Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

בודד סינפסה אינדיקטורים של גלוטמט שחרור ספיגה בפרוסות המוח חריפה מעכברים נורמלי הנטינגטון

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60113
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

Summary

אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את האיזון בין שחרור גלוטמט לבין הסיווג ב corticostriatal glutamatergic בודד בפרוסות חריפה מעכברים למבוגרים. פרוטוקול זה משתמש חיישן פלורסנט iGluu עבור זיהוי גלוטמט, מצלמה scmos עבור רכישת אותות והתקן עבור תאורה לייזר מוקד.

Abstract

הסינפסות הן יחידות פונקציונליות מאוד הפועלות באופן עצמאי אחד על השני. ב מחלת הנטינגטון (HD) ואחרים הפרעות ניווניות, עצמאות זו עלולה להיות בסכנה עקב הסיווג גלוטמט מספיק וכתוצאה מכך לשפוך ולשפוך את ההשפעות. כיסוי astrocytic משתנה של מסופי טרום סינפטיות ו/או שדוניים הדנדריטי, כמו גם גודל מופחת של אשכולות הטרנספורטר גלוטמט ב גלוטמט שחרור אתרים היו מעורבים בפתוגנזה של מחלות וכתוצאה מכך הסימפטומים של dys-/היפרקינססיa. עם זאת, המנגנונים המובילים את התפקוד של הסינפסות glutamatergic ב-HD אינם מובנים היטב. שיפור והחלה של הדמיה סינפסה הצלחנו להשיג נתונים ששפוך אור חדש על המנגנון מסכל את החניכה של תנועות. כאן, אנו מתארים את האלמנטים העיקריים של גישה זולה יחסית כדי להשיג החלטה סינפסה באמצעות החדש מקודד גנטית חיישן מהיר במיוחד iGluu, אופטיקה שדה רחב, מדעי ה-CMOS (scmos) מצלמה, 473 ננומטר לייזר ומערכת מיצוב לייזר כדי להעריך את המצב של סינפסות corticostriatal בפרוסות חריפה מן הגיל מטרואנטים גלוטמט נבנו מפיקסלים בודדים או מרובים כדי לקבל הערכות של i) שחרור גלוטמט מבוסס על העלאת המקסימלית של הריכוז גלוטמט [לגלו] ליד האזור הפעיל ii) ספיגת גלוטמט משתקף בזמן קבוע של ריקבון (טאוד) של perisynaptic [לגלו]. הבדלים מונחים על גודל בוטון ודפוסי מנוגדים של הפלסטיות לטווח קצר שימשו כקריטריונים לזיהוי של מסופים corticostriatal כשייכים לintratelencephalic (IT) או המסלול בדרכי במערכת (PT). באמצעות שיטות אלה, גילינו כי בעכברי HD סימפטומטי ~ 40% מסוג PT-type corticostriatal הציגו סיווג גלוטמט מספיק, הרומז כי הסינפסות האלה עשויים להיות בסיכון לנזק מרגש. התוצאות להדגיש את התועלת של TauD כמו סמנים של סינפסות תפקוד בעכברים הנטינגטון עם פנוטיפ היפוקינטית.

Introduction

ההשפעה היחסית של כל מסוף סינפטית השייכת ל"קשר יוניטרית" (כלומר, הקשר בין 2 תאי עצב) מוערך בדרך כלל על ידי השפעתו על החלק הראשוני של תא העצב הפוסט-סינפטית1,2. הקלטות סומטיים ו/או דנדריטים מנוירונים פוסט-סינפטיות מייצגות את הנפוצים ביותר, עד כה, גם האמצעים היצרניים ביותר להבהרת עיבוד מידע בפרספקטיבה מלמעלה-למטה או אנכית3,4,5. עם זאת, הנוכחות של אסטרוציטים עם נפרדת שלהם (במכרסמים) שטחים לא חופפים עשויים לתרום פרספקטיבה אופקית המבוססת על מנגנונים מקומיים של חילופי אותות, אינטגרציה וסנכרון באתרי סינפטיות6,7,8,9,10.

כי ידוע כי משחק אסטרוליה, באופן כללי, תפקיד מרכזי בפתוגנזה של מחלה נוירוניווניות11,12 , בפרט, תפקיד תחזוקה ופלסטיות של glutamatergic סינפסות13,14,15,16, זה אפשרי כי שינויים בביצועי סינפטית להתפתח בהתאם למצב של astroglia באזור היעד המשותף של סיבי כלי לימפה עם מוצא מגוון. כדי להמשיך לחקור את היעד-/astroglia-נגזרות מנגנונים התקינה המקומית בריאות ומחלות, יש צורך להעריך הסינפסות בודדים. הגישה הנוכחית עבדה כדי להעריך את מגוון של שחרור גלוטמט פונקציונלי ומחווני הסיווג להגדיר קריטריונים שעשויים לשמש כדי לזהות תפקוד לקוי (או התאושש) הסינפסות באזורים המוח הקשורות ביותר ליזום תנועה (כלומר, קודם כל בקליפת המנוע והסטריאטום).

לסטריאטום חסרה נוירונים glutamatergic פנימיים. לפיכך, קל יחסית לזהות glutamatergic היסודות של המקור. האחרון מקורם בעיקר בתלמוס המדיאלי ובקליפת המוח (ראה17,18,19,20 לעוד). הסינפסות Corticostriatal נוצרות על ידי אקסונים של נוירונים מיניים מקומי בשכבות קורטיקלית 2/3 ו 5. האקסונים טופס דו-telencephalic (IT) התקשרויות או התקשרויות התחברות דרך מערכת סיבים כי יותר מקבל יותר מהווה את מערכת הפירמידה (PT). יש עוד הציע כי זה-ו-PT-type מסופים שונים במאפייני השחרור שלהם בגודל21,22. לאור הנתונים האלה, אפשר גם לצפות כמה הבדלים בטיפול של גלוטמט.

הסטריאטום הוא אזור המוח המושפע ביותר במחלת הנטינגטון (HD)5. HD האדם הוא חמור חמורה הפרעת ניווניות תורשתית. מודל העכבר Q175 מציע הזדמנות לחקור את בסיס הסלולר של הצורה ההיפוקינטית-נוקשה של HD, מצב שיש הרבה במשותף עם parkinsonism. החל מגיל של כ 1 שנה, הומוזיציטים Q175 עכברים (HOM) התערוכה סימנים של היפוקיסיה, כפי שנחשף על ידי מדידת הזמן שהושקע ללא תנועה בשדה פתוח23. הניסויים הנוכחיים עם עכברים Q175 הטרוזיציטים (HET) אישרו את המנוע הקודם שנצפה ב HOM ו, בנוסף, הראה כי המוטוריים הנצפים היו מלווים על ידי רמה מופחתת של מרגש האסטרוציטי של חומצה אמינית הנשא 2 חלבון (EAAT2) בסביבה הקרובה של corticostriatal מסופים סינפטית24. ולכן יש היפותזה כי גרעון ספיגה של גלוטמט astrocytic יכול להוביל לתפקוד או אפילו אובדן של הסינפסות בהתאמה25,26.

כאן, אנו מתארים גישה חדשה המאפשרת אחד כדי להעריך את הסיווג בודד גלוטמט ביחס לכמות הנוירוטרנסמיטר שוחרר. חיישן גלוטמט חדש iGluu היה ביטא corticostriatal הנוירונים ביניים. הוא פותח על ידי קאטאלין Török27 ומייצג שינוי של הגבוהה ביותר הציג בעבר מאוד אהדה אבל החיישן גלוטמט איטי iGluSnFR28. שני החיישנים הם נגזרים של חלבון הפלורסנט הירוק המשופר (EGFP). לתכונות ספקטרליות וקינטית, ראו הלאסה ואח '27. בקצרה, iGluu הוא חיישן בעלי זיקה נמוכה עם קינטיקה מהירה של הפעלה, ולכן במיוחד מתאים גם כדי לחקור את הסיווג גלוטמט ב גלוטמט-שחרור מסופים סינפטית. קבוע זמן הדיסוציאציה של iGluu נקבע במתקן שנעצר, אשרהנחה את ערך הטאו של 2.1 אלפיות הראשונה ב-20 ° c, אך 0.68 מילישניות בטמפרטורה של 34 ° צ'27. מסופים בודדים שייפר בדקה ב 34 ° c עם סריקת לייזר ספירלה באזור CA1 של היפוסופקאית בתרבויות organotypic תחת מיקרוסקופ 2-פוטון הציג קבוע זמן ממוצע של ריקבון של 2.7 ms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה בוצעה בהתאם להנחיות האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי לניסויים בבעלי חיים ונרשמה במשרד ברלין להגנת הבריאות ובטיחות טכנית (G0233/14 ו-G0218/17).

הערה: הקלטות מסוג Q175 פראי (WT) ו הטרוזיטים (HETs) ניתן לבצע בכל גיל ומין. כאן למדנו זכרים ונקבות בגיל של 51 עד 76 שבועות.

1. הזרקת של חיישן גלוטמט iGluu עבור ביטוי ב Corticostriatal axons

  1. השתמש הפיפטה פולר (מצב צעד אחד) כדי להכין פיפטות זכוכית בורוסיליקט להזרקה של הווירוס. לאחר משיכת, לשבור את הצינורות באופן ידני כדי לקבל קוטר התשר של 30 – 50 μm. האוטוקלב וכלי כירורגי, כולל התרגיל לפתיחת הגולגולת.
  2. אחסן את הווירוס AAV9-CaMKIIa. iGluu. WPRE-hGH (7.5 x 10/13Gc/mL) ב-80 ° c ב 10 μl. אם הזריקות מתבצעות זמן קצר לאחר ייצור וירוסים (בתוך 6 חודשים), לשמור על 5 ° c. לפני הניתוח, להוציא את המבחנה ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
  3. ממלאים את הצנרת זכוכית ולהסיר כל בועות.
  4. לגרד את בעל החיים עם הזרקה תוך הצפק של פתרון המכיל 87.5 mg/ק"ג ו 12.5 מ"ג/ק"ג xylazine. תת-עורי להזריק 0.25% bupivacain (8 מ"ג/ק"ג) להקלה נוספת בכאב. בדוק את עומק ההרדמה על ידי ניטור הטון השריר והתבוננות העדר רפלקסים המושרה כאב.
  5. לגלח את העור על הראש ולעקר אותו עם 70% אלכוהול. התאימו את העכבר למסגרת הסטריאוטקאית.
  6. השתמש אזמל להסיר את העור מהירות גבוהה (38,000 rpm) מקדחה לעשות חור 1.2 מ"מ בעצם מעל קליפת המנוע.
  7. הר את המזרק עם המחט המצורפת הזריקה במחזיק של מניפולטור מדויק. הכניסו את הפיפטה האנכי לקליפת המוח ב-4 אתרים שונים. קואורדינטות ההזרקה הן, ביחס לברגמה (mm): קדמי 1.5, לרוחב 1.56, 1.8, 2.04, 2.28. העומק ביחס לדורא מאטר הוא (ב ממ): 1.5 – 1.7.
  8. באמצעות מערכת ההזרקה, להזריק 0.3 μL לאתר של פתרון וירוס בלתי מדולל עם מהירות של 0.05 μL/min. לאחר כל זריקה, להשאיר את הפיפטה במקום 1 דקות לפני הנסיגה לאט (1 מ"מ/דקה).
  9. סיים על ידי סגירת הפצע הכירורגי עם תפר ניילון.
  10. להשאיר את העכבר 0.5 כדי 1 h על משטח חימום בכלוב נקי לפני החזרתו לכלוב המקורי שלו.
  11. לשמור על העכבר על מחזור 12 היום בלילה עבור 6 עד 8 שבועות לפני הכנת פרוסות מוח חריפה.
    הערה: כדי למנוע תגובות החיסונית וכתוצאה מכך נזק לתאים ולאובדן סינפסה, יש לבצע הזרקה של מבנים ויראליים מרובים בו או בתוך 2 – 3 שעות לאחר ההזרקה הראשונית. נקודות הציון עבור הזרקת iGluu נבחרו על פי Paxinos ו פרנקלין29 המוח אטלס. הם מתאימים לקליפת. המנוע של M1 חיסוני של מוחות מוזרק דמיינו רבים אבל בעיקר היטב אקסונים מבודדים ו אקסונים בתוך ה-ipsi-ו החיסונית שולי צלעות ובתוך M1 הצלעות ו-S1 מערבולות.

2. חפש מסופים Glutamatergic ביטוי חיישן גלוטמט iGluu

  1. מצב כיול
    1. הכן את מצלמת sCMOS ואת תוכנת שליטה במצלמה עם ההגדרות הבאות. בדף הבדיקה קבע קצב בדיקה של פיקסל: 560 MHz (= המהירה ביותר בדיקה), רגישות/טווח דינמי: סיבית, מסנן רעש מזויף: כן, חפיפה הבדיקה: כן. בדף Binning/ROI , בחר מסך מלא.
    2. הכינו שקופית זכוכית המכילה טיפה של 5 מ"ג/mL לוציפר צהוב (LY) תחת תגית כיסוי.
    3. מניחים את שקופית LY תחת מטרה 63 x, לפתוח את תריס לייזר ולבצע רכישה טורית באמצעות ההגדרות הבאות: פיקסל בינינג: 1x1, מצב גורם מפעיל: פנימי, זמן חשיפה: מינימלי (להיות נחוש).
    4. כוונן את כוח הלייזר כדי להפיק נקודה פלואורסצנטית של 4 יקרומטר בקוטר (התמונה לא צריכה להכיל פיקסלים רוויים).
    5. כדי לבצע כיול של מערכת מיצוב הלייזר, בחר את ההגדרות הבאות בתוכנת מיקום הלייזר: גודל הספוט בקוטר: 10, מהירות סריקה: 43.200 kHz. לחצו על הלחצן ' התחל רכישת תמונה ' בחלונית הימנית. הגדרת רצפים: 0, הפעל עיכוב: 0, ובחר באפשרות הפעל באמצעות TTL בעמוד הרצף . לחץ על לחצן כיול בעמוד כיול וכיול את תוכנת בקרת הלייזר בהתאם להוראות המוצגות בפינה השמאלית העליונה של מסך הרכישה.
    6. אם ההתקנה משתמשת בתוכנה עצמאית עבור מצלמה ושליטה לייזר, לרכוש צילומי מסך מהחלון רכישת המצלמה ולשלוח אותו לתוכנת בקרת לייזר עבור חישוב מחדש של קואורדינטות XY. אם התוכנה מותקנת במחשבים שונים, השתמש בחוטף וידאו כדי לייבא את התמונה לתוך תוכנת בקרת הלייזר. תוכנת בקרת הלייזר תצטרך את המידע על הגורמים והסטות מדרוג XY. למטרה זו, קבעו את הקואורדינטות של הפינות השמאלית העליונה, השמאלית והתחתונה של התמונה בתוך חלון הרכישה של תוכנית בקרת הלייזר. חישוב הגורמים לשינוי גודל לפי המשוואות הבאות: X פקטור = (X תחתון-ימין – X התחתון שמאל)/2048, X היסט = X למטה שמאל, Y פקטור = (Y למעלה שמאל-Y תחתון-שמאל)/2048, Y היסט = Y תחתון שמאל.
    7. בסוף הליך הכיול, ליצור אזור מלבני של ריבית (ROI) של 267x460 פיקסלים, להעביר אותו למרכז המסך ולחץ על לחצן רצף התחל .
    8. חזור אל הגדרות התוכנה הבאות לבקרת מצלמה: Binning: 2x2, מצב גורם מפעיל: חשיפה חיצונית, זמן חשיפה: מינימלי (להיקבע).
  2. מצב תיקון פלואורסצנטית אוטומטי
    הערה: רמת המנוחה של [לגלו] בסביבה של מסופים הסינפטיות האקטיבית היא בדרך כלל מתחת 100 ננומטר14,30,31,32,33,34. לפיכך, כל חיישן של גלוטמט, במיוחד חיישן זיקה נמוכה כמו iGluu יהיה עמום למדי בהעדר שחרור גלוטמט סינפטית. אף על פי כן, כמה הזריחה iGluu יכול אפילו להיות מזוהה במנוחה, אבל יש להבדיל מתוך הרקמה האוטומטית של רקמות. התאורה 473 ננומטר מעוררת את הקרינה הפלואורסצנטית שלו ו-iGluu (איור 1א – ג). האחרון תופס מגוון רחב של אורכי גל, בעוד iGluu פלואורסצנטית מוגבל 480 – 580 nm (עם מקסימום ב 510 ננומטר). תיקון עבור פלואורסצנטית אוטומטי מבוסס על רכישת שתי תמונות עם מסננים high-pass שונים.
    1. הכינו פרוסות מוחית מראש כמתואר במקום אחר35. . תשאיר את פרוסות הסובין מוכנות
    2. להעביר את הפרוסות לתוך תא ההקלטה, מיזוג אותם לתוך נוזל חמצן מלאכותי מלאכותית (ACSF) המכיל 125 מ"מ הנאל, 3 מ"מ KCl, 1.25 mM נה2פו4, 25 מ"מ נחקו3, 2 מ"מ Cacl2, 1 מ"מ mgcl2, 10 מ"מ גלוקוז (pH 7.3, 303 Mosm/L), שיושלם עם 0.5 מילימטר נתרן פירובט, 2.8 mm נתרן ascorbate ו 0.005 מילימטר גלוטתיון. השתמש בקצב זרימה של 1 – 2 mL/min. לשמור על טמפרטורת האמבטיה ב 28 – 30 ° c.
    3. אתר את הסטריאטום מתחת למטרה טבילה במים 20x. תקן את הפרוסות בעזרת רשת ניילון על נבל פלטינה כדי למזער את תנועת הרקמה. מעבר ליעד טבילה במים 63 x/NA 1.0. מסננים בחר המשקף אור ב 473 ננומטר (דיקרואיק mirror) ואור עובר עם אורכי גל > 510 nm (מסנן פליטה).
    4. סנכרן תאורה, גירוי ורכישת תמונה באמצעות לוח AD/DA עם תוכנת בקרה בהתאמה. הגדר את תוכנית ההדק כדי לשלוט ברכישה עם זמן חשיפה לייזר של 180 ms וזמן רכישת תמונה של 160 ms. השתמש בהתקן מיקום לייזר כדי לשלוח את קרן הלייזר למספר מוגדר מראש של נקודות ולהגדיר את ההגדרות עבור סריקת מהירות וגודל ספוט.
    5. השיגו תמונה של מבנים בעלי קרינה פלואורסצנטית ו-iGluu-חיוביים באמצעות מסנן מעבר גבוה ב 510 ננומטר ("תמונה צהובה").
    6. לרכוש תמונה עם פלואורסצנטית אוטומטי לבד באמצעות מסנן high-pass ב 600 ננומטר ("תמונה אדומה").
    7. שינוי גודל התמונות האדומות והצהובות, תוך שימוש בעוצמות הכוונות של 10 המבריקים ו -10 הפיקסלים הכהים ביותר כדי להגדיר את הטווח. בצע חיסור "צהוב מינוס אדום התמונה" ולשנות את קנה המידה של התמונה החסרה כדי ליצור קובץ tif סטנדרטי 8-bit להדמיה נוחה של בוטון הריבית (איור 1D). הוא מכיל את הפיקסלים הבהירים ממבני iGluu-חיוביים, פיקסלים אפורים מהרקע ומפיקסלים כהים ממבנים בעלי פלואורסצנטית אוטומטי.
      הערה: עם ציוד נתון הממוצע מונח זריחה (F) יהיה מתחת 700 A.U.
  3. מצבי החיפוש של בוטון
    הערה: הפיקסלים של iGluu-חיוביים עשויים להשתייך לאלמנטים שונים מבחינה פונקציונלית של עץ האקסון, כגון הסתעפויות אקון של הסדר האחר, אתרים של ביוקטיון, אריפוזים לאחר המחסור בשלפוחית או באופן מלא באריזים פעילים. עם זאת, כמעט בלתי אפשרי לזהות מסופי סינפטית פונקציונליים רק באמצעות בדיקה חזותית. לכן, כל מסוף glutamatergic סינפטית צריך זיהוי על ידי התגובה שלה לדפולריזציה חשמלית. אתרים שאינם מגיבים לגירוי צריכים להיות מבוטלים. האמצעים הפיזיולוגיים כדי לגרום גלוטמט לשחרר מ corticostriatal אקסונים היא לעורר פוטנציאל פעולה. זה יכול להיות מושגת על ידי שימוש בערוץ הרודוסין של מאפיינים ספקטרלי מתאים או על ידי גירוי חשמלי של האקסון דמיינו על ידי iGluu עצמו. כדי למנוע הפעלת אופסין מקרית, העדפנו את האישור האחרון
    1. השתמש במיקרופיפטה (במצב של ארבעה צעדים) להפקת פיפטות גירוי מנימים מזכוכית בורוסיליקט. קוטר העצה הפנימי אמור להיות בערך 1 μm. כאשר מלא ACSF, עמידות האלקטרודה צריך להיות על 10 MΩ.
    2. כדי לגרום לפעולה בעלת הפוטנציאל שחרורו של גלוטמט מתוך קבוצה של בוטרוס סינפטית מצורף באותו axon, השימוש הגדלה 63 x, 510 מסנן פליטת ננומטר והתמונה המופחת כדי להניח את גירוי הזכוכית בסמוך לתוך וארינות פלורסנט . הימנע מהקרבה של אקסונים נוספים.
    3. הפעל את הגירוי כדי להעביר את הפולסים הנוכחיים לפיפטה הגירוי. השתמש בעוצמות הנוכחי סביב 2 μA (לא יותר מ-10 μA).
    4. הפעל את מערכת היישומים מרובי ערוצים שבו ערוץ אחד מספק את הפתרון אמבטיה רגיל וערוצים אחרים לספק את חוסמי הצורך של ערוצי יונים, מובילי או קולטני קרום. שלוט בזרימה באתר ההקלטה ולאחר מכן עבור לערוץ טטרודוטוקסין (ttx) (פתרון אמבט ועוד 1 μm ttx). לאחר 2 – 3 דקות, לעורר שוב את בוטון הריבית, אבל עכשיו בהיעדר הדור הפוטנציאלי לפעולה. השחרור הוא ישירות בשל סידן הזורם באמצעות מתח-ערוצי סידן תלויים.
    5. על ידי הפיכת מפתח העוצמה על הגירוי, כוונן את הגירוי הנוכחי כדי לקבל תגובות הדומות לאלה המקבלים באמצעות פוטנציאל פעולה. בדרך כלל, שהגירוי הנוכחי יהיה סביב 6 μA עבור 0.5 ms depolarization.
    6. עבור בדיקות בסיסיות של ההכנה, להחיל 0.5 mM CdCl2. הנוכחות של זה הסידן חוסם את הגרסה גלוטמט שחרור מונע לחלוטין את המהדורה גלוטמט סינפטית ובכך לאמת את התלות בסידן של האות גלוטמט מעורר ישירות.
      הערה: ההמלצה הכללית הבאה עשויה לסייע להגדיל את שיעור ההצלחה של ניסויי בודד של סינפסה בסטריאטום. כדי לבחור מסופים glutamatergic סינפטית עם מכונות שחרור ללא פגע, בעלי הצורה היחידה צריכה להיות: (i) יש צורת ציר חלקה; (2) לא להיות משויך לאקסון-ביפריון; (3) להיות בהירים יותר מאשר מבנים אחרים על "התמונה הצהובה"; (iv) מתגורר בסטרילאטאל נוירופיל ולא בשטח הסיבים; (v) מתגוררים על ענף אקעל דק מאוד; (vi) לא מתגוררים בחלקים העמוקים יותר של הפרוסה.

3. הדמיה של מהדורת גלוטמט שחרור

  1. מצב הקלטה
    הערה: לאחר החיסור של הקרינה האוטומטית (שלב 2.2) ומספר בדיקות ראשוניות לתגובתיות של בוטון הריבית (שלב 2.3), ניתן להתחיל ברכישת נתונים. התגובות ההפעלה החשמלית של גלוטמט לשחרר ממסופי אקסון יחיד ניתן לצפות בתמונה ישירות (איור 2), מבלי להחיל כלי ניתוח נוסף. עם זאת, זה הוכיח להיות מאוד נוח לחלץ מיד כמה אינדיקטורים בסיסיים של ביצועי סינפסה (איור 3). מידע זה נדרש כדי לקבל החלטות במהלך הניסוי העוקב, כגון מבחר סוגי מסופים מסוימים, הערכה מהירה של שינויים הקשורים ב-HD, מספר ותדירות של ניסויים או תרופות להיות מיושם עם מערכת סופר פיוז'ן. ייתכן גם שיהיה צורך להתמודד עם הופעת הפריטים בסופו של דבר. ראשית, ההגדרות הסטנדרטיות עבור הקלטת נתונים מתוארות.
    1. בעזרת מיקרוסקופ כונני XY, הציבו את משטח ה-iGluu-חיוביים הנבדק קרוב למרכז האשנב. הפסק את רכישת התמונה באמצעות לחצן ' ביטול רכישה'. בתמונה האחרונה שנרכשה, לקבוע את מיקום XY של המרכז בוטון על ידי לחיצה על זה עם לחצן העכבר השמאלי. הקואורדינטות XY של סמן הערכה יוצגו בלוח המצב התחתון של חלון הרכישה.
    2. באמצעות נתוני כיול (שלב 2.1.6), לחשב את הקואורדינטות של האתר שבו קרן הלייזר יש לשלוח עבור עירור של הזריחה iGluu . השתמש במשוואות הבאות: X לייזר = X מצלמה * x פקטור + X היסט, Y לייזר = Y היסט – Y מצלמה * Y פקטור. בעת ביצוע חישוב משני זה, שים לב להגדרות האנכיות או האופקיות של המצלמה.
    3. צור רצף של נקודה אחת בתוכנת בקרת הלייזר באמצעות נקודות הציון המחושבות. למטרה זו, בחר באפשרות הצבע בתיבה הוסף לרצף בעמוד הרצף של תוכנת בקרת הלייזר. בחר 10 μs עבור העיכוב כדי להפעיל את התחלתה ו 180 ms עבור זמן הדופק בלייזר. הזז את העכבר לקואורדינטות המחושבות ולחץ על הלחצן השמאלי.
    4. בחר את ההגדרות הבאות בתוכנת בקרת הלייזר: פועל: 0, השהיית הפעלה: 0, רצף: הפעלה בתוך TTL. לאחר מכן לחץ על התחל רצף.
    5. בתוכנת בקרת המצלמה, בחר את ההגדרות הבאות: בדף Binning/ROI , להגדיר את אזור התמונה: מותאם אישית, פיקסל binning: 2X2, גובה: 20, רוחב: 20, שמאלה: קואורדינטת X של מנוחה Igluu-חיובי המקום פחות 10 px, למטה: קואורדינטת Y של המקום igluu-חיוביים מנוחה מינוס 10 px, מצב הרכישה: הסדרה קינטי, הסדרה קינטי אורך: 400 0.0003744 s (ערך מינימלי). עם הגדרות כאלה, שיעור הרכישה יהיה 2.48 kHz.
    6. בחירת מצב גורם מפעיל: חיצוני. לחץ על קבל אות בתוכנת בקרת המצלמה. הפעל את הפרוטוקול הנסיוני. שנמצא במכשיר ההדק
    7. ליישם את המשפט פרוטוקול ניסיוני עם קו הזמן הבא: 0 ms-התחל המשפט, 1 ms-התחל לייזר תאורה, 20 ms-התחל רכישת תמונה עם מצלמה, 70 ms-להתחיל גירוי חשמלי 1, 120 – להתחיל גירוי חשמלי 2, 181 ms – סיום המשפט (לייזר ומצלמה off). כך, במהלך משפט אחד המצלמה רוכשת 400 מסגרות עם תדר של 2.48 kHz. ראה שלבים 2.3.3 ו-2.3.5. לפרטים על גירוי חשמלי.
    8. כדי לאפשר שחזור מספיק של בריכות שלפוחית המוח מראש, להחיל את המשפט הפרוטוקול עם תדירות חזרה של 0.1 Hz או נמוך.
  2. מחוץ לשורה הבנייה של גלוטמט ארעי והערכה מהירה של שחרור גלוטמט וסיווג לזיהוי של סינפסות פתולוגית
    1. הפעל את רוטינות ההערכה. כאן, אנו משתמשים בתוכנה כתובה בתוך הבית הכתובה v. 3.2. (מחבר: אנטון דבורז'ק). השלבים הבאים נחוצים כדי לבנות ΔF/F ארעי מתוך הפיקסלים עם הזריחה iGluu מוגבה כמו בווידאו של איור 2.
    2. כדי לקבוע את גודל בוטון, לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן (SD) של עוצמת הזריחה ROI במנוחה (F), לפני תחילת הגירוי. לקבוע ולהתאגרף באזור שנכבש על ידי פיקסלים עם F >ממוצע+3 SD (איור 3א). לקבוע קוטר וירטואלי (ב-μm) בהנחה צורה מעגלית של אזור לפני הסף.
    3. קבע את ΔF כהפרש בין ערך עוצמת השיא ו-F. התווה את הזרם המעורר ואת ΔF/F נגד הזמן (איור 3ב). לחשב את SD של ΔF/F במנוחה (לפני תחילת הגירוי) ו "שיא משרעת". השתמש בפיקסל עם משרעת שיא יותר 3 SD של ΔF/F לבצע התאמה monoexponential עבור הריקבון משיא. לקבוע את קבוע הזמן של העששת Taud של ΔF/F.
    4. כדי להעריך את "משרעת המקסימלית" בסינפסה נתונה, בחר את הפיקסל עם הערך ΔF/F הגבוה ביותר. הוא ממוקם בדרך כלל בתוך או ליד גבולות הבוטרוס המנוחה של iGluu . "משרעת מקסימלית" יהיה האינדיקטור הטוב ביותר של עומס גלוטמט הציג את מכונות הסיווג של סינפסה אחת.
    5. כדי להעריך את השלוחה המרחבית של אות iGluu , בדוק את קוטר השטח של כל הפיקסלים לפני הסף בשילוב ליצירת מעגל וירטואלי. הקוטר המתאים נקרא "להתפשט". המונח "שיא התפשטות" ולאחר מכן מתייחס לערך השיא של התפשטות הממוצע (איור 3ג, ההבדל בין קווים אדומים מנוקדים).
  3. תיקונים לפריטים אפשריים
    הערה: דפולריזציה חשמלית קשורה לזרימה חיצונית של פתרון הפנים-פיפטה. הדבר עלול לגרום לתזוזת רקמות קטנה. כדי להפלות בין שינויים מזורפי הגירוי של iGluu ושינויי יציאה ממוקד של התמונה, ניתן להשתמש בגישה הבאה כדי לזהות ולסלק ממצאים הזחה (איור 4).
    1. לנתח את המאפיינים המרחבית של פיקסלים suprathreshold נגזר ההחזר עם סימנים של עקירה (איור 4F – H).
    2. מצא פיקסלים מחוץ לגבולות שנקבעו בתחילה של הבוטון בשאר (איור 4F – H, מתאגרף באדום).
    3. הזדהו בסופו של דבר ערכים של עוצמת פיקסלים שליליים (איור 4I, J). כל ΔF/F בכיוון השלילי עם משרעת גדול יותר מאשר גירוי מקדים ± 3 SD צריך להיחשב כחפץ, והשיא צריך להיות מושלך.
    4. כדי למנוע ממצאים מחוץ לפוקוס, מניחים את האלקטרודה הגירוי על הצד השני של הנמל הסינפטית, משתמשים בגירוי חשמלי biphasic ומצמצמים את עוצמת הגירוי/משך.
      הערה: ניתן לגזור פריטים מחוץ לפוקוס גם מהמצלמה. אם האחרון אינו קבוע בצורה אופטימלית למיקרוסקופ זה יכול לייצר תנודות, סביר להניח בשל תנודות קטנות של מערכת קירור המצלמה. ויברציות כאלה יוצרות דפוס "יין ויאנג" בתמונות ΔF/F הסובבות בתדירות של 50 Hz. הויברציות יכולות להיות מופחתים מבחינה מתמטית מהאות הפלואורסצנטית, אך האיכות הסופית של המידות תהיה תלויה באופן ביקורתי בזמן ההקלטה.
    5. לתקן את המצלמה למיקרוסקופ כגון ויברציות נעדרים. אם האחרון נשאר, מניחים אטם גומי בין המצלמה לבין מתאם מיקרוסקופ.
      הערה: אי אפשר להזניח את האפשרות שהסטרילאטפיל הנוירולוגי סביב הסינפסה של הריבית מכיל glutamatergic אריזים שאינם מבטאים iGluu ולכן נשארים בלתי נראים. במקרה של שיתוף ההפעלה שלהם (סביר יותר בהעדר TTX) הטרנזיאנטים שהתקבלו מן הבוטרוס הריבית עשויים להיות מושפעים על ידי שפיכת-over. כנ ל לגבי מסופי iGluu-ביטוי שהיו מחוץ לפוקוס. תופעה אופיינית במקרה זה להיות כי הארעיות הזריחה מקורם באזור הרבה יותר רחב. כפי שתגובה זו מסולקת על ידי TTX, ניתן לפרש אותו כתגובה לא ספציפית הנגרמת על ידי הפעלה רב-סיבים בלתי מוצדק.
    6. כדי לתקן תגובה מרובת סיבים לא ספציפית זו, בצע את ההליך המתואר באיור 5. השתמש באות הקרינה הפלואורסצנטית של פיקסלים בגבולות האשנב. כדי למזער את תגובת הרקע, מזער את עוצמת הגירוי והמשך או השתמש ב-TTX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זיהוי של שני סוגים של corticostriatal glutamatergic אריאוזים
IT ו-PT afferents מקורם שכבה 2/3 ו 5, בהתאמה, והתצוגה ההפרש הדיפרנציאליות ודפוסי הסיום בתוך השצלעות והצלעות (מסופי IT בלבד) סטריאטום. עדיין מעט ידוע על המאפיינים של שחרור גלוטמט ואת הסיווג תחת תנאי הפעלה חוזרים כפי שנצפו במהלך החניכה של תנועות, אבל זה מתועד היטב כי גלוטמט בהתאמה שחרור הצדדים שונים בגודל22. החלת קריטריון גודל, נמצא כי מסופי IT ו-PT מוצגים צורות מנוגדות של הפלסטיות לטווח קצר24. במרווחי זמן גירוי של 50 אלפיות הזאת, מסופי ה-IT הקטנים יותר היו נוטים לזווג דיכאון דופק (PPD) בעוד שמסופי ה-PT הגדולים יותר הראו הנחיית פולס. הבדל זה נצפה גם במרווחי זמן קצרים יותר (20 ms) ובמהלך סדרה של 6 פולסים. איור 3 ואיור 6 להמחיש את הניסויים האלה שבו שחרור גלוטמט סינפטית הוקצב דרך הפעולה הפוטנציאלית מנגנון ב-Ca הפיסיולוגיים2 +/Mg2 + ריכוז.

זיהוי של סינפסות תפקוד בעכברים עם מחלת הנטינגטון מתקדמת
מחלות ניווניות כגון אלצהיימר, פרקינסון ומחלת הנטינגטון מאופיינים על ידי אובדן מתקדם אי פעם של glutamatergic הסינפסות36. טיפולים חדשניים לכוון לעכב או אפילו להפוך את ההתקדמות הקטלנית. מה בדיוק מפעיל את היעלמותו של סינפסה, ומתי, הוא ברובו לא ידוע. תובנה נוספת ניתן לצפות ממחקרים המציעים קריטריונים עבור (א) זיהוי חיוני של מחלקה מסוימת של הסינפסות glutamatergic ו (ב) זיהוי של תפקוד לקוי לעומת ביצוע המגעים בדרך כלל. כאן זה יוצג כיצד ערכי Taud שהתקבלו מ-PT-סוג של מסופים שימשו כדי להעריך את החלק של סינפסות תפקודית ב Q175 הטרוזיטים עם מנוע מזוהה פנוטיפ.

לפני הניסויים בהטעייה אחת, העכברים הוגשו לבדיקה מהירה אך איתנה לשינויים בהתנהגויות הגישוש שלהם. בדיקה זו מכונה "מבחן צעד-אחר". החיה הונחה לתוך מרכז צלחת פטרי (של קוטר 185 מ"מ ו -28 מ"מ גובה הקיר). הבדיקה הוקלטה עם מצלמת וידאו. באמצעות ניתוח לא מקוון, ניתן לקבוע את הזמן בין היציאה של יד הנסניסה לבין הרגע שבו החיה מקבל את כל 4 הרגליים מתוך המנה. התוויית נתונים ממעל 100 WT ו Q175 HET בגילאים בין 12 ו 18 חודשים עולה כי עכברים עם השהיה צעד-מעל של > 300 s ניתן לאבחן כמו hypokinetic. איור 7A ממחיש קורלציה חיובית משמעותית בין התוצאות שהתקבלו עבור הנתיב הכולל לפעול בשדה הפתוח ואת ההשהיה צעד-מעל.

בודד סינפסה iGluu הדמיה הראו כי אלה עכברים מסוג HD סימפטומטי הציגו גרעון במהירות של הריקבון מגלוטמט juxtasyntic כפי שמשתקף ערכי taud מסינגל (או הראשון ברצף) גירויים (איור 7ב, ג). ב WT, הארכה כגון נצפתה רק לאחר היישום של מעכב סלקטיבי שאינו הניתנים להעברה של הספיגה שלגלוטמט-DL-β-החומצה הבנזיתית (tboa ואה, איור 7ד, ה). זה מרמז על תפקיד של מובילים מגלוטמט astrocytic בוויסות של סיווג מגלוטמט סינפטית. שינויים בדיפוזיה של לגלו במרחב הפראיזאנטיק לא נמצאו24. אבל, כמובן, הרבה יותר עבודה נחוצה כדי לזהות בעצם את הגורם לסיווג גלוטמט האטה ב-HD, כמו גם צורות אחרות של parkinsonism. מלבד שינויים בסמיכות אסטרוציט9 ו מופחתת slc1A2 ביטוי37, אחד יכול גם לשקול הקשורות למחלות אי-יציבות של EAAT2 בקרום הפלזמה של תהליכים אסטרוציט perisynaptic (paps). זה יכול להיות תוצאה של שינויים EAAT2 interactome. ואכן, הניסויים האחרונים בספקטרוסקופיית מסה בנקודת המעבדה לאובדן EAAT2-הדיסטרופין בסטריאטאטציטים (הירשברג, דבורז'ק, קיכנר, מרקנס וגראנטיין, לא פורסמו).

מעט מאוד ידוע לגבי ציר הזמן של תפקוד סינפטית עם התקדמות של HD, אבל זה סביר מאוד כי הסינפסות בריאים להתקיים עם אלה לקויי כבר. בחיפוש אחר קריטריון סיווג, בדקנו את נתוני הטאוד מעכברים שונים. לצורך זה, משרעת וערכי טאוד מתוך 3 מבחנים רצופים התעברו לתגובה הראשונה (ראה איור 6F לתוכנית ניסיונית), וההסתברות להתרחשות ערך taud נתון הושוו בגיל המתאים WT לעומת Q175 HET (איור 6G). נמצא כי ב WT מעולם לא חרג 15 ms, בעוד סימפטומטי Q175 HET, 40% של הסינפסות הציגו ערכי taud בין 16 ו 58 ms, למרות נטייה להפחתת כמות גלוטמט שוחרר (איור 6H, אני). טאוד יכול להיות לאחר מכן התייחסו כסמן עבור סינפסות תפקודית ב-HD ועוד לשמש כדי לוודא התאוששות פונקציונלית בניסויים המיקוד astrocytic גלוטמט הובלה.

Figure 1
איור 1: זיהוי האריאוזים של iGluu-חיוביים. (א) תמונה פלואורסצנטית השיג עם מסנן 510 ננומטר גבוה nm ("התמונההצהובה"). (ב) אותו שדה תצוגה שנרכשה עם מסנן מעבר בגובה 600 ננומטר ("תמונה אדומה"). שים לב שהנקודה המסומנת בראש חץ שחור נעלמה ב-(ב). כיסוי של (A) ו-(ב). חץ לבן = פלואורסצנטית אוטומטי, חץ שחור = iGluu-בטוח הארימי. (ד) תמונה שהושגה על ידי חיסור (ב) מ (א). כתמי הפלורסנט האוטומטיים מוארים והאתר מואר באור iGluu+. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הסרט עדיין מתוך וידאו איטי תנועה (ההאטה פקטור 1240x). השורה העליונה: תמונות מ WT (משמאל), Q175 HET (אמצע) ו-HOM (מימין). שורה תחתונה: מארעיות iGluu בהתאמה מתוך הפיקסל עם העלאת גלוטמט הגבוהה ביותר (ΔF מקסימלית /F). הסמן האדום מציין את הנקודה על הארעי המתאים לתמונה מעל המעקב. הערה העלאה ממושכת של הזריחה iGluu (פיקסלים אדומים ו ΔF/F טרנסיאנטים). השתנה והודפס מראש באישור מדבורק ואח '24אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הפקת אינדיקטורים פונקציונליים מן התמונות סינפסה בודדת של חיישן מקודד מבחינה גנטית iGluu ב corticostriatal נוירונים. (A, D) דוגמה של PT (A) ו-IT (D) בוטון עם הזריחה iGluu בהתאמה בשאר (משמאל) ובשיא של תגובה AP-בתיווך igluu (מימין). (B, C, E, F) תגובות igluu הוקלטו מ בוטון המוצגת ב (א, ד); הניסוי ב 2 מ"מ Ca2 + ו 1 מ ג Mg2 +. (ב) הקלטה בו של הגירוי הנוכחי (מעקב עליון) ועוצמה מרושעת של פיקסלים לסף-הסף (מעקב תחתון). . אותו סרגל זמן עבור כל העקבות הגברה מרבית (בין קווים אופקיים אדומים מנוקדים) ופונקציה חד-מעריכית הותאמה לדעיכה משיא זה (שכבת-על אדומה). ערכי ה-TauD (τ) המתאימים מוצגים לצד עקומות ההתאמה. (E, F) . מגרש התפשטות כנגד הזמן התפשטות השיא: ההפרש בין קווים אופקיים מנוקדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מאפייני המושרה iGluu ארעי (a – E) בניגוד לחפץ העקירה (F-J). (א, ב) ו (F, G) להראות את עוצמת הקרינה המוחלטת במנוחה (A, F) ולאחר גירוי (ב, g) ביחידות שרירותיות (au). (ג, ח) שינוי של קרינה פלואורסצנטית באחוזים של הזריחה המנוחה לפני גירוי (ΔF/F%). (D, I) תנוחת הסופרפוזיציה שלהטרנזיגו האילו (iglu u) מכל הפיקסלים ביחידות שרירותיות. (E, J) מיקום הסופרפוזיציה שלהטרנזיגו האילו (iglu u) מכל הפיקסלים ב-ΔF/F%. במקרה של שחרור גלוטמט הסינפטית, הפיקסלים ליד מסוף מנוחה התערוכה להגדיל את הזריחה לאחר גירוי, ואילו במקרה של out-of-המוקד משמרות את הפיקסל הבהיר ביותר רק לשנות את עמדתם ב-ROI, ללא עלייה ליווי בעוצמת הקרינה מעל כל האור של הנוף-שדה. בנוסף, ניתן לזהות פריט הזחה במראה של אותות ΔF/F שליליים (J). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תיקון עבור תגובת iGluu לא ספציפית. (א – ד) דוגמה לתגובה סינפטית משויכת הנגועה בתגובת רקע בלתי ספציפית. (E – H) . אותו הדבר אחרי התיקון (א, ה) . לפני הגירוי (ב, ו) . בזמן הגירוי (ג, ז) . אחרי הגירוי (ד, ח) המקביל ארעיות בעצימות (ב ΔF/F) מכל הפיקסלים של ההחזר. נקודת הזמן של רכישת התמונות מסומנת על ידי אותיות קטנות המקביל על ראשי החץ. שים לב כי בלוח C תגובת הרקע היא נפוצה מאוד והיא נרקבת לאט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: גודל שונה והקשורות לגודל ההבדלים משרעת יחס הדופק לזווג (PPR) של הארעי iGluu . (א) מערכת פשוטה של המעגלים הcorticostriatal22, הממחישות את הרעיון של הקרנה מועדפים של מערכת העיכול (PT) נוירונים למסלול עקיף הקרנה נוירונים (ispns) ו intratelencephalic (it) נוירונים כדי להפנות שמות spn (dspns), עם גודל הבדלים בין מסופי ה-IT ו-PT. (ב) התפלגות מודלית בקטרים שנקבעו על-ידי הסף המונח לפני הגירוי. בוטרוס עם קוטר ≥ 0.63 יקרומטר הוגדרו כ-"גדולים" והניחו שהונפקו על-ידי מזהה PT axons. עבור תמונות מקוריות ועקבות דגימות מ-PT-ו-IT-סוג של הסינפסות ראה איור 3. (ג) מתאם חיובי משמעותי מראה בין ה-ppr של המוני השיא ובין הקטרים. כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע משלושת הנסיונות הראשונים של כל בוטון. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: זיהוי של סינפסות לא מתפקדת ב Q175 עכברים עם היפוקינטי פנוטיפ. (א) תוצאות בדיקות מוטוריות ביום של הדמיה בודדת סינפסה. השהיות מ> 300 מילישניות נחשבו לפתולוגיים. בגיל שנבדק (ממוצע 16 חודשים), 17/54 HET הציג פנוטיפ מבוטא במבחן שלב-over. בנוגע להיפוקיסיה, הבדיקה הצעד-over נראית רגישה יותר מבחינת השדה הפתוח. עם זאת, היה קשר משמעותי בין התוצאה של הבדיקה צעד-over (הזמן בין המיקום לבין המכשול עם כל ארבע הרגליים) ואת בדיקת השדה הפתוח (כלומר, הנתיב הכולל לרוץ בתוך 5 דקות). Y =-0.01511 X + 458, 7; P = 0.0044 (רגרסיה פשוטה). (ב) הממוצע מעורר היתה סינפסה בודד הפונקציה igluu מנורמל לאותה משרעת שיא כדי להמחיש הבדלים הקשורים HD בסיווג של גלוטמט synaptically שוחרר. עקומות הולם בהתאמה להדגיש את ההבדלים במשך הארעיות גלוטמט. (ג) קוונפיקציה של התוצאות מסוג פראי (אפור), הט (אדום) ו-HOM (מגנטה). (ד, ה) דגירה של פרוסות WT ב 100 ננומטר של TFB-TFB מדומה לדיכאון של סיווג גלוטמט נצפתה ב-HOM. (ו) ערכה של הפעלת סינפסה וארגון נתונים. (ז) היסטרוגרמות מצטברות של ערכי #1 טאוד . (H, I) מגרשים של תגובות מנורמלות #2. נתונים מתוך 31 WT ו -30 סינפסות HET (כל סוג PT). ב-WT לדוגמה כל הערכים של הטאודמקס היו ≤ 15 ms. בדגם HET, 40% מהסינפסות הציגו ערכי TauDmax החורגים מהסף של 15 אלפיות השהוגדרה על-ידי ה-TauDmax הארוך ביותר ב-WT. גרפים אלה מדגישים את ההבדלים הקשורים ל-HD בטווחים של משרעת המקסימום (כלומר, הערך מהפיקסל עם עליית הזריחה הגבוהה ביותר iGluu ) ו-TauDmax ( הטאוד של הפיקסל עם הגובה הגבוה ביותר). ערכי טאודמקס הנמצאים באופן בלעדי ב-HET מוצגים באדום, וערכי משרעת שנראים באופן בלעדי ב-WT מוצגים באפור. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001. המבחנים הסטטיסטיים שבשימוש מצוינים לצד הגרף המתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הניסויים משפיעים על עניין כללי-סינפסה והפסד אפשרי במהלך ניוון שולי, ואנו מתארים גישה חדשה לזיהוי סינפסות מושפעות בפרוסות מוח חדות מבני האדם (> 1). ניצול המאפיינים הקינטית המשופרים של חיישן גלוטמט שהוצג לאחרונה iGluu הניסויים להאיר את היחסים בין גלוטמט שחרור הסינפטית וספיגת באופן שלא היה אפשרי לפני.

ההשפעה של הסיווג גלוטמט על הפונקציה ותחזוקה של הסינפסות אינה מאוד מובהר היטב, למרות ההשערה כי המושרה גלוטמט הנגרמת מרגש יכול לגרום לאובדן תא העצב והסינפסה מוזכר כמעט כל ביקורת רלוונטית על אפילפסיה, שבץ מחלות ניווניות38,39,40,41. עם זאת, הראיות הזמינות מוגבלות יותר מאשר ייתכן שצפויה מהספרות. בלבול נוסף נוספת על-ידי העובדה כי הכלים הניסיוניים שנבחרו עשוי להיות מספיק לראות את הבעיות הקשורות מרחבית נמוכה ברזולוציה הזמני בעת פענוח התוצאות שהתקבלו עם גירוי ברוטו טכניקות הקלטה42,43. זה יכול להוביל לתשלילים שווא מרתיע מחקר נוסף, שהוא יותר מצער במבט של הפרעות נוירולוגיים חמור כמו מחלת הנטינגטון. הגישה הנוכחית מבטיחה הבחנה טובה יותר של אפליה ולכן תמיכה חזקה יותר של הרעיון כי HD חלק משמעותי של הסינפסות corticostriatal מציג סימנים של סיווג גלוטמט לקויי.

התוצאה הנוכחית נחשפה הבדלים של פלסטיות לטווח קצר בתוך מסלול corticostriatal. למרות האחרון היה במוקד של מחקרים רבים17,44, זה לא היה צפוי כי afferents שמקורם השכבות הקורטיסטיות העליון היה מוצג דיכאון תלוי תדר, בניגוד לפרפראבדרכי במערכת המקורי שמקורם בשכבה 5. האחרון מעדיפים הראה הפוטנציאל התלוי בתדר של שחרור, ולכן עשוי להיות בסיכון גבוה יותר עבור גלוטמט ספיגת מחסור.

ניסויים על פרוסות מוח חריפה מעכברים למבוגרים חשובים להסבר לשינויים סינפטיים בעידן המתאים לחיים. הגיל והמצב הפונקציונלי של ההכנה רלוונטי במיוחד אם האסטרוציטים היו מעורבים במנגנון העניין. כאן, חיוני כי האסטרוציטים בוגרים מספיק כדי להציג רמות מבוגרים של פעילות טרנספורטר גלוטמט והומאוסטזיס כלוריד הקשורים45.

בודד סינפסה בודדת יהיה לסלול את הכביש לקראת הבנה טובה יותר של שינויים הקשורים ב-HD של שידור glutamatergic סינפטית במוח שלם46. זה הוכח כי החלטה בודדת סינפסה ניתן להשיג גם במוח שלם, בתנאי כי הסינפסות של עניין מותאמים לרבדים שטחיים של קליפת המוח47.

לבסוף, הגישה הניסיונית הנוכחית יש את הערעור כי זה יכול לשמש מאמינים רבים, שכן הציוד הנדרש הוא עדיין על הצד נמוך.

בקיצור, אותות הזריחה דיווח גלוטמט שחרור והשינויים juxtasyntic בריכוז גלוטמט במוח שלם יכול לספק נתונים ללא השגה עם כל שיטת אלקטרולוגית. אבל כמו עם כל שיטה חדשה, גישה זו יש מגבלות וחסרונות כי יש חלק טופלו בשלבים 2.2 ו 3.3. הזריחה נמוכה מנוחה של מהיר וגבוה iGluu חיישן דורש קצת פעילות גופנית/ניסיון לזהות באריזים מתאימים לבדיקות נוספות. עם ביטוי משותף של מחוון סידן מקודד גנטית (סמא) כגון xcamp-R48 ולפחות שתי מערכות תאורה מתואמת לייזרים, החיפוש אחר מסופי אקסון פונקציונלי יהפוך הרבה יותר קל. בכל מקרה, חשוב לחשוף את ההכנה מעט ככל האפשר לאור המרגש לפני ובמהלך הקלטת iGluu .

השימוש בלייזר 473 ננומטר (במקום לחיסול השדה הרגיל כולו) כדי לגרום לזריחה iGluu הוא תנאי מוקדם להשגת פליטה מספקת אך גם יגרום הלבנה. בתנאים הנתון, iGluu היה לגמרי הולבן לאחר 10 משפטי גירוי/רכישה (10 זוגות גירוי במרווח בין גירוי של 50 ms ו שיעור חזרה של 1/10 s). זמן התאורה המקסימלי הכולל לרכישת נתונים במצב יציב עם השימוש היום 1 מערכת לייזר פוטון וההגדרה המתוארת היה כ 2 s. הלבנת של iGluu היא אקספוננציאלית, להיות חזק מאוד במהלך 20 ms הראשון לאחר התחלת תאורה והרבה יותר איטי לאחר מכן. לכן מומלץ להימנע מרכישת אותות במהלך 20 ms הראשון של כל ניסוי לרכוש לא יותר מאשר סך של 10 זוגות תגובה. תגובות לגירויים בודדים יכול להיות מוקלט עם זמני חשיפה של 60 – 80 ms במקום הזמן המשמש כיום 180 ms.

בעיה קריטית נוספת היא רמת הביטוי של iGluu. במחקר החלוצי של Helassa ואח '27, המבנים ויראלי הוחלו על ידי אלקטרופורציה לנוירונים מתורבתים27, אשר מייצרת רמות ביטוי גבוהות יותר של החיישן וכנראה גם פחות הלבנת במיוחד אם המכשיר שני פוטון לייזר סריקה ניתן להשתמש במקום מיקרוסקופ אחד פוטון. דיסט ואח '49 שגרת הרכישה השוטפת של הביטוי הפוסט-סינפטית של igluu ב CA1 הנוירונים בעלי המוח ב ~ 100 ניסויים (כל אחד מהם נחשף רק 80 ms). עם זאת, רקמת המוח מתורבת היא לא אופציה כאשר הניסויים לכוון להבהרת פונקציות סינפטית תלויי-astrocyte התלויים במוח הישן. ביטוי CaMKII-התלוי ביצור של iGluu באמצעות מקדם חזק יותר עשוי לספק הכנות עם ביטוי חזק יותר בתאים, ובכך להגדיל את הרזולוציה של השיטה ולאפשר רכישה של ניסויים יותר לכל סינפסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי CHDI (A-12467), קרן המחקר הגרמני (Exc 257/1 ו DFG פרויקט-ID 327654276 – SFB 1315) ו הפנים קרנות מחקר של Charité. אנו מודים לקיי. '.. ', אוניברסיטת לונדון, ו-N. Helassa, אוניברסיטת ליברפול, עבור iGluu פלמיד ודיונים רבים ומועילים. ד. בליטות ושונהר סיפקו סיוע טכני מעולה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Tags

מדעי המוח סוגיה 157 גלוטמט שחרור גלוטמט סיווג גלוטמט התפשטות מסוף טרום סינפטיות astrocyte לספיגת גלוטמט ריקבון קינטיקה לשפוך על אלקטרואופטיקה iGluu scmos
בודד סינפסה אינדיקטורים של גלוטמט שחרור ספיגה בפרוסות המוח חריפה מעכברים נורמלי הנטינגטון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single… More

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter