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Neuroscience

Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60113
Automatic Translation
1, 1
1Synaptic Dysfunction Group, Neuroscience Research Center, Charité - University Medicine

Summary

Presentamos un protocolo para evaluar el equilibrio entre la liberación de glutamato y el aclaramiento en sinapsis glutamatérgicas corticostriatales en rodajas agudas de ratones adultos. Este protocolo utiliza el sensor fluorescente iGluu para la detección de glutamato, una cámara sCMOS para la adquisición de señal y un dispositivo para la iluminación láser focal.

Abstract

Las sinapsis son unidades funcionales altamente compartimentadas que funcionan de forma independiente entre sí. En la enfermedad de Huntington (EH) y otros trastornos neurodegenerativos, esta independencia podría verse comprometida debido a la falta de aclaramiento de glutamato y los efectos resultantes de derrame y derrame. La cobertura astrocítica alterada de los terminales presinápticos y/o espinas dendríticas, así como un tamaño reducido de grupos transportadores de glutamato en los sitios de liberación de glutamato se han implicado en la patogénesis de enfermedades que resultan en síntomas de dis-/hipercinesia. Sin embargo, los mecanismos que conducen a la disfunción de las sinapsis glutamatérgicas en la EH no se entienden bien. Mejorando y aplicando imágenes de sinapsis hemos obtenido datos arrojando nueva luz sobre los mecanismos que impiden el inicio de movimientos. Aquí, describimos los elementos principales de un enfoque relativamente barato para lograr una resolución de sinapsis única mediante el uso del nuevo sensor de glutamato ultrarrápido codificado genéticamente iGluu, óptica de campo ancho, una cámara científica CMOS (sCMOS), un láser de 473 nm y un sistema de posicionamiento láser para evaluar el estado de las sinapsis corticostriatales en rodajas agudas de ratones sanos o enfermos apropiados para la edad. Los transitorios de glutamato se construyeron a partir de píxeles individuales o múltiples para obtener estimaciones de i) liberación de glutamato basada en la elevación máxima de la concentración de glutamato [Glu] junto a la zona activa y ii) la aceptación de glutamato como se refleja en la constante de tiempo de descomposición (TauD) del [Glu] perisyáptico. Las diferencias en el tamaño del bouton en reposo y los patrones contrastantes de la plasticidad a corto plazo sirvieron como criterios para la identificación de terminales corticostriatales como pertenecientes a la vía intratefel (IT) o al tracto piramidal (PT). Usando estos métodos, descubrimos que en ratones sintomáticos de la EH el 40% de las sinapsis corticostriatales de tipo PT presentaban un aclaramiento insuficiente del glutamato, lo que sugiere que estas sinapsis podrían estar en riesgo de sufrir daño excitotóxico. Los resultados subrayan la utilidad de TauD como biomarcador de sinapsis disfuncionales en ratones Huntington con un fenotipo hipocético.

Introduction

El impacto relativo de cada terminal sináptico perteneciente a una "conexión unitaria" (es decir, la conexión entre 2 células nerviosas) se evalúa típicamente por su influencia en el segmento inicial de la neurona postsináptica1,,2. Las grabaciones somáticas y/o dendríticas de las neuronas postsinápticas representan las más comunes y, hasta ahora, también los medios más productivos para aclarar el procesamiento de la información bajo una perspectiva descendente o vertical3,4,5. Sin embargo, la presencia de astrocitos con sus territorios discretos y (en roedores) no superpuestos puede contribuir a una perspectiva horizontal que se basa en mecanismos locales de intercambio de señales, integración y sincronización en sitios sinápticos6,,7,8,9,10.

Porque se sabe que la astroglia juega, en general, un papel importante en la patogénesis de la enfermedad neurodegenerativa11,12 y, en particular, un papel en el mantenimiento y la plasticidad de las sinapsis glutamatérgicas13,14,15,16, es concebible que las alteraciones en el rendimiento sináptico evolucionan de acuerdo con el estado de los astrocitos en el área de destino compartido de fibras aferentes con diversa sortividad. Para explorar más a fondo los mecanismos reguladores locales derivados de la astroglia en salud y enfermedad, es necesario evaluar las sinapsis individuales. El enfoque actual se elaboró para estimar el rango de indicadores funcionales de liberación y aclaramiento de glutamato y para definir los criterios que pueden utilizarse para identificar sinapsis disfuncionales (o recuperadas) en áreas cerebrales más estrechamente relacionadas con el inicio del movimiento (es decir, en primer lugar en la corteza motora y el estriado dorsal).

El estriado carece de neuronas glutamatérgicas intrínsecas. Por lo tanto, es relativamente fácil identificar aferentes glutamatérgicos de origen extratriatal. Estos últimos se originan principalmente en el tálamo medial y en la corteza cerebral (ver17,18,19,20 para más). Las sinapsis corticostriatales están formadas por los axónicos de las neuronas piramidales localizadas en las capas corticales 2/3 y 5. Los axones respectivos forman conexiones bilaterales intratelencéfalas (IT) o conexiones ipsilaterales a través de un sistema de fibra que constituye más caudalmente el tracto piramidal (PT). Además, se ha sugerido que los terminales de tipo IT y PT difieren en sus características de liberación y tamaño21,,22. En vista de estos datos, también se podrían esperar algunas diferencias en el manejo del glutamato.

El estriado es el área cerebral más afectada en la enfermedad de Huntington (EH)5. La EH humana es un trastorno neurodegenerativo hereditario genético grave. El modelo de ratón Q175 ofrece la oportunidad de investigar la base celular de la forma hipocinética-rígida de la EH, un estado que tiene mucho en común con el parkinsonismo. A partir de una edad de aproximadamente 1 año, los ratones homocigotos Q175 (HOM) presentan signos de hipocinesia, como se revela midiendo el tiempo pasado sin movimiento en un campo abierto23. Los actuales experimentos con ratones heterocigoto Q175 (HET) confirmaron los déficits motores anteriores observados en HOM y, además, mostraron que los déficits motores observados estaban acompañados por un nivel reducido de la proteína 2 del transportador de aminoácidos astrocíticos excitatorios (EAAT2) en las inmediaciones de los terminales sinápticos corticostria24. Por lo tanto, se ha planteado la hipótesis de que un déficit en la aceptación astrocítica de glutamato podría conducir a la disfunción o incluso la pérdida de las respectivas sinapsis25,26.

Aquí, describimos un nuevo enfoque que permite evaluar el aclaramiento de glutamato de sinapsis única en relación con la cantidad del neurotransmisor liberado. El nuevo sensor de glutamato iGluu se expresó en neuronas piramidales corticostriatales. Fue desarrollado por Katalin T'r-k27 y representa una modificación del sensor de glutamato de alta afinidad pero lento iGluSnFR28introducido anteriormente. Ambos sensores son derivados de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP). Para las características espectrales y cinéticas, véase Helassa et al.27. En resumen, iGluu es un sensor de baja afinidad con cinética de desactivación rápida y por lo tanto particularmente adecuado para estudiar el aclaramiento de glutamato en terminales sinápticos que liberan glutamato. La constante de tiempo de disociación de iGluu se determinó en un dispositivo de flujo detenido, que hacía un valor de Tauapagado de 2,1 ms a 20 oC, pero 0,68 ms cuando se extrapolaba a una temperatura de 34 oC27. Los terminales colaterales Single Schaffer sondeados a 34 oC con escaneo láser en espiral en la región CA1 de cultivos de hipocampo organotípicos bajo un microscopio de 2 fotóns exhibieron una constante de tiempo medio de descomposición de 2,7 ms.

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Protocol

Todos los trabajos se han llevado a cabo de conformidad con la Directiva 2010/63/UE de la UE para experimentos con animales y se han registrado en la Oficina de Protección Sanitaria y Seguridad Técnica de Berlín (G0233/14 y G0218/17).

NOTA: Las grabaciones de Q175 de tipo salvaje (WT) y heterocigotos (HET) se pueden realizar a cualquier edad y sexo. Aquí estudiamos machos y hembras a una edad de 51 a 76 semanas.

1. Inyección del sensor de glutamato iGluu para expresión en axones corticostriatales

  1. Utilice el tirador de pipetas (modo de un paso) para preparar pipetas de vidrio borosilicato para la inyección del virus. Después de tirar, romper la pipeta manualmente para obtener un diámetro de punta de 30-50 m. Autoclave la pipeta y los instrumentos quirúrgicos, incluyendo el taladro para abrir el cráneo.
  2. Almacenar el virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) a -80 oC en alícuotas de 10 oC. Si las inyecciones se realizan poco después de la producción de virus (dentro de 6 meses), manténgase a 5 oC. Antes de la cirugía, saque el vial y manténgalo a temperatura ambiente.
  3. Llene la pipeta de vidrio y retire las burbujas.
  4. Anestetizar al animal con una inyección intraperitoneal de una solución que contenga 87,5 mg/kg de ketamina y 12,5 mg/kg de xilazina. Inyección por vía subcutánea 0,25% de bupivacaína (8 mg/kg) para un alivio adicional del dolor. Compruebe la profundidad de la anestesia monitoreando el tono muscular y observando la ausencia de reflejos inducidos por el dolor.
  5. Afeitar la piel de la cabeza y esterilizarla con 70% de alcohol. Coloque el ratón en el marco estereotaxico.
  6. Utilice un bisturí para eliminar la piel y un taladro de alta velocidad (38.000 rpm) para hacer un agujero de 1,2 mm en el hueso por encima de la corteza motora.
  7. Monte la jeringa con la pipeta de inyección conectada en el soporte de un manipulador de precisión. Inserte la pipeta orientada verticalmente en la corteza en 4 sitios diferentes. Las coordenadas de inyección son, con respecto a bregma (en mm): anterior 1.5, lateral 1.56, 1.8, 2.04, 2.28. La profundidad con respecto a la dura mater es (en mm): 1.5–1.7.
  8. Usando el sistema de inyección, inyectar 0,3 l por sitio de la solución de virus sin diluir con una velocidad de 0,05 l/min. Después de cada inyección, deje la pipeta en su lugar durante 1 min antes de retirarla lentamente (1 mm/min).
  9. Terminar cerrando la herida quirúrgica con una sutura de nylon.
  10. Deje el ratón de 0,5 a 1 h en una almohadilla de calentamiento en una jaula limpia antes de devolverlo a su jaula original.
  11. Mantener el ratón en un ciclo de 12 h día-noche durante 6 a 8 semanas antes de la preparación de rodajas de cerebro agudo.
    NOTA: Para evitar reacciones inmunitarias que resulten en daño celular y pérdida de sinapsis, la inyección de múltiples construcciones virales debe realizarse simultáneamente o dentro de 2-3 horas después de la inyección primaria. Las coordenadas para la inyección de iGluu fueron seleccionadas de acuerdo con el atlas cerebral Paxinos y Franklin29. Corresponden a la corteza motora M1. La inmunomancha de cerebros inyectados visualizaba numerosos axones y varicosidades de axón bien aislados en el estriado ipsi- y contralateral y en los corticios contralaterales M1 y S1.

2. Busque Terminales Glutamatérgicos Expresando el Sensor de Glutamato iGluu

  1. Modo de calibración
    1. Prepare la cámara sCMOS y el software de control de la cámara con los siguientes ajustes. En la página de lectura establecida Tasa de lectura de píxeles:560 MHz (lectura más rápida), Sensibilidad/Rango dinámico: bit, Filtro de ruido espurio: Sí, Lectura de superposición: Sí. En la página Binning/ROI, seleccione Pantalla completa.
    2. Prepare un portaobjetos de vidrio que contenga una gota de 5 mg/ml de lucifer amarillo (LY) debajo de un resbalón de la cubierta.
    3. Coloque la diapositiva LY debajo de un objetivo de 63x, abra el obturador láser y realice una adquisición en serie utilizando los siguientes ajustes: Pixel Binning: 1x1, Modo de disparo: Interno, Tiempo de exposición: Mínimo (por determinar).
    4. Ajustar la potencia del láser para producir un punto de fluorescencia de 4 m de diámetro (la imagen no debe contener píxeles saturados).
    5. Para realizar una calibración del sistema de posicionamiento láser, seleccione los siguientes ajustes en el software de posicionamiento láser: Diámetro del tamaño de punto:10, Velocidad de escaneo:43.200 kHz. Haga clic en el botón Iniciar adquisición de imagen en el panel derecho. Establecer ejecuciones: 0, Retardo de ejecución: 0, y seleccione la opción Ejecutar en TTL en la página Secuencia. Haga clic en el botón Calibrar de la página Calibración y calibre el software de control láser de acuerdo con las instrucciones que se muestran en la esquina superior izquierda de la pantalla de adquisición.
    6. Si la configuración utiliza software independiente para el control de la cámara y el láser, adquiera capturas de pantalla de la ventana de adquisición de la cámara y envíelas al software de control láser para un nuevo cálculo de las coordenadas XY. Si el software está instalado en diferentes ordenadores, utilice un captador de vídeo para importar la imagen en el software de control láser. El software de control láser necesitará la información sobre los factores de escala XY y los desplazamientos. Para ello, determine las coordenadas de las esquinas superior izquierda, inferior izquierda e inferior derecha de la imagen dentro de la ventana de adquisición del programa de control láser. Calcule los factores de escala de acuerdo con las siguientes ecuaciones: Factor X (X inferior-derecha – X abajo-izquierda)/2048, Desplazamiento X - X inferior-izquierda, Factor Y (Y arriba-izquierda – Y abajo-izquierda)/2048, Y offset > Y abajo-izquierda.
    7. Al final del procedimiento de calibración, cree una región rectangular de interés (ROI) de 267x460 píxeles, muévala al centro de la pantalla y haga clic en el botón Iniciar secuencia.
    8. Vuelva a los siguientes ajustes del software de control de la cámara: Binning:2x2, Modo de disparo: Exposición externa, Tiempo de exposición: Mínimo (por determinar).
  2. Modo de corrección de autofluorescencia
    NOTA: El nivel de reposo de [Glu] en el entorno de terminales sinápticos activos suele estar por debajo de 100 nM14,30,31,32,33,34. En consecuencia, cualquier sensor de glutamato, especialmente un sensor de baja afinidad como iGluu será bastante tenue en ausencia de liberación de glutamato sináptico. Sin embargo, algunas fluorescencias iGluu incluso se pueden detectar en reposo, pero deben distinguirse de la autofluorescencia tisular. La iluminación de 473 nm provoca fluorescencia y autofluorescencia de iGluu (Figura 1A–C). Este último ocupa una amplia gama de longitudes de onda, mientras que la fluorescencia iGluu está limitada a 480–580 nm (con un máximo de 510 nm). La corrección de la autofluorescencia se basa en la adquisición de dos imágenes con diferentes filtros de paso alto.
    1. Preparar las rebanadas de cerebro por adelantado como se describe en otros lugares35. Mantenga las rodajas de salvado listas.
    2. Transfiera las rodajas a la cámara de registro, sumergiéndolas en cerebrospinalfluid artificial oxigenado (ACSF) que contiene 125 mM de NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM de glucosa (pH 7,3, 303 mOsm/L), complementado con 0,5 mM de piruvato sódico, 2,8 mM de ascorbato sódico y 0,005 mM de glutatión. Utilice un caudal de 1–2 ml/min. Mantenga la temperatura del baño a 28–30 oC.
    3. Localice el estriado dorsal bajo un objetivo de inmersión en agua 20x. Fije las rodajas con una rejilla de nylon en un arpa de platino para minimizar el movimiento del tejido. Cambie al objetivo de inmersión en agua 63x /NA 1.0. Seleccione filtros que reflejen la luz a 473 nm (espejo dicroico) y luz que pasa con longitudes de onda >510 nm (filtro de emisión).
    4. Sincronice la iluminación, la estimulación y la adquisición de imágenes utilizando una placa AD/DA con el software de control respectivo. Configure el programa de disparo para controlar la adquisición con un tiempo de exposición láser de 180 ms y un tiempo de adquisición de imagen de 160 ms. Utilice el dispositivo de posicionamiento láser para enviar el rayo láser a un número predeterminado de puntos y definir los ajustes para velocidad de escaneo y tamaño de punto.
    5. Adquiere una imagen de estructuras autofluorescencia e iGluu-positivas usando un filtro de paso alto a 510 nm ("imagen amarilla").
    6. Adquiera una imagen con autofluorescencia sola usando un filtro de paso alto a 600 nm ("imagen roja").
    7. Escala las imágenes rojas y amarillas, utilizando las intensidades medias de los 10 píxeles más brillantes y los 10 píxeles más oscuros para definir el rango. Realice una resta "amarillo menos la imagen roja" y redimensione la imagen restado para generar un archivo tif estándar de 8 bits para una visualización conveniente del bouton de interés (Figura 1D). Contiene los píxeles brillantesude las estructuras iGlu u-positivas, píxeles grises del fondo y píxeles oscuros de estructuras con autofluorescencia.
      NOTA: Con el equipo dado, la fluorescencia media en reposo (F) será inferior a 700 U.U.
  3. Modo de búsqueda Bouton
    NOTA: los píxeles iGluu-positivos pueden pertenecer a elementos funcionalmente diferentes del árbol axonal, como ramas de axón de diferente orden, sitios de bifurcación, varicosidades después del agotamiento de la vesícula o varicosidades totalmente activas. Sin embargo, es casi imposible identificar terminales sinápticos funcionales sólo por inspección visual. Por lo tanto, cada terminal sináptico glutamatérgico necesita identificación por su capacidad de respuesta a la despolarización eléctrica. Los sitios que no responden a la estimulación tienen que ser desechados. El medio fisiológico para inducir la liberación de glutamato de los axones corticostriatales es provocar un potencial de acción. Esto se puede lograr mediante el uso de un canal de rodonina de características espectrales adecuadas o mediante la estimulación eléctrica de un axón visualizado por iGluu sí mismo. Para evitar la activación accidental de opsin, preferimos el último apropaso
    1. Utilice el tirador de micropipetas (en modo de cuatro pasos) para producir pipetas de estimulación a partir de capilares de vidrio borosilicato. El diámetro de la punta interna debe ser de aproximadamente 1 m. Cuando se llena con ACSF, la resistencia del electrodo debe ser de unos 10 M.
    2. Para inducir la liberación de glutamato potencial de acción a partir de un conjunto de boutones sinápticos unidos al mismo axón, utilice el aumento 63x, el filtro de emisión de 510 nm y la imagen restada para colocar un electrodo de estimulación de vidrio junto a una varicosidad fluorescente . Evite la proximidad de axónes adicionales.
    3. Encienda el estimulador para entregar pulsos de corriente despolarizantes a la pipeta de estimulación. Utilice intensidades de corriente alrededor de 2 oA (no más de 10 oA).
    4. Encienda el sistema de aplicación de baño multicanal donde un canal ofrece la solución de baño estándar y los otros canales ofrecen los bloqueadores necesarios de canales iónicos, transportadores o receptores de membrana. Controle el flujo en el lugar de grabación y luego cambie al canal de tetrodotoxina (TTX) (solución de baño más 1 M TTX). Después de 2-3 min, estimular el bouton de interés de nuevo, pero ahora en ausencia de acción generación potencial. La liberación se debe directamente a la afluencia de calcio a través de canales de calcio dependientes del voltaje.
    5. Al girar la tecla de intensidad en el estimulador, ajustar la corriente de estimulación para obtener respuestas similares a las obtenidas a través de potenciales de acción. Típicamente, la corriente de estimulación sería alrededor de 6 A para una despolarización de 0,5 ms.
    6. Para las pruebas básicas de la preparación, aplicar 0,5 mM CdCl2. La presencia de esta liberación de glutamato del bloqueador de los canales de calcio previene completamente la liberación de glutamato sináptico validando así la dependencia del calcio de la señal de glutamato evocada directamente.
      NOTA: La siguiente recomendación general puede ayudar a aumentar la tasa de éxito de los experimentos de sinapsis única en el estriado. Para seleccionar terminales sinápticos glutamatérgicos con maquinaria de liberación intacta, una varicosidad debe: (i) Tener una forma suave similar al husillo; (ii) No estar asociado con una bifurcación de axón; (iii) Ser más brillante que otras estructuras en la "imagen amarilla"; (iv) Residir en el neuropil estriado en lugar de en las vías de fibra; (v) Residir en una rama de axón muy delgada; (vi) No residir dentro de las partes más profundas de la rebanada.

3. Visualización de la liberación y eliminación de glutamato

  1. Modo de grabación
    NOTA: Después de la resta de la autofluorescencia (paso 2.2) y algunas pruebas iniciales para la capacidad de respuesta del bouton de interés (Paso 2.3), la adquisición de datos puede comenzar. Las respuestas a la activación eléctrica de la liberación de glutamato desde terminales de axón individuales se pueden observar directamente en la imagen(Figura 2), sin aplicar más herramientas de análisis. Sin embargo, resultó ser muy conveniente extraer inmediatamente algunos indicadores básicos del rendimiento de la sinapsis(Figura 3). Esta información es necesaria para tomar decisiones sobre el curso posterior del experimento, como la selección de determinados tipos de terminales, la evaluación rápida de las alteraciones relacionadas con la EH, el número y la frecuencia de los ensayos o fármacos que se aplicarán con el sistema de superfusión. También podría ser necesario lidiar con artefactos que aparezcan con el tiempo. En primer lugar, se describe n.o de la configuración estándar para la grabación de datos.
    1. Usando las unidades XY del microscopio, coloque el bouton iGluu-positivo probado cerca del centro del campo de visión. Detenga la adquisición de la imagen con el botón Anular adquisición. En la última imagen adquirida, determine la posición XY del centro del bouton en reposo haciendo clic en él con el botón izquierdo del ratón. Las coordenadas XY del cursor establecido se mostrarán en el panel de estado inferior de la ventana de adquisición.
    2. Utilizando los datos de calibración (paso 2.1.6), calcule las coordenadas del sitio donde se debe enviar el rayo láser para la excitación de la fluorescencia iGluu. Utilice las siguientes ecuaciones: Láser X - Cámara X * Factor X + Desplazamiento X, Y láser - Desplazamiento Y – Cámara Y * Factor Y. Al realizar este nuevo cálculo, preste atención a los ajustes de volteo vertical u horizontal de la cámara.
    3. Cree una secuencia de un punto en el software de control láser utilizando las coordenadas calculadas. Para ello, seleccione Punto en el cuadro Agregar a secuencia de la página Secuencia del software de control láser. Seleccione 10 s para que el retardo se active el inicio y 180 ms para el tiempo de pulso láser. Mueva el ratón a las coordenadas calculadas y haga clic en el botón izquierdo.
    4. Seleccione los siguientes ajustes en el software de control láser: Runs: 0, Run delay: 0, Sequence: Run at TTL. A continuación, haga clic en Iniciar secuencia.
    5. En el software de control de la cámara, seleccione los siguientes ajustes: En la página Binning/ROI, establezca El áreade imagen : Personalizado, Pixel Binning: 2x2, Altura: 20, Ancho: 20, Izquierda:Coordenada X del iGluenreposo -punto positivo menos 10 px, Inferior: Coordenada Y del iGluu-positivo de reposo menos 10 px, Modo adquisición: Serie cinética, Longitud de la serie cinética:400, Tiempo de exposición: 0.0003744s (valor mínimo). Con estos ajustes, la tasa de adquisición será de 2,48 kHz.
    6. Seleccione Modo de disparo: Externo. Haga clic en Tomar señal en el software de control de la cámara. Inicie el protocolo experimental establecido para el dispositivo de disparo.
    7. Implementar el protocolo experimental Trial con la siguiente línea de tiempo: 0 ms – start trial, 1 ms – start laser illumination, 20 ms – iniciar la adquisición de imágenes con cámara, 70 ms – iniciar la estimulación eléctrica 1, 120 – iniciar la estimulación eléctrica 2, 181 ms – prueba final (láser y cámara apagada). Así, durante una prueba la cámara adquiere 400 fotogramas con una frecuencia de 2,48 kHz. Consulte los pasos 2.3.3 y 2.3.5. para obtener detalles sobre la estimulación eléctrica.
    8. Para permitir una recuperación suficiente de las piscinas de vesículas presinápticas, aplique el protocolo Trial con una frecuencia de repetición de 0,1 Hz o inferior.
  2. Construcción fuera de línea del glutamato de liberación y aclaramiento del glutamato para la identificación de sinapsis patológicas
    1. Active las rutinas de evaluación. Aquí, utilizamos un software escrito internamente SynBout v. 3.2. (autor: Anton Dvorzhak). Los siguientes pasos son necesarios para construir un transitorio de F/F a partir de los píxeles con fluorescencia elevada de iGluu como en el vídeo de la Figura 2.
    2. Para determinar el tamaño del bouton, calcule la media y la desviación estándar (SD) de la intensidad de fluorescencia del ROI en reposo (F), antes de la aparición de la estimulación. Determinar y encasillar el área ocupada por píxeles con F>media + 3 SD(Figura 3A). Determinar un diámetro virtual (en m) asumiendo una forma circular del área supraumbral.
    3. Determinar la diferencia de F como la diferencia entre el valor de intensidad máxima y F. Trazar la corriente estimulante y f/F contra el tiempo(Figura 3B). Calcule el SD de F/F en reposo (antes del inicio de la estimulación) y la "amplitud de pico". Utilice píxeles con amplitud de pico superior a 3 SD de F/F para realizar el empalme monoexponencial para la descomposición desde el pico. Determinar la constante de tiempo de descomposición TauD de F/F.
    4. Para estimar la "amplitud máxima" en una sinapsis determinada, seleccione el píxel con el valor más alto de F/F. Por lo general se encuentra dentro o al lado de los límites de la fluorescencia de bouton iGluu en reposo. La "amplitud máxima" sería el mejor indicador de la carga de glutamato presentada a la maquinaria de despeje de una sola sinapsis.
    5. Para estimar la extensión espacial de la señal iGluu, determine el diámetro del área de todos los píxeles de umbral supra combinados para formar un círculo virtual. El diámetro respectivo se llama "Spread". El término "Spread de pico" se refiere entonces al valor máximo del transitorio de propagación promediado(Figura 3C, diferencia entre las líneas rojas punteadas).
  3. Correcciones de posibles artefactos
    NOTA: La despolarización eléctrica se asocia con un flujo externo de la solución intrapipeta. Esto puede resultar en un pequeño desplazamiento de tejido. Para discriminar entre los cambios inducidos por la estimulación de iGluu y los cambios fuera de foco de la imagen, se podría utilizar el siguiente enfoque para identificar y eliminar artefactos de desplazamiento(Figura 4).
    1. Analizar las características espaciales de los píxeles supraumbrales derivados de un ROI con signos de desplazamiento(Figura 4F–H).
    2. Busque píxeles fuera de los límites inicialmente determinados del bouton en reposo(Figura 4F–H,encajonado en rojo).
    3. Identifique los valores de intensidad de píxeles negativos existentes(Figura 4I, J). Cualquier F/F en la dirección negativa con una amplitud mayor que la media de preestimulación - 3 SD debe considerarse como artefacto, y el registro debe ser descartado.
    4. Para evitar artefactos fuera de foco, coloque el electrodo de estimulación en el lado antero-lateral del bouton sináptico, utilice estimulación eléctrica bifásica y minimice la intensidad/duración de la estimulación.
      NOTA: Los artefactos fuera de foco también se pueden derivar de la cámara. Si este último no se fija de forma óptima al microscopio puede producir oscilaciones, probablemente debido a pequeñas vibraciones del sistema de refrigeración de la cámara. Estas vibraciones crean un patrón "yin y yang" en las imágenes de F/F que giran con una frecuencia de 50 Hz. Las vibraciones se pueden restar matemáticamente de la señal de fluorescencia, pero la calidad final de las mediciones dependería críticamente del tiempo de grabación.
    5. Fije la cámara al microscopio de tal forma que las vibraciones estén ausentes. Si este último permanece, coloque una junta de goma entre la cámara y el adaptador del microscopio.
      NOTA: No se puede descuidar la posibilidad de que el neuropil estriado alrededor de la sinapsis de interés contenga varicosidades glutamatérgicas que no expresan iGluu y por lo tanto permanecen invisibles. En el caso de su coactivación (más probable en ausencia de TTX) los transitorios obtenidos de los boutons de interés podrían verse afectados por el derrame. Lo mismo se aplica a los terminales iGluu-expressing que estaban fuera de foco. Un fenómeno característico sería en este caso que los transitorios de fluorescencia se originan en un área mucho más amplia. Como esta respuesta es eliminada por TTX, se puede interpretar como una respuesta inespecífica inducida por la activación multifibra injustificada.
    6. Para corregir esta respuesta multifibra inespecífica, siga el procedimiento descrito en la Figura 5. Utilice la señal de fluorescencia de píxeles en los límites del campo de visión. Para minimizar la respuesta de fondo, minimice la intensidad y duración de la estimulación o utilice TTX.

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Representative Results

Identificación de dos tipos de varicosidades glutamatérgicas corticostriatales
Los aferents de TI y PT se originan en la capa 2/3 y 5, respectivamente, y presentan patrones diferenciales de ramificación y terminación en el estriado ipsilateral y contralateral (solo terminales de TI). Todavía poco se sabe sobre las propiedades de liberación de glutamato y aclaramiento en condiciones de activación repetitiva como se observó durante el inicio de los movimientos, pero está bien documentado que las vaidades liberadoras de glutamato respectivas difieren en tamaño22. Aplicando un criterio de tamaño, se encontró que los terminales IT y PT exhiben formas contrastantes de plasticidad a corto plazo24. A intervalos de estímulo de 50 ms, los terminales de TI más pequeños eran propensos a la depresión de pulso sin emparejar (PPD), mientras que los terminales PT más grandes mostraban facilitación de pulsos emparejadas. Esta diferencia también se observó a intervalos más cortos (20 ms) y a lo largo de una serie de 6 pulsos. La Figura 3 y la Figura 6 ilustran estos experimentos en los que la liberación de glutamato sináptico se provocó a través del mecanismo de potencial de acción a la concentración fisiológica Ca2+/Mg2+.

Identificación de sinapsis disfuncionales en ratones con enfermedad avanzada de Huntington
Las enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, el Parkinson y la enfermedad de Huntington se caracterizan por una pérdida cada vez mayor de las sinapsis glutamatérgicas36. Las nuevas terapias tienen como objetivo impedir o incluso revertir esta progresión fatal. Lo que desencadena exactamente la desaparición de una sinapsis, y cuándo, es en gran parte desconocido. Se puede esperar más información de estudios que ofrecen criterios para (a) la identificación vital de una clase particular de sinapsis glutamatérgicas y (b) la detección de contactos disfuncionales frente a los contactos que realizan normalmente. Aquí se mostrará cómo se utilizaron los valores TauD obtenidos del tipo PT de terminales para estimar la fracción de sinapsis disfuncionales en heterocigotos Q175 con un fenotipo motor identificado.

Antes de los experimentos de imágenes de una sola sinapsis, los ratones fueron sometidos a una prueba rápida pero bastante robusta para detectar alteraciones en sus comportamientos exploratorios. Esta prueba se denomina "prueba de paso a paso". El animal fue colocado en el centro de una placa Petri (de 185 mm de diámetro y 28 mm de altura de pared). La prueba fue grabada con una cámara de video. Usando el análisis fuera de línea, uno puede determinar el tiempo entre el despegue de la mano del experimentador y el momento en que el animal tiene todos los 4 pies fuera del plato. Trazar los datos de más de 100 WT y Q175 HET a edades entre 12 y 18 meses sugiere que los ratones con una latencia de paso a paso de >300 s pueden ser diagnosticados como hipocinéticos. La figura 7A ilustra una correlación positiva significativa entre los resultados obtenidos para la ejecución de ruta total en el campo abierto y la latencia de paso a paso.

Las imágenes de una sola sinapsis iGluu mostraron que estos ratones con EH sintomática mostraron un déficit en la velocidad de la descomposición del glutamato yuxtapsináptica, tal como se refleja en los valores de TauD de estímulos individuales (o primero en una secuencia)(Figura 7B,C). En WT, dicha prolongación sólo se observó después de la aplicación de un inhibidor selectivo no transportable de la captación de glutamato — DL-threo--ácido benzyloxiaspártico (TBOA, Figura 7D,E). Esto sugiere un papel de los transportadores de glutamato astrocítico en la regulación del aclaramiento del glutamato sináptico. No se han encontrado cambios en la difusión de Glu en el espacio perisyáptico24. Pero, por supuesto, se necesita mucho más trabajo para identificar realmente la causa de la disminución del aclaramiento del glutamato en la EH, así como en otras formas de parkinsonismo. Aparte de los cambios en la proximidad astrocito9 y la reducción de la expresión slc1A2 37, uno también puede considerar la inestabilidad relacionada con la enfermedad de EAAT2 en la membrana plasmática de los procesos de astrocitos perisinápticos (PAP). Esto podría ser el resultado de cambios en el interactome EAAT2. De hecho, los experimentos recientes de espectroscopia de masas en el laboratorio apuntan a una pérdida de interacción con EAAT2-distrofina en astrocitos estriados (Hirschberg, Dvorzhak, Kirchner, Mertins y Grantyn, inéditos).

Se sabe muy poco con respecto a la cronología de la disfunción sináptica con la progresión de la EH, pero es muy probable que las sinapsis sanas coexistan con las ya deterioradas. Al buscar un criterio de clasificación, examinamos los datos TauD de diferentes ratones. Para ello, la amplitud y los valores TauD de 3 ensayos emparejados consecutivos se normalizaron hasta la primera respuesta (véase la figura 6F para un esquema experimental), y la probabilidad de aparición de un valor TauD determinado se comparó en WT coincidente con la edad frente a Q175 HET(figura 6G). Se encontró que en WT TauD nunca superó los 15 ms, mientras que en el sintomático Q175 HET, el 40% de las sinapsis exhibieron valores de TauD entre 16 y 58 ms, a pesar de la tendencia a una reducción en la cantidad de glutamato liberado(Figura 6H,I). TauD podría entonces ser considerado como un biomarcador para las sinapsis disfuncionales en la EH y además ser utilizado para verificar la recuperación funcional en experimentos dirigidos al transporte astrocítico de glutamato.

Figure 1
Figura 1: Identificaciónude varicosidades iGlu u-positivas. (A) Imagen de fluorescencia obtenida con un filtro de paso alto de 510 nm ("imagen amarilla"). (B) Mismo campo de vista adquirido con un filtro de paso alto de 600 nm ("imagen roja"). Tenga en cuenta que el punto marcado con punta de flecha negra ha desaparecido en (B). Superposición de (A) y (B). Flecha blanca: autofluorescencia, flecha negra, iGluu-varicosidad positiva. (D) Imagen obtenida por resta de (B) de (A). Las manchas autofluorescentes son oscuras y la mancha iGluu+ es brillante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Película todavía de un vídeo a cámara lenta (factor de ralentización 1240x). Fila superior: Imágenes de WT (izquierda), Q175 HET (centro) y HOM (derecha). Fila inferior: Respetuosos con los transitorios iGluu del píxel con la elevación de glutamato más alta (Máximo de F/F). El cursor rojo indica el punto en el transitorio correspondiente a la imagen sobre el seguimiento. Tenga en cuenta la elevación prolongada de la fluorescencia de iGluu (píxeles rojos y transitorios de F/F). Modificado y reimpreso con permiso de Dvorzhak et al.24Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Extracción de indicadores funcionales de imágenes de sinapsis única del sensor Glu ultrarrápido codificado genéticamente iGluu en neuronas corticostriatales. (A, D) Ejemplo de un PT (A) y UN bouton IT (D) con la fluorescencia respectiva de iGluu en reposo (izquierda) y en el pico de una respuesta iGluu mediada por AP (derecha). (B, C, E, F) respuestas iGluu registradas desde el bouton mostrado en (A, D); Experimente en 2 mM Ca2+ y 1 mM Mg2+. (B) Registro simultáneo de la corriente de estimulación (traza superior) y la intensidad media de los píxeles de umbral supra (traza inferior). La misma escala de tiempo para todos los seguimientos. Amplitudes pico (entre líneas horizontales rojas punteadas) y una función monoexponencial ajustada a la descomposición desde este pico (superposición roja). Los valores correspondientes de TauD (o) se muestran junto a las curvas de ajuste. (E, F) Parcela de propagación contra el tiempo. Spread de pico: diferencia entre líneas horizontales rojas punteadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Características de un iGluu transitorio inducido por glutamato (A–E) en comparación con un artefacto de desplazamiento (F-J). (A, B) y (F, G) muestran la intensidad absoluta de fluorescencia en reposo (A, F) y después de la estimulación (B, G) en unidades arbitrarias (au). (C, H) Cambio de fluorescencia en el porcentaje de la fluorescencia en reposo antes de la estimulación (F/F%). (D, I) Superposición de los transitorios iGluu de todos los píxeles en unidades arbitrarias. (E, J) Superposición de los transitorios iGluu de todos los píxeles en % F/F. En el caso de la liberación de glutamato sináptico, los píxeles junto al terminal de reposo presentan un aumento de fluorescencia después de la estimulación, mientras que en el caso de los desplazamientos desenfocados el píxel más brillante en reposo simplemente cambia su posición en el ROI, sin un aumento acompañante en la intensidad de fluorescencia excesivamente total del campo de visión. Un artefacto de desplazamiento también puede ser reconocido por la aparición de señales negativas de F/F (J). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Corrección de la respuesta iGluu no específica. (A–D) Ejemplo de respuesta sináptica emparejada contaminada por una respuesta de fondo inespecífica. (E–H) Lo mismo después de la corrección. (A, E) Antes de la estimulación. (B, F) Durante la estimulación. (C, G) Después de la estimulación. (D, H) Los transitorios de intensidad superpuestos correspondientes (en F/F) de todos los píxeles del ROI. El punto de tiempo de adquisición de las imágenes está marcado con letras pequeñas correspondientes sobre las puntas de flecha. Tenga en cuenta que en el panel C la respuesta de fondo es muy extendida y lentamente en descomposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Diferencias de tamaño y tamaño diferencias distintas en la relación de pulsos emparejados de amplitud (PPR) del transitorio iGluu. (A) Esquema simplificado del circuito corticostriatal22,ilustrando el concepto de proyección preferencial de neuronas del tracto piramidal (PT) a las neuronas de proyección estriada indirecta de vía (iSPN) y las neuronas intratefalicas (IT) para dirigir los SPN de vía (DSPN), con diferencias de tamaño entre los terminales DE TI y PT. (B) Distribución bimodal de los diámetros de los bouton según lo determinado por la fluorescencia de reposo supraumbral antes de la estimulación. Los boutons con un diámetro de 0,63 m se definieron como "grandes" y se supone que son emitidos por axons PT. Para obtener imágenes originales y trazas de muestras de PT y tipo de TI de sinapsis, consulte la Figura 3. (C) Se observa una correlación positiva significativa entre el PPR de las amplitudes pico y los diámetros de bouton. Cada punto de datos representa el promedio de los primeros 3 ensayos de cada bouton. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Identificación de sinapsis disfuncionales en ratones Q175 con un fenotipo hipocinético. (A) Resultados de las pruebas motoras del día de la imagen de una sola sinapsis. Las latencias paso a paso >300 ms se consideraron patológicas. A la edad probada (promedio de 16 meses), 17/54 HET exhibió un fenotipo pronunciado en la prueba de paso a paso. Con respecto a la hipocinesia, la prueba de paso a paso parece ser más sensible que la prueba de campo abierto. Sin embargo, hubo una correlación significativa entre el resultado de la prueba de paso a paso (tiempo entre la colocación y la barrera cruzada con los cuatro pies) y la prueba de campo abierto (es decir, la ruta total de acceso en 5 min). Y - -0.01511X + 458,7; P a 0,0044 (regresión simple). (B) Promedio evocó un solo sinapsis iGluu transitorios normalizados a la misma amplitud de pico para ilustrar las diferencias relacionadas con la EH en el aclaramiento de glutamato liberado sinaptically. Las curvas de ajuste respectivas resaltan las diferencias en la duración de los transitorios de glutamato. (C) Cuantificación de los resultados de tipo salvaje (gris), HET (rojo) y HOM (magenta). (D, E) La incubación de rodajas de WT en 100 nM de TFB-TBOA simuló la depresión del aclaramiento de glutamato observada en HOM. (F) Esquema de activación de sinapsis y organización de datos. (G) Histogramas acumulados de #1 valores TauD. (H, I) Gráficas de respuestas de #2 normalizadas. Datos de 31 WT y 30 sinapsis HET (todas de tipo PT). En la muestra WT todos los valores de TauDmax fueron de 15 ms. En la muestra HET, el 40% de las sinapsis exhibieron valores De TauDmax que superaban el umbral de 15 ms definido por el TauDmax más largo en WT. Estos gráficos enfatizan las diferencias relacionadas con la HD en los rangos de amplitud máxima (es decir, el valor del píxel con el aumento más alto de la fluorescencia de iGluu) y TauDmax (el TauD del píxel con la elevación más alta). Los valores de TauDmax que se encuentran exclusivamente en HET se muestran en rojo, y los valores de amplitud que se ven exclusivamente en WT se muestran en gris. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Las pruebas estadísticas utilizadas se indican junto al gráfico respectivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los experimentos se refieren a una cuestión de interés general: la independencia de la sinapsis y su posible pérdida en el curso de la neurodegeneración, y describimos un nuevo enfoque para identificar las sinapsis afectadas en rebanadas cerebrales agudas de ratones envejecidos (>1 año). Aprovechando las características cinéticas mejoradas del sensor de glutamato recientemente introducido iGluu los experimentos iluminan la relación entre la liberación y la absorción del glutamato sináptico de una manera que no ha sido posible antes.

La influencia del aclaramiento de glutamato en la función y el mantenimiento de las sinapsis no está muy bien aclarada, aunque la hipótesis de que la excitotoxicidad inducida por glutamato puede causar pérdida de neuronas y poda de sinapsis se menciona en casi cualquier revisión pertinente sobre epilepsia, accidente cerebrovascular y enfermedades neurodegenerativas38,39,40,41. Sin embargo, las pruebas disponibles son más limitadas de lo posible previsto por la literatura. La confusión se añade además por el hecho de que las herramientas experimentales seleccionadas podrían ser insuficientes en vista de los problemas asociados con la baja resolución espacial y temporal al interpretar los resultados obtenidos con las técnicas brutas de estimulación y registro42,43. Esto puede llevar a falsos negativos que desalientan más investigaciones, que es más que desafortunada en vista de trastornos neurológicos tan graves como la enfermedad de Huntington. El enfoque actual garantiza una mejor discriminación de la señal y, por lo tanto, un mayor apoyo a la idea de que en la EH una fracción significativa de las sinapsis corticostriatales presenta signos de deterioro del aclaramiento del glutamato.

Los resultados actuales revelaron diferencias de plasticidad a corto plazo dentro de la vía corticostriatal. Aunque este último había estado en el foco de numerosos estudios17,44, no se ha anticipado que los afferents procedentes de las capas corticales superiores exhibirían depresión dependiente de la frecuencia, en contraste con los afferents del tracto piramidal originarios de la capa 5. Este último mostró preferentemente una potenciación de la liberación dependiente de la frecuencia y, por lo tanto, puede tener un mayor riesgo de insuficiencia de absorción de glutamato.

Los experimentos en rebanadas cerebrales agudas de ratones adultos son importantes para dilucidar alteraciones sinápticas a una edad de vida adecuada. La edad y el estado funcional de la preparación son particularmente relevantes si los astrocitos participaron en el mecanismo de interés. Aquí, es esencial que los astrocitos sean lo suficientemente maduros como para exhibir niveles adultos de actividad transportadora de glutamato y homeostasis de cloruro relacionada45.

Los ensayos de una sola sinapsis allanarán el camino hacia una mejor comprensión de los cambios relacionados con la EH de la transmisión sináptica glutamatérgica en el cerebro intacto46. Se ha demostrado que la resolución de una sola sinapsis también se puede lograr en el cerebro intacto, siempre que las sinapsis de interés se localicen en las capas superficiales de la corteza cerebral47.

Por último, el enfoque experimental actual tiene el atractivo de que puede ser utilizado por muchos seguidores, ya que el equipo requerido todavía está en el lado de bajo costo.

En resumen, las señales de fluorescencia que informan de la liberación de glutamato y los cambios yuxtanapticos en la concentración de glutamato en el cerebro intacto pueden proporcionar datos inalcanzables con cualquier método electrofisiológico. Pero como con cualquier método nuevo, este enfoque tiene sus limitaciones y desventajas que en parte se han abordado en los pasos 2.2 y 3.3. La fluorescencia de bajo descanso del sensor iGluu de alta afinidad rápida y alta requiere un poco de ejercicio/experiencia para identificar varicosidades adecuadas para pruebas adicionales. Con la co-expresión de un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) como XCaMP-R48 y al menos dos sistemas de iluminación láser coordinados, la búsqueda de terminales de axón funcionales sería mucho más fácil. En cualquier caso, es fundamental exponer la preparación lo menos posible a la luz emocionante antes y durante la grabación de iGluu.

El uso de un láser de 473 nm (en lugar de la eliminación regular de todo el campo) para provocar fluorescencia de iGluu es un requisito previo para obtener una emisión suficiente, pero también causará blanqueo. En las condiciones dadas, iGluu fue completamente blanqueado después de 10 ensayos de estimulación/adquisición (10 pares de estímulo en un intervalo inter-estímulo de 50 ms y una tasa de repetición de 1/10 s). El tiempo máximo de iluminación total para la adquisición de datos en estado estacionario con el sistema láser de 1 fotones actualmente utilizado y el ajuste descrito fue de aproximadamente 2 s. El blanqueo de iGluu es exponencial, siendo muy fuerte durante los primeros 20 ms después del inicio de la iluminación y mucho más lento a partir de entonces. Por lo tanto, es aconsejable evitar la adquisición de la señal durante los primeros 20 ms de cada ensayo y adquirir no más de un total de 10 pares de respuesta. Las respuestas a estímulos individuales se podían registrar con tiempos de exposición de 60-80 ms en lugar de los 180 ms utilizados actualmente.

Otro problema crítico es el nivel de expresión de iGluu. En el estudio pionero de Helassa et al.27, las construcciones virales se aplicaron por electroporación a las neuronas cultivadas27, que produce niveles de expresión más altos del sensor y presumiblemente también menos blanqueo, especialmente si se puede utilizar un dispositivo de escaneo láser de dos fotones en lugar de un microscopio de un fotón. 49 reportan la adquisición rutinaria de expresión postsináptica de iGluu en neuronas piramidales CA1 en ensayos de 100 euros (cada uno expuesto por sólo 80 ms). Sin embargo, el tejido cerebral cultivado no es una opción cuando los experimentos tienen como objetivo aclarar las funciones sinápticas dependientes de los astrocitos en el cerebro envejecido. Una expresión dependiente de CaMKII-Cre de iGluu usando un promotor más fuerte puede proporcionar preparaciones con una expresión más fuerte en menos células, aumentando así la resolución del método y permitiendo la adquisición de más ensayos por sinapsis.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por CHDI (A-12467), la Fundación Alemana de Investigación (Exc 257/1 y DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) y los Fondos de Investigación Intramuros de la Charité. Agradecemos a K. Társk, St. George's, Universidad de Londres, y N. Helassa, Universidad de Liverpool, por el plásmido iGluu y muchas discusiones útiles. D. Betances y A. Sch-nherr proporcionaron una excelente asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI

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Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single… More

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).

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