Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Enkle synapseindikatorer for glutamatfrigjøring og opptak i akutte hjerneskiver fra normale og huntingtonmus

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60113
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

Summary

Vi presenterer en protokoll for å evaluere balansen mellom glutamat frigjøring og klaring ved enkelt kortikostriatal glutamatergic synapser i akutte skiver fra voksne mus. Denne protokollen bruker fluorescerende sensor iGluu for glutamat deteksjon, et sCMOS kamera for signaloppkjøp og en enhet for fokal laser belysning.

Abstract

Synapser er svært kompartialiserte funksjonelle enheter som opererer uavhengig av hverandre. Ved Huntingtons sykdom (HD) og andre nevrodegenerative lidelser kan denne uavhengigheten bli kompromittert på grunn av utilstrekkelig glutamatclearance og de resulterende spill-in- og utsøleffektene. Endret astrocytisk dekning av presynaptiske terminaler og/eller dendrittiske spines samt en redusert størrelse på glutamat transportørklynger ved glutamat frigjøringssteder har blitt innblandet i patogenesen av sykdommer som resulterer i symptomer på dys-/hyperkinesi. Imidlertid er mekanismene som fører til dysfunksjon av glutamatergic synapser i HS ikke godt forstått. Forbedre og bruke synapse bildebehandling vi har innhentet data som kaster nytt lys over mekanismene som hindrer initiering av bevegelser. Her beskriver vi de viktigste elementene i en relativt billig tilnærming for å oppnå enkelt synapse oppløsning ved hjelp av den nye genetisk kodet ultrarask glutamat sensor iGluu, wide-field optikk, en vitenskapelig CMOS (sCMOS) kamera, en 473 nm laser og en laser posisjonering system for å evaluere tilstanden korticostriatal synapses i akutte skiver fra alder passende sunn eller syk mus. Glutamat transienter ble konstruert fra enkelt eller flere piksler for å oppnå estimater av i) glutamat utgivelse basert på maksimal økning av glutamat konsentrasjon [Glu] ved siden av den aktive sonen og ii) glutamat opptak som gjenspeiles i tidkonstanten av forfall (TauD) av perisynaptic [Glu]. Forskjeller i hvileanfallstørrelse og kontrastmønstre av kortsiktig plastisitet fungerte som kriterier for identifisering av kortikostriatale terminaler som tilhører intratelencephalic (IT) eller pyramidalkanalen (PT) banen. Ved hjelp av disse metodene oppdaget vi at hos symptomatiske HS-mus ~ 40% av PT-type korticostriatal synapser viste utilstrekkelig glutamat clearance, noe som tyder på at disse synapsene kan være i fare for excitotoxic skade. Resultatene understreker nytten av TauD som en biomarkør av dysfunksjonelle synapser hos Huntington mus med en hypokinetisk fenotype.

Introduction

Den relative virkningen av hver synaptiske terminal som tilhører en "enhetlig forbindelse" (dvs. forbindelsen mellom 2 nerveceller) vurderes vanligvis av sin innflytelse på det første segmentet av det postsynaptiskenevron1,2. Somatiske og/eller dendrittiske opptak fra postsynaptiske nevroner representerer de vanligste, og til nå også de mest produktive måtene å klargjøre informasjonsbehandling under et ovenfra og ned eller vertikalt perspektiv3,4,5. Tilstedeværelsen av astrocytter med sine diskrete og (i gnagere) ikke-overlappende distrikter kan imidlertid bidra til et horisontalt perspektiv som er basert på lokale mekanismer for signalutveksling, integrasjon og synkronisering på synaptiske steder6,7,8,9,10.

Fordi det er kjent at astroglia spille, generelt, en viktig rolle i patogenesen av nevrodegenerativ sykdom11,12 og spesielt en rolle i vedlikehold og plastisitet av glutamatergic synapser13,14,15,16, er det tenkelig at endringer i synaptisk ytelse utvikle seg i samsvar med tilstanden av astrocytter i det delte målområdet afferent fibre med variert opprinnelse. For ytterligere å utforske mål-/astroglia-avledede lokale regulatoriske mekanismer i helse og sykdom, er det nødvendig å evaluere individuelle synapser. Den nåværende tilnærmingen ble utarbeidet for å estimere omfanget av funksjonelle glutamat utgivelses- og klaringsindikatorer og for å definere kriterier som kan brukes til å identifisere dysfunksjonelle (eller gjenopprettede) synapser i hjerneområder som er mest relatert til bevegelsesinitiering (dvs. først og fremst i motorcortex og dorsal striatum).

Striatum mangler iboende glutamatergiske nevroner. Derfor er det relativt enkelt å identifisere glutamatergic afferents av ekstrastriatal opprinnelse. Sistnevnte stammer for det meste i mediale thalamus og i hjernebarken (se17,18,19,20 for mer). Korticostriatal synapser dannes av aksoner av pyramidale nevroner lokalisert i kortikale lag 2/3 og 5. De respektive aksonene danner bilaterale intra-telencephalic (IT) tilkoblinger eller ipsilaterale forbindelser via et fibersystem som mer caudally utgjør pyramidekanalen (PT). Det har videre blitt foreslått at IT- og PT-type terminaler varierer i deres utgivelsesegenskaper og størrelse21,22. I lys av disse dataene kan man også forvente noen forskjeller i håndteringen av glutamat.

Striatum er det mest berørte hjerneområdet ved Huntingtons sykdom (HS)5. Human HS er en alvorlig genetisk arvet nevrodegenerativ lidelse. Den Q175 musemodell tilbyr en mulighet til å undersøke cellulær grunnlag av hypokinetisk-rigid form for HS, en tilstand som har mye til felles med parkinsonisme. Fra en alder av ca 1 år viser homozygote Q175 mus (HOM) tegn på hypokinesi, som avslørt ved å måle tiden brukt uten bevegelse i et åpent felt23. De nåværende eksperimentene med heterozygote Q175 mus (HET) bekreftet de tidligere motorunderskuddene observert i HOM, og i tillegg viste at de observerte motorunderskuddene ble ledsaget av et redusert nivå av astrosyktisk eksitatorisativ aminosyretransportør 2 protein (EAAT2) i umiddelbar nærhet av korticostriatal synaptiske terminaler24. Det har derfor blitt hypotetisk at et underskudd i astrocytisk glutamat opptak kan føre til dysfunksjon eller tap av respektive synapser25,26.

Her beskriver vi en ny tilnærming som gjør det mulig å evaluere enkelt synapse glutamat clearance i forhold til mengden av den frigjorte nevrotransmitteren. Den nye glutamatsensoren iGluu ble uttrykt i kortikostriatale pyramidale nevroner. Den ble utviklet av Katalin Török27 og representerer en modifikasjon av den tidligere introduserte høyaffinitet, men langsom glutamat sensor iGluSnFR28. Begge sensorene er derivater av det forbedrede grønne fluorescerende proteinet (EGFP). For spektrale og kinetiske egenskaper, se Helassa et al.27. Kort, iGluu er en lav affinitetssensor med rask de-aktivering kinetikk og derfor spesielt godt egnet til å studere glutamat clearance ved glutamat-frigjørende synaptiske terminaler. Dissosiasjonstiden konstant av iGluu ble bestemt i en stoppet strømningsenhet, som gjorde en Tauav verdi på 2,1 ms ved 20 °C, men 0,68 ms når ekstrapolert til en temperatur på 34 °C27. Enkelt Schaffer sikkerhet terminaler probed ved 34 °C med spiral laser skanning i CA1-regionen av organotypic hippocampal kulturer under en 2-foton mikroskop utstilt en gjennomsnittlig tid konstant for forfall på 2,7 ms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt arbeid er utført i samsvar med EU-direktivet 2010/63/EU for dyreforsøk og ble registrert ved Berlins kontor for helsevern og teknisk sikkerhet (G0233/14 og G0218/17).

MERK: Opptak fra Q175 wild-type (WT) og heterozygotes (HETs) kan utføres i alle aldre og kjønn. Her studerte vi menn og kvinner i en alder av 51 til 76 uker.

1. Injeksjon av glutamatsensoren iGluu for uttrykk i Kortikostriatal Axons

  1. Bruk pipetteavtrekkeren (ett trinns modus) til å forberede borosilikatglasspipetter til injeksjon av viruset. Etter trekking, bryte pipette manuelt for å få en spiss diameter på 30-50 μm. Autoklav pipette og kirurgiske instrumenter, inkludert boret for å åpne skallen.
  2. Lagre viruset AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/ml) ved -80 °C i 10 μL aliquots. Hvis injeksjoner utføres kort tid etter virusproduksjon (innen 6 måneder), må du holde ved 5 °C. Før operasjonen, ta ut hetteglasset og vedlikehold det ved romtemperatur.
  3. Fyll glasspipetten og fjern eventuelle bobler.
  4. Bedøve dyret med en intraperitoneal injeksjon av en oppløsning som inneholder 87,5 mg/kg ketamin og 12,5 mg/kg xylazin. Subkutant injiser 0,25 % bupivainin (8 mg/kg) for ytterligere smertelindring. Kontroller dybden av anestesi ved å overvåke muskeltonen og observere fraværet av smerteinduserte reflekser.
  5. Barber huden på hodet og steriliser den med 70% alkohol. Monter musen i stereotaxic rammen.
  6. Bruk en skalpell til å fjerne huden og en høy hastighet (38 000 o/min) drill for å lage et 1,2 mm hull i beinet over motorcortexen.
  7. Monter sprøyten med den vedlagte injeksjonspipetten i holderen til en presisjonsmanipulator. Sett den vertikalt orienterte pipetten inn i cortex på 4 forskjellige steder. Injeksjonskoordinatene er, med hensyn til bregma (i mm): anterior 1.5, lateral 1.56, 1.8, 2.04, 2.28. Dybden med hensyn til dura mater er (i mm): 1,5–1,7.
  8. Bruk injeksjonssystemet til å injisere 0,3 μL per sted for den ufortynnede virusoppløsningen med en hastighet på 0,05 μL/min. Etter hver injeksjon, la pipetten stå på plass i 1 min før du trekker den langsomt (1 mm/min).
  9. Avslutt med å lukke det kirurgiske såret med en nylonsutur.
  10. La musen stå i 0,5 til 1 t på en varmepute i et rent bur før den returneres til det opprinnelige buret.
  11. Opprettholde musen på en 12 t dag-natt syklus i 6 til 8 uker før utarbeidelsen av akutte hjerneskiver.
    MERK: For å unngå immunreaksjoner som resulterer i celleskade og synapsetap, må injeksjon av flere viruskonstruksjoner utføres samtidig eller innen 2–3 timer etter den primære injeksjonen. Koordinatene for iGluu injeksjon ble valgt i henhold til Paxinos og Franklin29 hjerneatlas. De tilsvarer M1 motorcortex. Immunfarging av injiserte hjerner visualiserte mange, men for det meste godt isolerte aksoner og aksonvaricosities i ipsi- og kontralateral striatum og i kontralaterale M1 og S1 kortiices.

2. Søk etter glutamatergiske terminaler som uttrykker glutamatsensoren iGluu

  1. Kalibreringsmodus
    1. Klargjør sCMOS-kameraet og kamerakontrollprogramvaren med følgende innstillinger. På Readout-siden angir du Bildeavlesningsfrekvens:560 MHz (= raskeste avlesning), Følsomhet/dynamisk område: bit, Falskt støyfilter: Ja, Overlap-avlesning: Ja. Velg Fullskjerm på Siden Binning/ROI.
    2. Forbered et glasslysbilde som inneholder en dråpe 5 mg/ml lucifer gul (LY) under en dekselslip.
    3. Plasser LY-lysbildet under et mål på 63 x, åpne laserlukkeren og utfør et seriell oppkjøp ved hjelp av følgende innstillinger: Pixel Binning: 1x1, Utløsermodus: Intern, Eksponeringstid: Minimal (som skal bestemmes).
    4. Juster laserkraften for å produsere et fluorescenssted på 4 μm i diameter (bildet skal ikke inneholde mettede piksler).
    5. Hvis du vil utføre en kalibrering av laserposisjoneringssystemet, velger du følgende innstillinger i laserposisjoneringsprogramvaren: Spotstørrelsesdiameter: 10, Skannehastighet:43,200 kHz. Klikk på Start bildeanskaffelse-knappen på høyre panel. Sett kjøringer:0, Kjør forsinkelse: 0, og velg alternativet Kjør ved TTL på Sekvens-siden. Klikk på Kalibrer-knappen på kalibreringssiden og kalibrer laserkontrollprogramvaren i henhold til instruksjonene som vises øverst til venstre på anskaffelsesskjermen.
    6. Hvis oppsettet bruker uavhengig programvare for kamera- og laserkontroll, skaffe skjermbilder fra kameraoppkjøpsvinduet og send det til laserkontrollprogramvaren for en re-beregning av XY-koordinatene. Hvis programvaren er installert på forskjellige datamaskiner, kan du bruke en videograbber til å importere bildet til laserkontrollprogramvaren. Laserkontrollprogramvaren trenger informasjon om XY-skaleringsfaktorene og forskyvningene. For dette formålet, bestemme koordinatene til øverst til venstre, nederst til venstre og nederst til høyre av bildet i oppkjøpsvinduet i laserkontrollprogrammet. Beregn skaleringsfaktorene i henhold til følgende ligninger: X-faktor = (X nederst til høyre – X nederst til venstre)/2048, X offset = X nederst til venstre, Y-faktor = (Y øverst til venstre – Y nederst til venstre)/2048, Y offset = Y nederst til venstre.
    7. På slutten av kalibreringsprosedyren oppretter du et rektangulært område av interesse (ROI) på 267x460 piksler, flytter den til midten av skjermen og klikker startsekvensknappen.
    8. Gå tilbake til følgende innstillinger for kamerakontroll: Binning: 2x2, Utløsermodus: Ekstern eksponering, Eksponeringstid: Minimal (som skal bestemmes).
  2. Autofluorescens korreksjonmodus
    MERK: Hvilenivået på [Glu] i miljøet av aktive synaptiske terminaler er vanligvis under 100 nM14,,30,,31,,32,,33,,34. Følgelig vil enhver sensor av glutamat, spesielt en lav affinitetssensor som iGluu være ganske svak i fravær av synaptisk glutamatfrigjøring. Likevel kan noen iGluu fluorescens til og med oppdages i ro, men må skilles fra vevautofluorescens. 473 nm-belysningen fremkaller både iGluu fluorescens og autofluorescens (figur 1A–C). Sistnevnte opptar et bredt spekter av bølgelengder, mens iGluu fluorescens er begrenset til 480–580 nm (med maksimalt 510 nm). Korreksjonen for autofluorescens er basert på oppkjøp av to bilder med forskjellige høypassfiltre.
    1. Forbered hjerneskiver på forhånd som beskrevet andre steder35. Hold kliskiver klare.
    2. Overfør skivene inn i opptakskammeret, og senk dem ned i oksygenert kunstig cerebrospinalfluid (ACSF) som inneholder 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4,25 mM NaHCO3,2 mM CaCl2,1 mM MgCl2,10 mM glukose (pH 7.3, 303 mOsm/L), supplert med 0,5 m natriumpyruvat, 2,8 mnatrium ascorbate og 0,005 mM glutathione. Bruk en strømningshastighet på 1–2 ml/min. Hold badetemperaturen ved 28 –30 °C.
    3. Finn dorsal striatum under et 20x vannnedsenking mål. Fest skivene med et nylongitter på en platinaharpe for å minimere vevsbevegelsen. Bytt til 63x /NA 1.0 vannnedsenking målet. Velg filtre som reflekterer lys ved 473 nm (dichroic speil) og passerende lys med bølgelengder > 510 nm (utslippsfilter).
    4. Synkroniser belysning, stimulering og bildeinnhenting ved hjelp av et AD/DA-kort med den respektive kontrollprogramvaren. Angi utløserprogrammet for å kontrollere anskaffelsen med en lasereksponeringstid på 180 ms og en bildeanskaffelsestid på 160 ms. Bruk laserposisjoneringsenheten til å sende laserstrålen til et forhåndsbestemt antall punkter og definere innstillingene for skannehastighet og spotstørrelse.
    5. Få et bilde av både autofluorescens og iGluu-positive strukturer ved hjelp av et høypassfilter ved 510 nm ("gult bilde").
    6. Skaffe et bilde med autofluorescens alene ved hjelp av et høypassfilter på 600 nm ("rødt bilde").
    7. Skaler de røde og gule bildene ved hjelp av de gjennomsnittlige intensitetene til de 10 lyseste og de 10 mørkeste pikslene for å definere området. Utfør en subtraksjon "gul minus rødt bilde" og rescale det fratrukket bildet for å generere en standard 8-biters tif-fil for praktisk visualisering av interesseanfallet (figur 1D). Den inneholder de lyse pikslene fra iGluu-positive strukturer, grå piksler fra bakgrunnen og mørke piksler fra strukturer med autofluorescens.
      MERK: Med det gitte utstyret vil gjennomsnittlig hvilefluorescens (F) være under 700 EUs
  3. Kampsøk-modus
    MERK: iGluu-positive piksler kan tilhøre funksjonelt forskjellige elementer av aksonalt treet, for eksempel aksongrener av forskjellig rekkefølge, steder av bifurcation, varicosities etter vesikkel uttømming eller fullt aktive varicosities. Det er imidlertid nesten umulig å identifisere funksjonelle synaptiske terminaler bare ved visuell inspeksjon. Derfor trenger hver glutamatergic synaptiske terminal identifikasjon ved respons på elektrisk depolarisering. Nettsteder som ikke reagerer på stimulering må kastes. Den fysiologiske måten å indusere glutamat frigjøring fra korticostriatal aksoner er å fremkalle et handlingspotensial. Dette kan enten oppnås ved hjelp av en kanal rhodopsin av passende spektrale egenskaper eller ved elektrisk stimulering av en akson visualisert av iGluu selv. For å unngå utilsiktet opsin aktivering, foretrakk vi sistnevnte approastep
    1. Bruk mikropipetteavtrekkeren (i firetrinnsmodus) til å produsere stimuleringspipetter fra borosilikatglasskapillærer. Den innvendige spissen diameter bør være ca 1 μm. Når den er fylt med ACSF, bør elektrodemotstanden være ca. 10 MΩ.
    2. For å indusere virkningen potensiellavhengig frigjøring av glutamat fra et sett med synaptiske anfall festet til samme akson, bruk 63x forstørrelse, 510 nm utslippsfilteret og det trekkede bildet for å plassere en glassstimuleringselektrode ved siden av en fluorescerende varicosity . Unngå nærhet av flere aksoner.
    3. Slå på stimulatoren for å levere depolariserende strømpulser til stimuleringspipetten. Bruk dagens intensiteter rundt 2 μA (ikke mer enn 10 μA).
    4. Slå på flerkanals bad applikasjonssystem der en kanal leverer standard bad løsning og de andre kanalene levere de nødvendige blokkere av ione kanaler, transportører eller membran reseptorer. Kontroller strømmen på opptaksstedet, og bytt deretter til tetrodotoksinkanalen (TTX) (badløsning pluss 1 μM TTX). Etter 2–3 min, stimulere bouton av interesse igjen, men nå i fravær av handling potensiell generasjon. Utgivelsen skyldes direkte kalsiumtilstrømning gjennom spenningsavhengige kalsiumkanaler.
    5. Ved å dreie intensitetsnøkkelen på stimulatoren, juster stimuleringsstrømmen for å oppnå svar som ligner på de som fremkommer via handlingspotensialer. Vanligvis vil stimuleringsstrømmen være rundt 6 μA for en 0,5 ms depolarisering.
    6. For grunnleggende testing av preparatet, bruk 0,5 mM CdCl2. Tilstedeværelsen av denne kalsiumkanalblokkerglutamatutgivelsen forhindrer fullstendig synaptisk glutamatfrigjøring og validerer dermed kalsiumavhengigheten til det direkte fremkalte glutamatsignalet.
      MERK: Følgende generelle anbefaling kan bidra til å øke suksessraten for enkle synapseeksperimenter i striatum. For å velge glutamatergic synaptiske terminaler med intakt frigjøringsmaskiner, bør en varicosity: (i) Ha en jevn spindellignende form; (ii) Ikke være forbundet med en aksonbifurcation; (iii) Vær lysere enn andre strukturer på det "gule bildet"; (iv) Bor i striatal neuropil i stedet for i fiberkanalene; (v) Bor på en veldig tynn aksongren; (vi) Ikke bor i de dypere delene av skiven.

3. Visualisering av glutamat frigjøring og klaring

  1. Opptaksmodus
    MERK: Etter subtraksjonen av autofluorescensen (trinn 2.2) og noen få innledende tester for respons av interesseanfallet (trinn 2.3), kan datainnhenting begynne. Svarene på elektrisk aktivering av glutamatfrigjøring fra enkelt aksonterminaler kan observeres direkte i bildet (Figur 2), uten å bruke ytterligere analyseverktøy. Det viste seg imidlertid å være veldig praktisk å umiddelbart trekke ut noen grunnleggende indikatorer på synapse ytelse (Figur 3). Denne informasjonen er nødvendig for å ta beslutninger om etterfølgende eksperimentering, for eksempel valg av bestemte terminaltyper, rask vurdering av HS-relaterte endringer, antall og hyppighet av studier eller legemidler som skal brukes med superfusjonssystemet. Det kan også være nødvendig å håndtere til slutt vises gjenstander. For det første er standardinnstillingene for dataregistrering beskrevet.
    1. Bruk xy-kvarstasjonene til mikroskopet til å plassere den testede iGluu-positiveboutonen nær visningsfeltet. Stopp bildeanskaffelsen med Knappen Avslutt anskaffelse. På det sist ervervede bildet, bestemme XY posisjon av hvile bouton sentrum ved å klikke på den med venstre museknapp. XY-koordinatene for den angitte markøren vises på det nederste statuspanelet i anskaffelsesvinduet.
    2. Ved hjelp av kalibreringsdataene (trinn 2.1.6) beregner du koordinatene til stedet der laserstrålen skal sendes til eksitasjon av iGluu fluorescens. Bruk følgende ligninger: X laser = X kamera * X faktor + X offset, Y laser = Y offset – Y kamera * Y faktor. Vær oppmerksom på kameraets vertikale eller horisontale flippinnstillinger mens du utfører denne omberegningen.
    3. Opprett en ett-punkts sekvens i laserkontrollprogramvaren ved hjelp av de beregnede koordinatene. For dette formålet velger du Pek i boksen Legg til i sekvens på Sekvens-siden i laserkontrollprogramvaren. Velg 10 μs for forsinkelsen for å utløse innsettende og 180 ms for laserpulstiden. Flytt musen til de beregnede koordinatene og klikk venstre knapp.
    4. Velg følgende innstillinger i laserkontrollprogramvaren: Kjører: 0, Kjør forsinkelse: 0, Sekvens: Kjør ved TTL. Klikk deretter Start sekvens.
    5. I kamerakontrollprogramvaren velger du følgende innstillinger: På Binning/ROI-siden angir du Bildeområde: Egendefinert, Pikselbinning:2x2, Høyde:20, Bredde: 20, Venstre:X-koordinat av hvilende iGluu-positive punkt minus 10 px, Bunn: Y-koordinat av hvilende iGluu-positive spot minus 10 px, Oppkjøpsmodus: Kinetisk SeriesLengde : 400, Eksponeringstid: 0,0003744s (minimal verdi). Med slike innstillinger vil anskaffelsesraten være 2,48 kHz.
    6. Velg Utløsermodus: Ekstern. Klikk på Ta signal i kamerakontrollprogramvaren. Start den eksperimentelle protokollen som er fastsatt for utløserenheten.
    7. Implementer eksperimentell protokoll Prøven med følgende tidsperiode: 0 ms – start prøve, 1 ms – start laserbelysning, 20 ms – start bildeinnhenting med kamera, 70 ms – start elektrisk stimulering 1, 120 – start elektrisk stimulering 2, 181 ms – sluttprøve (laser og kamera av). Dermed, under en prøve kameraet kjøper 400 bilder med en frekvens på 2,48 kHz. Se trinn 2.3.3 og 2.3.5. for detaljer om elektrisk stimulering.
    8. For å tillate tilstrekkelig gjenoppretting av presynaptiske vesikkelbassenger, bruk protokollen Trial med en repetisjonsfrekvens på 0,1 Hz eller lavere.
  2. Off-line konstruksjon av glutamat forbigående og rask vurdering av glutamat frigjøring og klaring for identifisering av patologiske synapser
    1. Slå på evalueringsrutinene. Her bruker vi en intern-skrevet programvare SynBout v. 3.2. (forfatter: Anton Dvorzhak). Følgende trinn er nødvendig for å konstruere en ΔF/F-transient fra pikslene med forhøyet iGluu fluorescens som i videoen av figur 2.
    2. For å avsette bouton-størrelsen, beregn gjennomsnitts- og standardavviket (SD) av ROI fluorescensintensiteten ved hvile (F), før stimuleringsutbruddet. Bestem og boks området som er opptatt av piksler med F>gjennomsnitt + 3 SD (figur 3A). Bestem en virtuell diameter (i μm) forutsatt en sirkulær form for supra-terskelområdet.
    3. Bestem ΔF som forskjellen mellom toppintensitetsverdien og F. Plott den stimulerende strømmen og ΔF/F mot tiden (figur 3B). Beregn SD av ΔF / F i ro (før stimuleringsutbruddet) og "Peak amplitude". Bruk piksel med topp amplitude mer enn 3 SD av ΔF/F til å utføre monoeksponentiell tilpasning for forfallet fra toppen. Bestem tidskonstanten for forfall TauD av ΔF/F.
    4. Hvis du vil anslå "Maksimal amplitude" på en gitt synapse, velger du pikselen med den høyeste ΔF/F-verdien. Det er vanligvis plassert innenfor eller ved siden av grensene for hvilebouton iGluu fluorescens. Den "Maximal amplitude" ville være den beste indikatoren på glutamat belastningen presentert for klaring maskiner i en enkelt synapse.
    5. For å estimere denu romlige utvidelsen av iGlu u-signalet, bestemme diameteren på området for alle supra-terskelpiksler kombinert for å danne en virtuell sirkel. Den respektive diameteren kalles "Spread". Begrepet "Peak spread" refererer deretter til toppverdien av den gjennomsnittlige spredningsforbigående (Figur 3C, forskjellen mellom stiplede røde linjer).
  3. Rettelser for mulige artefakter
    MERK: Elektrisk depolarisering er forbundet med en ytre strøm av intrapipetteoppløsningen. Dette kan føre til en liten vevforskyvning. For å diskriminere mellom stimuleringsinduserte endringer av iGluu og ut-av-fokus skift av bildet, kan man bruke følgende tilnærming til å identifisere og for å eliminere forskyvning artefakter (Figur 4).
    1. Analyser de romlige egenskapene til supraterskelpikslene avledet fra en avkastning med tegn på forskyvning (figur 4F-H).
    2. Finn piksler utenfor de opprinnelig bestemte grensene for bouton i ro (Figur 4F-H, bokset i rødt).
    3. Identifiser til slutt eksisterende negative pikselintensitetsverdier (figur 4I, J). Enhver ΔF/F i negativ retning med amplitude som er større enn prestimuleringsgjennomsnittet ± 3 SD bør betraktes som artefakt, og posten skal kastes.
    4. For å unngå ut-av-fokus artefakter, plassere stimulering elektroden på antero-lateral side av synaptic bouton, bruke biphasic elektrisk stimulering og minimere stimulering intensitet / varighet.
      MERK: Gjenstander som ikke er i fokus, kan også utledes fra kameraet. Hvis sistnevnte ikke er optimalt festet til mikroskopet, kan det produsere svingninger, mest sannsynlig på grunn av små vibrasjoner i kameraets kjølesystem. Slike vibrasjoner skaper et "yin og yang" mønster i ΔF / F-bildene som roterer med en frekvens på 50 Hz. Vibrasjonene kan matematisk trekkes fra fluorescenssignalet, men den endelige kvaliteten på målingene vil da være kritisk avhengig av opptakstiden.
    5. Fest kameraet til mikroskopet slik at vibrasjoner er fraværende. Hvis sistnevnte forblir, plasser en gummipakning mellom kameraet og mikroskopadapteren.
      MERK: Man kan ikke forsømme muligheten for at striatal neuropil rundt synapse av interesse inneholder glutamatergic varicosities som ikke uttrykker iGluu og derfor forblir usynlig. I tilfelle av deres co-aktivering (mer sannsynlig i fravær av TTX) transienter hentet fra boutons av interesse kan bli påvirket av spill-over. Det samme gjelder iGluu-uttrykkendeterminaler som var ute av fokus. Et karakteristisk fenomen ville i dette tilfellet være at fluorescenstransienter stammer fra et mye bredere område. Som dette svaret er eliminert av TTX, kan man tolke det som en uspesifikk respons indusert av uberettiget multi-fiber aktivering.
    6. Hvis du vil korrigere for denne uspesifikke multifiberresponsen, følger du fremgangsmåten som er beskrevet i figur 5. Bruk fluorescenssignalet for piksler på utsiktsfeltgrensene. For å minimere bakgrunnsrespons, minimere stimuleringsintensitet og varighet eller bruk TTX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifikasjon av to typer kortikostriatal glutamatergic varicosities
IT og PT afferents stammer fra henholdsvis lag 2/3 og 5, og viser differensialforringning og termineringsmønstre i det ipsilaterale og kontralaterale (kun IT-terminaler) striatum. Fortsatt lite er kjent om egenskapene til glutamat frigjøring og klaring under repeterende aktiveringsforhold som observert under initiering av bevegelser, men det er godt dokumentert at de respektive glutamat-frigjørende varicosities varierer i størrelse22. Ved å bruke et størrelseskriterium, ble det funnet at IT- og PT-terminaler viser kontrasterende former for kortsiktig plastisitet24. Med stimulansintervaller på 50 ms var de mindre IT-terminalene utsatt for parret pulsdepresjon (PPD), mens de større PT-terminalene viste parede pulstilrettelegging. Denne forskjellen ble også observert med kortere intervaller (20 ms) og gjennom en serie på 6 pulser. Figur 3 og figur 6 illustrerer disse eksperimentene der synaptisk glutamatfrigjøring ble utløst via den potensielle virkningsmekanismen ved fysiologisk Ca2+/Mg2+-konsentrasjon.

Identifikasjon av dysfunksjonelle synapser hos mus med avansert Huntington sykdom
Nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers, Parkinsons og Huntington sykdom er preget av et stadig utviklende tap av glutamatergiske synapser36. Nye terapier tar sikte på å hindre eller til og med reversere denne fatale progresjonen. Hva utløser egentlig forsvinningen av en synapse, og når, er stort sett ukjent. Ytterligere innsikt kan forventes fra studier som tilbyr kriterier for (a) vital identifisering av en bestemt klasse glutamatergic synapser og (b) påvisning av dysfunksjonelle versus normalt utførende kontakter. Her vil det bli vist hvordan TauD-verdiene hentet fra PT-type terminaler ble brukt til å estimere brøkdelen av dysfunksjonelle synapser i Q175 heterozygotes med en identifisert motor fenotype.

Før de enkle synapse bildeforsøkene ble musene sendt til en rask, men ganske robust test for endringer i deres utforskende atferd. Denne testen kalles "step-over test". Dyret ble plassert i midten av en petriskål (185 mm diameter og 28 mm vegghøyde). Testen ble tatt opp med et videokamera. Ved hjelp av offline analyse, kan man bestemme tiden mellom take-off av eksperimentererens hånd og øyeblikket da dyret har alle 4 fot ut av parabolen. Plotting av data fra over 100 WT og Q175 HET i alderen mellom 12 og 18 måneder tyder på at mus med en step-over ventetid på > 300 s kan diagnostiseres som hypokinetisk. Figur 7A illustrerer en signifikant positiv sammenheng mellom resultatene som er oppnådd for den totale banen i det åpne feltet og step-over-ventetiden.

Enkelt synapse iGluu imaging viste at disse symptomatiske HS-musene viste et underskudd i hastigheten på juxtasynaptisk glutamat forfall som gjenspeiles i TauD-verdiene fra enkelt (eller først i en sekvens) stimuli (figur 7B, C). Ved WT ble en slik forlengelse bare observert etter påføring av en selektiv ikke-transportbar hemmer av glutamatopptak — DL-threo-β-benzyloksyaspartisyre (TBOA, figur 7D,E). Dette antyder en rolle astrocytisk glutamat transportører i reguleringav synaptisk glutamat klaring. Endringer i diffusjon av Glu i perisynaptic plass har ikke blitt funnet24. Men, selvfølgelig, mye mer arbeid er nødvendig for å faktisk identifisere årsaken til redusert glutamat klaring i HS så vel som i andre former for parkinsonisme. Bortsett fra endringer i astrocyttnærhet9 og redusert slc1A2 uttrykk37, kan man like godt vurdere sykdomsrelatert ustabilitet av EAAT2 i plasmamembranen i perisynaptic astrocyttprosesser (PAPs). Dette kan være et resultat av endringer i EAAT2-interactomet. Faktisk peker nylige massespektroskopieksperimenter i laboratoriet på et tap av EAAT2-dystrophin interaksjon i striatal astrocytter (Hirschberg, Dvorzhak, Kirchner, Mertins og Grantyn, upublisert).

Svært lite er kjent om tidslinjen for synaptisk dysfunksjon med progresjon av HS, men det er svært sannsynlig at sunne synapser eksisterer sammen med allerede svekkede. Ved å søke etter et klassifiseringskriterium undersøkte vi TauD-dataene fra forskjellige mus. For dette formålet ble amplituden og TauD-verdiene fra 3 påfølgende parede studier normalisert til det første svaret (se figur 6F for en eksperimentell ordning), og sannsynligheten for forekomst av en gitt TauD-verdi ble sammenlignet i alderstilpasset WT versus Q175 HET (figur 6G). Det ble funnet at i WT TauD aldri overskredet 15 ms, mens i symptomatisk Q175 HET, 40% av synapsene viste TauD verdier mellom 16 og 58 ms, til tross for en tendens til en reduksjon i mengden av utgitt glutamat (Figur 6H, I). TauD kan da betraktes som en biomarkør for dysfunksjonelle synapser i HS og videre brukes til å verifisere funksjonell utvinning i eksperimenter rettet mot astrocytisk glutamat transport.

Figure 1
Figur 1: Identifikasjon av iGluu-positive varicosities. (A) Fluorescensbilde oppnådd med et 510 nm høypassfilter ("gult bilde"). (B) Samme visningsfelt ervervet med et 600 nm høypassfilter ("rødt bilde"). Vær oppmerksom på at stedet merket med svart pilhode har forsvunnet i (B). Overlegg av (A) og (B). Hvit pil = autofluorescens, svart pil = iGluu-positiv varicosity. (D) Bilde innhentet ved subtraksjon av (B) fra (A). Autofluorescerende flekker er mørke og iGluu+ spot er lys. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Filmen fortsatt fra en slow-motion video (slowdown faktor 1240x). Øvre rad: Bilder fra WT (venstre), Q175 HET (midten) og HOM (høyre). Nedre rad: Respektive iGlu u-transienter fra pikselen med høyest glutamathøyde (Maximal ΔF/F).u Den røde markøren angir punktet på forbigående som tilsvarer bildet over sporet. legg merke til langvarig økning av iGluu fluorescens (røde piksler og ΔF/F-transienter). Modifisert og gjengitt med tillatelse fra Dvorzhak et al.24Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Ekstraksjon av funksjonelle indikatorer fra enkelt synapse bilder av genetisk kodet ultrarask Glu sensor iGluu i korticostriatal nevroner. -AJeg har ikke noeå si. Eksempel på en PT (A) og IT (D) bouton med den respektive iGluu fluorescens i ro (venstre) og på toppen av en AP-mediert iGluu respons (høyre). (B, C, E , F) iGluu svar registrert fra bouton vist i (A, D); F Eksperimenter i 2 mM Ca2 + og 1 mM Mg2 +. (B) Samtidig registrering av stimuleringsstrømmen (øvre spor) og gjennomsnittlig intensitet av supra-terskelpiksler (bunnspor). Samme tidsskala for alle spor. Toppamplituder (mellom stiplede røde horisontale linjer) og en monoeksponentiell funksjon montert på forfallet fra denne toppen (rødt overlegg). De tilsvarende TauD-verdiene (τ) vises ved siden av tilpasningskurvene. - Jeghar ikke noe å si. Tomten spredt mot tiden. Peak spread: forskjell mellom stiplede røde horisontale linjer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kjennetegn på en glutamat-indusert iGluu transient (A–E) i motsetning til en forskyvningsartefakt (F–J). (A, B) og (F, G) viser den absolutte fluorescensintensiteten i ro (A, F) og etter stimulering (B, G) i vilkårlige enheter (au). - Jegharikke noe å si. Fluorescensendring i prosent av hvilefluorescensen før stimulering (ΔF/F%). JegDhar ikke noe å sitil deg. Superposisjon av iGluu transienter fra alle piksler i vilkårlige enheter. - Jeghar ikke noe åsi. Superposisjon av iGlu u-transientene fra alle piksler i ΔF/F %.u I tilfelle av synaptisk glutamat utgivelse, viser pikslene ved siden av hvileterminalen en fluorescensøkning etter stimulering, mens i tilfelle av ut-av-fokus skifter den lyseste pikselen i ro bare endre sin posisjon i avkastningen, uten en tilhørende økning i den over-all fluorescensintensiteten til visningsfeltet. En forskyvningsartefakt kan også gjenkjennes ved utseendet på negative ΔF/F-signaler (J). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Korreksjon foru uspesifikk iGlu u-respons. - Jeghar ikke noe å si. Eksempel på parede synaptisk respons forurenset av et uspesifikt bakgrunnssvar. - Jeg har ikke noe åsi. Samme etter korreksjon. -AJeg har ikke noe å si. Før stimulering. (B, F) Under stimulering. - Jegharikke noe å si. Etter stimulering. -DJeg har ikke noe å si. Tilsvarende overliggende intensitetstransienter (i ΔF/F) fra alle bildepunkter i avkastningen. Tidspunktet for oppkjøp et av bildene er merket med tilsvarende små bokstaver over pilhodene. Merk at i panel C er bakgrunnsresponsen svært utbredt og langsomt forfall. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Distinkte størrelses- og størrelsesrelaterte forskjeller i amplitudenparetu pulsforhold (PPR) på iGlu u-forbigående. (A) Forenklet ordningen av kortikostriatal kretser22, illustrerer begrepet fortrinnsrett projeksjon av pyramidale kanalen (PT) nevroner til indirekte vei striatal projeksjon nevroner (iSPN) og intratelencephalic (IT) nevroner til direkte vei SPNer (dSPNs), med størrelsesforskjeller mellom IT og PT terminaler. (B) Bimodal fordeling av bouton diameter som bestemmes av supra-terskel hvile fluorescens før stimulering. Boutons med diameter ≥0,63 μm ble definert som "Large" og antas å bli utstedt av PT-aksoner. For originale bilder og prøvespor fra PT- og IT-type synapser, se figur 3. (C) Signifikant positiv korrelasjon er sett mellom PPR av topp amplituder og bouton diameter. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet fra de tre første studiene av hver bouton. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Identifikasjon av dysfunksjonelle synapser hos Q175 mus med hypokinetisk fenotype. (A) Resultater av motortesting på dagen for enkelt synapse bildebehandling. Step-over latencies > 300 ms ble ansett som patologisk. I en alder serdur (gjennomsnitt 16 måneder), 17/54 HET utstilt en uttalt fenotype i step-over test. Når det gjelder hypokinesi, synes step-over-testen å være mer følsom enn den åpne felttesten. Likevel var det en betydelig sammenheng mellom utfallet av step-over-testen (tid mellom plassering og barriere krysset med alle fire fot) og den åpne felttesten (dvs. total banekjøring på 5 min). Y = -0,01511X + 458,7; P = 0,0044 (enkel regresjon). (B) Gjennomsnittlig fremkalt enkelt synapse iGluu transienter normalisert til samme topp amplitude for å illustrere HD-relaterte forskjeller i clearance av synaptically utgitt glutamat. De respektive tilpasningskurvene fremhever forskjellene i glutamattransientenes varighet. (C) Kvantifisering av resultatene fra villtype (grå), HET (rød) og HOM (magenta). -DJeg har ikke noe å si. Inkubasjon av WT-skiver i 100 nM av TFB-TBOA simulerte depresjonen av glutamatclearance observert i HOM. (F) Ordning for synapse aktivering og dataorganisasjon. (G) Kumulative histogrammer av #1 TauD-verdier. - Jeghar ikke noe å si. Tomter av normaliserte #2 svar. Data fra 31 WT og 30 HET synapser (alle PT type). I WT-prøven var alle TauDmax-verdiene ≤15 ms. I HET-prøven viste 40 % av synapsene TauDmax-verdier som overskrider 15 ms-terskelen definert av den lengste TauDmax i WT. Disse grafene understreker de HD-relaterte forskjellene i områdene maksimal amplitude (dvs. verdien fra pikselen med høyest iGluu fluorescensøkning) og TauDmax (TauD av pikselen med høyest høyde). TauDmax-verdier som utelukkende oppstår i HET, vises i rødt, og amplitudeverdier som utelukkende ses i WT, vises i grått. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. De brukte statistiske testene er angitt ved siden av den respektive grafen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eksperimentene gjelder et spørsmål av generell interesse - synapse avhengighet og dets mulige tap i løpet av neurodegenerasjon, og vi beskriver en ny tilnærming for å identifisere berørte synapser i akutte hjerneskiver fra eldre (> 1 år) mus. Ved å dra nytte av de forbedrede kinetiske egenskapene til den nylig introduserte glutamatsensoren iGluu belyser eksperimentene forholdet mellom synaptisk glutamatfrigjøring og opptak på en måte som ikke har vært mulig før.

Påvirkningen av glutamatclearance på funksjon og vedlikehold av synapser er ikke veldig godt beklart, selv om hypotesen om at glutamat-indusert eksitometsisk het kan forårsake nevrontap og synapsebeskjæring er nevnt i nesten enhver relevant gjennomgang av epilepsi, hjerneslag og nevrodegenerative sykdommer38,39,40,41. Det tilgjengelige beviset er imidlertid mer begrenset enn forventet fra litteraturen. Forvirring er videre lagt til av det faktum at de valgte eksperimentelle verktøyene kan være utilstrekkelig i lys av problemene forbundet med lav romlig og temporal oppløsning når du tolker resultatene oppnådd med brutto stimulering og opptaksteknikker42,43. Dette kan føre til falske negativer som fraråder videre forskning, noe som er mer enn uheldig i lys av nevrologiske lidelser så alvorlige som Huntington sykdom. Den nåværende tilnærmingen sikrer bedre signaldiskriminering og dermed sterkere støtte til ideen om at i HS viser en betydelig brøkdel av korticostriatal synapser tegn på nedsatt glutamatclearance.

De nåværende resultatene avslørte forskjeller i kortsiktig plastisitet innenfor kortikostriatalbanen. Selv om sistnevnte hadde vært i fokus for mange studier17,44, har det ikke vært forventet at de vennlige resenitatene som stammer fra de øvre kortikale lagene ville vise frekvensavhengig depresjon, i motsetning til pyramidale traktatafferenter som stammer fra lag 5. Sistnevnte viste fortrinnsrett en frekvensavhengig frigjøring av frigjøring og kan derfor ha høyere risiko for glutamatopptaksinsuffisiens.

Eksperimenter på akutte hjerneskiver fra voksne mus er viktige for å belyse synaptiske endringer i en passende alder av livet. Alder og funksjonell tilstand av preparatet er spesielt relevant hvis astrocytter var involvert i mekanismen av interesse. Her er det viktig at astrocytter er modne nok til å vise voksne nivåer av glutamat transportøraktivitet og relatert klorid homeostase45.

Enkelt synapse analyser vil bane veien mot en bedre forståelse av HS-relaterte endringer av glutamatergic synaptisk overføring i den intakte hjernen46. Det har vist seg at enkelt synapse oppløsning også kan oppnås i den intakte hjernen, forutsatt at synapsene av interesse er lokalisert i de overfladiske lagene i hjernebarken47.

Til slutt har den nåværende eksperimentelle tilnærmingen appellen om at den kan brukes av mange tilhengere, siden det nødvendige utstyret fortsatt er på lavprissiden.

Kort sagt, fluorescenssignaler som rapporterer glutamatfrigjøring og de juxtasynaptiske endringene i konsentrasjonen av glutamat i den intakte hjernen kan gi data som ikke kan oppnås med noen elektrofysiologisk metode. Men som med enhver ny metode, har denne tilnærmingen sine begrensninger og ulemper som delvis har blitt adressert i trinn 2.2 og 3.3. Den lave hvilefluorescensen til denu raske og høye affiniteten iGlu u-sensoren krever litt trening/erfaring for å identifisere egnede variasjoner for videre testing. Med co-uttrykk for en genetisk kodet kalsiumindikator (GECI) som XCaMP-R48 og minst to koordinerte lasere belysningsystemer, søket av funksjonelle akson terminaler ville bli mye enklere. I alle fall er det avgjørende å avsløre preparatet så liteu som mulig for det spennende lyset før og under iGlu u-opptak.

Bruk av en 473 nm laser (i stedet for vanlig hele feltet eliminering) for å fremkalle iGluu fluorescens er en forutsetning for å oppnå tilstrekkelig utslipp, men vil også føre til bleking. Under de gitte forholdene ble iGluu fullstendig bleket etter 10 stimulerings-/oppkjøpsforsøk (10 stimuluspar med et inter-stimulus intervall på 50 ms og en repetisjonshastighet på 1/10 s). Den maksimale totale belysningstiden for steady-state datainnsamling med det nåværende brukte 1 fotonlasersystemet og den beskrevne innstillingen var ca. 2 s. Blekingen av iGluu er eksponentiell, og er veldig sterk i løpet av de første 20 ms etter belysningstart og mye langsommere deretter. Det anbefales derfor å unngå signalinnhenting i løpet av de første 20 ms av hver studie og å skaffe seg ikke mer enn totalt 10 svarpar. Svar på enkelt stimuli kan registreres med eksponeringstider på 60-80 ms i stedet for den nåværende brukte 180 ms.

Et annet kritisk problem er uttrykksnivået til iGluu. I den banebrytende studien av Helassa et al.27ble viruskonstruksjonene brukt av elektroporasjon til kultiverte nevroner27, som produserer høyere uttrykksnivåer av sensoren og antagelig også mindre bleking, spesielt hvis en to-foton laserskanningsenhet kan brukes i stedet for et enfotnmikroskop. Dürst et al.49 rapportere rutinemessig oppkjøp av postsynaptisk uttrykk for iGluu i CA1 pyramidale nevroner i ~ 100 studier (hver utsatt for bare 80 ms). Men kultivert hjernevev er ikke et alternativ når forsøkene tar sikte på å klargjøre astrocyttavhengige synaptiske funksjoner i den aldrende hjernen. Et CaMKII-Cre-avhengig uttrykk for iGluu ved hjelp av en sterkere promotor kan gi preparater sterkere uttrykk i færre celler, og dermed øke oppløsningen av metoden og tillate oppkjøp av flere studier per synapse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av CHDI (A-12467), German Research Foundation (Exc 257/1 og DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) og intramural Research Funds of the Charité. Vi takker K. Török, St. George's, University of London, og N. Helassa, University of Liverpool, for iGluu plasmid og mange nyttige diskusjoner. D. Betances og A. Schönherr ga utmerket teknisk assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Tags

Nevrovitenskap glutamat frigjøring glutamat clearance glutamat spredning presynaptisk terminal astrocytt glutamat opptak forfall kinetikk spill-over optogenetikk iGluu sCMOS
Enkle synapseindikatorer for glutamatfrigjøring og opptak i akutte hjerneskiver fra normale og huntingtonmus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single… More

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter