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Neuroscience

正常小鼠和亨廷顿小鼠急性脑切片中谷氨酸释放和服用的单突触指标

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60113
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

Summary

我们提出了一个协议，以评估成年小鼠急性切片中单皮质谷胱甘肽突触的谷氨酸释放和间隙之间的平衡。该协议使用荧光传感器iGluu进行谷氨酸检测，sCMOS摄像机用于信号采集和用于聚焦激光照明的设备。

Abstract

突触是高度分节的功能单元，相互独立地运行。在亨廷顿舞蹈症 （HD） 和其他神经退行性疾病中，由于谷氨酸清除不足以及由此产生的溢出和溢出效应，这种独立性可能会受到损害。前突起性终端和/或树突脊柱的天体细胞覆盖率改变，谷氨酸释放部位谷氨酸转运器簇的缩小，都与导致头晕/超激症症状的疾病发病机制有关。然而，导致HD谷胱甘肽突触功能障碍的机制并不十分了解。改进和应用突触成像，我们获得了数据，为阻碍运动启动的机制提供了新的曙光。在这里，我们描述了一种相对便宜的方法，通过使用新的基因编码的超快谷氨酸传感器iGluu，宽场光学，科学的CMOS（sCMOS）相机，473纳米激光和激光定位系统，以评估从年龄适当的健康或患病小鼠急性切片皮质分泌突触的状态，实现单突触分辨率的原理元素。谷氨酸瞬变由单像素或多个像素构造，根据活性区旁边的谷氨酸浓度[Glu]的最大海拔获得谷氨酸释放估计值，ii） 谷氨酸上升，反映在阴囊 [Glu] 的衰减时间常数 （TauD） 中。休息的回合大小和短期可塑性对比模式的差异是确定属于端脑内 （IT） 或金字塔道 （PT） 路径的皮质质间端子的标准。使用这些方法，我们发现，在有症状的HD小鼠+40%的PT型皮质突触显示谷氨酸间隙不足，这表明这些突触可能面临兴奋毒性损伤的风险。研究结果强调了TauD作为亨廷顿小鼠功能失调突触的生物标志物的效用，这种生物标志物具有低动力学表型。

Introduction

属于"单一连接"（即2个神经细胞之间的连接）的每个突触终端的相对影响通常由其对脑后神经元11、22的初始部分的影响来评估。体素和/或从后鼻神经神经元的树突状记录代表最常见的，直到现在，也是澄清自上而下或垂直透视33，4，54,5下信息处理的最有效手段。然而，星形细胞的存在及其离散和（在啮齿动物）非重叠区域可能有助于一个水平视角，基于在突触站点66，7，8，9，107,8,9,10的局部信号交换、集成和同步机制。

因为,众所周知，天体胶原体在神经退行性疾病11、12,12的发病机制中起着重要作用，特别是在谷胱甘肽突触13、14、15、1614的维持和可塑性方面起着重要作用13，可以想象，突触性能的变化会随着星形细胞在不同来源的共享靶区状态而演变。15,16为了进一步探索在健康和疾病方面目标/天体胶衍生的局部监管机制，有必要评估单个突触。制定本办法是为了估计功能性谷氨酸释放和清除指标的范围，并确定可用于识别与运动启动最密切相关的大脑区域（即首先在运动皮层和背纹体）中功能失调（或恢复）突触的标准。

纹状体缺乏内在谷胱甘肽神经元。因此，相对容易识别外分源的谷氨酸。后者主要起源于丘脑中和大脑皮层（见17，18，19，2018,19,20更多）。17皮质科斯特里亚特突触是由在皮质层2/3和5中局部的金字塔神经元的斧子形成的。各自的斧头通过更具有组织性地构成金字塔地带（PT）的光纤系统形成双端脑内 （IT） 连接或 ipsi边连接。另据介绍，IT型和PT型终端的发布特性和尺寸21、22,22不同。鉴于这些数据，人们也可以预期在谷氨酸的处理上会有一些差异。

纹状体是亨廷顿舞蹈症（HD）5中受影响最大的脑区。人类HD是一种严重的遗传性神经退行性疾病。Q175鼠标模型提供了一个机会来研究低动力学刚性形式的HD的细胞基础，这种状态与帕金森主义有很多共同之处。从大约1岁开始，同源Q175小鼠（HOM）表现出低血症的迹象，通过测量在开放场23中不运动所花的时间来揭示出来。目前对异血Q175小鼠（HET）的实验证实了在HOM观察到的先前运动缺陷，此外，观察到的马达缺陷伴随着在皮质分泌突触终端24附近出现星形外皮氨基酸输送器2蛋白（EAAT2）水平的下降。因此，人们推测，天体性谷氨酸的缺乏可能导致功能障碍，甚至失去各自的突触25，26。25,

在这里，我们描述了一种新方法，它允许人们根据释放的神经递质的量评估单个突触谷氨酸间隙。新的谷氨酸传感器iGluu在皮质激素金字塔神经元中表达。它由卡塔林Türük27开发，代表了先前引入的高亲和力，但缓慢的谷氨酸传感器iGluSnFR28的修改。两个传感器都是增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的衍生物。有关光谱和动力学特性，请参阅赫拉萨等人27。简而言之，iGluu是一种低亲和力传感器，具有快速去活化动力学，因此特别适合研究谷氨酸释放突触端子的谷氨酸间隙。iGluu的分离时间常数是在停止流装置中确定的，在 20°C 下，Tau的脱位值为 2.1 毫秒，但推断到温度为 34 °C27时为 0.68 毫秒。在2光子显微镜下，在有机细胞海马培养的CA1区域，在34°C下探测的单舍弗辅助终端，平均衰变时间常数为2.7毫秒。

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Protocol

所有工作均按照欧盟第2010/63/欧盟动物实验指令进行，并在柏林卫生保护和技术安全办公室（G0233/14和G0218/17）注册。

注：Q175 野生类型 （WT） 和异种 （HETs） 的录音可以在任何年龄和性别进行。在这里，我们研究了51至76周的男性和女性。

1. 注射谷氨酸传感器 iGluu，用于在科蒂科斯塔阿克斯中表达

  1. 使用移液器拉拔器（一步模式）准备硼硅酸盐玻璃移液器以注射病毒。拉动后，手动打破移液器，以获得 30~50 μm 的尖端直径。 高压灭菌器和手术器械，包括打开头骨的钻头。
  2. 存储病毒AAV9-CaMKIIa.iGluu.WPRE-hGH （7.5 x 1013gc/mL） 在 -80 °C 在 10 μL 等位值。如果在病毒产生后不久（6 个月内）进行注射，请保持在5°C。手术前，拿出小瓶，在室温下保持。
  3. 填充玻璃移液器并清除任何气泡。
  4. 用含有87.5毫克/千克氯胺酮和12.5毫克/千克木拉辛的溶液的腹内注射麻醉动物。皮下注射0.25%bupivacain（8毫克/千克），以额外缓解疼痛。通过监测肌肉张力并观察疼痛引起的反射的缺失，检查麻醉的深度。
  5. 将皮肤上的皮肤上做光，用70%的酒精消毒。将鼠标放入立体框架中。
  6. 使用手术刀去除皮肤和高速（38，000 rpm）钻头，使1.2毫米的孔在运动皮层上方的骨头。
  7. 将注射器与连接的注射移液器一起安装在精密操纵器的支架中。将垂直定向移液器插入4个不同部位的皮层。喷射坐标相对于布雷格玛（以毫米为单位）：前1.5、横向1.56、1.8、2.04、2.28。与杜拉母体有关的深度为（以毫米为单位）：1.5~1.7。
  8. 使用喷射系统，以0.05 μL/min的速度，每位未稀释的病毒溶液注射0.3 μL。每次注射后，将移液器留在原位 1 分钟，然后缓慢取出（1 毫米/分钟）。
  9. 最后用尼龙缝合结束手术伤口。
  10. 将鼠标放在洁净笼的加热垫上 0.5 至 1 小时，然后再将其返回到原始笼子。
  11. 在准备急性脑切片之前，将鼠标保持12小时昼夜循环6至8周。
    注：为了避免免疫反应导致细胞损伤和突触损失，注射多个病毒结构必须同时进行，或在主注射后2-3小时内进行。根据Paxinos和Franklin29大脑图集，选择了iGluu注射的坐标。它们对应于M1运动皮层。注射大脑的免疫染色可视化了许多，但大多是很好地孤立的斧头和斧头静脉曲张在ipsi和反向纹状体和在反向M1和S1皮质。

2. 搜索谷氨酸终端 表达谷氨酸传感器 iGluu

  1. 校准模式
    1. 使用以下设置准备 sCMOS 摄像机和摄像机控制软件。在读出页设置像素读出率： 560 MHz （= 最快读出），灵敏度/动态范围： 位，杂散噪声滤波器： 是，重叠读出： 是.在"装箱/ROI"页上，选择"全屏"。
    2. 在盖玻片下准备一个玻璃滑梯，内滴5毫克/mL路西法黄（LY）。
    3. 将 LY 幻灯片置于 63x 目标下方，打开激光快门并使用以下设置执行串行采集：像素装箱：1x1，触发模式：内部，曝光时间：最小（待定）。
    4. 调整激光功率以产生直径为 4 μm 的荧光点（图像不应包含饱和像素）。
    5. 要对激光定位系统进行校准，请在激光定位软件中选择以下设置：光点尺寸直径：10，扫描速度：43.200 kHz。单击右侧面板上的"开始图像采集"按钮。设置运行： 0，运行延迟：0，并在"序列"页上选择"在 TTL 上运行"选项。单击校准页面上的校准按钮，并根据采集屏幕左上角显示的说明校准激光控制软件。
    6. 如果设置使用独立的软件进行相机和激光控制，请从相机采集窗口获取屏幕截图，并将其发送到激光控制软件以重新计算 XY 坐标。如果软件安装在不同的计算机上，则使用视频抓取器将图像导入激光控制软件。激光控制软件将需要有关 XY 缩放因子和偏移的信息。为此，确定激光控制程序采集窗口中图像的左上角、左下角和右下角的坐标。根据以下方程计算缩放因子：X 因子 = （X 右下角 = X 左下）/2048，X 偏移 = X 左下角，Y 因子 = （Y 左上角 = Y 左下）/2048，Y 偏移 = Y 左下角。
    7. 在校准过程结束时，创建 267x460 像素的矩形感兴趣区域 （ROI），将其移动到屏幕中心，然后单击"开始序列"按钮。
    8. 返回到以下摄像机控制软件设置：装箱： 2x2，触发模式： 外部曝光，曝光时间： 最小 （待定）。
  2. 自动荧光校正模式
    注：[Glu]在主动突触终端环境中的静止水平通常低于100 nM 14、30、31、32、33、34。14,30,31,32,33,34因此，任何谷氨酸传感器，特别是像iGluu这样的低亲和力传感器，在没有突触谷氨酸释放的情况下都会相当暗淡。然而，一些iGluu荧光甚至可以在休息时检测到，但必须区分组织自荧光。473 nm 照明同时引起 iGluu荧光和自荧光（图 1A+C）。后者占据广泛的波长，而iGluu荧光限制为480~580nm（最大为510nm）。自动荧光校正基于对具有不同高通滤波器的两个图像的采集。
    1. 提前准备脑切片，如其他地方描述35。保持麸皮片的准备。
    2. 将切片转移到记录室，将其浸入含125 mM NaCl的含氧人工脑脊液（ACSF），3 mM KCl，1.25 mMNaH2PO4，25 mM NaHCO3， 2 mM CaCl2，1 mM MgCl2，10 mM 葡萄糖 （pH 7.3， 303 mOsm/L）， 辅以 0.5 mM 氧化钠丙酮， 2.8 mm 钠抗坏剂和 0.005 mM 谷胱甘肽.使用 1⁄2 mL/min 的流速。将沐浴温度保持在 28~30 °C。
    3. 在 20 倍水浸式目标下找到背纹纹。用尼龙网固定片在铂竖琴上，以尽量减少组织运动。切换到 63x /NA 1.0 水浸没目标。选择反射 473 nm（二色镜）光的滤镜和波长 >510 nm（发射滤镜）的过光滤光。
    4. 使用 AD/DA 板将照明、刺激和图像采集与相应的控制软件同步。设置触发程序以激光曝光时间180毫秒和图像采集时间160 ms来控制采集。 使用激光定位装置将激光束发送到预定的点数，并定义扫描速度和聚光灯大小的设置。
    5. 使用 510 nm 的高通滤波器（"黄色图像"）获取自荧光和 iGluu-正结构的图像。
    6. 使用 600 nm 的高通滤波器（"红色图像"）单独获取具有自动荧光的图像。
    7. 使用 10 最亮像素和 10 个最暗像素的平均强度来定义范围，缩放红色和黄色图像。执行减法"黄色减去红色图像"，重新缩放减去的图像以生成标准的 8 位 tif 文件，以方便可视化感兴趣的对象（图 1D）。它包含来自 iGluu-正结构的明亮像素、背景的灰色像素和具有自荧光结构结构的暗像素。
      注：使用给定设备时，平均静静荧光 （F） 将低于 700 A.U.A.U.
  3. 布顿搜索模式
    注：iGluu-正像素可能属于同节树的功能上不同的元素，如不同顺序的斧子分支、分叉部位、囊泡耗尽后的静脉曲张或完全活跃的静脉曲张。但是，仅仅通过目视检查几乎不可能识别功能突触端子。因此，每个谷胱甘肽突触端子都需要通过对电气去极化的反应来识别。对刺激没有反应的网站必须被丢弃。诱导谷氨酸从皮质激素下释放的生理手段是引起行动潜力。这可以通过使用具有适当光谱特性的通道红豆素或通过iGluu本身可视化的斧头的电刺激来实现。为了避免意外的奥辛激活，我们更喜欢后者
    1. 使用微移液拉拔器（在四步模式下）从硼硅酸盐玻璃毛细血管中产生刺激移液器。内部尖端直径应约为 1 μm。当充满ACSF时，电极电阻应约为10 MΩ。
    2. 为了诱导谷氨酸从连接到同一斧子的一组突触布顿释放，使用63倍放大倍率、510 nm 发射滤光片和减去的图像在荧光变数旁边放置玻璃刺激电极.避免靠近其他斧子。
    3. 打开刺激器，将去极化电流脉冲传送到刺激移液器。在 2 μA（不超过 10 μA）左右使用电流强度。
    4. 打开多通道沐浴应用系统，其中一个通道提供标准沐浴解决方案，另一个通道提供必要的电水通道、输送机或膜受体的阻滞器。控制记录现场的流量，然后切换到特罗多毒素 （TTX） 通道（沐浴溶液加 1 μM TTX）。2~3分钟后，再次激发人们的兴趣，但现在在缺乏行动的可能生成。释放直接是由于钙通过电压依赖的钙通道流入。
    5. 通过转动刺激器的强度键，调整刺激电流以获得与动作势引起的响应类似的反应。通常，0.5 ms 去极化的刺激电流约为 6 μA。
    6. 对于制备的基本测试，应用 0.5 mM CdCl2。这种钙通道阻滞谷氨酸释放的存在完全防止突触谷氨酸释放，从而验证直接引起谷氨酸信号的钙依赖性。
      注：以下一般性建议可能有助于提高纹状体中单突触实验的成功率。要选择具有完整释放机械的谷氨酸突触端子，应具有可变性：（一） 具有平滑的主轴形状;（二） 与斧子分叉无关;（三） 比"黄色图像"上的其他结构更亮;（四） 居住在纹状神经皮中，而不是纤维地带;（五） 驻留在一个非常薄的斧子分支上;（vi） 不驻留在切片的较深部分。

3. 谷氨酸释放和间隙的可视化

  1. 录制模式
    注：在自动荧光减法（步骤 2.2）和一些初始测试对感兴趣回合响应性（步骤 2.3）后，可以开始数据采集。无需应用进一步分析工具，即可在图像中直接观察到单个斧子端子中谷氨酸释放电活化的响应（图2）。然而，事实证明，立即提取突触性能的一些基本指标是非常方便的（图3）。需要这些信息来决定后续的实验过程，例如选择特定的终端类型、快速评估与HD相关的改动、试验的数量和频率或药物要应用于超级融合系统。可能还需要处理最终出现的工件。首先，描述了数据记录的标准设置。
    1. 使用显微镜 XY 驱动器，将测试的 iGluu-阳性布顿放置在视野中心附近。使用中止采集按钮停止图像采集。在最后一张获取的图片上，用鼠标左键单击休息的丁龙中心 XY 位置。设置光标的 XY 坐标将显示在采集窗口的底部状态面板上。
    2. 使用校准数据（步骤 2.1.6），计算应发送激光束以激发 iGluu荧光的站点的坐标。使用以下方程：X 激光 = X 摄像机 = X 因子 = X 偏移，Y 激光 = Y 偏移 = Y 摄像机 = Y 因子。执行此重新计算时，请注意摄像机的垂直或水平翻转设置。
    3. 使用计算坐标在激光控制软件中创建单点序列。为此，在激光控制软件的序列页上的"添加到序列"框中选择"点"。选择 10 μs 以进行延迟触发启动，选择 180 毫秒，用于激光脉冲时间。将鼠标移动到计算坐标，然后单击左键。
    4. 在激光控制软件中选择以下设置：运行： 0，运行延迟： 0，序列： 在 TTL 上运行。然后单击"开始"序列。
    5. 在相机控制软件中，选择以下设置：在Binning/ROI页面上，设置图像区域：自定义，像素装箱：2x2，高度：20，宽度：20，左：X 坐标的休息 iGluu- 正点减去 10 px，底部：Y坐标的休息 iGluu-正点减去 10 px，采集模式：动力学系列，动力学系列长度：400，曝光时间：0.0003744s（最小值）。通过此类设置，采集速率将为 2.48 kHz。
    6. 选择触发模式：外部。单击相机控制软件中的信号。启动为触发装置制定的实验协议。
    7. 实施实验协议试验与以下时间线： 0 ms = 开始试验， 1 ms = 开始激光照明， 20 ms • 使用相机开始图像采集， 70 ms • 启动电气刺激 1， 120 • 开始电气刺激 2， 181 ms = 结束试验 （激光和相机关闭）。因此，在一次试验中，摄像机可获取 400 帧，频率为 2.48 kHz。请参阅步骤 2.3.3 和 2.3.5。有关电刺激的详细信息。
    8. 为了充分恢复预突囊泡池，应用重复频率为 0.1 Hz 或更低的协议试用版。
  2. 谷氨酸瞬态的线外构造，以及谷氨酸释放的快速评估，用于识别病理突触
    1. 打开评估例程。在这里，我们使用内部编写的软件 SynBout v. 3.2。（作者：安东·德沃尔扎克）。以下步骤需要从具有提升 iGluu荧光的像素构造 μF/F 瞬态，如图2的视频中所示。
    2. 要确定 bouton 大小，请计算刺激开始前静止的 ROI 荧光强度 （F） 的平均值和标准差 （SD）。使用 F>平均 = 3 SD 确定像素占用的区域并将其框框（图 3A）。确定虚拟直径（以 μm 为单位），假设超阈值区域呈圆形形式。
    3. 确定 #F 作为峰值强度值和 F 之间的差值，绘制刺激电流和 +F/F 与时间（图 3B）。计算静止的 μF/F SD（在刺激开始之前）和"峰值振幅"。使用峰值振幅超过 3 SD 的 ±F/F 像素对峰值衰减执行单指数拟合。确定衰变的衰变陶D的时间常数为μF/F。
    4. 要估计给定突触处的"最大振幅"，请选择具有最高 +F/F 值的像素。它通常位于休息的布顿 iGluu荧光的边界内或旁边。"最大振幅"将是向单个突触的间隙机械显示的谷氨酸负载的最佳指标。
    5. 要估计 iGluu信号的空间扩展，确定所有超阈值像素的直径组合形成虚拟圆。相应的直径称为"扩散"。术语"峰值点差"是指平均点差瞬态的峰值（图3C，虚线红线之间的差异）。
  3. 对可能工件的修正
    注：电气去极化与移液内溶液的流出有关。这可能导致小组织置换。为了区分 iGluu的刺激引起的变化和图像的聚焦移位，可以使用以下方法识别和消除位移伪像（图 4）。
    1. 分析从 ROI 派生的超阈值像素的空间特征，具有位移迹象（图4F+H）。
    2. 查找静止的 bouton 最初确定边界以外的像素（图 4F+H，以红色框装）。
    3. 确定最终存在的负像素强度值（图 4I，J）。在负方向上任何 +F/F，其振幅大于刺激前均值 = 3 SD 应视为伪影，并且应丢弃记录。
    4. 为避免失焦伪影，将刺激电极放在突触的正侧，使用双相电刺激，并尽量减少刺激强度/持续时间。
      注： 非焦伪影也可以从相机派生。如果后者未以最佳方式固定在显微镜上，则会产生振荡，很可能是由于摄像机冷却系统的微小振动。这种振动在+F/F图像中形成"阴阳"模式，频率为 50 Hz。振动可以从荧光信号数学上减去，但测量的最终质量将在很大程度上取决于记录时间。
    5. 将相机固定在显微镜上，使振动不存在。如果后者仍然存在，则在相机和显微镜适配器之间放置橡胶垫片。
      注：人们不能忽视一种可能性，即围绕利息突触的纹状神经层含有谷胱甘肽的静脉曲张，不表达iGluu，因此保持不可见。在它们共同激活的情况下（更有可能在没有TTX的情况下），从利息的布顿获得的瞬变可能会受到溢出的影响。这同样适用于焦点失焦点的 iGluu表达终端。在这种情况下，一个典型的现象是荧光瞬变来自一个更为广泛的区域。由于 TTX 消除了此响应，因此可以将它解释为由不必要的多光纤激活引起的非特异性响应。
    6. 要更正此未特定的多光纤响应，请按照图 5中概述的过程操作。使用视场边界处像素的荧光信号。要最小化背景响应，请尽量减少刺激强度和持续时间或使用 TTX。

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Representative Results

两种皮质质谷类性变异性鉴定
IT 和 PT 亲和力分别源自第 2/3 层和第 5 层，在 ipsi边和反向（仅限 IT 终端）纹状体中表现出差分冲压和终止模式。仍然鲜为人知的谷氨酸释放和清除在重复激活条件下的特性，在运动开始期间观察到，但它是有充分记录，相应的谷氨酸释放变数在大小22不同。应用尺寸标准，发现IT和PT终端呈现出对比形式的短期可塑性24。在 50 ms 的刺激间隔下，较小的 IT 终端容易配对脉冲凹陷 （PPD），而较大的 PT 端子则表现出配对脉冲促进。这种差异也观察到在较短的时间间隔（20 ms）和整个一系列的6个脉冲。图 3和图 6说明了这些实验，其中突触谷氨酸释放是通过生理 Ca2+/Mg2+浓度下的动作势力机制诱导的。

晚期亨廷顿舞蹈症小鼠功能失调的识别
神经退行性疾病，如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症和亨廷顿舞蹈症，其特征是谷氨酸突触不断丧失36。新的疗法旨在阻碍甚至扭转这种致命的进展。究竟是什么触发了突触的消失，以及何时，基本上未知。从研究中可以预期进一步的见解，这些研究提供了以下标准：（a） 确定某一类谷氨酸突触的重要识别，以及（b） 检测功能失调与正常表现的接触。在这里，它将显示如何使用从 PT 型端子获得的TauD值来估计 Q175 中具有标识电机表型的杂散突触的分数。

在单一突触成像实验之前，小鼠被提交到一个快速但相当健壮的测试，以改变其探索行为。此测试称为"跨步测试"。动物被放置在一个培养皿的中心（直径185毫米，壁高28毫米）。测试是使用摄像机录制的。通过离线分析，可以确定实验者手的起飞和动物离开菜的4英尺之间的时间。绘制 100 多个 WT 和 Q175 HET 的数据，年龄介于 12 到 18 个月之间，表明具有 >300 s 的步长延迟的小鼠可以诊断为低动力学。图 7A说明了在开放字段中运行的总路径的结果与跨步延迟之间的显著正相关。

单突触iGluu成像显示，这些有症状的HD小鼠表现出在串联性谷氨酸衰减的速度缺陷，反映在TauD值从单（或一序第一）刺激（图7B，C）。在WT中，这种延长只有在应用了谷氨酸摄入的选择性不可运输抑制剂——DL-threo-β-苯基氧阿霉酸（TBOA，图7D，E）后才观察到。这表明占星性谷氨酸运输器在调节突触谷氨酸清除中的作用。格鲁在内空空间的扩散变化24日尚未发现。但是，当然，还需要做更多的工作来实际确定HD和其他形式的帕金森主义中谷氨酸清除速度减慢的原因。除了星细胞接近9的变化和减少slc1A2表达37，人们不妨考虑EAAT2在天体囊肿过程（PAPS）的血浆膜中与疾病有关的不稳定性。这可能是 EAAT2 交互器中更改的结果。事实上，最近在实验室进行的质谱实验表明，在纹状星细胞（赫希伯格、德沃尔扎克、基什内尔、默廷斯和格兰廷，未发表）中EAAT2-迪司芬相互作用的丧失。

关于HD进展的突触功能障碍的时间表知之甚少，但健康突触很可能与已经受损的突触共存。在搜索分类标准时，我们检查了来自不同小鼠的TauD数据。为此，连续3个连续配对试验的振幅和TauD值被规范化为第一个响应（参见实验方案图6F），并在年龄匹配的WT与Q175 HET（图6G）中比较了给定TauD值发生的概率。结果发现，在WT TauD从未超过15毫秒，而在症状Q175 HET中，40%的突触显示TauD值在16至58毫秒之间，尽管释放谷氨酸的数量有减少的趋势（图6H，I）。然后，TauD可能被视为 HD 中功能失调突触的生物标志物，并进一步用于验证针对天体谷氨酸迁移的实验的功能恢复。

Figure 1
图1：iGluu-正性变异性鉴定。（A） 荧光图像通过 510 nm 高通滤波器（"黄色图像"）获得。（B） 使用 600 nm 高通滤波器（"红色图像"）获取的相同视场。请注意，标有黑色箭头的点已消失在 （B） 中。（A） 和 （B） 的叠加。白色箭头 = 自动荧光，黑色箭头 = iGluu-正变化。（B）从 （A） 的减法获得的图像。自动荧光点是黑暗的，iGluu+ 点是明亮的。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图 2：仍在慢动作视频（减速系数 1240x）中拍摄影片。上一行：来自 WT（左）、Q175 HET（中）和 HOM（右）的图像。下排：从谷氨酸高程最高的像素（最大+F/F）的像素中，分别出现 iGluu瞬变。红色光标指示与跟踪上方图像对应的瞬态上的点。注意 iGluu荧光（红色像素和 +F/F 瞬变）的长时间高程。经德沃尔扎克等人许可修改和转载24，请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3：从皮质神经神经元中基因编码的超快Glu传感器iGluu的单突触图像中提取功能指标。（A， D）PT （A） 和 IT （D） 在静止时和 AP 介导的 iGluu响应峰值（右）与相应的 iGluu荧光的轮值示例。（B， C， E， F） iGluu从 （A， D） 所示的 bouton 中记录的响应;实验在2 mM Ca2+和1 mM毫克2+。（B） 同时记录刺激电流（上轨迹）和超阈值像素（下轨迹）的平均强度。所有跟踪的相同时间刻度。峰值振幅（在点红色水平线之间）和适合此峰值衰变的单指数函数（红色叠加）。相应的 TauD （*） 值显示在拟合曲线旁边。（E， F）与时间一起传播的阴谋。峰值点差：虚线红色水平线之间的差异。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 4
图 4：谷氨酸诱导 iGluu瞬态 （A+E） 相对于位移伪影 （F_J）的特征。（A， B） 和（F， G） 以任意单位 （au） 显示静止 （A、 F） 和刺激后 （B、 G） 的绝对荧光强度。（C， H）刺激前休息荧光百分比的荧光变化（+F/F%）。（D， I）以任意单位表示所有像素的 iGluu瞬变的叠加。（E， J）在 μF/F%% 中，来自所有像素的 iGluu瞬变的叠加在突触谷氨酸释放的情况下，休息终端旁边的像素在刺激后出现荧光增加，而在失焦位置时，静止最亮的像素只是改变其在 ROI 中的位置，而视野的泛光强度不会随之增加。位移伪像也可以通过负 +F/F 信号 （J） 的外观来识别。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 5
图 5：对未特定的 iGluu响应的更正。（A+D）被非特异性背景响应污染的成对突触响应示例。（E+H）修正后相同。（A， E）刺激前（B， F）在刺激期间。（C， G）刺激后。（D， H）来自 ROI 所有像素的相应叠加强度瞬变（以 +F/F 为单位）。获取图像的时间点在箭头上用相应的小字母标记。请注意，在面板 C 中，背景响应非常广泛且正在缓慢衰减。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 6
图 6：iGluu瞬态的振幅成对脉冲比 （PPR） 中与大小相关的显著差异。（A） 皮质体电路22的简化方案，说明金字塔道（PT）神经元向间接路径纹状投影神经元（iSPN）和特尔脑内（IT）神经元定向通路SPN（dSPN）的优先投影概念，IT终端和PT终端之间的大小差异。（B） 在刺激前由超阈值静静荧光决定的比态分布。直径 ±0.63 μm 的布顿被定义为"大"，假定由 PT 斧头发出。有关 PT 和 IT 类型的突触的原始图像和样本痕迹，请参阅图3。（C） 峰值振幅的 PPR 与风眼直径之间存在显著的正相关关系。每个数据点表示每个回合的前 3 个试验的平均值。*P < 0.05， *P < 0.01， *P < 0.001.请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 7
图7：识别Q175小鼠低动力学表型功能失调。（A） 单突触成像当天电机测试结果。跨步延迟 >300 ms 被视为病理。在测试年龄（平均16个月）时，17/54 HET 在跨步测试中表现出明显的表型。关于低皮血症，步进测试似乎比开放场测试更敏感。然而，步进测试的结果（放置和障碍与所有四英尺交叉的障碍物之间的时间）与开放场测试（即总路径在 5 分钟内运行）之间存在显著的相关性。Y = -0.01511X = 458，7;P = 0.0044（简单回归）。（B） 平均调用的单突触 iGluu瞬变规范化到相同的峰值振幅，以说明 HD 相关差异，在透明释放谷氨酸的间隙。相应的拟合曲线突出显示谷氨酸瞬变持续时间的差异。（C） 野生类型（灰色）、HET（红色）和 HOM（洋红色）的结果的量化。（D， E）在TFB-TBOA的100 nM中孵育WT切片模拟了在HOM中观察到的谷氨酸间隙的凹陷。（F） 突触激活和数据组织方案。（G） #1 TauD值的累积直方图。（H， I）规范化#2响应的图。来自 31 WT 和 30 HET 突触的数据（所有 PT 类型）。在WT样本中，所有TauDmax值为±15 ms。 在HET样本中，40%的突触显示的TauDmax值超过了WT中最长的TauDmax定义的15 ms阈值。这些图形强调了最大振幅范围（即 iGluu荧光增加率最高的像素中与 HD 相关的差异）和 TauDmax（具有最高高程的像素的TauD）。HET 中独遇到的 TauDmax 值以红色显示，WT 中唯一看到的振幅值以灰色显示。*P < 0.05， *P < 0.01， *P < 0.001.所使用的统计测试在相应的图形旁边指示。请点击此处查看此图形的较大版本。

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Discussion

实验涉及一个普遍感兴趣的问题 ——突触不依赖及其在神经退化过程中可能失去的问题，我们描述了一种识别老年（>1年）小鼠急性脑切片中受影响的突触的新方法。利用最近引入的谷氨酸传感器 iGluu的改进动力学特性，实验以前所未有的方式阐明突触谷氨酸释放和服用之间的关系。

谷氨酸清除对突触功能和维持的影响没有很好地阐明，虽然谷氨酸引起的兴奋毒性可导致神经元损失和突触修剪的假设在几乎所有有关癫痫、中风和神经退行性疾病的关于38、39、40、4139,40,41的假设中都提到了。38然而，现有证据比文献中可能预期的更为有限。由于在解释用总刺激和记录技术获得,的结果时，由于空间和时间分辨率低的问题，选定的实验工具可能不够充分，这进一步增加了混乱。这可能导致假阴性阻碍进一步研究，这是比不幸的是，鉴于神经紊乱，如亨廷顿舞蹈症。目前的方法确保更好的信号歧视，因此更有力地支持这样一种观点，即在HD中，相当一部分皮质突触显示出谷氨酸间隙受损的迹象。

本结果揭示了皮质菌通路内短期可塑性的差异。虽然后者一直是许多研究的焦点17 ， 44 ，但预计来自上皮质层的亲缘关系将表现出频率依赖性抑郁症，与源自第 5 层的金字塔性地块的形成对照。17,后者优先显示释放的频率相关强效，因此可能面临谷氨酸摄入不足的较高风险。

对成年小鼠急性脑切片的实验对于阐明在适当年龄的突触变化非常重要。如果星形细胞参与感兴趣的机制，制备的年龄和功能状态特别相关。在这里，天文学家必须足够成熟，以显示成人水平的谷氨酸运输器活性和相关氯化物平衡45。

单突触测定将为更好地了解在完整大脑46中谷胱甘肽突触的HD相关变化铺平道路。已经表明，单突触分辨率也可以在完整的大脑，只要感兴趣的突触被本地化在大脑皮层的表层47。

最后，目前的实验方法具有许多追随者可以使用的吸引力，因为所需的设备仍然处于低成本的一方。

简而言之，荧光信号报告谷氨酸释放和全完整大脑中谷氨酸浓度的并列变化，可以提供任何电生理方法无法实现的数据。但是，与任何新方法一样，这种方法也有其局限性和缺点，在步骤 2.2 和 3.3 中部分解决了这些缺点。快速和高亲和力 iGluu传感器的低静静荧光需要一点锻炼/经验来识别适合进一步测试的变数。通过基因编码的钙指标 （GECI）（如 XCaMP-R48）和至少两个协调的激光照明系统的共同表达，搜索功能性安克斯端子将变得更加容易。在任何情况下，在 iGluu录制之前和期间，尽可能少地将准备暴露在刺激光下至关重要。

使用473 nm激光（而不是常规的全场消除）诱导iGluu荧光是获得足够排放的先决条件，但也会导致漂白。在给定条件下，iGluu在10次刺激/采集试验后完全漂白（10对刺激对，刺激间隔为50毫秒，重复率为1/10秒）。目前使用的1光子激光系统为稳态数据采集的最大总照明时间，所述设置约为2s。iGluu的漂白呈指数级，在照明开始后的前 20 毫秒中非常强，此后速度较慢。因此，建议避免在每个试验的前 20 毫秒期间采集信号，并获取总共不超过 10 个响应对。对单一刺激的反应可以记录在曝光时间60~80毫秒，而不是目前使用的180毫秒。

另一个关键问题是iGluu的表达水平。在Helassa等人27的开创性研究中，病毒结构通过电穿孔应用于培养的神经元27，从而产生更高的传感器表达水平，并且可能也减少了漂白，特别是如果可以使用双光子激光扫描装置代替一光子显微镜。Dürst等人49报告在 #100 试验中，在 CA1 金字塔神经元中定期采集 iGluu的后纳普表达（每个只暴露 80 毫秒）。然而，当实验旨在澄清老年大脑中星细胞依赖突触功能时，培养的脑组织不是一种选择。使用更强的启动子的iGluu的CaMKII-Cre相关表达可以提供制剂，在更少的细胞中表达更强，从而提高该方法的分辨率，并允许获得每个突触更多的试验。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了CHDI（A-12467）、德国研究基金会（Exc 257/1和DFG项目ID327654276 + SFB 1315）和Charité校内研究基金的支持。我们感谢伦敦圣乔治大学K.Türék和利物浦大学的N.Helassa，感谢他们的iGluu质粒和许多有益的讨论。D. 贝坦斯和A.舍恩赫尔提供了出色的技术援助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI

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References

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神经科学， 第 157 期， 谷氨酸释放， 谷氨酸清除， 谷氨酸扩散， 前突起性终端， 星形细胞， 谷氨酸上升， 衰变动力学， 溢出， 光遗传学， iGluu，sCMOS
正常小鼠和亨廷顿小鼠急性脑切片中谷氨酸释放和服用的单突触指标
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Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).

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