Summary
Neutrofiele extracellulaire vallen (netten) zijn driedimensionale structuren gegenereerd door geprikkeld neutrofiele granulocyten. Het is in de afgelopen jaren duidelijk geworden dat netten betrokken zijn bij een grote verscheidenheid aan ziekten. Detectie van netten in weefsel kan diagnostische relevantie hebben, zodat gestandaardiseerde protocollen voor het labelen van NETTOCOMPONENTEN vereist zijn.
Abstract
Neutrofiele granulocyten, ook wel polymorfonucleaire leukocyten (PMN) als gevolg van hun gelobuleerde Nucleus, zijn de meest voorkomende vorm van leukocyten. Ze rijpen in het beenmerg en worden vrijgelaten in het perifere bloed, waar ze circuleren voor ongeveer 6 − 8 uur; echter, in weefsel, ze kunnen overleven voor dagen. Door en door het endotheel, verlaten ze de bloedstroom, voeren ze weefsels in en migreren ze naar de plaats van een infectie na Chemotactische verlopen. Neutrofielen kunnen de binnenvallende micro-organismen bestrijden door fagocytose, degranulatie en het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten). Dit protocol zal helpen bij het opsporen van netten in in paraffine ingesloten weefsel. Netten zijn het resultaat van een proces genaamd NETosis, wat leidt tot het vrijkomen van nucleaire, korrelige, en cytoplasmische componenten hetzij uit levende (vitale NETosis) of sterven (suïcidale NETosis) neutrofielen. In vitro vormen netten een wolkachtige structuur, die meerdere malen groter is dan die van de cellen waaruit ze stammen. De ruggengraat van netten is chromatine, waaraan een selectie van eiwitten en peptiden afkomstig van korrels en cytoplasma gebonden zijn. Daardoor wordt een hoge lokale concentratie van toxische verbindingen gehandhaafd, zodat netten een verscheidenheid aan pathogenen, waaronder bacteriën, schimmels, virussen en parasieten, kunnen opvangen en inactiveren, terwijl de diffusie van de zeer actieve netto componenten die leiden tot beschadiging in naburige weefsel is beperkt. Niettemin, in de afgelopen jaren is gebleken dat netten, als het wordt gegenereerd in overvloed of onvoldoende gewist, hebben pathologisch potentieel, variërend van auto-immuunziekten tot kanker. De detectie van netten in weefselmonsters kan dus een diagnostische betekenis hebben en de opsporing van netten in ziek weefsel kan de behandeling van patiënten beïnvloeden. Aangezien paraffine-ingebedde weefselmonsters het standaard preparaat zijn dat wordt gebruikt voor pathologische analyse, werd getracht een protocol op te zetten voor fluorescerende kleuring van NETCOMPONENTEN in paraffine-ingesloten weefsel met behulp van in de handel verkrijgbare antilichamen.
Introduction
Neutrofiele extracellulaire vallen (netten) hebben een complexe driedimensionale structuur. Scannen met hoge resolutie-elektronen microscopische analyse onthulde dat ze bestaan uit gladde vezels met een diameter van 15 − 20 nm (chromatine) bezaaid met bolvormige domeinen van > 25 nm die vermoedelijk bestaan uit een assortiment van ongeveer 30 korrelige en cytoplasmatisch eiwitten en peptiden1,2. Wanneer in vitro uit geïsoleerde neutrofielen wordt gegenereerd, kunnen netten worden geïdentificeerd door kleuring van twee of meer van hun componenten door immunofluorescentie (bijv. histonen en neutrofiele elastase [NE]). In ongestimuleerde polymorfonucleaire leukocyten (PMN) bevinden histonen zich uitsluitend in de Nucleus, terwijl NE in korrels zit. Tijdens netosis komt ne in de Nucleus, waar hij histonen3,4verwerkt. Netten worden gekenmerkt door colokalisatie van componenten, die duidelijk zijn gescheiden in ongestimuleerde neutrofielen. Aangezien er momenteel geen antilichamen bestaan die uitsluitend netto specifieke epitopen detecteren (d.w.z. niet reageren met naïeve neutrofielen), is het opsporen van colokalisatie van neutrofiele eiwitten in netten de enige manier om netten te identificeren.
In weefsel kunnen netten nauwelijks gedetecteerd worden door conventionele histologische vlekken (bijvoorbeeld door kleuring met hematoxyline/eosine [H & E], die netten weergeeft als een diffuse bleke blauwachtige tint). Alleen bij zeer overvloedige netten kan duidelijk onderscheid worden gemaakt met H & E-kleuring, zoals in trombi5. Aangezien netten per se diffuus zijn, moet de weefselstructuur optimaal worden bewaard, zodat Cryo-preparaten die gevoelig zijn voor het opwekken van Vries voorwerpen, suboptimaal zijn voor de analyse van netten in weefsel. In plaats daarvan, formaldehyde fixatie en paraffine insluiten is aangetoond dat het behoud van de netto structuur in weefsel goed2. (Immuno-) histologische inspectie van secties van paraffine-ingesloten weefsel is de standaardmethode voor pathologische analyse. Aangezien weefsel in paraffineblokken zelfs bij kamertemperatuur (RT) bewaard wordt, kunnen weefsel specimens uit het dagelijkse diagnostische werk worden vergeleken met specimens die jaren geleden zijn bereid, met vragen en technieken die recentelijk zijn ontstaan. Netten in weefsel zijn tot voor kort niet gedetecteerd, en een gedetailleerde analyse van de netto-vorming en verwijdering in de loop van ziekten kan leiden tot nieuwe inzichten in de pathogenese. Het gebruik van paraffine weefsel heeft het onschatbare voordeel om de analyse van archiverings materiaal mogelijk te maken en retrospectieve studies uit te voeren6. Onmiskenbaar, deze voordelen komen tegen een kostprijs. Vóór inbedding in paraffine moet het weefsel formaldehyde-vast, gedehydrateerd en verwarmd boven 50 °C zijn. Deze procedures induceren weefsel auto fluorescentie en epitoop maskeren.
Om fixatie artefacten te beperken, moet de fixatietijd tot een minimum worden beperkt, zodat de grootte van weefselmonsters niet groter mag zijn dan een oppervlakte van 20 mm x 30 mm met een dikte van ~ 3 mm. Monsters van deze grootte worden volledig bevestigd na nachtelijke incubatie op RT in formaldehyde, idealiter gevolgd door directe uitdroging en paraffine insluiten. Als alternatief kunnen vaste monsters worden opgeslagen voor 1 of 2 dagen in buffer. Voor immunofluorescentie onderzoeken moet het fixeermiddel vers worden bereid uit Paraformaldehyde opgelost in een geschikte buffer (bijv. fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS] of tris-gebufferde zoutoplossing [TBS]). Tijdens de fixatieve bereiding moet de temperatuur onder de 60 °C worden gehouden om vorming van mierenzuur te voorkomen. Formalin, een standaard fixeermiddel voor pathologie, mag niet worden gebruikt omdat het methanol, andere aldehyden, ketonen en mierenzuur bevat. Deze onzuiverheden leiden tot verhoogde epitoop maskeren en significante weefsel auto fluorescentie.
Voor een succesvolle immunolabeling moet epitoop masking worden teruggedraaid in een proces genaamd antigeen retrieval. Weefsel secties worden verhit in een geschikte buffer, die wordt verondersteld om methyleen bruggen breken, dus epitopen toegankelijk voor de antilichamen7. Voor de detectie van netten heeft warmtegeïnduceerde epitoop retrieval (hier) de voorkeur boven andere methoden, zoals het gebruik van Proteolytische enzymen. Regelmatig wordt immunolabeling van paraffine secties uitgevoerd met één enkel antilichaam, gevolgd door een peroxidase-gelabeld secundair antilichaam, dat wordt gedetecteerd met een neerslag substraat. Vergeleken met immunofluorescentie, hebben enzym gebaseerde detectiemethoden een lagere ruimtelijke resolutie als gevolg van diffusie van het substraat precipitaat, en in het algemeen is gelijktijdige detectie van meer dan één antigeen beperkt6.
Aangezien er momenteel geen antilichamen bestaan die uitsluitend aan netten binden, wordt dit protocol gebruikt voor het labelen van twee eiwitten, Histon 2b, die nucleair is, en neutrofiele elastase, die gelokaliseerd is in korrels. In ongestimuleerde neutrofielen, deze eiwitten worden gescheiden, maar ze zijn gelokaliseerd in neutrofielen ondergaan NETosis en in netten. De gelijktijdige detectie van twee antigenen kan worden bereikt met twee primaire antilichamen die worden verhoogd in verschillende hosts en twee soortspecifieke secundaire antilichamen die zijn gelabeld met verschillende fluorochromes. Dit verslag is een standaardisering van ons eerder gepubliceerde protocol8 en maakt gebruik van een combinatie van twee in de handel verkrijgbare antilichamen die de netto-componenten in met paraffine ingesloten weefsel, zowel vers als archivering, van menselijke en murijnse oorsprong betrouwbaar beits.
Protocol
Weefsel protocollen werden goedgekeurd door Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlijn, Duitsland (G0121/16). Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU betreffende de zorg, het welzijn en de behandeling van dieren.
1. fixatie, dehydratie, paraffine insluiten, snijden, monteren van secties
- Bereid 2% formaldehyde oplossing door het oplossen van Paraformaldehyde in TBS (pH 7,4). Vermijd verwarmen boven 60 °C. Koelen naar RT. formaldehyde oplossing kan worden bewaard bij-20 °C.
- Plaats vers weefsel (hier: muis Long) in een glazen Petri schaaltje met TBS. Met een scalpel, ontleden in stukken van niet meer dan 20 mm x 30 mm x 3 mm groot. Dompel het preparaat onder in de 2% formaldehyde oplossing in TBS.
Opmerking: het volume van fixeermiddel moet ten minste 20 x die van het weefsel. - Fix bij RT voor 8 − 20 h. Breng specimens over naar TBS. plaats in cassettes.
- Dehydraat met een reeks ethanol (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), bij elke stap van 1 uur.
- Heldere specimens 2x in 100% xyleen (dimethylbenzeen), elke stap 1 h.
- Dompel u onder in paraffine 2x bij 60 °C (smelttemperatuur van 54 − 56 °C), elke stap 1 uur.
- Monteer specimens met behulp van insluitings mallen, gebruik de cassette bodem als omslag.
- Laat paraffine stollen en verwijder de insluit mallen.
- Bereid 3 μm weefsel secties, en laat ze drijven op 37 ° c waterbad.
- Vlotter secties op het wateroppervlak op zelfklevende glaasjes (tabel van materialen).
- Inbroed de delen op glasplaten 's nachts bij 40 °C om het weefsel op het glas te doen.
2. rehydratatie, hitte-geïnduceerde epitoop ophalen, kleuring, montage, microscopische analyse
- Plaats secties op glaasjes in racks en dompel ze onder in de media die worden gebruikt voor uitdroging en clearing, in omgekeerde volgorde, bij elke stap gedurende 5 minuten: 2x 100% xyleen, ethanol serie (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
- Verwarm een waterbad met een temperatuurgeregelde kookplaat tot 70 °C. Plaats een potje gevuld met hitte-geïnduceerde epitoop retrieval (hier)-buffer (pH 9; Tabel met materialen), die 10% glycerol als een temperatuur buffer bevatten, in een waterbad. Wanneer de HIER-buffer 70 °C heeft bereikt, plaatst u het rek met dia's in buffer jar.
- Incuberen de glijbanen voor 120 min bij 70 °C.
- Haal het potje uit het waterbad en laat het afkoelen tot RT. Spoel de delen 3x met gedeïoniseerd water en eenmaal met TBS (pH 7,4).
- Verwijder voorzichtig vloeistof uit dia's tussen secties met gewalst filtreerpapier of wattenstaafje, waardoor secties gehydrateerd worden.
- Maak een barrière rond secties met een hydrofobe barrière pen.
- Inincuberen van secties in blokkerende buffer (1% boviene serumalbumine [BSA], 2% normaal Donkey serum, 5% koudwatervis gelatine en detergenten [tabel van materialen] in TBS) bij RT gedurende 30 min om niet-specifieke binding te voorkomen.
- Verdun primaire antilichamen met een concentratie van 1 μg/mL in de blokkerende buffer.
Opmerking: voor mens-en muis netten kan een combinatie van konijn-antilichamen tegen neutrofiele elastase en kippen antilichaam tegen histone 2B worden gebruikt (tabel met materialen). - Plaats dia's in een vochtige kamer. Verwijder de blokkerende buffer en voeg de verdunde primaire antilichamen zonder wassen toe aan de secties met voldoende volume om uitdroging te voorkomen. Bevochtigde vochtige kamer met paraffine folie en incuberen 's nachts op RT.
- Was secties 3x met TBS voor 5 min elk.
- Werkoplossing van secundaire antilichamen in blokkerende buffer voorbereiden. Voor de detectie van primaire antilichamen, gebruik secundaire antilichamen verhoogd in ezel en vooraf geabsorbeerd tegen serumeiwitten van meerdere soorten (tabel van materialen). Afdekkings weefsel secties met werkoplossing van secundaire antilichamen. Overbrenging van dia's naar vochtige kamer, afdichting met paraffine folie. Incuberen gedurende 1 uur bij RT.
Opmerking: Donkey anti konijn geconjugeerd aan Cy2 en Donkey anti kip geconjugeerd aan Cy3 kan worden gecombineerd met een DNA-contra vlek. - Was secties 3x voor 5 min elk met TBS, dan eenmaal voor 5 minuten met gedeïoniseerd water.
- Afdek stukken met afdekmedium (inhoudstafel) en breng afdekglas aan voor het vermijden van Bubble-vorming.
- Laat het montage medium stollen en analyseer vervolgens immunofluorescentie met behulp van een breed-veld microscoop met geschikte band doorlaatfilters of een confocale Microscoop.
Representative Results
Met dit protocol kunnen NET-componenten met succes worden gedetecteerd in paraffine-ingesloten weefsel, zowel van menselijke als van muriene oorsprong. In ongestimuleerde neutrofielen, H2B bevindt zich uitsluitend in de Nucleus en neutrofiele elastase in korrels; Bijgevolg overlappen hun fluorescentie signalen elkaar niet. In tegenstelling, tijdens NETosis en na de netto-vorming, NE, H2B, en DNA deels colocaliseren. Als de groene, rode en blauwe signalen worden afgebeeld, worden gebieden met een colokalisatie als witachtige overlay (figuur 1g, figuur 2Den figuur 3D) getoond. Deze overlay kan ook worden gekwantificeerd met behulp van Image Analysis software. Pixels van overlappende signalen die positief zijn voor groen, rood en blauw, zijn gebruikt om een paarse overlay te maken met de netto-gebieden in afbeelding 1g', figuur 2D'en figuur 3D. Sommige cellen in Figuur 1 en Figuur 2 hebben een kernen-kern, maar zijn negatief voor ne. Er wordt aangenomen dat deze cellen eosinofiele granulocyten zijn.
Als de weefsel secties een dikte hebben van 2 – 3 μm, kunnen ze worden geanalyseerd door microscopie met een breed veld met 10x of 20x doelstellingen. Een voorbeeld wordt weergegeven in Figuur 1, waarin een gedeelte van menselijk blindedarmontsteking weefsel gekleurd voor ne (groen), H2B (rood) en Hoechst 33342 (blauw) afgebeeld. De deelvensters A, C, E en G zijn afkomstig uit een gebied van de sectie met netten, terwijl de panelen B, D, F en H afkomstig zijn uit een ander gebied van dezelfde sectie, dat talrijke neutrofielen bevat (Figuur 1b, ne) maar geen netten. Gebieden met massale netto-formatie kunnen gemakkelijk worden gevonden, zelfs bij lage vergroingen, omdat alle drie de netto-componenten colocaliseren, vaak in draderige spaanders extracellulaire structuren, die in de overlay van de drie kanalen verschijnen als witachtige extracellulaire vezels (figuur 1g ), paarse overlay in afbeelding 1g'.
De kleurings patronen van beide weefsel gebieden zijn duidelijk verschillend, met NE vervat in korrels (Figuur 1b) en DNA in kernen (Figuur 1f). Interessant is dat de kleuring voor H2B nogal zwak is in neutrofiele rijke gebieden (figuur 1d) in vergelijking met netbevattende weefsel (figuur 1c). Dit kan te wijten zijn aan de grootte van het antilichaam (IgY heeft 180 kD vergeleken met 150 kD voor IgG), die kan voorkomen dat de binding aan compact chromatine in intacte kernen, terwijl de toegang tot H2B wordt vergemakkelijkt als het chromatine wordt degecondenseerd zoals het geval is in netten (figuur 1c).
Voor een hogere resolutie moeten confocale microscopen of Widefield-microscopen met deconvolutie worden gebruikt om onscherpe vervaging te minimaliseren. Figuur 2 toont een net-rijk gebied uit hetzelfde menselijke blindedarmontsteking specimen. Het is een maximale projectie van een confocale stapel. NE (groen, Figuur 2a) is te vinden in korrels, maar is ook overvloedig extracellulair, waar het colocaliseert met H2B (rood, Figuur 2b) en DNA (blauw, figuur 2c). De extracellulaire colokalisatie resulteert in een witachtige kleurencombinatie (figuur 2D). Deze pixels die positief zijn voor groen, rood en blauw, zijn gebruikt om een paarse overlay te maken die netten in figuur 2Dpresenteert.
Figuur 3 is een detail van een centraal deel van een muis Long die is geïnfecteerd met Mycobacterium tuberculose (M. TB). Het ophalen van antigeen en de kleurings condities zijn gelijk aan die voor Figuur 1 en Figuur 2. Nogmaals, colokalisatie van alle drie de netto-componenten is duidelijk zichtbaar als witachtige gebieden tussen de neutrofielen, die is gebruikt om een paarse laag te creëren die netten in figuur 3Daangeeft'.
De specificiteit van de kleuring wordt aangetoond in aanvullend figuur 1, die verwaarloosbare kleuring met bestrijdings antilichamen weergeeft, en aanvullende figuur 1a, B toont konijn niet-immuun serum (groen) en kip anti-GFP igy (rood). Figuur 1 C, D toont de kleuring met secundaire antilichamen alleen, de combinatie was hetzelfde als werd gebruikt in Figuur 1, Figuur 2en Figuur 3. Aanvullend figuur 1a, C toont een deel van de humane blindedarmontsteking, vergelijkbaar met Figuur 1 en Figuur 2. Aanvullende figuur 1b, D is muis longweefsel vergelijkbaar met Figuur 3. DNA is gekleurd met Hoechst 33342. Schaalbalk vertegenwoordigt 25 μm.
Figuur 1: breedveld fluorescentiemicroscopie van een paraffine gedeelte van een humaan blindedarmontsteking monster.
Deelvensters A, C, E en G beschrijven een weefselgebied met netten, terwijl de panelen B, D, F en H een ander gebied van dezelfde sectie vertonen dat rijk is aan neutrofielen, maar zonder netto-vorming. Kleuring is tegen NE (a, B; groen), H2B (C, D; rood) en DNA (E, F; blauw). Afbeelding 1g, H staat voor de overlay van alle drie de kanalen. Pixels met een intensiteit tussen 80 en 256 in alle kleuren vertegenwoordigen gebieden van overlappende kleuring voor NE, H2B en DNA en worden geacht te zijn afgeleid van netten of neutrofielen die Netose ondergaan. Deze pixels zijn pseudo-gekleurd als paars in panel G ', waar ze een groot gebied vormen; en in panel H ', waar alleen kleine vlekken worden aangetroffen. Beelden werden genomen met een breed-veld microscoop met behulp van een 20 x objectief, en schaalbalk vertegenwoordigt 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: confocale fluorescentiemicroscopie van de netto-componenten in een humaan blindedarmontsteking monster.
In Figuur 1 werd dezelfde weefsel sectie gebruikt. A) vlekken tegen ne, (B) afbeelding van H2B, en (C) HOECHST 33342 kleuring van het DNA. D) de overlay van alle drie de kanalen. Colokalisatie van alle drie de signalen is pseudo-gekleurd paars in panel D '. Hiervoor werden pixels met een intensiteit > 80 in alle drie de kleuren gedetecteerd met behulp van Volocity 6,3. Het paarse gebied toont netten of neutrofielen die Netose ondergaan. De beelden werden genomen met een confocale microscopie als Z-stacks en gepresenteerd als maximale projectie. Schaalbalk vertegenwoordigt 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: confocale fluorescentiemicroscopie van NET componenten in een muis Long geïnfecteerd met M. TB.
Het is een detail van het centrale deel van een deel van een volledige Long met massale neutrofiele infiltratie. A) kleuring van de ne, (B) H2B kleuring, en (C) DNA-kleuring. D) de overlay van alle drie de kanalen. De paarse overlay in deelvenster D ' geeft pixels aan met intensiteitswaarden van > 80 in alle drie de kleuren die duiden op neutrofielen ondergaat netosis en netten. De beelden werden opgevat als een Z-stapels met een confocale Microscoop en gepresenteerd als maximale projectie. Schaalbalk vertegenwoordigt 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: kleurings regeling met niet-verwante primaire antilichamen. Humaan (a, C) en muriene weefsel(b, D) zoals werd gebruikt voor Figuur 1 en Figuur 2, respectievelijk Figuur 3, werden bevlekt met niet-verwante primaire antilichamen (A, b) of zonder primaire antilichamen (C, D). Als controle primaire antilichamen in panelen A en B werden serum van een niet-geïmmobiliseerd konijn en een kip IgY tegen GFP toegepast. Secundaire antilichamen waren dezelfde als in alle andere vlekken en werden ook gebruikt in de panelen C en D. Zoals verwacht werd in alle omstandigheden verwaarloosbare achtergrondkleuring gedetecteerd, ter illustratie van de specificiteit van de antilichamen die worden gebruikt voor Figuur 1, Figuur 2en Figuur 3. De beelden werden genomen met een confocale Microscoop, DNA gekleurd met Hoechst 33342, en schaalbalk vertegenwoordigt 25 μm. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Discussion
Met een groeiend bewustzijn van de rol van netten tijdens pathogenese9, wint hun detectie in weefsel van patiënten of proefdieren steeds meer aan belang. Paraffine-ingebedde weefselmonsters hebben een aantal voordelen ten opzichte van andere weefsel preparaten (bijv. secties van cryopreserved specimens). Het weefsel conservering in paraffine-ingesloten monsters is duidelijk superieur, en eenmaal ingebed, de monsters worden bewaard voor decennia, waardoor retrograde studies. Voor de opsporing van netten, die filigraan structuren zijn, is een goed monster behoud een voorwaarde voor het gebruik van cryopreserved materiaal, dat gevoelig is voor weefselbeschadiging als gevolg van IJskristal vorming die aanleiding kan geven tot artefacten die morfologisch lijken op Netten.
Voor een optimale bewaring moet weefsel van proefdieren kort na de dood worden vastgesteld, idealiter door perfusie, om autolyse te voorkomen. Als fixeermiddel, vers bereide of vers ontdooide oplossingen van Paraformaldehyde in een geschikte buffer zoals TBS of PBS ore optimaal. Dit is chemisch gedefinieerd in tegenstelling tot formaline preparaten gebruikt voor standaard histologie, en induceert minder weefsel auto fluorescentie. Het menselijk weefsel wordt daarentegen vaak niet direct na excisie vastgesteld, en als fixeermiddel wordt normaalgesproken een 10% verdunning van formaline gebruikt, die 10% tot 15% methanol bevat als stabilisator om polymerisatie te voorkomen, evenals mierenzuur, andere aldehyden en ketonen. . Vaak wordt het weefsel in deze fixatief opgeslagen voor langere tijd voor het insluiten. Het resultaat kan zijn autolyse (afhankelijk van de tijd tussen excisie en fixatie), en overmatige vorming van methyleen bruggen als gevolg van de overfixatie. Formaldehyde fixatie induceert veranderingen in de tertiaire structuur van eiwitten door vorming van intra-en intermoleculaire methyleen bruggen10. Niet-proteinaceeuze celcomponenten zoals nucleïnezuren, koolhydraten en lipiden worden niet direct gerepareerd, maar geïmmobiliseerd in het driedimensionale eiwit netwerk. Voor een succesvolle etikettering moeten methyleen bindingen worden gebroken om de epitopen in het proces van antigeen-opvraging bloot te leggen. Dit wordt bereikt door het verwarmen van weefsel secties gemonteerd op Microscoop dia's in een geschikte warmtegeïnduceerde antigeen retrieval buffer (HIER buffer)11. Onze vorige studie analyseerde de invloed van pH en temperatuur van HIER buffers op de detectie van netto-componenten in geparaffiniseerd weefsel, en bleek dat succesvolle weefsel voorbehandeling voor één component vaak suboptimaal is voor een tweede component8.
In de tussentijd is gebleken dat het verwarmen van het weefsel tot 70 °C in HIER buffer bij een pH van 9 is een goed compromis voor veel netto-componenten en zal behouden goede weefsel behoud, die vaak wordt aangetast bij hogere temperaturen. Er wordt voorgesteld om de ophaaltijd als uitgangspunt te gebruiken, maar vooral bij archiveringsdoeleinden van onbekende fixatie parameters kan de kleurings intensiteit onbevredigend zijn. In dit geval kan verlenging of hogere temperatuur tijdens de ophaal procedure de kleurings efficiëntie verbeteren. Dit kan ook invloed hebben op de Histon 2b-kleuring van het igy-antilichaam dat in ons protocol wordt gebruikt. Zoals weergegeven in Figuur 1, kan degecondenseerde chromatine worden gevonden in neutrofielen die netose ondergaan, evenals in netten die veel sterker zijn met dit antilichaam dan chromatine in rust neutrofielen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan beperkte toegang van de 180 kDa igy molecuul tot compacte kernen en kan verschillen na verhoogde epitoop herstel. Dit kan de bindende efficiëntie zelfs in gebieden van gecondenseerde Chromatin intensiveren, wat zal resulteren in een sterkere fluorescentie in normale kernen van neutrofielen en andere cellen. Het verschil in kleurings efficiëntie tussen neutrofielen die Netose ondergaan en niet-gestimuleerde neutrofielen kan minder uitgesproken zijn dan afgebeeld in Figuur 1. Gebieden van de netto-vorming zou nog steeds worden geïdentificeerd door de co-lokalisatie van NE, H2B, en DNA.
De fixatie procedure kan ook aanzienlijke auto fluorescentie van het weefsel induceren, voornamelijk in het blauwachtige/groene deel van het spectrum. Het is belangrijk om de meeste van deze auto fluorescentie te vermijden door gebruik te maken van adequate smalle band pass fluorescentie filter sets (Wide-Field) of detector instellingen (confocale) die overeenkomen met het emissie maximum van het fluor chroom dat met blauwe excitatie wordt gebruikt, bijvoorbeeld Cy2, Alexafluor 488. in extreme gevallen van autofluorescentie moet het blauwachtige/groene deel van het spectrum worden vermeden. In plaats daarvan kunnen fluorescentie signalen gemakkelijker worden gedetecteerd in het verre rode deel van het spectrum (bijv. secundaire antilichamen gekoppeld aan CY 5 of Alexafluor 635), maar dit vereist filterloze zwart/witte camera's of confocale microscopen. Omdat het menselijk oog buiten 600 nm nogal ongevoelig is, kunnen er nauwelijks rode fluorescentie signalen worden gedetecteerd met behulp van een oculars. In ieder geval is het belangrijk om negatieve controles (bijv. niet-immuunsera/Isotype-controles in plaats van primaire antilichamen of het weglaten van primaire antilichamen) te gebruiken om geschikte blootstellings tijden of detector-instellingen te bepalen.
Weefsel secties van 1 − 2 μm kunnen worden geanalyseerd met breedveld microscopen met behulp van 10x of 20x doelstellingen. Deze lenzen bieden een grote focale diepte, dus (bijna) de hele weefsel sectie zal scherp worden gesteld. Dit kan worden gebruikt om snel weefsel secties voor gebieden van de netto-vorming te scannen als ze voldoende groot zijn (zoals in Figuur 1). De colokalisatie van de groene (NE), rode (H2B) en blauwe (DNA) kanalen resulteert in een witte kleuring die gebieden van de netto-vorming aangeeft (figuur 1g). Voor hogere vergroingen zijn confocale of breedveld microscopen met deconvolutie noodzakelijk. Figuur 2 toont de details van het monster van de humane blindedarmontsteking, ook gebruikt voor Figuur 1. In Fig. 2alokaliseert ne zich tot kleine puntjes (korrels), maar een groot deel is extracellulair, vaak vormen strepen die OVERLAPPEN met H2B (Figuur 2b) en DNA (figuur 2c). Deze colokalisatie resulteert in een witachtige overlay die netten aangeeft (figuur 2D). Een vergelijkbaar patroon kan gevonden worden in de Long sectie van een muis geïnfecteerd met M. tuberculose (Figuur 3).
De hier gepresenteerde specimens worden gekenmerkt door gebieden met een hoge mate van netto-vorming, die zelfs bij lage vergroting kan worden geïdentificeerd. Afhankelijk van de weefsel dichtheid en de respectieve stimulus, kan de netto-vorming veel minder uitgesproken zijn, tot aan de netto vorming van kleine groepen neutrofielen (Zie voor een voorbeeld in myocarditis een eerdere publicatie12). Men gelooft dat dit protocol zal helpen om meer onderzoek naar netten in weefsel te bevorderen en hopelijk hulp te verlenen bij het ontrafelen van niet-erkende rollen van netten bij de vorming of preventie van ziekten.
Disclosures
De financieringsbron van dit werk is de Max Planck Society. We danken Arturo Zychlinsky voor het kritisch lezen van het manuscript en Philippe Saikali voor het muis weefsel.
Acknowledgments
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
| cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
| donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
| embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
| embedding molds | Sakura | 4162 | |
| embedding station | Microm | AP280 | |
| ethanol | Roth | 9065.4 | |
| filter paper, rolled | OCB | ||
| forceps | Dumont | 7a | |
| glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
| glycerol | Roth | 3783.1 | |
| HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
| moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
| Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
| normal donkey serum | Merck | S30 | |
| PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
| paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
| paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
| petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
| rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
| racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
| scalpel | Braun | Fig.22 | |
| Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
| tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
| Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
| Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
| Tween 20 | Fluka | 93773 | |
| water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
| widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
| xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).
