica: bit, filtro de ruído espúrio:Sim, Sobreposição de leitura: Sim. Na página Binning/ROI, selecione Tela cheia.
    2. Prepare um slide de vidro contendo uma gota de 5 mg/mL Lucifer Yellow (LY) um deslizamento de cobertura.
    3. Coloque o slide LY um objetivo de 63x, abra o obturador a laser e realize uma aquisição serial usando as seguintes configurações: Pixel Binning: 1x1, Modo de gatilho:Interno, Tempo de exposição:Mínimo (a ser determinado).
    4. Ajuste a potência do laser para produzir um ponto de fluorescência de 4 μm de diâmetro (a imagem não deve conter pixels saturados).
    5. Para realizar uma calibração do sistema de posicionamento a laser, selecione as seguintes configurações no software de posicionamento a laser: Diâmetro do tamanho spot:10, Velocidade de varredura:43.200 kHz. Clique no botão Iniciar de aquisição de imagens no painel direito. Definir executar: 0, Executar atraso: 0 e selecionar a opção Executar em TTL na página Seqüência. Clique no botão Calibrar na página de calibração e calibrar o software de controle a laser de acordo com as instruções mostradas no canto superior esquerdo da tela de aquisição.
    6. Se a configuração usar software independente para controle de câmera e laser, adquira capturas de tela da janela de aquisição da câmera e envie-a para o software de controle a laser para um recálculo das coordenadas XY. Se o software estiver instalado em computadores diferentes, use um capturador de vídeo para importar a imagem para o software de controle a laser. O software de controle a laser precisará das informações sobre os fatores de dimensionamento XY e deslocamentos. Para isso, determine as coordenadas dos cantos superior esquerdo, inferior esquerdo e inferior direito da imagem dentro da janela de aquisição do programa de controle a laser. Calcule os fatores de escala de acordo com as seguintes equações: Fator X = (X inferior-direito – X inferior-esquerdo)/2048, X offset = X inferior esquerdo, fator Y = (Y superior-esquerdo – Y inferior-esquerdo)/2048, Deslocamento Y = Y inferior-esquerdo.
    7. No final do procedimento de calibração, crie uma região de interesse retangular (ROI) de 267x460 pixels, mova-a para o centro da tela e clique no botão Iniciar seqüência.
    8. Retorne às seguintes configurações do software de controle da câmera: Binning: 2x2, Modo de disparo: Exposição externa, Tempo de exposição: Mínimo (a ser determinado).
  2. Modo de correção de autofluorescência
    NOTA: O nível de descanso de [Glu] no ambiente dos terminais sinápticos ativos é tipicamente inferior a 100 nM14,,30,,31,,32,,33,34. Assim, qualquer sensor de glutamato, especialmente um sensor de baixa afinidade como iGluu será bastante fraco na ausência de liberação de glutamato sináptico. No entanto, alguns iGluu fluorescência podem até ser detectados em repouso, mas devem ser distinguidos da autofluorescência tecidual. A iluminação de 473 nm provocau tanto a fluorescência quanto a autofluorescência(Figura 1A-C). Este último ocupa uma ampla gama de comprimentos de onda, enquanto iGluu fluorescência é limitado a 480-580 nm (com um máximo de 510 nm). A correção para autofluorescência baseia-se na aquisição de duas imagens com filtros de alta passagem diferentes.
    1. Prepare as fatias cerebrais com antecedência, como descrito em outro lugar35. Mantenha as fatias de farelo prontas.
    2. Transfira as fatias para a câmara de gravação, submergindo-as em fluido cefalorraquidiano artificial oxigenado (ACSF) contendo 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glicose (pH 7.3, 303 mOsm/L), suplementada com piruvato de sódio de 0,5 mM, 2,8 mM de ascorbora e 0,005 mM de glutathione. Use uma vazão de 1-2 mL/min. Mantenha a temperatura do banho em 28-30 °C.
    3. Localize o estriado dorsal um objetivo de imersão de 20x de água. Fixar as fatias com uma grade de nylon em uma harpa de platina para minimizar o movimento do tecido. Mude para o objetivo de imersão em água 63x /NA 1.0. Selecione filtros que refletem a luz a 473 nm (espelho dicóico) e passem luz com comprimentos de onda >510 nm (filtro de emissão).
    4. Sincronize a iluminação, estimulação e aquisição de imagens usando uma placa AD/DA com o respectivo software de controle. Defina o programa de gatilho para controlar a aquisição com um tempo de exposição a laser de 180 ms e um tempo de aquisição de imagem de 160 ms. Use o dispositivo de posicionamento a laser para enviar o raio laser a um número predeterminado de pontos e defina as configurações para velocidade de varredura e tamanho spot.
    5. Adquira uma imagem de estruturas autofluorescência e iGluupositivos usando um filtro de passagem alta a 510 nm ("imagem amarela").
    6. Adquira uma imagem com autofluorescência sozinho usando um filtro de alta passagem a 600 nm ("imagem vermelha").
    7. Dimensione as imagens vermelhas e amarelas, usando as intensidades médias dos 10 pixels mais brilhantes e dos 10 mais escuros para definir o alcance. Execute uma subtração "imagem amarela menos vermelha" e redimensione a imagem subtraída para gerar um arquivo tif padrão de 8 bits para visualização conveniente do bouton de interesse(Figura 1D). Ele contém os pixels brilhantes das estruturas iGluupositivo, pixels cinzentos do fundo e pixels escuros de estruturas com autofluorescência.
      NOTA: Com o equipamento dado, a fluorescência média de repouso (F) será inferior a 700 A.U.
  3. Modo de busca bouton
    NOTA: iGluu-pixels positivos podem pertencer a elementos funcionalmente diferentes da árvore axonal, como ramos de axôono de ordem diferente, locais de bifurcação, varizes após o esgotamento da vesícula ou varizes totalmente ativas. No entanto, é quase impossível identificar terminais sinápticos funcionais apenas por inspeção visual. Portanto, cada terminal sináptico glutamatergico precisa ser identificado por sua capacidade de resposta à despolarização elétrica. Locais que não respondem à estimulação devem ser descartados. O meio fisiológico para induzir a liberação de glutamato a partir de axôns corticostriatais é provocar um potencial de ação. Isso pode ser conseguido usando um canal de rodopsina de características espectrais apropriadas ou por estimulação elétrica de um axôono visualizado pelo próprio iGluu. Para evitar ativação acidental de opsina, preferimos o último approastep
    1. Use o puxador de micropipeette (em um modo de quatro etapas) para produzir pipetas de estimulação a partir de capilares de vidro borossilicato. O diâmetro da ponta interna deve ser de cerca de 1 μm. Quando preenchido com ACSF, a resistência ao eletrodo deve ser de cerca de 10 MΩ.
    2. Para induzir a liberação potencialmente dependente da ação do glutamato a partir de um conjunto de boutons sinápticos ligados ao mesmo axônio, use ampliação de 63x, o filtro de emissão de 510 nm e a imagem subtraída para colocar um eletrodo de estimulação de vidro ao lado de uma varicosidade fluorescente . Evite a proximidade de axôns adicionais.
    3. Ligue o estimulador para fornecer pulsos de corrente despolarizante à pipeta de estimulação. Use intensidades de corrente em torno de 2 μA (não mais de 10 μA).
    4. Ligue o sistema de aplicação de banho multicanal onde um canal fornece a solução de banho padrão e os outros canais fornecem os bloqueadores necessários de canais de íons, transportadores ou receptores de membrana. Controle o fluxo no local da gravação e, em seguida, mude para o canal de tetrodotoxina (TTX) (solução de banho mais 1 μM TTX). Depois de 2-3 min, estimule o bouton de interesse novamente, mas agora na ausência de geração potencial de ação. A liberação é diretamente devido ao fluxo de cálcio através de canais de cálcio que dependem da tensão.
    5. Ao girar a chave de intensidade no estimulador, ajuste a corrente de estimulação para obter respostas semelhantes às obtidas através de potenciais de ação. Normalmente, a corrente de estimulação seria em torno de 6 μA para uma despolarização de 0,5 ms.
    6. Para o teste básico da preparação, aplique 0,5 mM CdCl2. A presença deste canal de cálcio bloqueador de glutamato libera completamente a liberação de glutamato sináptico validando assim a dependência de cálcio do sinal de glutamato diretamente evocado.
      NOTA: A seguinte recomendação geral pode ajudar a aumentar a taxa de sucesso de experimentos de sinapse única no estriado. Para selecionar terminais sinápticos glutamatergicos com máquinas de liberação intactas, uma varicosidade deve: (i) Ter uma forma suave semelhante ao fuso; (ii) Não estar associado a uma bifurcação de axôno; (iii) Ser mais brilhante do que outras estruturas na "imagem amarela"; (iv) Residir no neuropil estriado em vez de nos tratos de fibras; (v) Residir em um ramo de axôno muito fino; (vi) Não resida nas partes mais profundas da fatia.

3. Visualização da Liberação e Liberação do Glutamato

  1. Modo de gravação
    NOTA: Após a subtração da autofluorescência (etapa 2.2) e alguns testes iniciais para resposta do bouton de interesse (Etapa 2.3), a aquisição de dados pode começar. As respostas à ativação elétrica da liberação de glutamato a partir de terminais de axôno único podem ser observadas diretamente na imagem (Figura 2), sem aplicar mais ferramentas de análise. No entanto, mostrou-se muito conveniente extrair imediatamente alguns indicadores básicos do desempenho da sinapse (Figura 3). Essas informações são necessárias para tomar decisões sobre o curso subsequente do experimento, como seleção de determinados tipos de terminais, avaliação rápida de alterações relacionadas ao HD, número e frequência de ensaios ou medicamentos a serem aplicados com o sistema de superfusão. Também pode ser necessário lidar com artefatos eventualmente aparecendo. Primeiro, as configurações padrão para gravação de dados são descritas.
    1. Usando os drives XY do microscópio, coloque o bouton iGluupositivo testado perto do centro do campo de visão. Interrompa a aquisição de imagens com o botão de aquisição Abort. Na última imagem adquirida, determine a posição XY do centro de descanso bouton clicando nele com o botão esquerdo do mouse. As coordenadas XY do cursor definido serão mostradas no painel de status inferior da janela de aquisição.
    2. Utilizando os dados de calibração (etapa 2.1.6), calcule as coordenadas do local onde o raio laser deve ser enviado para a excitação da fluorescência iGluu. Use as seguintes equações: X laser = X câmera * X fator + X offset, Y laser = Y offset – Y câmera * Fator Y. Durante a realização deste recálculo, preste atenção nas configurações verticais ou horizontais da câmera.
    3. Crie uma seqüência de um ponto no software de controle a laser usando as coordenadas calculadas. Para isso, selecione Ponto na caixa Adicionar para seqüência na página Seqüência do software de controle a laser. Selecione 10 μs para o atraso para disparar o início e 180 ms para o tempo de pulso do laser. Mova o mouse para as coordenadas calculadas e clique no botão esquerdo.
    4. Selecione as seguintes configurações no software de controle a laser: Executa: 0, Execute delay: 0, Sequence: Run at TTL. Em seguida, clique em Iniciar seqüência.
    5. No software de controle de câmera, selecione as seguintes configurações: Na página Binning/ROI, set Área de imagem:Personalizado, Pixel Binning:2x2, Altura:20, Largura: 20, Esquerda:X-coordenada do ponto de descanso iGluupositivo menos 10 px, Exposure Time Inferior: Y-coordinate do iGluu-ponto positivo menos 10 px, Modo de Aquisição: Série Cinética, Série Cinética 0,0003744s (valor mínimo). Com essas configurações, a taxa de aquisição será de 2,48 kHz.
    6. Selecione modo Gatilho: Externo. Clique em Pegar sinal no software de controle da câmera. Inicie o protocolo experimental estabelecido para o dispositivo de disparo.
    7. Implemente o protocolo experimental Teste com a seguinte linha de tempo: 0 ms – iniciar o teste, 1 ms – iniciar iluminação a laser, 20 ms – iniciar aquisição de imagem com câmera, 70 ms – iniciar estimulação elétrica 1, 120 – iniciar estimulação elétrica 2, 181 ms – final de teste (laser e câmera desligada). Assim, durante um teste a câmera adquire 400 quadros com uma frequência de 2,48 kHz. Veja os passos 2.3.3 e 2.3.5. para detalhes sobre estimulação elétrica.
    8. Para permitir a recuperação suficiente de piscinas de vesículas pré-sinápticas, aplique o teste de protocolo com uma frequência de repetição de 0,1 Hz ou inferior.
  2. Construção off-line do glutamato transitório e rápida avaliação da liberação e liberação de glutamato para identificação de sinapses patológicas
    1. Ligue as rotinas de avaliação. Aqui, usamos um software escrito internamente SynBout v. 3.2. (autor: Anton Dvorzhak). As etapas a seguir são necessárias para construir um δF/F transitório a partir dos pixels com fluorescência elevada iGluu como no vídeo da Figura 2.
    2. Para determinar o tamanho do bouton, calcule a média e o desvio padrão (DP) da intensidade de fluorescência do ROI em repouso (F), antes do início da estimulação. Determine e encaixote a área ocupada por pixels com F>média + 3 SD(Figura 3A). Determine um diâmetro virtual (em μm) assumindo uma forma circular da área supra-limiar.
    3. Determine ΔF como a diferença entre o valor de intensidade de pico e F. Plote a corrente estimulante e ΔF/F contra o tempo(Figura 3B). Calcule o SD de ΔF/F em repouso (antes do início da estimulação) e a "Amplitude de Pico". Use pixel com amplitude de pico mais de 3 SD de ΔF/F para realizar encaixes monoexponenciais para a decomposição do pico. Determine a constante temporal de decomposição TauD de ΔF/F.
    4. Para estimar a "amplitude máxima" em uma determinada sinapse, selecione o pixel com o valor δF/F mais alto. É tipicamente localizado dentro ou ao lado dos limites do bouton de repouso iGluu fluorescência. A "Amplitude Máxima" seria o melhor indicador da carga de glutamato apresentada à maquinaria de uma única sinapse.
    5. Para estimar a extensão espacial do sinal iGluu, determine o diâmetro da área de todos os pixels supra-limiares combinados para formar um círculo virtual. O respectivo diâmetro é chamado de "Spread". O termo "Pico de spread" refere-se então ao valor máximo do transitório de spread médio(Figura 3C, diferença entre linhas vermelhas pontilhadas).
  3. Correções para possíveis artefatos
    NOTA: A despolarização elétrica está associada a um fluxo externo da solução intra-pipeta. Isso pode resultar em um pequeno deslocamento de tecido. Para discriminar as mudanças induzidas pela estimulação do iGluu e as mudanças fora de foco da imagem, pode-se usar a seguinte abordagem para identificar e eliminar artefatos de deslocamento(Figura 4).
    1. Analisar as características espaciais dos pixels supralimiares derivados de um ROI com sinais de deslocamento (Figura 4F-H).
    2. Encontre pixels fora dos limites inicialmente determinados do bouton em repouso(Figura 4F-H, encaixotado em vermelho).
    3. Identificar eventualmente os valores de intensidade de pixels negativos existentes(Figura 4I, J). Qualquer ΔF/F na direção negativa com uma amplitude maior que a média de pré-estimulação ± 3 SD deve ser considerado como artefato, e o registro deve ser descartado.
    4. Para evitar artefatos fora de foco, coloque o eletrodo de estimulação no lado antero-lateral do bouton sináptico, use estimulação elétrica bifásica e minimize a intensidade/duração da estimulação.
      NOTA: Artefatos fora de foco também podem ser derivados da câmera. Se este último não for fixado de forma ideal ao microscópio, pode produzir oscilações, provavelmente devido a pequenas vibrações do sistema de resfriamento da câmera. Tais vibrações criam um padrão "yin e yang" nas imagens ΔF/F girando com uma frequência de 50 Hz. As vibrações podem ser matematicamente subtraídas do sinal de fluorescência, mas a qualidade final das medições dependeria criticamente do tempo de gravação.
    5. Fixe a câmera no microscópio de tal forma que as vibrações estejam ausentes. Se este permanecer, coloque uma junta de borracha entre a câmera e o adaptador de microscópio.
      NOTA: Não se pode negligenciar a possibilidade de que o neuropil estriatal em torno da sinapse de interesse contenha varizes glutamatergicas que não expressam iGluu e, portanto, permanecem invisíveis. No caso de sua co-ativação (mais provável na ausência de TTX) os transitórios obtidos a partir dos boutons de interesse podem ser afetados pelo derramamento. O mesmo se aplica aos terminais de expressão iGluuque estavam fora de foco. Um fenômeno característico seria, neste caso, que os transitórios de fluorescência se originam de uma área muito mais ampla. Como essa resposta é eliminada pelo TTX, pode-se interpretá-la como uma resposta inespecífica induzida pela ativação multifibra injustificada.
    6. Para corrigir essa resposta multifibra inespecífica, siga o procedimento descrito na Figura 5. Use o sinal de fluorescência de pixels nos limites do campo de visão. Para minimizar a resposta em segundo plano, minimize a intensidade e a duração da estimulação ou use TTX.

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Representative Results

Identificação de dois tipos de varizes glutamatergicas corticostriatais
Os aferentes de TI e PT originam-se na camada 2/3 e 5, respectivamente, e apresentam padrões diferenciais de ramificação e terminação no estriado ipsilateral e contralateral (somente terminais de TI). Ainda pouco se sabe sobre as propriedades da liberação de glutamato e liberação condições de ativação repetitivas observadas durante o início dos movimentos, mas é bem documentado que as respectivas varicosidades libertadoras de glutamato diferem no tamanho22. Aplicando um critério de tamanho, verificou-se que os terminais de TI e PT exibem formas contrastantes de plasticidade de curto prazo24. Em intervalos de estímulo de 50 ms, os terminais de TI menores eram propensos à depressão de pulso pareado (PPD), enquanto os terminais maiores de PT apresentavam facilitação de pulso pareado. Essa diferença também foi observada em intervalos mais curtos (20 ms) e ao longo de uma série de 6 pulsos. A Figura 3 e a Figura 6 ilustram esses experimentos onde a liberação de glutamato sináptico foi provocada através do mecanismo potencial de ação na concentração fisiológica de Ca2+/Mg2+.

Identificação de sinapses disfuncionais em camundongos com doença avançada de Huntington
Doenças neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson e Doença de Huntington são caracterizadas por uma perda cada vez maior de sinapses glutamatergicas36. Novas terapias visam impedir ou mesmo reverter essa progressão fatal. O que exatamente desencadeia o desaparecimento de uma sinapse, e quando, é amplamente desconhecido. Mais informações podem ser esperadas a partir de estudos que ofereçam critérios para (a) a identificação vital de uma determinada classe de sinapses glutamatergicas e (b) a detecção de contatos disfuncionais versus normalmente realizados. Aqui será mostrado como os valores taud obtidos a partir de terminais tipo PT foram usados para estimar a fração de sinapses disfuncionais no Q175 heterozigotes com um fenótipo motor identificado.

Antes dos experimentos de imagem da sinapse única, os camundongos foram submetidos a um teste rápido, mas bastante robusto, para alterações em seus comportamentos exploratórios. Este teste é chamado de "teste de passo". O animal foi colocado no centro de uma placa de Petri (de 185 mm de diâmetro e 28 mm de altura da parede). O teste foi gravado com uma câmera de vídeo. Usando a análise offline, pode-se determinar o tempo entre a decolagem da mão do experimentador e o momento em que o animal tem todos os 4 pés fora do prato. O plotagem dos dados de mais de 100 HET e Q175 HET com idades entre 12 e 18 meses sugere que camundongos com latência de >300 s podem ser diagnosticados como hipocinéticos. A Figura 7A ilustra uma correlação positiva significativa entre os resultados obtidos para o caminho total executado no campo aberto e a latência de passo a passo.

A imagem de sinapse única iGluu mostrou que esses camundongos hd sintomáticos apresentaram déficit na velocidade de decaimortalidade do glutamato justato, como refletido nos valores taud de estímulos únicos (ou primeiro em uma seqüência)(Figura 7B,C). Em WT, tal prolongamento só foi observado após a aplicação de um inibidor não transportável seletivo da captação de glutamato - DL-threo -β-benxioxiaspartic (TBOA, Figura 7threoD,E). Isso sugere um papel dos transportadores de glutamato ascróciticos na regulação da liberação de glutamato sináptico. Alterações na difusão de Glu no espaço perissináptico não foram encontradas24. Mas, é claro, muito mais trabalho é necessário para realmente identificar a causa da liberação lenta do glutamato em HD, bem como em outras formas de parkinsonismo. Além das alterações na proximidade astrócito9 e da redução da expressão slc1A2 37, pode-se considerar também a instabilidade relacionada à doença de EAAT2 na membrana plasmática dos processos de astrócitos perissinápticos (PAPs). Isso pode ser resultado de mudanças no interactome EAAT2. De fato, recentes experimentos de espectroscopia em massa no laboratório apontam para uma perda da interação eaat2-distrophin em astrócitos estriais (Hirschberg, Dvorzhak, Kirchner, Mertins e Grantyn, inédito).

Muito pouco se sabe em relação à linha do tempo da disfunção sináptica com progressão de HD, mas é muito provável que as sinapses saudáveis coexistam com as já prejudicadas. Na busca por um critério de classificação, examinamos os dados taud de diferentes camundongos. Para isso, os valores de amplitude e TauD de 3 ensaios emparelhados consecutivos foram normalizados para a primeira resposta (ver Figura 6F para um esquema experimental), e a probabilidade de ocorrência de um determinado valor taud foi comparada em WT compatível com a idade versus Q175 HET(Figura 6G). Verificou-se que em TM TauD nunca ultrapassou 15 ms, enquanto no Q175 HET sintomático, 40% das sinapses apresentaram taud valores entre 16 e 58 ms, apesar de uma tendência de redução na quantidade de glutamato liberado(Figura 6H,I). TauD pode então ser considerado como um biomarcador para sinapses disfuncionais em HD e ainda ser usado para verificar a recuperação funcional em experimentos direcionados ao transporte de glutamato ascrócitico.

Figure 1
Figura 1: Identificação de varicosidadesiGluu-positivas. (A) Imagem de fluorescência obtida com um filtro de passe de 510 nm ("imagem amarela"). (B) Mesmo campo de visão adquirido com um filtro de passe de 600 nm ("imagem vermelha"). Note que o ponto marcado com ponta de seta preta desapareceu em (B). Sobreposição de (A) e (B). Seta branca = autofluorescência, seta preta = iGluu-varizeity positiva. (D) Imagem obtida por subtração de (B) de (A). As manchas autofluorescentes são escuras e o ponto iGluu+ é brilhante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Filme ainda de um vídeo em câmera lenta (fator de desaceleração 1240x). Linha superior: Imagens de WT (esquerda), Q175 HET (meio) e HOM (direita). Linha inferior: Respectivos iGluu transitórios do pixel com a maior elevação de glutamato (Maximal ΔF/F). O cursor vermelho indica o ponto no transitório correspondente à imagem acima do traço. note a elevação prolongada de iGluu fluorescência (pixels vermelhos e transitórios ΔF/F). Modificado e reimpresso com permissão de Dvorzhak et al.24Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Extração de indicadores funcionais a partir de imagens de sinapse única do sensor de cola ultrarrápido geneticamente codificado iGluu em neurônios corticostriatais. (A, D) Exemplo de um bouton PT (A) e IT (D) com o respectivo iGluu fluorescência em repouso (esquerda) e no auge de uma resposta iGluu mediada por AP (direita). (B, C, E, F) iGluu respostas registradas a partir do bouton mostrado em (A, D); Experimente em 2 mM Ca2+ e 1 mM Mg2+. (B) Gravação simultânea da corrente de estimulação (traço superior) e intensidade média de pixels supra-limiares (traço inferior). A mesma escala de tempo para todos os vestígios. Amplitudes de pico (entre linhas horizontais vermelhas pontilhadas) e uma função monoexponencial adaptada à decadência deste pico (sobreposição vermelha). Os valores taud correspondentes (τ) são mostrados ao lado das curvas de encaixe. (E, F) Trama de propagação contra o tempo. Pico de propagação: diferença entre linhas horizontais vermelhas pontilhadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Características de um iGluu transitório induzido por glutamato (A-E) em oposição a um artefato de deslocamento (F-J). (A, B) e(F, G) mostram a intensidade absoluta de fluorescência em repouso (A, F) e após a estimulação (B, G) em unidades arbitrárias (au). (C, H) Fluorescência varia em percentual da fluorescência de repouso antes da estimulação (ΔF/F%). (D, I) Superposição do iGluu transitórios de todos os pixels em unidades arbitrárias. (E, J) Superposição dos transitórios iGluu de todos os pixels em ΔF/F %. No caso da liberação de glutamato sináptico, os pixels próximos ao terminal de descanso apresentam um aumento de fluorescência após a estimulação, enquanto no caso de mudanças fora de foco, o pixel mais brilhante em repouso apenas muda sua posição no ROI, sem um aumento na intensidade de fluorescência geral do campo de visão. Um artefato de deslocamento também pode ser reconhecido pelo aparecimento de sinais negativos δf/f (J). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Correção para resposta iGluu inespecífica. (A-D) Exemplo de resposta sináptica emparelhada contaminada por uma resposta de fundo inespecífica. (E-H) O mesmo depois da correção. (A, E) Antes da estimulação. (B, F) Durante a estimulação. (C, G) Depois da estimulação. (D, H) Transitórios de intensidade sobrepostas correspondentes (em ΔF/F) de todos os pixels do ROI. O ponto de tempo de aquisição das imagens é marcado por letras pequenas correspondentes sobre as pontas das flechas. Observe que no painel C a resposta de fundo é muito difundida e lentamente em decomposição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Diferenças distintas de tamanho e tamanho na relação de pulso emparelhado com amplitude (PPR) do iGluu transitório. ( A) Esquema simplificado do circuito corticostriatal22, ilustrando o conceito de projeção preferencial de neurônios do trato piramidal (PT) para neurônios de projeção estrial indireta (iSPNs) e neurônios intratelencefálicos (TI) para direcionar as SPNs (dSPNs), com diferenças de tamanho entre os terminais de TI e PT. (B) Distribuição bimodal dos diâmetros de bouton, conforme determinado pela fluorescência de repouso supra-limiar antes da estimulação. Os boutons com diâmetro ≥0,63 μm foram definidos como "Grandes" e assumidos como emitidos por axôns pt. Para imagens originais e traços de amostras de sinapses pt e it-type ver Figura 3. (C) A correlação positiva significativa é observada entre o PPR das amplitudes de pico e os diâmetros do bouton. Cada ponto de dados representa a média dos 3 primeiros ensaios de cada bouton. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Identificação de sinapses disfuncionais em camundongos Q175 com fenótipo hipocinético. (A) Resultados de testes motores no dia da única imagem sinapse. Latências over-over >300 ms foram consideradas patológicas. Na idade testada (média de 16 meses), 17/54 HET apresentou um fenótipo pronunciado no teste de step-over. No que diz respeito à hipocinesia, o teste de passo a passo parece ser mais sensível do que o teste de campo aberto. No entanto, houve uma correlação significativa entre o resultado do teste de passo (tempo entre colocação e barreira cruzada com todos os quatro pés) e o teste de campo aberto (ou seja, o percurso total executado em 5 min). y = -0,01511X + 458,7; P = 0,0044 (regressão simples). (B) Média evocada sinapse única iGluu transitórios normalizados para a mesma amplitude de pico para ilustrar diferenças relacionadas ao HD na liberação de glutamato sinapticamente liberado. As respectivas curvas de montagem destacam as diferenças na duração dos transitórios de glutamato. (C) Quantificação dos resultados do tipo selvagem (cinza), HET (vermelho) e HOM (magenta). (D, E) A incubação de fatias de TT em 100 nM de TFB-TBOA simulou a depressão do despejo de glutamato observada em HOM. (F) Esquema de ativação da sinapse e organização de dados. (G) Histogramas cumulativos de valores #1 TauD. (H, I) Parcelas de respostas #2 normalizadas. Dados de 31 sinapses HET e 30 HET (todas do tipo PT). Na amostra de WT, todos os valores taudmax foram ≤15 ms. Na amostra HET, 40% das sinapses apresentaram valores TauDmax superiores ao limiar de 15 ms definido pelo taudmax mais longo em WT. Esses gráficos enfatizam as diferenças relacionadas ao HD nas faixas de amplitude máxima (ou seja, o valor do pixel com o maior aumento de fluorescência iGluu) e TauDmax (o TauD do pixel com maior elevação). Os valores taudmax exclusivamente encontrados em HET são mostrados em vermelho, e os valores de amplitude vistos exclusivamente em WT são mostrados em cinza. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Os testes estatísticos utilizados são indicados junto ao respectivo gráfico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os experimentos dizem respeito a uma questão de interesse geral — a independência da sinapse e sua possível perda no curso da neurodegeneração, e descrevemos uma nova abordagem para identificar sinapses afetadas em fatias cerebrais agudas de camundongos idosos (>1 ano). Aproveitando as características cinéticas melhoradas do sensor de glutamato recém-introduzido iGluu os experimentos iluminam a relação entre liberação de glutamato sináptico e captação de uma forma que não foi possível antes.

A influência do despejo de glutamato na função e manutenção das sinapses não é muito bem elucidada, embora a hipótese de que a excitotoxicidade induzida por glutamato possa causar perda de neurônios e poda de sinapse é mencionada em quase qualquer revisão pertinente sobre epilepsia, derrame e doenças neurodegenerativas38,39,40,41. No entanto, as evidências disponíveis são mais limitadas do que o esperado da literatura. A confusão se soma ainda mais ao fato de que as ferramentas experimentais selecionadas podem ser insuficientes tendo em vista os problemas associados à baixa resolução espacial e temporal ao interpretar os resultados obtidos com técnicas brutas de estimulação e gravação42,43. Isso pode levar a falsos negativos desencorajando novas pesquisas, o que é mais do que lamentável, tendo em vista distúrbios neurológicos tão graves quanto a doença de Huntington. A presente abordagem garante melhor discriminação por sinal e, portanto, maior apoio à ideia de que em HD uma fração significativa das sinapses corticostriatais exibe sinais de desobstrução do glutamato prejudicado.

Os resultados apresentados revelaram diferenças de plasticidade de curto prazo dentro da via corticostriatal. Embora este último tenha estado no foco de inúmeros estudos17,44, não foi previsto que os afientes originários das camadas corticais superiores apresentariam depressão dependente da frequência, em contraste com os aferentes do trato piramidal originários da camada 5. Este último preferencialmente mostrou uma potencialização dependente da freqüência de liberação e pode, portanto, estar em maior risco de insuficiência de captação de glutamato.

Experimentos em fatias cerebrais agudas de camundongos adultos são importantes para elucidar alterações sinápticas em uma idade apropriada da vida. A idade e o estado funcional da preparação são particularmente relevantes se os astrócitos estavam envolvidos no mecanismo de interesse. Aqui, é essencial que os astrócitos sejam maduros o suficiente para exibir níveis adultos de atividade do transportador de glutamato e homeostase de cloreto relacionado45.

Ensaios sinapses únicos abrirão o caminho para uma melhor compreensão das alterações relacionadas ao HD da transmissão sináptica glutamatergica no cérebro intacto46. Foi demonstrado que a resolução da sinapse única também pode ser alcançada no cérebro intacto, desde que as sinapses de interesse estejam localizadas nas camadas superficiais do córtex cerebral47.

Finalmente, a presente abordagem experimental tem o apelo de que pode ser usada por muitos seguidores, uma vez que o equipamento necessário ainda está no lado de baixo custo.

Em suma, sinais de fluorescência relatando liberação de glutamato e as alterações justatosynapticna na concentração de glutamato no cérebro intacto podem fornecer dados inalcançáveis com qualquer método eletrofisiológico. Mas, como em qualquer novo método, essa abordagem tem suas limitações e desvantagens que foram, em parte, abordadas nas etapas 2.2 e 3.3. A fluorescência de baixa restingdo do sensor iGluu de alta e rápida afinidade requer um pouco de exercício/experiência para identificar varicosidades adequadas para testes posteriores. Com a co-expressão de um indicador de cálcio geneticamente codificado (GECI) como o XCaMP-R48 e pelo menos dois sistemas coordenados de iluminação de lasers, a busca de terminais funcionais de axôno se tornaria muito mais fácil. De qualquer forma, é fundamental expor a preparação o mínimo possível à luz excitante antes e durante a gravação do iGluu.

O uso de um laser de 473 nm (em vez da eliminação regular do campo inteiro) para provocar iGluu fluorescência é um pré-requisito para obter emissões suficientes, mas também causará branqueamento. Nas condições dadas, iGluu foi totalmente branqueado após 10 ensaios de estimulação/aquisição (10 pares de estímulos em um intervalo inter-estímulo de 50 ms e uma taxa de repetição de 1/10 s). O tempo máximo de iluminação total para aquisição de dados de estado estável com o sistema de laser de 1 fóton atualmente utilizado e a configuração descrita foi de aproximadamente 2 s. O branqueamento do iGluu é exponencial, sendo muito forte durante os primeiros 20 ms após o início da iluminação e muito mais lento depois disso. Portanto, é aconselhável evitar a aquisição de sinal durante os primeiros 20 ms de cada ensaio e adquirir não mais do que um total de 10 pares de resposta. As respostas a estímulos únicos poderiam ser registradas com tempos de exposição de 60-80 ms em vez dos 180 ms atualmente utilizados.

Outra questão crítica é o nível de expressão de iGluu. No estudo pioneiro de Helassa et al.27,os construtos virais foram aplicados por eletroporação a neurônios cultivados27, o que produz níveis de expressão mais elevados do sensor e, presumivelmente, também menos branqueamento especialmente se um dispositivo de varredura a laser de dois fótons pode ser usado em vez de um microscópio de um fóton. Dürst et al.49 relatam a aquisição rotineira de expressão postynaptica de iGluu em neurônios piramidais CA1 em ~100 ensaios (cada um exposto por apenas 80 ms). No entanto, o tecido cerebral cultivado não é uma opção quando os experimentos visam esclarecer funções sinápticas dependentes de astrócitos no cérebro envelhecido. Uma expressão dependente de CaMKII-Cre de iGluu usando um promotor mais forte pode fornecer preparações com expressão mais forte em menos células, aumentando assim a resolução do método e permitindo a aquisição de mais ensaios por sinapse.

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Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo CHDI (A-12467), a Fundação Alemã de Pesquisa (Exc 257/1 e DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) e fundos de pesquisa intramuros do Charité. Agradecemos a K. Török, St. George's, University of London, e N. Helassa, University of Liverpool, pelo iGluu plasmid e muitas discussões úteis. D. Betances e A. Schönherr prestaram excelente assistência técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI

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Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington
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Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single… More

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).

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