Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Enda synaps indikatorer på glutamat release och upptag i akut hjärnskivor från normala och Huntington Möss

Published: March 11, 2020 doi: 10.3791/60113

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att utvärdera balansen mellan glutamat release och clearance vid enstaka korticostriatal glutamatergic synapser i akuta skivor från vuxna möss. Detta protokoll använder fluorescerande sensor iGluu för glutamat upptäckt, en sCMOS-kamera för signalförvärv och en enhet för fokal laserbelysning.

Abstract

Synapser är mycket uppdelade funktionella enheter som fungerar oberoende av varandra. Vid Huntingtons sjukdom (HS) och andra neurodegenerativa sjukdomar kan detta oberoende äventyras på grund av otillräcklig glutamat clearance och de resulterande spridnings- och utspillningseffekterna. Förändrad astrocytisk täckning av presynaptiska terminaler och/eller dendritiska ryggar samt en minskad storlek på glutamat transportör kluster på glutamat release platser har varit inblandad i patogenesen vid sjukdomar som resulterar i symtom på dys-/hyperkinesi. Men de mekanismer som leder till dysfunktion av glutamaterga synapser i HS är inte väl förstådda. Förbättra och tillämpa synapse imaging vi har fått data sprider nytt ljus över de mekanismer som hindrar inledandet av rörelser. Här beskriver vi de viktigaste inslagen i en relativt billig metod för att uppnå en enda synaps upplösning genom att använda den nya genetiskt kodade ultrasnabba glutamat sensor iGluu, wide-field optik, en vetenskaplig CMOS (sCMOS) kamera, en 473 nm laser och en laser positioneringssystem för att utvärdera tillståndet för korticostriatal synapser i akuta skivor från ålder lämpliga friska eller sjuka möss. Glutamat transienter konstruerades från enstaka eller flera pixlar för att få uppskattningar av i) glutamat release baserat på den maximala höjden av glutamat koncentrationen [Glu] bredvid den aktiva zonen och ii) glutamat upptag som återspeglas i tidkonstanten av förfall (TauD) av perisynaptic [Glu]. Skillnader i vilande bouton storlek och kontrasterande mönster av kortsiktiga plasticitet fungerat som kriterier för identifiering av korticostriatal terminaler som tillhör intratelencephalic (IT) eller pyramidala tarmkanalen (PT) väg. Med hjälp av dessa metoder upptäckte vi att i symptomatiska HS möss ~ 40% av PT-typ korticostriatal synapser uppvisade otillräcklig glutamat clearance, vilket tyder på att dessa synapser kan vara i riskzonen för excitotoxic skador. Resultaten understryker taud:s användbarhet som biomarkör för dysfunktionella synapser hos Huntington-möss med en hypokinetisk fenotyp.

Introduction

Den relativa effekten av varje synaptisk terminal som tillhör en "enhetlig anslutning" (dvs. sambandet mellan 2 nervceller) bedöms vanligtvis av dess påverkan på det ursprungliga segmentet av den postsynaptiska neuron1,2. Somatiska och/eller dendritiska inspelningar från postsynaptiska nervceller representerar de vanligaste och hittills också det mest produktiva sättet att klargöra informationsbehandling under ett uppifrån och ner eller vertikalt perspektiv3,4,5. Förekomsten av astrocyter med deras diskreta och (hos gnagare) icke-överlappande territorier kan dock bidra med ett horisontellt perspektiv som bygger på lokala mekanismer för signalutbyte, integration och synkronisering vid synaptiska platser6,7,8,99,10.

Eftersom det är känt att astroglia spelar, i allmänhet, en viktig roll i patogenesen vid neurodegenerativ sjukdom11,12 och i synnerhet en roll i underhåll och plasticitet av glutamaterga synapser13,14,1515,16, är det tänkbart att förändringar i synaptisk prestanda utvecklas i enlighet med tillståndet av astrocyter i det gemensamma målområdet för afferent fibrer med olika ursprung. För att ytterligare utforska de mål-/astroglia-härledda lokala regleringsmekanismerna vid hälsa och sjukdom är det nödvändigt att utvärdera enskilda synapser. Den nuvarande metoden utarbetades för att uppskatta utbudet av funktionella glutamat release och clearance indikatorer och att definiera kriterier som kan användas för att identifiera dysfunktionella (eller återvunna) synapser i hjärnan områden som är närmast relaterade till rörelse inledande (dvs. först och främst i motor cortex och dorsala striatum).

Striatum saknar inneboende glutamatergic nervceller. Därför är det relativt lätt att identifiera glutamaterga afferents av extrastriatal ursprung. Den senare har mestadels sitt ursprung i den mediala talamus och i hjärnbarken (se17,18,19,20 för mer). Korticostriatal synapser bildas av axoner av pyramidala nervceller lokaliserade i när lager 2/3 och 5. Respektive axoner bildar bilaterala anslutningar inom telencephalic (IT) eller ensidiga anslutningar via ett fibersystem som mer caudally utgör pyramidala tarmkanalen (PT). Det har vidare föreslagits att TERMINALER av IT- och PT-typ skiljer sig åt i sina utgivningsegenskaper och storlek21,,22. Med tanke på dessa uppgifter kan man också förvänta sig vissa skillnader i hanteringen av glutamat.

Striatum är det mest drabbade hjärnområdet vid Huntingtons sjukdom (HS)5. Human Hd är en allvarlig genetiskt ärftlig neurodegenerativ sjukdom. Q175 musmodellen erbjuder en möjlighet att undersöka den cellulära grunden för den hypokinetiska styva formen av HS, ett tillstånd som har mycket gemensamt med parkinsonism. Från en ålder av ca 1 år, homozygotQ175 möss (HOM) uppvisar tecken på hypokinesi, vilket framgår av att mäta den tid som tillbringas utan rörelse i ett öppet fält23. De nuvarande experimenten med heterozygotq175 möss (HET) bekräftade de tidigare motorunderskott som observerats i HOM och visade dessutom att de observerade motorunderskotten åtföljdes av en reducerad nivå av astrocytic excitatoriska aminosyratransportören 2 protein (EAAT2) i omedelbar närhet av korticostriatal synaptiska terminaler24. Det har därför varit en hypotes om att ett underskott i astrocytic glutamat upptag kan leda till dysfunktion eller till och med förlust av respektive synapser25,26.

Här beskriver vi en ny metod som gör det möjligt för en att utvärdera enstaka synaps glutamat clearance i förhållande till mängden av den frigjorda signalsubstansen. Den nya glutamat sensor iGluu uttrycktes i korticostriatal pyramidal nervceller. Det har utvecklats av Katalin Török27 och representerar en ändring av den tidigare introducerade hög-affinitet men långsam glutamat sensor iGluSnFR28. Båda sensorerna är derivat av det förstärkta gröna fluorescerande proteinet (EGFP). För spektrala och kinetiska egenskaper, se Helassa et al.27. Kort, iGluu är en låg affinitet sensor med snabb de-aktivering kinetik och därför särskilt väl lämpad att studera glutamat clearance på glutamat-släppa synaptiska terminaler. Dissociationstidskonstanten för iGluu fastställdes i en stoppad flödesanordning, vilket gjorde en Tauav värde på 2,1 ms vid 20 °C, men 0,68 ms när extrapoleras till en temperatur på 34 °C27. Single Schaffer säkerheter terminaler sonderade vid 34 °C med spiral laser scanning i CA1 regionen organotypic hippocampus kulturer under en 2-fotonmikroskop uppvisade en genomsnittlig tid konstant av förfall på 2,7 ms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Allt arbete har utförts i enlighet med EU-direktiv 2010/63/EU för djurförsök och registrerades vid Kontoret för skydd av marknaden för hälsa och teknisk säkerhet (G0233/14 och G0218/17).

OBS: Inspelningar från Q175 wild-type (WT) och heterozygotes (HETs) kan utföras i alla åldrar och kön. Här studerade vi män och kvinnor vid en ålder av 51 till 76 veckor.

1. Injektion av glutamatsensorn iGluu för uttryck i Korticostriatal Axons

  1. Använd pipettavdragaren (ett stegläge) för att förbereda borosilikatglaspipetter för injektion av viruset. Efter att ha dragit, bryt pipetten manuellt för att få en spetsdiameter på 30–50 μm. Autoclave pipetten och kirurgiska instrumenten, inklusive borren för att öppna skallen.
  2. Förvara viruset AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) vid -80 °C i 10 μL aliquots. Om injektioner utförs strax efter virusproduktionen (inom 6 månader), förvaras vid 5 °C. Före operationen, ta ut flaskan och underhålla den i rumstemperatur.
  3. Fyll glaspipetten och ta bort eventuella bubblor.
  4. Anestesi isär djuret med en intraperitoneal injektion av en lösning som innehåller 87,5 mg/kg ketamin och 12,5 mg/kg xylazine. Injicera subkutant 0,25% bupivacain (8 mg/kg) för ytterligare smärtlindring. Kontrollera djupet av anestesi genom att övervaka muskeltonus och observera frånvaron av smärta-inducerad reflexer.
  5. Raka huden på huvudet och sterilisera den med 70% alkohol. Montera musen i stereotaxic ramen.
  6. Använd en skalpell för att ta bort huden och en hög hastighet (38.000 rpm) borr för att göra en 1,2 mm hål i benet ovanför motorcortex.
  7. Montera sprutan med den bifogade injektionspipetten i hållaren på en precisionsmanipulator. Sätt in den vertikalt orienterade pipetten i hjärnbarken på 4 olika platser. Injektionskoordinaterna är, med avseende på bregma (i mm): främre 1,5, laterala 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. Djupet med avseende på duramater är (i mm): 1,5–1,7.
  8. Injicera 0,3 μL per plats i den outspädda viruslösningen med en hastighet på 0,05 μL/min. Efter varje injektion, låt pipetten vara på plats i 1 min innan du drar tillbaka den långsamt (1 mm/min).
  9. Avsluta genom att stänga det kirurgiska såret med en nylonsutur.
  10. Lämna musen i 0,5 till 1 h på en värmedyna i en ren bur innan du returnerar den till sin ursprungliga bur.
  11. Håll musen på en 12 h dag-natt cykel för 6 till 8 veckor före utarbetandet av akut hjärnan skivor.
    OBS: För att undvika immunreaktioner som leder till cellskador och synapsförlust måste injektion av multipla viruskonstruktioner utföras samtidigt eller inom 2–3 timmar efter den primära injektionen. Koordinaterna för iGluu injektion valdes enligt Paxinos och Franklin29 hjärnatlas. De motsvarar M1 motor cortex. Immunfärgning av injicerade hjärnor visualiseras många men mestadels väl isolerade axoner och axon varicosities i ipsi- och kontralateral striatum och i kontralateralM1 och S1 cortices.

2. Sök efter glutamatergic terminaler som uttrycker glutamatsensor iGluu

  1. Kalibreringsläge
    1. Förbered sCMOS-kameran och kamerastyrningsprogrammet med följande inställningar. På readout-sidan anges Pixel avläsningshastighet:560 MHz (= snabbaste avläsning), Känslighet/dynamiskt omfång: bit, falska brusfilter:Ja, Överlappningsavläsning:Ja. Välj Helskärm på sidan Binning/ROI.
    2. Förbered en glasbild som innehåller en droppe 5 mg/mL Lucifer Yellow (LY) under en täcksli.
    3. Placera LY-bilden under ett mål på 63x, öppna laserslutaren och utför en seriell förvärv med hjälp av följande inställningar: Pixel Binning: 1x1, Trigger-läge: Intern, Exponeringstid: Minimal (som ska fastställas).
    4. Justera lasereffekten för att producera en fluorescensplats på 4 μm i diameter (bilden får inte innehålla mättade pixlar).
    5. Om du vill utföra en kalibrering av laserpositioneringssystemet väljer du följande inställningar i laserpositioneringsprogramvaran: Diameter i spotstorlek:10, Skanningshastighet:43.200 kHz. Klicka på knappen Starta bildanskaffning på den högra panelen. Ange körningar:0, Kör fördröjning:0 och välj alternativet Kör på TTL på sidan Sekvens. Klicka på knappen Kalibrera på kalibreringssidan och kalibrera laserstyrningsprogrammet enligt instruktionerna som visas i det övre vänstra hörnet av anskaffningsskärmen.
    6. Om installationen använder oberoende programvara för kamera- och laserkontroll, skaffa skärmdumpar från kamerafönstret och skicka den till laserstyrningsprogrammet för en omberäkning av XY-koordinaterna. Om programvaran är installerad på olika datorer, sedan använda en video grabber att importera bilden till laserkontroll programvara. Laserkontrollprogramvaran behöver information om XY-skalningsfaktorer och förskjutningar. För detta ändamål bestämmer du koordinaterna för de övre vänstra, nedre vänstra och nedre högra hörnen av bilden inom laserkontrollprogrammets anskaffningsfönster. Beräkna skalningsfaktorerna enligt följande ekvationer: X-faktor = (X nedifrån höger – X nederkant-vänster)/2048, X-förskjutning = X nedifrån vänster, Y-faktor = (Y överst till vänster – Y nedtill vänster)/2048, Y-förskjutning = Y längst ned till vänster.
    7. I slutet av kalibreringsproceduren skapar du ett rektangulärt intresseområde (ROI) på 267x460 pixlar, flyttar den till mitten av skärmen och klickar på knappen Startsekvens.
    8. Återgå till följande inställningar för kamerakontroll: Binning:2x2, Trigger-läge: Extern exponering, Exponeringstid: Minimal (ska fastställas).
  2. Korrigeringsläge för automatisk fluorescens
    OBS: Vilonivån för [Glu] i miljön av aktiva synaptiska terminaler är vanligtvis under 100 nM14,30,31,32,33,34. Följaktligen kommer någon sensor av glutamat, särskilt en låg affinitet sensor som iGluu vara ganska svag i avsaknad av synaptisk glutamat release. Ändå kan vissa iGluu fluorescens även detekteras i vila, men måste skiljas från vävnaden autofluorescens. 473 nm-belysningen framkallar både iGluu fluorescens och autofluorescens (figur 1A–C). Den senare upptar ett brett spektrum av våglängder, medan iGluu fluorescens är begränsad till 480-580 nm (med högst 510 nm). Korrigeringen för autofluorescens baseras på förvärv av två bilder med olika högpassfilter.
    1. Förbered hjärnan skivor i förväg som beskrivs någon annanstans35. Håll kli skivor redo.
    2. Överför skivorna till inspelningskammaren och doppa dem i syreiserad konstgjord cerebrospinalfluid (ACSF) som innehåller 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 2 mM CaCl2,1 mM MgCl2,10 mM glukos (pH 7.3, 303 mOsm/L), kompletterat med 0,5 mM natriumpyruvat, 2,8 mM natriumaskorbat och 0,005 mM glutathione. Använd ett flöde på 1–2 ml/min. Håll badtemperaturen vid 28–30 °C.
    3. Lokalisera dorsala striatum under en 20x vatten nedsänkning mål. Fixa skivorna med ett nylongaller på en platinaharpa för att minimera vävnadsrörelsen. Växla till 63x /NA 1.0 vattennedsänkningsmålet. Välj filter som reflekterar ljus vid 473 nm (dichroic mirror) och passerar ljus med våglängder >510 nm (utsläppsfilter).
    4. Synkronisera belysning, stimulering och bildförvärv med hjälp av en AD/DA-kort med respektive kontrollprogramvara. Ställ in utlösarprogrammet för att styra förvärvet med en laserexponeringstid på 180 ms och en bildförvärvstid på 160 ms. Använd laserpositioneringsenheten för att skicka laserstrålen till ett förutbestämt antal punkter och definiera inställningarna för skanningshastighet och spotstorlek.
    5. Skaffa en bild av både autofluorescens och iGluu-positivastrukturer med hjälp av ett högpassfilter på 510 nm ("gul bild").
    6. Skaffa en bild med automatisk fluorescens ensam med hjälp av ett högpassfilter på 600 nm ("röd bild").
    7. Skala de röda och gula bilderna med hjälp av medelintensiteten i de 10 ljusaste och de 10 mörkaste pixlarna för att definiera området. Utför en subtraktion "gul minus röd bild" och skala om den subtraherade bilden för att generera en vanlig 8-bitars tif-fil för bekväm visualisering av anfall av intresse(bild 1D). Den innehåller de ljusa pixlarna från iGluu-positivastrukturer, grå pixlar från bakgrunden och mörka pixlar från strukturer med autofluorescens.
      OBS: Med den givna utrustningen kommer den genomsnittliga vilofluorescensen (F) att vara under 700 A.U.
  3. Bouton sökläge
    OBS: iGluu-positivapixlar kan tillhöra funktionellt olika delar av axonalträdet, såsom axongrenar av olika ordning, platser för bifurkation, varicosities efter vesikelutarmning eller helt aktiva varianter. Det är dock nästan omöjligt att identifiera funktionella synaptiska terminaler bara genom visuell inspektion. Därför behöver varje glutamatergic synaptisk terminal identifiering genom sin lyhördhet för elektrisk depolarisering. Webbplatser som inte svarar på stimulering måste kasseras. De fysiologiska sättatt inducera glutamat frisättning från korticostriatal axons är att framkalla en åtgärd potential. Detta kan antingen uppnås genom att använda en kanal rhodopsin av lämpliga spektrala egenskaper eller genom elektrisk stimulering av en axon visualiseras av iGluu själv. För att undvika oavsiktlig opsin aktivering föredrog vi den senare approastep
    1. Använd micropipette avdragare (i ett fyrastegsläge) för att producera stimulering pipetter från borosilikat glas kapillärer. Den inre spetsdiametern bör vara ca 1 μm. När elektroden är fylld med ACSF bör det vara ca 10 MΩ.
    2. För att inducera åtgärden potential-beroende utsläpp av glutamat från en uppsättning synaptiska boutons knutna till samma axon, använd 63x förstoring, 510 nm utsläppsfilter och subtraherad bild för att placera en glas stimulering elektrod bredvid en fluorescerande varicosity . Undvik närheten till ytterligare axoner.
    3. Slå på stimulatorn för att leverera depolariserande strömpulser till stimuleringspipetten. Använd strömintensiteter runt 2 μA (högst 10 μA).
    4. Slå på flerkanaliga badapplikationssystem där en kanal levererar standardbadlösningen och de andra kanalerna levererar nödvändiga blockerare av jonkanaler, transportörer eller membranreceptorer. Styr flödet på inspelningsplatsen och växla sedan till tetrodotoxinkanalen (TTX) (badlösning plus 1 μM TTX). Efter 2–3 min, stimulera det stora intresset igen, men nu i avsaknad av handlingspotential. Frisättningen beror direkt på kalciumtillströmning genom spänningsberodde kalciumkanaler.
    5. Genom att vrida intensitetsnyckeln på stimulatorn, justera stimuleringsströmmen för att få svar liknande dem som framkallas via åtgärdspotentialer. Vanligtvis skulle stimuleringsströmmen vara runt 6 μA för en 0,5 ms depolarisering.
    6. För grundläggande testning av preparatet, applicera 0,5 mM CdCl2. Förekomsten av denna kalciumkanal blockerare glutamat release förhindrar helt synaptisk glutamat release därmed validera kalcium beroende av direkt framkallat glutamat signal.
      OBS: Följande allmänna rekommendation kan bidra till att öka framgången för enstaka synapsexperiment i striatum. För att välja glutamaterga synaptiska terminaler med intakta frisättningsmaskiner, bör en varicosity: (i) Ha en smidig spindelliknande form; (ii) Inte associeras med en axonbifurkation. iii) Var ljusare än andra strukturer på den "gula bilden". (iv) Bo i striatal neuropil snarare än i fiberskrifter; v) Bo på en mycket tunn axongren. vi) Inte vistas inom de djupare delarna av segmentet.

3. Visualisering av glutamat release och clearance

  1. Inspelningsläge
    OBS: Efter subtraktion av autofluorescens (steg 2.2) och några inledande tester för lyhördhet av anfall av intresse (steg 2.3), datainsamling kan börja. Svaren på elektrisk aktivering av glutamat frisättning från enstaka axonterminaler kan observeras i bilden direkt(figur 2), utan att tillämpa ytterligare analysverktyg. Det visade sig dock vara mycket bekvämt att omedelbart extrahera vissa grundläggande indikatorer på synapsprestanda(figur 3). Denna information behövs för att fatta beslut om efterföljande experiment, såsom urval av särskilda terminaltyper, snabb bedömning av Hd-relaterade ändringar, antalet och frekvensen av försök eller läkemedel som ska tillämpas med superfusionssystemet. Det kan också vara nödvändigt att ta itu med så småningom visas artefakter. För det första beskrivs standardinställningarna för datainspelning.
    1. Med hjälp av mikroskop XY-enheter placerar du den testade iGluu-positivbouton nära viewfield-centret. Stoppa bildförvärvet med knappen Avbryt förvärv. På den senast förvärvade bilden bestämmer du XY-positionen för vilande bouton-mitten genom att klicka på den med vänster musknapp. XY-koordinaterna för den inställda markören visas på anskaffningsfönstrets nedre statuspanel.
    2. Beräkna koordinaterna för den plats där laserstrålen ska skickas för excitation av iGlu u-fluorescensen.u Använd följande ekvationer: X laser = X kamera * X faktor + X offset, Y laser = Y offset - Y kamera * Y faktor. När du utför den här omberäkningen bör du vara uppmärksam på kamerans vertikala eller horisontella flip-inställningar.
    3. Skapa en enpunktssekvens i laserstyrningsprogrammet med hjälp av de beräknade koordinaterna. För detta ändamål väljer du Punkt i rutan Lägg till i-sekvenssidan Sekvens i laserkontrollprogrammet. Välj 10 μs för fördröjningen att utlösa debut och 180 ms för laserpulstiden. Flytta musen till de beräknade koordinaterna och klicka på vänster knapp.
    4. Välj följande inställningar i laserkontrollprogrammet: Körs:0, Kör fördröjning:0, Sekvens:Kör vid TTL. Klicka sedan på Startsekvens.
    5. I kameran kontrollprogramvara, välj följande inställningar: På binning / ROI sida, ange bildområde:Anpassad, Pixel Binning:2x2, Höjd:20, Bredd: 20, Vänster:X-koordinat av vila iGluu-positiv plats minus 10 px, Botten: Y-koordinering av vila iGluu-positiv plats minus 10 px, Läge Förvärv: Kinetic Series, KineTic Series LengthTic:400, Exponeringstid: 0.0003744s (minimalt värde). Med sådana inställningar kommer förvärvstakten att vara 2,48 kHz.
    6. Välj Utlösarläge:Externt. Klicka på Ta signal i kamerans kontrollprogram. Initiera det experimentella protokoll som fastställts för utlösaren.
    7. Implementera det experimentella protokollet Test med följande tidslinje: 0 ms – starttest, 1 ms – starta laserbelysning, 20 ms – starta bildförvärv med kamera, 70 ms – starta elektrisk stimulering 1, 120 – starta elektrisk stimulering 2, 181 ms – sluttest (laser och kamera av). Under en testversion förvärvar kameran 400 bildrutor med en frekvens på 2,48 kHz. Se steg 2.3.3 och 2.3.5. för mer information om elektrisk stimulering.
    8. Om du vill möjliggöra tillräcklig återställning av presynaptiska vesicle-pooler använder du protokollet Testversion med en repetitionsfrekvens på 0,1 Hz eller lägre.
  2. Off-line konstruktion av glutamat övergående och snabb bedömning av glutamat frisättning och clearance för identifiering av patologiska synapser
    1. Aktivera utvärderingsrutinerna. Här använder vi en egenskriven programvara SynBout v. 3.2. (författare: Anton Dvorzhak). Följande steg behövs för att konstruera en ΔF/F-transient från pixlarna med förhöjd iGluu fluorescens som i videon med figur 2.
    2. För att fastställa boutonstorleken, beräkna medelvärdet och standardavvikelsen (SD) för ROI-fluorescensintensiteten i vila (F), före stimuleringens början. Bestäm och boxas det område som upptas av pixlar med F>medelvärde + 3 SD (bild 3A). Bestäm en virtuell diameter (i μm) förutsatt att en cirkulär form av supratröskelområdet.
    3. Bestäm ΔF som skillnaden mellan toppintensitetsvärdet och F. Rita den stimulerande strömmen och ΔF/F mot tiden(figur 3B). Beräkna SD för ΔF/F i vila (före stimuleringens början) och "Peak amplitud". Använd pixel med toppamplitud mer än 3 SD δf/f för att utföra monoexponentiell montering för förfallet från toppen. Bestäm tidskonstanten för sönderfall TauD av ΔF/F.
    4. Om du vill uppskatta "Maximal amplitud" vid en viss synaps väljer du pixeln med det högsta ΔF/F-värdet. Det är vanligtvis ligger inom eller bredvid gränserna för vila bouton iGluu fluorescens. Den "Maximal amplitud" skulle vara den bästa indikatorn på glutamat belastning presenteras för clearance maskiner i en enda synaps.
    5. Om du vill uppskatta den rumsliga förlängningen av iGluu-signalen bestämmer du diametern på området för alla supratröskelpixlar som kombineras för att bilda en virtuell cirkel. Respektive diameter kallas "Spread". Termen "Toppspridning" refererar sedan till toppvärdet för den genomsnittliga spreaden övergående (figur 3C, skillnaden mellan prickade röda linjer).
  3. Korrigeringar för möjliga artefakter
    OBS: Elektrisk avpolning är associerad med ett utåtflöde av intrapipettlösningen. Detta kan resultera i en liten vävnadsförskjutning. För att diskriminera mellan stimulering-inducerad förändringar av iGluu och out-of-focus skift av bilden, kan man använda följande metod för att identifiera och eliminera förskjutning artefakter (Figur 4).
    1. Analysera de rumsliga egenskaperna hos suprathresholdpixlarna som härleds från en roi med tecken på förskjutning (figur 4F–H).
    2. Hitta pixlar utanför de ursprungligen bestämda gränserna för bouton i vila(bild 4F-H, förpackad i rött).
    3. Identifiera så småningom befintliga negativa pixelintensitetsvärden (bild 4I, J). Alla ΔF/F i negativ riktning med en amplitud som är större än prestimuleringsmedelvärdet ± 3 SD bör betraktas som artefakt, och posten bör kasseras.
    4. För att undvika out-of-fokus artefakter, placera stimulering elektroden på antero-laterala sidan av synaptiska bouton, använd bifasiska elektrisk stimulering och minimera stimulering intensitet / varaktighet.
      OBS: Out-of-fokus artefakter kan också härledas från kameran. Om det senare inte är optimalt fastsatt på mikroskopet kan det producera svängningar, troligen på grund av små vibrationer i kamerans kylsystem. Sådana vibrationer skapar ett "yin och yang"-mönster i ΔF/F-bilderna som roterar med en frekvens på 50 Hz. Vibrationerna kan matematiskt subtraheras från fluorescenssignalen, men den slutliga kvaliteten på mätningarna skulle då kritiskt bero på inspelningstiden.
    5. Fäst kameran på mikroskopet så att vibrationer saknas. Om den senare stannar kvar placerar du en gummipackning mellan kameran och mikroskopadaptern.
      OBS: Man kan inte försumma möjligheten att den striatala neuropil runt synaps av intresse innehåller glutamatergic varicosities som inte uttrycker iGluu och därför förblir osynlig. När det gäller deras samtidigaktivering (mer sannolikt i avsaknad av TTX) kan de transienter som erhållits från anfall av intresse påverkas av spridningsspridning. Detsamma gäller iGlu u-uttrycksterminaler som var ur fokus.u Ett karakteristiskt fenomen skulle i detta fall vara att fluorescenstransienter kommer från ett mycket större område. Eftersom detta svar elimineras av TTX, kan man tolka det som ett ospecifikt svar framkallas av obefogad multi-fiber aktivering.
    6. För att korrigera för detta ospecifika multifibersvar, följ proceduren som beskrivs i figur 5. Använd fluorescenssignalen för pixlar vid vyfältsgränserna. För att minimera bakgrundsrespons, minimera stimuleringsintensitet och varaktighet eller använd TTX.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifiering av två typer av korticostriatal glutamatergic varicosities
IT- och PT-afferents har sitt ursprung i lager 2/3 respektive 5, och uppvisar differentialförgreningar och termineringsmönster i den ensidiga och kontralaterala (endast IT-terminaler) striatum. Fortfarande lite är känt om egenskaperna hos glutamat release och clearance under repetitiva aktiveringsförhållanden som observerats under inledandet av rörelser, men det är väl dokumenterat att respektive glutamat-släppa varicosities skiljer sig i storlek22. Med hjälp av ett storlekskriterium konstaterades det att IT- och PT-terminaler uppvisar kontrasterande former av kortsiktig plasticitet24. Med stimulansintervall på 50 ms var de mindre IT-terminalerna benägna att parat pulsdepression (PPD) medan de större PT-terminalerna visade ihopkopplad pulsunderlättande. Denna skillnad observerades också med kortare mellanrum (20 ms) och under en serie av 6 pulser. Figur 3 och figur 6 illustrerar dessa experiment där synaptisk glutamat release framkallades via åtgärden potentiella mekanismen vid fysiologiska Ca 2+/Mg2 + koncentration.

Identifiering av dysfunktionella synapser hos möss med avancerad Huntingtons sjukdom
Neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdom kännetecknas av en ständigt fortskridande förlust av glutamaterga synapser36. Nya terapier syftar till att hindra eller till och med vända denna ödesdigra progression. Exakt vad som utlöser försvinnandet av en synaps, och när, är i stort sett okänd. Ytterligare insikt kan förväntas från studier som erbjuder kriterier för (a) den avgörande identifieringen av en viss klass av glutamaterga synapser och (b) detektion av dysfunktionella kontra normalt utför kontakter. Här kommer det att visas hur TauD-värden som erhållits från PT-typ av terminaler användes för att uppskatta den del av dysfunktionella synapser i Q175 heterozygotes med en identifierad motor fenotyp.

Före de enda synapsavbildningsexperimenten skickades mössen till ett snabbt men ganska robust test för förändringar i deras undersökande beteenden. Detta test kallas "step-over test". Djuret placerades i mitten av en Petri skål (av 185 mm diameter och 28 mm vägghöjd). Testet spelades in med en videokamera. Med hjälp av offline analys, kan man bestämma tiden mellan start av experimentörens hand och det ögonblick då djuret har alla 4 meter ur skålen. Rita data från över 100 WT och Q175 HET i åldrarna 12 och 18 månader tyder på att möss med en steg-over latens på >300 s kan diagnostiseras som hypokinetik. Figur 7A illustrerar ett betydande positivt samband mellan de resultat som erhålls för den totala sökvägen som körs i det öppna fältet och steg-över-latensen.

Enkel synapse iGluu imaging visade att dessa symptomatiska HS möss uppvisade ett underskott i hastigheten på juxtasynaptic glutamat förfall som återspeglas i TauD värden från singel (eller först i en sekvens) stimuli(figur 7B,C). I WT observerades en sådan förlängning först efter applicering av en selektiv icke-transportabel hämmare av glutamatupptag – DL-threo-β-bensyloxyassparac syra (TBOA, figur 7D,E). Detta tyder på en roll av astrocytic glutamat transportörer i regleringen av synaptisk glutamat clearance. Förändringar i spridningen av Glu i det perisynaptiska utrymmet har inte hittats24. Men, naturligtvis, mycket mer arbete behövs för att faktiskt identifiera orsaken till långsammare glutamat clearance i HS samt i andra former av parkinsonism. Bortsett från förändringar i astrocyt närheten9 och minskad slc1A2 uttryck37, kan man lika gärna överväga sjukdomsrelaterad instabilitet i EAAT2 i plasmamembranet i perisynaptic astrocyt processer (PAPs). Detta kan bero på ändringar i EAAT2-interactome. Faktum är att de senaste massspektroskopi experiment i labbet pekar på en förlust av EAAT2-dystrofin interaktion i strimmiga astrocyter (Hirschberg, Dvorzhak, Kirchner, Mertins och Grantyn, opublicerade).

Mycket lite är känt när det gäller tidslinjen för synaptisk dysfunktion med progression av HS, men det är mycket troligt att friska synapser samexistera med redan nedsatt. När vi sökte efter ett klassificeringskriterium undersökte vi TauD-data från olika möss. För detta ändamål normaliserades amplitudens- och TauD-värdena från 3 på varandra följande parade försök till det första svaret (se figur 6F för ett experimentellt system) och sannolikheten för förekomst av ett visst TauD-värde jämfördes i åldersmatchade WT jämfört med Q175 HET (figur 6G). Det konstaterades att i WT TauD aldrig överskred 15 ms, medan i symptomatiskt Q175 HET, 40% av synapser uppvisade TauD värden mellan 16 och 58 ms, trots en tendens till en minskning av mängden frisläppt glutamat(figur 6H,I). TauD kan då betraktas som en biomarkör för dysfunktionella synapser i HS och ytterligare användas för att kontrollera funktionell återhämtning i experiment som riktar astrocytic glutamat transport.

Figure 1
Figur 1: Identifiering av iGluu-positivavariationer. (A)Fluorescensbild som erhållits med ett 510 nm högt passfilter ("gul bild"). (B)Samma vyfält som förvärvats med ett 600 nm högpassfilter ("röd bild"). Observera att den plats som är markerad med svart pilspets har försvunnit i (B). Överlägg av (A) och (B). Vit pil = autofluorescens, svart pil = iGluu-positiv varicosity. (D)Bild som erhållits genom subtraktion av (B) från (A). De autofluorescerande fläckarna är mörka och iGluu+ punkten är ljus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Film fortfarande från en slow motion video (avmattning faktor 1240x). Övre raden: Bilder från WT (vänster), Q175 HET (mitten) och HOM (höger). Nedre raden: Respektive iGluu transienter från pixeln med den högsta glutamat höjden (Maximal ΔF/F). Den röda markören anger punkten på den övergående som motsvarar bilden ovanför spårningen. observera långvarig höjd av iGluu fluorescens (röda pixlar och ΔF/F transienter). Ändrad och omtryckt med tillstånd från Dvorzhak et al.24Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Extraktion av funktionella indikatorer från enstaka synapsbilder av den genetiskt kodade ultrasnabb Glu-sensorn iGluu i korticostriatalnervceller. (A, D) Exempel på en PT (A) och IT (D) bouton med respektive iGluu fluorescens i vila (vänster) och på toppen av en AP-medierad iGluu svar (höger). (B, C, E, F)iGluu svar som registrerats från bouton visas i (A, D); Experimentera i 2 mM Ca2+ och 1 mM Mg2+. (B)Samtidig inspelning av stimuleringsströmmen (övre spår) och medelintensitet för supratröskelpixlar (bottenspårning). Samma tidsskala för alla spår. Toppamplituds (mellan prickade röda horisontella linjer) och en monoexponentiell funktion monterad på förfallet från denna topp (röd överlägg). Motsvarande TauD-värden (τ) visas bredvid passande kurvor. (E, F) Handlingen att sprida sig mot tiden. Toppspridning: skillnaden mellan prickade röda horisontella linjer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Egenskaper hos en glutamatinducerad iGluu övergående (A-E) i motsats till en förskjutningartefakt (F-J). (A, B)och(F, G)visar den absoluta fluorescensintensiteten i vila (A, F) och efter stimulering (B, G) i godtyckliga enheter (au). C, H) Fluorescensförändring i procent av vilande fluorescens före stimulering (ΔF/F%). (D, I) Översätt av iGluu transienter från alla pixlar i godtyckliga enheter. (E, J) Övertag för iGluu transienter från alla pixlar i ΔF/F %. När det gäller synaptisk glutamat release, pixlarna bredvid viloterminalen uppvisar en fluorescens ökning efter stimulering, medan i händelse av out-of-fokus skiftar den ljusaste pixeln i vila bara ändra sin position i ROI, utan en medföljande ökning av över-alla fluorescensintensitet en vy-fältet. En förskjutningsartefakt kan också kännas igen genom utseendet på negativa ΔF/F-signaler (J). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Korrigering föru ospecifikt iGlu u-svar. (A-D) Exempel på parat synaptiskrespons som förorenats av ett ospecifikt bakgrundssvar. (E–H) Samma efter korrigering. A, E) Före stimulering. (B, F) Under stimulering. (C, G) Efter stimulering. (D, H) Motsvarande övergående intensitetsövergående intensitet (i ΔF/F) från alla pixlar i avkastningen. Tidspunkten för förvärvet av bilderna markeras med motsvarande små bokstäver över pilspetsarna. Observera att bakgrundssvaret i panel C är mycket utbrett och långsamt sönderfallande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Distinkta storleks- och storleksrelaterade skillnader i amplitudens parat pulsförhållande (PPR) för iGluu transient. (A)Förenklat system för korticostriatal kretsar22,som illustrerar begreppet förmånsprojektion av pyramidala tarmkanalen (PT) nervceller till indirekt väg striatal projektion nervceller (iSPN) och intratelencephalic (IT) nervceller att direkt väg SPNs (dSPNs), med storlek-skillnader mellan IT och PT terminaler. (B)Bimodal fördelning av boutondiametrar enligt definitionen av supra-tröskel vila fluorescens före stimulering. Boutons med diameter ≥0,63 μm definierades som "Stora" och antas vara utfärdade av PT-axoner. För originalbilder och provspår från PT- och IT-typ av synapser se figur 3. (C)Betydande positiv korrelation ses mellan PPR av toppamplituder och bouton diametrarna. Varje datapunkt representerar genomsnittet från de första 3 försöken i varje bouton. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Identifiering av dysfunktionella synapser i Q175 möss med en hypokinetisk fenotyp. (A)Resultat av motorprovning på dagen för enda synapsavbildning. Steg-över latenser >300 ms ansågs vara patologiska. Vid den ålder som testades (i genomsnitt 16 månader) uppvisade 17/54 HET en uttalad fenotyp i steg-över-testet. När det gäller hypokinesi verkar steg-över-testet vara känsligare än det öppna fälttestet. Det fanns dock ett betydande samband mellan resultatet av steg-över-testet (tid mellan placering och barriär korsas med alla fyra meter) och det öppna fältet testet (dvs. total bana körs i 5 min). Y = -0,01511X + 458,7; P = 0,0044 (enkel regression). (B)Genomsnittlig framkallat enda synapse iGluu transienter normaliseras till samma topp amplitud för att illustrera HD-relaterade skillnader i clearance av synaptically frigörs glutamat. De respektive passande kurvorna markerar skillnaderna i glutamattransienternas varaktighet. c)Kvantifiering av resultaten från vildtyp (grå), HET (röd) och HOM (magenta). (D, E) Inkubation av WT skivor i 100 nM av TFB-TBOA simulerade depressionen av glutamat clearance observerats i HOM. (F)Schema för aktivering av synaps och dataorganisation. (G)Kumulativa histogram av #1 TauD-värden. (H, I) Tomter av normaliserade #2 svar. Data från 31 WT och 30 HET synapser (alla PT typ). I WT-provet var alla TauDmax-värden ≤15 ms. I HET-provet uppvisade 40 % av synapser TauDmax-värden som översteg tröskelvärdet på 15 ms som definieras av den längsta TauDmax i WT. Dessa diagram betonar HD-relaterade skillnader i intervallen för maximal amplitud (dvs. värdet från pixeln med den högsta iGluu fluorescensökning) och TauDmax (TauD av pixeln med den högsta höjden). TauDmax-värden som uteslutande påträffas i HET visas i rött, och amplitudvärden som uteslutande ses i WT visas i grått. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. De använda statistiska testerna anges bredvid respektive diagram. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Experimenten handlar om en fråga av allmänt intresse – synapsberoende och dess eventuella förlust under neurodegeneration, och vi beskriver en ny metod för att identifiera drabbade synapser i akuta hjärnskivor från äldre (>1 år) möss. Dra nytta av de förbättrade kinetiska egenskaperna hos den nyligen introducerade glutamat sensor iGluu experimenten belysa förhållandet mellan synaptisk glutamat release och upptag på ett sätt som inte har varit möjligt tidigare.

Påverkan av glutamat clearance på funktion och underhåll av synapser är inte särskilt väl klarlagt, även om hypotesen att glutamat-inducerad excitotoxicitet kan orsaka neuron förlust och synapse beskärning nämns i nästan alla pertinent översyn av epilepsi, stroke och neurodegenerativa sjukdomar38,39,4040,41. De tillgängliga bevisen är dock mer begränsade än vad som möjligen förutses från litteraturen. Förvirring läggs ytterligare till av det faktum att de valda experimentella verktygen kan vara otillräckliga med tanke på de problem som är förknippade med låg rumslig och tidsmässig upplösning vid tolkningav de resultat som erhållits med bruttostimulering och inspelningstekniker42,43. Detta kan leda till falska negativ avskräcka ytterligare forskning, vilket är mer än olyckligt med tanke på neurologiska sjukdomar så allvarliga som Huntingtons sjukdom. Den nuvarande metoden säkerställer bättre signaldiskriminering och därför starkare stöd för tanken att i HS en betydande del av korticostriatal synapser uppvisar tecken på nedsatt glutamat clearance.

De nuvarande resultaten avslöjade skillnader i kortsiktig plasticitet inom korticostriatal vägen. Även om den senare hade varit i fokus för många studier17,44, har det inte förväntats att afferents som härrör från de övre närlagren skulle uppvisa frekvensberoende depression, i motsats till pyramidala tarmkanalen afferents med ursprung i lager 5. Den senare visade företrädesvis en frekvensberoende potentiering av frisättningen och kan därför löper större risk för glutamat upptagsufficiens.

Experiment på akuta hjärnskivor från vuxna möss är viktiga för att klargöra synaptiska förändringar vid en lämplig ålder av liv. Beredningens ålder och funktionella tillstånd är särskilt relevant om astrocyter var inblandade i mekanismen av intresse. Här är det viktigt att astrocyterna är mogna nog att uppvisa vuxna nivåer av glutamat transportör aktivitet och relaterade klorid homeostas45.

Enda synaps analyser kommer att bana väg mot en bättre förståelse av HD-relaterade förändringar av glutamatergic synaptisk överföring i den intakta hjärnan46. Det har visat sig att enstaka synaps upplösning också kan uppnås i den intakta hjärnan, förutsatt att synapser av intresse är lokaliserade i de ytliga skikten av hjärnbarken47.

Slutligen har den nuvarande experimentella metoden överklagandet att det kan användas av många anhängare, eftersom den nödvändiga utrustningen är fortfarande på den billiga sidan.

Kort sagt, fluorescens signaler rapportering glutamat release och juxtasynaptic förändringar i koncentrationen av glutamat i den intakta hjärnan kan ge data ouppnåeliga med någon elektrofysiologisk metod. Men som med alla nya metoder har detta tillvägagångssätt sina begränsningar och nackdelar som delvis har åtgärdats i steg 2.2 och 3.3. Den låga vilande fluorescensen hos den snabba och höga affiniteten iGluu-sensorn kräver lite motion/erfarenhet för att identifiera lämpliga variationer för vidare testning. Med samuttryck av en genetiskt kodad kalciumindikator (GECI) som XCaMP-R48 och minst två samordnade laserbelysningssystem, skulle sökningen av funktionella axonterminaler bli mycket enklare. I vilket fall som helst är det viktigt att utsätta preparatet så lite som möjligt för spännande ljus före och under iGluu inspelning.

Användningen av en 473 nm laser (i stället för den vanliga hela fältet eliminering) för att framkalla iGluu fluorescens är en förutsättning för att få tillräckligt med utsläpp, men kommer också att orsaka blekning. Under de givna förhållandena var iGluu helt blekt efter 10 stimulering / förvärv prövningar (10 stimulans par med en inter-stimulus intervall på 50 ms och en upprepning på 1 /10 s). Den maximala totala belysningstiden för steady-state dataförvärv med det för närvarande använda 1 fotonlasersystemet och den beskrivna inställningen var cirka 2 s. Blekning av iGluu är exponentiell, är mycket stark under de första 20 ms efter belysning start och mycket långsammare därefter. Det är därför tillrådligt att undvika signalförvärv under de första 20 ms av varje försök och att förvärva högst totalt 10 svarpar. Svar på enstaka stimuli kunde registreras med exponeringstider på 60–80 ms istället för de för närvarande använda 180 ms.

En annan kritisk fråga är uttrycksnivån för iGluu. I den banbrytande studien av Helassa et al.27tillämpades de virala konstruktionerna genom elektroporation på odlade nervceller27, som ger högre uttrycknivåer av sensorn och förmodligen också mindre blekning, särskilt om en två-foton laser scanning enhet kan användas i stället för en en-foton mikroskop. Dürst et al.49 rapport rutinmässigt förvärv av postsynaptic uttryck för iGluu i CA1 pyramidal nervceller i ~ 100 prövningar (varje exponeras för endast 80 ms). Men odlade hjärnvävnad är inte ett alternativ när experimenten syftar till att klargöra astrocyt-beroende synaptiska funktioner i den åldrade hjärnan. Ett CaMKII-Cre-beroende uttryck för iGluu med hjälp av en starkare promotor kan ge förberedelser med starkare uttryck i färre celler, vilket ökar upplösningen av metoden och möjliggör förvärv av fler försök per synaps.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av CHDI (A-12467), Den tyska forskningsstiftelsen (Exc 257/1 och DFG Project-ID 327654276 – SFB 1315) och intramural forskningsfonder i Charité. Vi tackar K. Török, St George's, University of London, och N. Helassa, University of Liverpool, för iGluu plasmid och många hjälpsamma diskussioner. D. Betances och A. Schönherr gav utmärkt teknisk hjälp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microsope WPI PZMIII Precision Stereo Zoom Binocular Microscope
Stereotaxic frame Stoelting 51500D Digital Lab New Standard stereotaxic frame
High speed drill equipment Stoelting 514439V Foredom K1070 cromoter Kit
Injection system Stoelting 53311 Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)
Hamilton syringe 5 µl Hamilton 87930 75RN Syr (26s/51/2)
Laser positioning system Rapp OptoElectronic UGA-40 UGA-40
Blue laser for iGluu excitation Rapp OptoElectronic DL-473-020-S 473 nm laser
Dichroic mirror for 473 nm Rapp OptoElectronic ROE TB-355-405-473 Dichroic
1P upright microscope Carl Zeiss 000000-1066-600 Axioskop 2 FS Plus
Objective 63x/1.0 Carl Zeiss 421480-9900 W Plan-Apochromat
4x objective Carl Zeiss 44-00-20 Achroplan 4x/0,10
Dichroic mirror for iGluu Omega optical XF2030
Emission filter for iGluu Omega optical XF3086
Dichroic mirror Omega optical QMAX_DI580LP
Emission filter for autofluorescence subtr. Omega optical QMAX EM600-650
sCMOS camera Andor ZYLA4.2PCL10 ZYLA 4.2MP Plus
Acqusition software Andor 4.30.30034.0 Solis
AD/DA converter HEKA Elektronik 895035 InstruTECH LIH8+8
Aquisition software HEKA Elektronik 895153 TIDA5.25
Electrode positioning system Sutter Instrument MPC-200 Micromanipulator
Electrical stimulator Charite workshops STIM-26
Slicer Leica VT1200 S Vibrotome
Brown/Flaming-type puller Sutter Instr SU-P1000 P-1000
Glass tubes for injection pipettes WPI 1B100F3
Glass tubes forstimulation pipettes WPI R100-F3
Tetrodotoxin Abcam ab120054 TTX
iGluu plasmid Addgene 106122 pCI-syn-iGluu
Q175 mice Jackson Lab 27410 Z-Q175-KI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nature Reviews Neuroscience. 1, 181-190 (2000).
  2. Thome, C., et al. Axon-carrying dendrites convey privileged synaptic input in hippocampal neurons. Neuron. 83, 1418-1430 (2014).
  3. Larkum, M. E., Petro, L. S., Sachdev, R. N. S., Muckli, L. A Perspective on Cortical Layering and Layer-Spanning Neuronal Elements. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 56 (2018).
  4. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neuroscience. 9, 206-221 (2008).
  5. Khakh, B. S., et al. Unravelling and exploiting astrocyte dysfunction in Huntington's disease. Trends in Neurosciences. 40, 422-437 (2017).
  6. Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32, 421-431 (2009).
  7. Perea, G., Araque, A. Astrocytes potentiate transmitter release at single hippocampal synapses. Science. 317, 1083-1086 (2007).
  8. Savtchenko, L. P., et al. Disentangling astroglial physiology with a realistic cell model in silico. Nature Communications. 9, 3554 (2018).
  9. Octeau, J. C., et al. An optical neuron-astrocyte proximity assay at synaptic distance scales. Neuron. 98, 49-66 (2018).
  10. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiological Reviews. 98, 239 (2018).
  11. Xie, Z., Yang, Q., Song, D., Quan, Z., Qing, H. Optogenetic manipulation of astrocytes from synapses to neuronal networks: A potential therapeutic strategy for neurodegenerative diseases. Glia. 10, (2019).
  12. Verkhratsky, A., Parpura, V., Pekna, M., Pekny, M., Sofroniew, M. Glia in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Biochemical Society Transactions. 42, 1291-1301 (2014).
  13. Dvorzhak, A., Melnick, I., Grantyn, R. Astrocytes and presynaptic plasticity in the striatum: Evidence and unanswered questions. Brain Research Bulletin. , 17-25 (2017).
  14. Rose, C. R., et al. Astroglial Glutamate Signaling and Uptake in the Hippocampus. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 451 (2018).
  15. Scimemi, A., Diamond, J. S. Deriving the time course of glutamate clearance with a deconvolution analysis of astrocytic transporter currents. Journal of Visualized Experiments. (10), (2013).
  16. Theodosis, D. T., Poulain, D. A., Oliet, S. H. Activity-dependent structural and functional plasticity of astrocyte-neuron interactions. Physiological Reviews. 88, 983-1008 (2008).
  17. Reiner, A., Deng, Y. P. Disrupted striatal neuron inputs and outputs in Huntington's disease. CNS Neuroscience & Therapeutics. 24, 250-280 (2018).
  18. Plotkin, J. L., Surmeier, D. J. Corticostriatal synaptic adaptations in Huntington's disease. Current Opinion in Neurobiology. 33, 53-62 (2015).
  19. Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in Parkinson's disease: from homeostasis to maladaptive plasticity. Journal of Neural Transmission (Vienna). 125, 431-447 (2018).
  20. Huerta-Ocampo, I., Mena-Segovia, J., Bolam, J. P. Convergence of cortical and thalamic input to direct and indirect pathway medium spiny neurons in the striatum. Brain Structure and Function. 219, 1787-1800 (2014).
  21. Kincaid, A. E., Zheng, T., Wilson, C. J. Connectivity and convergence of single corticostriatal axons. Journal of Neuroscience. 18, 4722-4731 (1998).
  22. Reiner, A., Hart, N. M., Lei, W., Deng, Y. Corticostriatal projection neurons - dichotomous types and dichotomous functions. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 142 (2010).
  23. Rothe, T., et al. Pathological gamma oscillations, impaired dopamine release, synapse loss and reduced dynamic range of unitary glutamatergic synaptic transmission in the striatum of hypokinetic Q175 Huntington mice. Neuroscience. 311, 519-538 (2015).
  24. Dvorzhak, A., Helassa, N., Torok, K., Schmitz, D., Grantyn, R. Single synapse indicators of impaired glutamate clearance derived from fast iGluu imaging of cortical afferents in the striatum of normal and Huntington (Q175) mice. Journal of Neuroscience. 39, 3970-3982 (2019).
  25. Rebec, G. V. Corticostriatal network dysfunction in Huntington's disease: Deficits in neural processing, glutamate transport, and ascorbate release. CNS Neuroscience & Therapeutics. 10, (2018).
  26. Friedman, A., et al. Chronic Stress Alters Striosome-Circuit Dynamics, Leading to Aberrant Decision-Making. Cell. 171, 1191-1205 (2017).
  27. Helassa, N., et al. Ultrafast glutamate sensors resolve high-frequency release at Schaffer collateral synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, 5594-5599 (2018).
  28. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nature Methods. 10, 162-170 (2013).
  29. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier. (2003).
  30. Marcaggi, P., Attwell, D. Role of glial amino acid transporters in synaptic transmission and brain energetics. Glia. 47, 217-225 (2004).
  31. Bergles, D. E., Diamond, J. S., Jahr, C. E. Clearance of glutamate inside the synapse and beyond. Current Opinion in Neurobiology. 9, 293-298 (1999).
  32. Papouin, T., Dunphy, J., Tolman, M., Foley, J. C., Haydon, P. G. Astrocytic control of synaptic function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372, 20160154 (2017).
  33. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8, 935-947 (2007).
  34. Nedergaard, M., Verkhratsky, A. Artifact versus reality--how astrocytes contribute to synaptic events. Glia. 60, 1013-1023 (2012).
  35. Octeau, J. C., Faas, G., Mody, I., Khakh, B. S. Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain. Journal of Visualized Experiments. (10), (2018).
  36. Shrivastava, A. N., Aperia, A., Melki, R., Triller, A. Physico-Pathologic Mechanisms Involved in Neurodegeneration: Misfolded Protein-Plasma Membrane Interactions. Neuron. 95, 33-50 (2017).
  37. Langfelder, P., et al. Integrated genomics and proteomics define huntingtin CAG length-dependent networks in mice. Nature Neuroscience. 19, 623-633 (2016).
  38. Pal, B. Involvement of extrasynaptic glutamate in physiological and pathophysiological changes of neuronal excitability. Cellular and Molecular Life Sciences. 75, 2917-2949 (2018).
  39. Pekny, M., et al. Astrocytes: a central element in neurological diseases. Acta Neuropathologica. 131, 323-345 (2016).
  40. Bading, H. Therapeutic targeting of the pathological triad of extrasynaptic NMDA receptor signaling in neurodegenerations. Journal of Experimental Medicine. 214, 569-578 (2017).
  41. Pajarillo, E., Rizor, A., Lee, J., Aschner, M., Lee, E. The role of astrocytic glutamate transporters GLT-1 and GLAST in neurological disorders: Potential targets for neurotherapeutics. Neuropharmacology. 10, (2019).
  42. Jensen, T. P., Zheng, K., Tyurikov, aO., Reynolds, J. P., Rusakov, D. A. Monitoring single-synapse glutamate release and presynaptic calcium concentration in organised brain tissue. Cell Calcium. 64, 102-108 (2017).
  43. Reynolds, J. P., Zheng, K., Rusakov, D. A. Multiplexed calcium imaging of single-synapse activity and astroglial responses in the intact brain. Neuroscience Letters. 10, (2018).
  44. Kuo, H. Y., Liu, F. C. Synaptic Wiring of Corticostriatal Circuits in Basal Ganglia: Insights into the Pathogenesis of Neuropsychiatric Disorders. eNeuro. 6, 19 (2019).
  45. Untiet, V., et al. Glutamate transporter-associated anion channels adjust intracellular chloride concentrations during glial maturation. Glia. 65, 388-400 (2017).
  46. Burgold, J., et al. Cortical circuit alterations precede motor impairments in Huntington's disease mice. Scientific Reports. 9, 6634 (2019).
  47. Jensen, T. P., et al. Multiplex imaging relates quantal glutamate release to presynaptic Ca (2+) homeostasis at multiple synapses in situ. Nature Communications. 10, 1414 (2019).
  48. Inoue, M., et al. Rational Engineering of XCaMPs, a Multicolor GECI Suite for In Vivo Imaging of Complex Brain Circuit Dynamics. Cell. 177, 1346-1360 (2019).
  49. Durst, C. D., et al. High-speed imaging of glutamate release with genetically encoded sensors. Nature Protocols. 14, 1401-1424 (2019).

Tags

Neurovetenskap glutamat release glutamat clearance glutamat spridning presynaptisk terminal astrocyt glutamat upptag sönderfall kinetik spill-over optogenetik iGluu sCMOS
Enda synaps indikatorer på glutamat release och upptag i akut hjärnskivor från normala och Huntington Möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dvorzhak, A., Grantyn, R. SingleMore

Dvorzhak, A., Grantyn, R. Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice. J. Vis. Exp. (157), e60113, doi:10.3791/60113 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter