Summary
מלכודות מוכילות (רשתות) הן מבנים תלת-מימדיים שנוצרו על-ידי ממריצים נויטרופילים גרנולוציטים. זה הפך ברור בשנים האחרונות כי רשתות מעורבות במגוון רחב של מחלות. זיהוי רשתות ברקמות עשויות להיות בעלת רלוונטיות אבחונית, ולכן נדרשות פרוטוקולים מתוקננת לתיוג רכיבי NET.
Abstract
נויטרופילים גרנולוציטים, הנקראים גם פולימולציטים ברורים (PMN) בשל הגרעין lobulated שלהם, הם סוג שופע ביותר של לוקיציטים. הם בוגרים במח העצם ומשתחררים לתוך הדם ההיקפי, שם הם מוהים במשך כ-6-8 שעות; עם זאת, ברקמה, הם יכולים לשרוד במשך ימים. על ידי החתלה באמצעות האנדותל, הם משאירים את זרם הדם, נכנסים לרקמות, ועוברים לכיוון האתר של זיהום לאחר הדרגתיות. נויטרופילים יכול להילחם מיקרואורגניזמים הפולשים על ידי phagocyציטוזה, degranulation והדור של מלכודות נויטרופילים מסחטות (רשתות). פרוטוקול זה יסייע לזהות רשתות ב פרפין-רקמה מוטבעת. רשתות הן תוצאה של תהליך שנקרא Neציטוזה, אשר מוביל לשחרור של גרעיני, הרכיבים הגרעיניים, ו cytoplasmic מחיים (החיוניות החיונית) או למות (התאבדותי Neציטוזה) נויטרופילים. באופן מתורבת, רשתות מהוות מבנים כמו ענן, אשר תופסים שטח מספר פעמים גדול יותר מאשר התאים שמהם הם ירדו. עמוד השדרה של רשתות הוא כרומטין, שאליו מבחר של חלבונים ופפטידים המקורם בגרגירים וציטופלסמה הם כבולים. ובכך, ריכוז מקומי גבוה של תרכובות רעילות מתוחזק כך רשתות יכול ללכוד ולהשבית מגוון של פתוגנים כולל חיידקים, פטריות, וירוסים, טפילים, בעוד דיפוזיה של הרכיבים נטו פעיל מאוד מוביל לנזק ב הרקמה השכנה מוגבלת. עם זאת, בשנים האחרונות התברר כי רשתות, אם נוצרו בשפע או מנוקה במידה מספקת, יש פוטנציאל פתולוגי החל ממחלות אוטואימוניות לסרטן. לפיכך, איתור רשתות בדגימות רקמות עשויות להיות בעלת משמעות אבחונית, וזיהוי רשתות ברקמה החולה יכול להשפיע על הטיפול במטופלים. מאחר שפרפין-דגימות רקמה מוטבעות הן הדגימה הסטנדרטית המשמשת לניתוח פתולוגי, היא הייתה מבוקשת להקמת פרוטוקול לצביעת הפלורסנט של רכיבי NET ברקמת פרפין באמצעות נוגדנים מסחרית זמינים.
Introduction
מלכודות בתמציות נויטרופילים (רשתות) יש מבנה תלת מימדי מורכב. סריקה ברזולוציה גבוהה-אלקטרון ניתוח מיקרוסקופיים גילה כי הם מורכבים סיבים חלקים עם קוטר של 15 למעלה ל-20 ננומטר (כרומטין) עם תחומים כולוניים של > 25 ננומטר אשר ככל הנראה מורכב ממגוון של כ 30 גרגרים cytoplasmic חלבונים ופפטידים1,2. כאשר נוצר בתוך מבחנה מבודד נויטרופילים, רשתות יכול להיות מזוהה על ידי כתמים של שניים או יותר מרכיביו על ידי immunofluorescence (למשל, האבנים ונויטרופילים אלסטסה [NE]). בעזרת פולימלוציטים בלתי מוסטימולציה (PMN), האבנים ממוקמות באופן בלעדי בגרעין, בעוד NE כלולה בגרגירים. במהלך הניטוזה, NE נכנס לגרעין, שם הוא מעבד האבנים3,4. הרשתות מתאפיינות בלוקליזציה של רכיבים, אשר מופרדים באופן ברור באמצעות נויטרופילים שאינם ממריצים. מכיוון שכרגע אין נוגדנים שמזהים באופן בלעדי את האפיסקופים הספציפיים של NET (כלומר, אינם מגיבים עם נויטרופילים תמימים), מזהה לוקליזציה של חלבונים נויטרופילים ברשתות היא הדרך היחידה לזהות רשתות.
ברקמה, לא ניתן לזהות רשתות בקושי על ידי כתמי היסטולוגית קונבנציונליים (למשל, על ידי הכתם עם המטאוקסילין/אאוזין [H & E], אשר מתארת רשתות כגון כחלחל בהיר וחיוור). רק כאשר בשפע מאוד, הרשתות יכולות להיות ברורות עם כתמים H & E, כמו בתרובי5. מאחר שרשתות מפוזר כשלעצמה, יש לשמור על מבנה הרקמה בצורה אופטימלית, כך שההכנות לצורך הקפאת הפריטים הקפואים הן מיטביות לניתוח רשתות ברקמות. במקום זאת, קיבוע פורמלדהיד הטבעה פרפין הוכח לשמר מבנה נטו רקמות היטב2. (אימונולוגית) בדיקה היסטולוגית של מקטעי פרפין-רקמה מוטבעת היא השיטה הסטנדרטית לניתוח פתולוגי. כמו רקמה בלוקים פרפין הוא שימור גם בטמפרטורת החדר (RT), דגימות רקמות מעבודה אבחון יומי ניתן להשוות עם דגימות שהיו מוכנים לפני שנים, עם שאלות וטכניקות שהופיעו לאחרונה. רשתות ברקמה לא זוהו עד לאחרונה, וניתוח מפורט של היווצרות והסרה של NET במהלך מחלות עלול להוביל תובנות חדשות לפתוגנזה. השימוש ברקמה המוטבעת של הפרפין הוא בעל יתרון רב-ערך כדי לאפשר ניתוח של חומר ארכיוני ולערוך לימודי רטרוספקטיבה6. בהחלט, הטבות אלה מגיעות במחיר. לפני הטבעה של פרפין, הרקמה צריכה להיות פורמלדהיד-קבוע, מיובש ומחומם מעל 50 ° c. הליכים אלה להביא את הרקמה האוטומטית לרקמות כמו גם מיסוך אפיפי.
כדי להגביל את ממצאים קיבעון, זמן קיבעון צריך להישמר למינימום, כך גודל של דגימות רקמות לא יעלה על שטח של 20 מ"מ x 30 מ"מ עם העובי ~ 3 מ"מ. דגימות של גודל זה קבועים לחלוטין לאחר הדגירה לילה ב RT ב פורמלדהיד, באופן אידיאלי ואחריו התייבשות ישירה הטבעה פרפין. לחילופין, ניתן לאחסן דוגמאות קבועות במאגר למשך 1 או 2 ימים. עבור מחקרים אימונוofor, הקיבעון צריך להיות טרי מוכן פאראפורמלדהיד התפרקה בתוך מאגר מתאים (למשל, מלח מומס באגירה [PBS] או מלוחים טריס באגירה [TBS]). במהלך הכנת התיקונים, יש לשמור על הטמפרטורה מתחת 60 ° c כדי למנוע היווצרות חומצה פורמית. Formalin, שהוא קבע סטנדרטית עבור הפתולוגיה, לא צריך להיות בשימוש מאז הוא מכיל מתנול, אלהידס אחרים, ketones, ו-formalin חומצה. אלה זיהומים להוביל הסוואה מוגברת מיסוך הרקמה האוטומטית רקמות משמעותי.
עבור החיסונית מוצלחת, מיסוך אפירופה צריך להיות להחזירה בתהליך שנקרא לאיחזור אנטיגן. חתכי הרקמה מחוממים בתוך מאגר מתאים, הנחשב לשבור גשרים מתילן, כך שהאפיסקופים הופכים לנגישים לנוגדנים7. לאיתור רשתות, המושרה בחום לשליפה אפיפי (HIER) הוא המועדף על שיטות אחרות כגון השימוש באנזימים פרוטנוגד חרדה. באופן שגרתי, אימונויניום של מקטעי פרפין מבוצעת עם נוגדן אחד ואחריו נוגדן משני מתויג peroxidase, אשר מזוהה עם מצע מזרז. לעומת immunofluorescence שיטות איתור מבוססות אנזימים יש רזולוציה מרחבית נמוכה בשל הפצת המצע מזרז, ובדרך כלל, זיהוי סימולטני של יותר מאנטיגן אחד מוגבל6.
כמו כרגע לא קיימים נוגדנים כי באופן בלעדי לאגד רשתות, פרוטוקול זה משמש כדי לתייג שני חלבונים, היסטון 2b, אשר גרעיני, ו נויטרופילים elastase, אשר מקומי בגרגירים. ב נויטרופילים בלתי מגורה, חלבונים אלה מופרדים, אבל הם מותאמים לשפות נויטרופילים שעברו בניוסיס ורשתות. זיהוי סימולטני של שני אנטיגנים יכול להיות מושגת עם שני נוגדנים עיקריים שהועלו במחשבים מארחים שונים ושני מינים ספציפיים משני נוגדנים מתויג עם fluorochromes שונים. הדו ח הזה הוא סטנדרטיזציה של הפרוטוקול שפורסם בעבר שלנו8 ומשתמש בשילוב של שני נוגדנים זמינים מסחרית כי באופן אמין להכתים רכיבי NET ברקמה מוטבעת פרפין, הן טרי וארכיוני, של מוצא אנושי ומורטין.
Protocol
הפרוטוקולים של הרקמה אושרו על ידי לנדסמיט, ברלין, גרמניה (G0121/16). הניסויים נערכו בהתאם להנחיה האירופאית 2010/63/האיחוד האירופי על טיפול, רווחה וטיפול בבעלי חיים.
1. קיבוע, התייבשות, פרפין, הטמעה, הרכבה של סעיפים
- להכין 2% פורמלדהיד פתרון על ידי המסת פאראפורמלדהיד ב-TBS (pH 7.4). הימנעו מחימום מעל 60 ° c. מגניב ל-RT. ניתן לאחסן פתרון פורמלדהיד ב-20 ° c.
- מניחים רקמה טרייה (כאן: ריאות העכבר) לתוך צלחת פטרי זכוכית עם TBS. עם אזמל, נתח לחתיכות לא יעלה 20 מ"מ x 30 מ"מ x 3 מ"מ בגודל. לטבול הדגימה לתוך 2% פורמלדהיד פתרון ב-TBS.
הערה: הנפח של הקבע צריך להיות לפחות 20x של הרקמה. - תקן ב-RT עבור 8-20 h. העברת דגימות ל-TBS. מקום לקלטות.
- מייבשים באמצעות סדרה של אתנול (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), עם כל צעד הנמשך 1 h.
- ברור דגימות 2x ב 100% קסילין (diמתילבנזין), כל שלב 1 h.
- השתזפו בפרפין 2 x ב 60 ° צ' (טמפרטורת התכה 54-56 ° c), כל צעד 1 h.
- מטען דגימות בעזרת תבניות הטבעה, השתמש בתחתית הקלטת ככיסוי.
- תן פרפין לגבש ולהסיר תבניות הטבעה.
- הכינו 3 מקטעי רקמות יקרומטר, והרשו להם לצוף ב-37 מרחץ המים ב° c.
- הצפת קטעים על משטח מים על שקופיות זכוכית דביק (לוח חומרים).
- מסגרות הדגירה על זכוכית מחליק לילה ב 40 ° צ' כדי לקשר את הרקמה לזכוכית.
2. החזרת החום, המושרה, כתמים, הרכבה, ניתוח מיקרוסקופי
- המקום סעיפים על שקופיות זכוכית בארונות תקשורת ושופך אותם לתוך התקשורת המשמש להתייבשות וניקוי, בסדר הפוך, עם כל צעד עבור 5 דקות: 2x 100% xylene סדרת אתנול (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
- מחממים אמבט מים עם צלחת חמה מבוקרת טמפרטורה עד 70 ° c. מניחים צנצנת מלאה בשליפה מושרה בחום (HIER)-מאגר (pH 9; טבלת חומרים), המכילה 10% גליצרול כמאגר טמפרטורה, לאמבט מים. כאשר מאגר HIER הגיע 70 ° c, הצב את ארון התקשורת עם שקופיות בצנצנת מאגר.
- דגירה שקופיות עבור 120 דקות ב 70 ° c.
- להסיר את הצנצנת מן האמבט מים ולתת לו להתקרר RT. לשטוף סעיפים 3 x עם מים מוכי פעם עם TBS (pH 7.4).
- הסר בזהירות את הנוזל משקופיות בין מקטעים עם נייר סינון מתגלגל או ספוגית כותנה, השארת חלקים מהתייבשות.
- צור מכשול סביב מקטעים עם עט מכשול הידרופובי.
- מקטעים מבית היוצר במאגר חסימת מאגר (1% בסרום שיסמין [BSA], 2% סרום חמור רגיל, 5% מים קרים הג'לטין וחומרי ניקוי [טבלת חומרים] ב-TBS) ב-RT עבור 30 דקות כדי למנוע איגוד לא ספציפי.
- לדלל נוגדנים עיקריים בריכוז של 1 μg/mL במאגר חסימת.
הערה: עבור רשתות האדם והעכבר, שילוב של נוגדן הארנב נגד נויטרופילים elastase ונוגדן עוף נגד Histone 2B ניתן להשתמש (לוח חומרים). - מניחים שקופיות בתא לח. הסרת מאגר חוסם ולהוסיף את הנוגדנים הראשוניים מדולל בלי לשטוף את הסעיפים באמצעות נפח מספיק כדי למנוע ייבוש. אטם לחדר לח עם סרט פרפין ו-דגירה לילה ב RT.
- לשטוף סעיפים 3 x עם TBS עבור 5 דקות כל אחד.
- הכינו פתרון עבודה של נוגדנים משניים במאגר חסימת. לאיתור נוגדנים ראשוניים, השתמש בנוגדנים משניים שהועלו בחמור ונספג מראש נגד חלבונים בסרום ממינים מרובים (טבלת חומרים). כיסוי מקטעים רקמה עם פתרון עבודה של נוגדנים משניים. העברת שקופיות לחדר לח, חותם עם סרט פרפין. . מודטה בשביל 1 h ב-RT
הערה: החמור נגד הארנב מצוCy2 החמור נגד עוף מצוב ל Cy3 יכול להיות משולב עם כתם DNA. - לשטוף סעיפים 3 x עבור 5 דקות כל אחד עם TBS, ולאחר מכן פעם 5 דקות עם מים מלא.
- מקטעים לכסות עם הרכבה בינונית (טבלה של חומרים) ולהחיל זכוכית כיסוי הימנעות היווצרות בועה.
- תנו הרכבה בינונית, ולאחר מכן לנתח אימונוoforto באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב עם מסנני להעביר הלהקה מתאים או מיקרוסקופ קונפוקלית וקד.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לזהות רכיבי NET בהצלחה ברקמת פרפין-מוטבע הן של המקור האנושי והן מקורו. ב נויטרופילים בלתי מגורה, H2B ממוקם באופן בלעדי בגרעין ו נויטרופילים elastase בגרגירים; כתוצאה מכך, אותות הזריחה שלהם אינם חופפים. לעומת זאת, במהלך הקמתה ולאחר היווצרות נטו, NE, H2B, ו-DNA באופן חלקי לוקליזציה. אם התמונה מצויירת כאותות ירוקים, אדומים וכחולים, אזורים של לוקליזציה מתוארים כשכבת-על לבנבן (איור 1G, איור 2D ואיור 3d). ניתן גם לכמת את הכיסוי באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. פיקסלים מאותות חופפים החיוביים לירוק, אדום וכחול שימשו ליצירת כיסויסגול המתאראזורים נטו באיור 1g, איור 2d ואיור 3d'. לחלק מהתאים באיור 1 ובאיור 2 יש גרעינים מלובטים אך שליליים עבור NE. הוא האמין כי תאים אלה הם אאוזינופיל גרנולוציטים.
אם מקטעי רקמות יש עובי של 2 – 3 μm, הם יכולים להיות מנותח על ידי מיקרוסקופ שדה רחב באמצעות מטרות 10x או 20x. דוגמה מוצגת באיור 1, אשר מתארת קטע של רקמת התוספתן האנושית ויטראז עבור NE (ירוק), H2B (אדום) ו-Hoechst 33342 (כחול). פאנלים A, C, E, ו-G הם מאזור בחלק המכיל רשתות, בעוד פאנלים B, D, F, ו-H הם מאזור אחר של אותו סעיף, אשר מכיל מספר נויטרופילים (איור 1B, NE) אבל אין רשתות. אזורים עם היווצרות נטו מסיבי ניתן למצוא בקלות גם בהאצות נמוכות, מאז כל שלושת הרכיבים נטו להתאים, לעתים קרובות מבנים המתכלים, אשר כיסוי של שלושת הערוצים מופיעים כמו סיבים לבנבן מסחטות (איור 1G ), כיסוי סגול באיור 1g.
דפוסי הצביעת של שני שטחי הרקמה שונים בבירור, עם NE הכלול בגרגירים (איור 1B) ו-DNA ב גרעינים (איור 1b). מעניין, הצביעת עבור H2B הוא חלש למדי באזורים העשירים נויטרופילים (איור 1D) לעומת הרקמה המכילה נטו (איור 1d). זה יכול להיות בגלל גודל הנוגדן (IgY יש 180 kD לעומת 150 kD עבור Igy), אשר עשוי למנוע כריכת כרומטוטין קומפקטית בגרעינים שלמים, בעוד הגישה H2B הוא הקלה אם כרומטין הוא לפרק כמו במקרה ברשתות (איור 1C).
לקבלת רזולוציה גבוהה יותר, מיקרוסקופ קונפוקלית או מיקרוסקופים שטח עם פירוק יש להשתמש כדי למזער את טשטוש מיקוד. איור 2 מתארת אזור עשיר ברשת מתוך הדגימה של התוספתן האנושי. זוהי הקרנה מקסימלית של מחסנית קונפוקלית וקד. NE (ירוק, איור 2A) נמצא בגרגירים, אבל הוא גם שופע extracellularly, שם הוא לוקליזציה עם H2B (אדום, איור 2a) ו-DNA (כחול, איור 2a). לוקליזציה החילוץ תוצאות בשילוב צבע לבנבן (איור 2D). פיקסלים אלה חיוביים לירוק, אדום וכחול שימשו ליצירת כיסוי סגול המציג רשתות באיור 2D.
איור 3 הוא פרט של מקטע מרכזי מריאות העכבר נגוע בשחפת פטרת (M. tb). התנאים לאחזור אנטיגן וכתמים זהים לאלה של איור 1 ואיור 2. שוב, לוקליזציה של כל שלושת רכיבי NET גלוי בבירור כמו אזורי לבנבן בין נויטרופילים, אשר נעשה שימוש כדי ליצור שכבה סגול המציין רשתות באיור 3D'.
היחודיות של ההכתמים מומחש באיור המשלים 1, המתאר כתמים זניחים עם נוגדנים לשליטה, ואיור משלים 1A, B מתאר ארנב ללא החיסון (ירוק) ועוף אנטי gfp igy (אדום). איור 1 C, D מראה את הצביעת עם נוגדנים משניים בלבד, השילוב היה זהה לשימוש באיור 1, איור 2, ואיור 3. איור משלים 1A, C מראה קטע של התוספתן האנושי דומה לאיור 1 ואיור 2. איור משלים 1B, D היא רקמת הריאה של העכבר דומה לאיור 3. דנ א מוכתם עם הואכסט 33342. סרגל קנה המידה מייצג 25 μm.
איור 1: המיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב של חלק פרפין של דגימת התוספתן האנושית.
פאנלים A, C, E, ו-G מתארים אזור רקמה עם רשתות, בעוד פאנלים B, D, F, ו-H להראות אזור אחר של אותו מקטע כי הוא עשיר ב נויטרופילים אך ללא היווצרות נטו. כתמים הוא נגד NE (A, B; ירוק), H2B (C, D; אדום), ו-DNA (E, F; כחול). איור 1G, H מייצג את שכבת הכיסוי של כל שלושת הערוצים. פיקסלים בעלי עוצמה בין 80 ל-256 בכל הצבעים מייצגים אזורים של כתמים חופפים עבור NE, H2B, ו-DNA, נחשבים לנגזרים מרשתות או מהנויטרופילים העוברים בניוסיס. פיקסלים אלה היו מדומה בצבע סגול בלוח G, שם הם יוצרים שטח גדול; ובלוח H ', שם מצויים רק נקודות קטנות. תמונות צולמו עם מיקרוסקופ שדה רחב באמצעות מטרה 20x, וסרגל קנה מידה מייצג 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיקרוסקופ מוקדי מיקוד של רכיבי NET במדגם התוספתן האנושי.
השתמשו באותו מקטע של הרקמה הראשונה באיור 1 . (א) מכתים נגד NE, (ב) תיאור של H2B, ו (ג) HOECHST 33342 כתמים של דנ א. (ד) שכבת הכיסוי של כל שלושת הערוצים. לוקליזציה של כל שלושת האותות הוא פסאודו בצבע סגול בלוח D '. בשביל זה, פיקסלים עם עוצמה > 80 בכל שלושת הצבעים זוהו באמצעות Volocity 6.3. האזור הסגול מתאר רשתות או נויטרופילים שעוברים בניוזה. התמונות צולמו עם מיקרוסקופ ממוקד כמו Z-ערימות והציגו כהקרנה מקסימלית. סרגל קנה מידה מייצג 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: המיקרוסקופיה הקונקלית של רכיבי NET בריאה העכבר נגוע M. tb.
זהו פרט מן החלק המרכזי של קטע של ריאה מלאה עם חדירה מסיבית נויטרופילים. (א) מכתים, (ב) H2B כתמים, ו (ג) כתמים DNA. (ד) שכבת הכיסוי של כל שלושת הערוצים. כיסוי סגול בפאנל D ' מציין פיקסלים עם ערכי עוצמה של > 80 בכל שלושת הצבעים המציינים נויטרופילים שעוברים netosis כמו גם רשתות. התמונות נלקחו כמו Z-ערימות עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד והציגו כהקרנה מקסימלית. סרגל קנה מידה מייצג 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: צביעת שליטה עם נוגדנים ראשוניים לא קשורים. הגוף האנושי (א, ג) ורקמת המורין (ב, ד) כפי ששימש לאיור 1 ואיור 2, ואיור 3, בהתאמה, היו מוכתמים בנוגדנים ראשוניים לא קשורים (א, ב) או ללא נוגדנים ראשיים (C, D). כמו שליטה נוגדנים העיקרי פאנלים A ו-B, סרום מארנב לא החיסון ו IgY עוף נגד GFP הוחלו. נוגדנים משניים היו זהים כמו המוצג בכל ההכתמים אחרים משמש גם חלוניות C ו-D. כצפוי, בכל התנאים, זוהה כתמים ברקע זניח, המדגימה את הספציפיות של הנוגדנים המשמשים לאיור 1, איור 2, ואיור 3. התמונות צולמו עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, דנ א מוכתם עם hoechst 33342, ואת סרגל בקנה מידה מייצג 25 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.
Discussion
עם המודעות הגוברת לתפקיד הרשתות במהלך הפתוגנזה9, האיתור שלהם ברקמה מחולים או בעלי חיים ניסיוניים הוא צובר חשיבות גוברת. פרפין-דגימות רקמה משובצות יש מספר יתרונות לעומת ההכנות רקמות אחרות (למשל, סעיפים של יצורים הcryשמורות). שימור רקמות בדגימות פרפין מוטבע הוא מעולה באופן ברור, ופעם מוטבע, הדגימות נשמרות במשך עשורים, המאפשר לימודי נסיגה. לאיתור רשתות, שהן מבני הפיליבנים, שימור טוב לדוגמה הוא פסק דין מקדים החוצה את השימוש בחומר cryopreserved, אשר נוטה נזק לרקמות בשל היווצרות גביש הקרח שיכול להצמיח פריטים מורפולוגית הדומה רשתות.
לשימור אופטימלי, הרקמה מבעלי החיים הניסיוניים צריכה להיות קבועה זמן קצר לאחר המוות, באופן אידיאלי על ידי perfusion, כדי למנוע אוטוליזיס. כמו fixative, טרי מוכן פתרונות מופשרים של פאראפורמלדהיד במאגר מתאים כמו TBS או PBS עפרות האופטימלי. זה מוגדר כימית בניגוד להכנות פורמאלין המשמש היסטולוגיה סטנדרטי, וגורם מאוד לקרינה אוטומטית רקמות. לעומת זאת, רקמת האדם לעתים קרובות אינה קבועה ישירות לאחר הכריתה, וכמו מתוקן, בדרך כלל 10% דילול של פורמלין מנוצל אשר מכיל 10% כדי 15% של מתנול כמיצב כדי למנוע פולימוניזציה, כמו גם חומצה פורמית, אלדטים אחרים, והקטונים . לעתים קרובות, הרקמה מאוחסנת זה קבע עבור כמויות ממושכות של זמן לפני הטבעה. התוצאה יכולה להיות אוטומטית (בהתאם לזמן שבין כריתה לקיבעון), והיווצרות מוגזמת של גשרים מתילן עקב קיבוע יתר. קיבוע פורמלדהיד מעורר שינויים במבנה השלישוני של חלבונים על-ידי היווצרות גשרים מתילן פנים ובין-מולקולריים10. הרכיבים שאינם פרוטטינואאוס תאים כמו חומצות גרעין, פחמימות ושומנים אינם קבועים ישירות, אבל מקיבוע ברשת חלבון תלת מימדי. עבור תוויות מוצלחות, איגרות חוב מתילן יש לשבור כדי לחשוף את האפיסקופים בתהליך של אחזור אנטיגן. זה מושגת על ידי חימום של מקטעי רקמות רכוב על שקופיות מיקרוסקופ במאגר מתאים המושרה החום אנטיגן מאגר (HIER מאגר)11. המחקר הקודם שלנו ניתח את השפעת ה-pH והטמפרטורה של מאגרי hier על זיהוי של רכיבי NET ברקמת paraf, והוא נמצא כי הרקמה המוצלחת מראש עבור רכיב אחד לעתים קרובות הוא אטען עבור רכיב שני8.
בינתיים, זה נמצא כי לחמם את הרקמה 70 ° c במאגר HIER ב-pH של 9 היא פשרה טובה עבור רכיבי NET רבים ישמרו על שימור רקמות טוב, אשר לעיתים קרובות להתפשר בטמפרטורות גבוהות יותר. הוא מוצע להשתמש בזמן האחזור המצוין כנקודת התחלה, אבל במיוחד עם דגימות ארכיוני של פרמטרים לא ידוע הקיבעון, עוצמת הצביעת יכול להיות משביע רצון. במקרה זה, הארכה של או טמפרטורה גבוהה יותר במהלך הליך אחזור יכול לשפר את היעילות מכתים. זה יכול גם להשפיע על כתמים 2b היסטון של הנוגדן igy בשימוש בפרוטוקול שלנו. כפי שמוצג באיור 1, ניתן למצוא את כרומטין כרומודנט העובר בתהליך של נויטרופילים, כמו גם כתמי רשת הרבה יותר חזק עם נוגדן זה לעומת כרומטין במנוחה נויטרופילים. זה כנראה בשל גישה מוגבלת של 180 kDa IgY מולקולה כדי לדחוס גרעינים ועשויים להיות שונים לאחר התאוששות אפירופה מוגברת. הדבר עשוי להעצים את יעילות הכריכה גם באזורים של כרומטין מעובה, שיגרמו לזריחה חזקה יותר בגרעינים רגילים של נויטרופילים ותאים אחרים. ההבדל בצביעת היעילות בין נויטרופילים שעברו שאינם ממריצים ו נויטרופילים לא מגורה יכול להיות פחות מבוטא מאשר מתואר באיור 1. תחומי היווצרות נטו עדיין יזוהו על ידי לוקליזציה של NE, H2B, ו-DNA.
הליך הקיבוע יכול גם לגרום לקרינה אוטומטית משמעותית של הרקמה, בעיקר בחלק כחלחל/ירקרק של הספקטרום. חשוב למנוע את רוב האור האוטומטי הזה על ידי שימוש מספיק צר בנדנה באמצעות מסנן באמצעות מסננים (רחב שדה) או גלאי הגדרות (confocal) התואמים את הפליטה המקסימלית של fluorochrome בשימוש עם עירור כחול, למשל, Cy2, Alexafluor 488. במקרים קיצוניים של קרינה פלואורסצנטית, יש להימנע מהחלק הכחלחל/ירקרק של הספקטרום. במקום, אותות הזריחה ניתן להבחין קל יותר בחלק האדום הרחוק של הספקטרום (למשל, נוגדנים משניים מצמידים Cy 5 או alexafluor 635), אבל זה דורש מסנן שחור/לבן פחות או מיקרוסקופ קונפוקלית. מאז העין האנושית היא חסרת רגישות למדי מעבר 600 ננומטר, הרבה אותות פלואורסצנטית אדום בקושי ניתן להבחין באמצעות oculars. בכל מקרה, חשוב להשתמש בפקדים שליליים (למשל, שאינם מערכת חיסונית/איזוtype שולטת במקום נוגדנים ראשוני או משמיט נוגדנים ראשוניים) כדי לקבוע את זמני חשיפה מתאימים או הגדרות גלאי.
מקטעי רקמות של 1-2 יקרומטר ניתן לנתח עם מיקרוסקופים שטח רחב באמצעות מטרות 10x או 20x. עדשות אלה לספק עומק מוקד גדול, כך (כמעט) מקטע הרקמה כולה יהיה בפוקוס. ניתן להשתמש באפשרות זו כדי לסרוק במהירות את מקטעי הרקמה לאזורים של היווצרות NET אם הם גדולים מספיק (כמו באיור 1). הלוקליזציה של הערוצים הירוקים (NE), אדום (H2B) וכחול (ה-DNA) תוצאות באזורים לבנים המצביעים על היווצרות נטו (איור 1G). בעבור הגדלה, מיקרוסקופים או מיקרוסקופ שדה רחב עם פירוק הם נחוצים. איור 2 מראה פרטים של הדגימה של התוספתן האנושית משמש גם לאיור 1. באיור 2A, NE לאתר נקודות קטנות (גרגירים), אבל שיעור גדול הוא מסחטות, לעתים קרובות להרכיב פסים אשר חופפים עם H2B (איור 2a) ו-DNA (איור 2a). לוקליזציה זו יוצרת כיסוי לבנבן המציין רשתות (איור 2D). דפוס דומה מאוד ניתן למצוא בסעיף הריאות של עכבר נגוע M. שחפת (איור 3).
הדגימות המוצגות כאן מתאפיינות בתחומים בעלי רמה גבוהה של היווצרות נטו, שניתן לזהותה גם בהגדלה נמוכה. בהתאם לצפיפות רקמות הגירוי המתאים, היווצרות נטו יכול להיות הרבה פחות מבוטא, למטה להקמת NET של קבוצות קטנות של נויטרופילים (לדוגמה יקרדיטיס, לראות פרסום קודם12). הוא האמין כי פרוטוקול זה יסייע לטפח מחקר נוסף על רשתות ברקמה ובתקווה לסייע בפיתוח תפקידים לא מוכרים של רשתות בהיווצרות או מניעת מחלות.
Disclosures
מקור המימון של עבודה זו הוא חברת מקס פלאנק. אנו מודים לארטורו זיכלינסקי על קריאה ביקורתית של כתב היד ופיליפ סאקאלי על רקמת העכבר.
Acknowledgments
. למחברים אין מה לגלות
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
| cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
| donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
| embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
| embedding molds | Sakura | 4162 | |
| embedding station | Microm | AP280 | |
| ethanol | Roth | 9065.4 | |
| filter paper, rolled | OCB | ||
| forceps | Dumont | 7a | |
| glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
| glycerol | Roth | 3783.1 | |
| HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
| moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
| Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
| normal donkey serum | Merck | S30 | |
| PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
| paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
| paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
| petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
| rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
| racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
| scalpel | Braun | Fig.22 | |
| Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
| tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
| Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
| Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
| Tween 20 | Fluka | 93773 | |
| water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
| widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
| xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).
