Summary
호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 자극 된 호중구 과립구에 의해 생성 된 3 차원 구조입니다. 최근 몇 년 동안 NET가 다양한 질병에 관여하고 있음이 분명해졌습니다. 조직에서 NET를 검출하는 것은 진단 관련성이 있을 수 있으므로 NET 성분을 라벨링하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.
Abstract
호중구 과립구는 또한 그들의 lobulated 핵 때문에 다형성 핵 백혈구 (PMN)에게 불린, 백혈구의 가장 풍부한 모형입니다. 그(것)들은 골수에서 성숙하고 말초 혈액으로 풀어 놓입니다, 그(것)들은 대략 6-8 시간 동안 순환합니다; 그러나 조직에서는 며칠 동안 생존 할 수 있습니다. 내피를 통해 diapedesis에 의해, 그들은 혈 류를 떠나, 조직을 입력, 화학 구배를 다음 감염의 사이트로 마이그레이션. 호중구는 식세포증, 탈과립 및 호중구 세포 외 트랩 (NETs)의 생성에 의해 침입 미생물을 방지 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 파라핀 내장 조직에서 NET를 검출하는 데 도움이 될 것입니다. NET는 NETosis에게 불린 프로세스의 결과입니다, 이는 살아있는 (생명 NETosis) 또는 죽어가는 (자살 NETosis) 호중구에서 핵, 과립 및 세포질 분대의 방출로 이끌어 냅니다. 시험관에서, NETs는 그(것)들이 내려온 세포의 그것 보다는 몇 배 더 큰 공간을 차지하는 구름 같이 구조물을 형성합니다. NETs의 중추는 크로마틴으로, 과립과 세포질에서 유래한 단백질과 펩티드의 선택이 결합되어 있습니다. 이에 따라, 높은 국부적 농도의 독성 화합물이 유지되어 NET가 박테리아, 곰팡이, 바이러스 및 기생충을 포함한 다양한 병원체를 포획하고 비활성화할 수 있으며, 고활성 NET 성분의 확산은 손상을 초래합니다. 인접한 조직은 제한적입니다. 그럼에도 불구하고, 최근 몇 년 동안 NETs가 풍부하게 생성되거나 불충분하게 제거되면 자가 면역 질환에서 암에 이르는 병리학적 잠재력을 가지고 있다는 것이 명백해졌습니다. 따라서, 조직 샘플에서 NET의 검출은 진단의 중요성을 가질 수 있으며, 병에 걸린 조직에서 NET의 검출은 환자의 치료에 영향을 미칠 수 있다. 파라핀 내장 조직 샘플은 병리학 적 분석에 사용되는 표준 표본이기 때문에 시판되는 항체를 사용하여 파라핀 내장 조직에서 NET 성분의 형광 염색프로토콜을 확립하고자 했습니다.
Introduction
호중구 세포외 트랩(NET)은 복잡한 3차원 구조를 갖는다. 고해상도 스캐닝-전자 현미경 분석은 15-20 nm (크로마틴)의 직경을 가진 매끄러운 섬유로 이루어져 있다는 것을 밝혔습니다 >25 nm의 구형 도메인으로 박힌 약 30 개의 과립 및 세포질의 구색으로 구성 단백질 및 펩티드1,2. 분리된 호중구로부터 시험관 내에서 생성될 때, NET는 면역형광에 의해 두 개 이상의 성분의 염색에 의해 식별될 수 있다(예를 들어, 히스톤 및 호중구 엘라스타제 [NE]). 자극되지 않은 다형성 핵 백혈구 (PMN)에서, 히스톤은 핵에서 독점적으로 위치하며 NE는 과립에 포함되어 있습니다. NETosis 동안, NE는 히스톤3,4를처리하는 핵에 들어갑니다. NET는 비자극 호중구에서 명확하게 분리되는 성분의 공동 국소화가 특징입니다. 현재 NET 특이적 에피토프(즉, 순진한 호중구와 반응하지 않음)를 독점적으로 검출하는 항체가 존재하지 않기 때문에, NET에서 호중구 단백질의 동국화를 검출하는 것이 NET를 식별하는 유일한 방법입니다.
조직에서, NET는 거의 기존의 조직 학적 얼룩에 의해 검출 될 수 없다 (예를 들어, 헤마톡신 / 에오신 [H&E]로 염색하여, 이는 확산 창백한 푸른 색조로 NET를 묘사). 높은 풍부한 경우에만, NET는 명확하게 트롬비5와같은 H & E 염색으로 구별 될 수있다. NET는 그 것 당 확산되기 때문에, 조직 구조는 최적으로 보존되어야 합니다, 그래서 동결 유물을 유도하는 경향이 있는 저온 준비는 조직에 있는 NETs의 분석을 위해 최적이 아닙니다. 대신, 포름알데히드 고정 및 파라핀 포함은 조직 웰2에서NET 구조를 보존하는 것으로 나타났다. (면역-) 파라핀 내장 된 조직의 단면의 조직학적 검사는 병리학 적 분석을위한 표준 방법입니다. 파라핀 블록의 조직이 실온(RT)에서도 보존되기 때문에, 매일 진단 작업의 조직 표본은 수년 전에 준비된 표본과 비교할 수 있으며, 최근에 생겨난 질문과 기술로 볼 수 있습니다. 조직에 있는 NET는 최근까지 검출되지 않으며, 질병의 과정 도중 그물 대형 그리고 제거의 상세한 분석은 병인에 새로운 통찰력으로 이끌어 낼 수 있습니다. 파라핀 내장 된 조직의 사용은 아카이브 물질의 분석을 허용하고 소급 연구를 수행 할 수있는 귀중한 장점을 갖는다6. 명백하게, 이러한 혜택은 비용에 와서. 파라핀에 포함시키기 전에, 조직은 포름알데히드 고정, 탈수 및 50 °C 이상으로 가열되어야 한다. 이 절차는 조직 자동 형광뿐만 아니라 에피토프 마스킹을 유도합니다.
고정 아티팩트를 제한하려면 고정 시간을 최소한으로 유지해야 하므로 조직 샘플의 크기는 ~ 3mm 두께의 20mm x 30mm 영역을 초과해서는 안됩니다. 이 크기의 샘플은 포름알데히드에서 RT에서 하룻밤 배양 한 후 완전히 고정되며, 이상적으로 직접 탈수 및 파라핀 포함이 뒤따릅니다. 또는 고정 샘플을 버퍼에서 1일 또는 2일 동안 저장할 수 있습니다. 면역형광 연구의 경우, 고정제는 적합한 완충액(예를 들어, 인산완충식염수[PBS] 또는 트리스 완충식염수[TBS]])에 용해된 파라포름알데히드로부터 신선하게 제조되어야 한다. 고정 제제 동안 포심산 형성을 방지하기 위해 온도를 60 °C 이하로 유지해야합니다. 병리학의 표준 고정제인 포르말린은 메탄올, 다른 알데히드, 케톤 및 포름산을 함유하고 있기 때문에 사용해서는 안됩니다. 이러한 불순물은 증가 된 에피토프 마스킹 및 중요한 조직 자가 형광으로 이어질.
성공적인 면역 표지를 위해, 에피토프 마스킹은 항원 회수에게 불린 프로세스에서 되돌려져야 합니다. 조직 절편은 메틸렌 다리를 부러 뜨리는 것으로 여겨지는 적절한 완충액으로 가열되므로 에피토프는 항체7에접근 할 수 있게됩니다. NET의 검출을 위해, 열 유도 에피토프 회수(HIER)는 프로테오라틱 효소의 사용과 같은 다른 방법에 바람직하다. 일상적으로, 파라핀 단면도의 면역 표지는 침전기로 검출되는 peroxidase 표지된 이차 항체에 선행된 단 하나 항체로 수행됩니다. 면역형광에 비해, 효소 계 검출 방법은 기질 침전물의 확산으로 인한 낮은 공간 분해능을 가지며, 일반적으로 하나 이상의 항원의 동시 검출이제한된다 6.
현재 NET에 독점적으로 결합하는 항체가 존재하지 않기 때문에,이 프로토콜은 두 개의 단백질, 핵인 히스톤 2B 및 과립으로 국한된 호중구 엘라스타아제에 라벨을 붙이는 데 사용됩니다. 자극되지 않은 호중구에서, 이 단백질은 분리됩니다, 그러나 NETosis를 겪고 있는 호중구및 NETs에서 공국화됩니다. 2개의 항원의 동시 검출은 다른 호스트및 다른 불소로 표지된 2개의 종 특정 이차 항체에서 제기된 2개의 1 차적인 항체로 달성될 수 있습니다. 이 보고서는 이전에 발표된 프로토콜8의 표준화이며 인간 및 뮤린 기원의 파라핀 내장 조직에서 NET 성분을 신선및 보관모두에서 안정적으로 염색하는 두 가지 상용 항체의 조합을 사용합니다.
Protocol
조직 프로토콜은 란데삼트 퓌르 게순드헤이트 und Soziales, 베를린, 독일(G0121/16)에 의해 승인되었다. 실험은 동물의 치료, 복지 및 치료에 대한 유럽 지침 2010/63/EU에 따라 수행되었습니다.
1. 고정, 탈수, 파라핀 포함, 단면화, 섹션 장착
- TBS(pH 7.4)에서 파라포름알데히드를 용해시켜 2% 포름알데히드 용액을 준비한다. 60 °C 이상의 가열을 피하십시오. RT. 포름알데히드 용액은 -20°C에서 보관할 수 있다.
- 신선한 조직(여기: 마우스 폐)을 TBS가 있는 유리 페트리 접시에 넣습니다. 메스를 사용하면 크기가 20mm x 30mm x 3mm를 초과하지 않는 조각으로 해부하십시오. TBS에서 2% 포름알데히드 용액에 시편을 담그다.
참고 : 고정물의 부피는 조직의 20 배 이상이어야합니다. - RT에서 8-20 시간 동안 수정하십시오.
- 일련의 에탄올(70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%)을 사용하여 탈수는 각 단계마다 1시간 동안 지속됩니다.
- 100 % 자일렌 (디메틸 벤젠)에서 2 x 의 명확한 표본, 각 단계 1 시간.
- 60 °C (용융 온도 54-56 °C)에서 파라핀 2x에 담그십시오, 각 단계 1 시간.
- 임베딩 금형을 사용하여 시편을 장착하고 카세트 바닥을 덮개로 사용합니다.
- 파라핀이 고형화되고 내장 형몰을 제거하십시오.
- 3 μm 조직 섹션을 준비하고 37 °C 수조에 떠있게하십시오.
- 물 표면에 섹션을 접착제 유리 슬라이드(재료 표)에부동 합니다.
- 유리 슬라이드에 섹션40 °C에서 밤새 배양하여 조직을 유리에 결합합니다.
2. 수분 공급, 열 유도 에피토프 회수, 염색, 장착, 현미경 분석
- 랙에 유리 슬라이드에 섹션을 배치하고 탈수 및 청산에 사용되는 매체에 침전, 역순으로, 5 분 동안 각 단계 : 2x 100 % 자일렌, 에탄올 시리즈 (2 x 100%, 96 %, 90 %, 80 %, 70 %).
- 온도 제어 핫 플레이트로 수조를 70 °C로 가열합니다. 열 유도 에피토프 회수(HIER)-버퍼(pH 9)로 채워진 항아리를 놓습니다. 재료의 표),10% 글리세롤을 온도 완충액으로 함유하고, 수조에 넣는다. HIER 버퍼가 70°C에 도달하면 슬라이드가 있는 랙을 버퍼 용기에 넣습니다.
- 70 °C에서 120 분 동안 배양 슬라이드.
- 수조에서 항아리를 제거하고 탈이온수로 3배, TBS(pH 7.4)로 한 번 RT 헹구기로 식힙니다.
- 압연 필터 페이퍼 또는 면봉이 있는 섹션 사이의 슬라이드에서 액체를 조심스럽게 제거하고 섹션을 수화상태로 둡니다.
- 소수성 배리어 펜으로 섹션 주위에 장벽을 만듭니다.
- 차단 완충제의 섹션 (1% 소 혈청 알부민 [BSA], 2 % 일반 당나귀 혈청, 5 % 냉수 생선 젤라틴 및 세제[재료의 표]RT에서 30 분 동안 비특이적 인 결합을 방지합니다.
- 차단 버퍼에서 1 μg / mL의 농도로 1 차 항체를 희석하십시오.
참고: 인간 및 마우스 NET의 경우, 호중구 엘라스타아제에 대한 토끼 항체및 히스톤 2B에 대한 닭 항체의 조합이 사용될 수있다(재료표). - 촉촉한 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 차단 버퍼를 제거하고 건조를 방지하기 위해 충분한 부피를 사용하여 섹션에 세척하지 않고 희석 된 기본 항체를 추가하십시오. 파라핀 필름으로 촉촉한 챔버를 밀봉하고 RT에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 각각 5분 동안 TBS로 3x 섹션을 세척하십시오.
- 블로킹 버퍼에서 이차 항체의 작동 용액을 준비합니다. 1 차 항체의 검출을 위해, 당나귀에서 올려진 이차 항체를 사용하고 다중 종에서 혈청 단백질에 대하여 미리 흡수됩니다(재료표). 이차 항체의 작동 용액으로 조직 섹션을 덮습니다. 촉촉한 챔버에 슬라이드를 전송, 파라핀 필름밀봉. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
참고: Cy2에 공액된 당나귀 안티 토끼와 Cy3에 공액된 당나귀 안티 치킨은 DNA 카운터스테인과 결합될 수 있다. - TBS로 각 5분 동안 3x 를 씻은 다음 탈이온수로 5분 동안 한 번 씻습니다.
- 장착 매체(재료 표)와커버 섹션을 커버하고 기포 형성을 피하기 커버 유리를 적용합니다.
- 장착 매체를 고화하게 한 다음 적절한 밴드 패스 필터 또는 공초점 현미경을 사용하여 광시야 현미경을 사용하여 면역 형광을 분석하십시오.
Representative Results
이 프로토콜을 사용하여, NET 성분은 인간 및 뮤린 기원 둘 다의 파라핀 내장 조직에서 성공적으로 검출될 수 있다. 자극되지 않은 호중구에서, H2B는 과립의 핵 및 호중구 엘라타아제에 독점적으로 위치; 따라서 형광 신호가 겹치지 않습니다. 대조적으로, NEToSIS 동안 및 그물 형성 후에, NE, H2B, 및 DNA는 부분적으로 동local화한다. 녹색, 빨간색 및 파란색 신호로 이미지하면 공동 지역화 영역이 희끄무레한 오버레이로표시됩니다(그림 1G, 그림 2D및 그림 3D). 이 오버레이는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화할 수도 있습니다. 녹색, 빨간색 및 파란색에 대해 양수인 중첩 신호의 픽셀은 그림 1G', 그림 2D'및 그림 3D'에서NET 영역을 묘사하는 보라색 오버레이를 만드는 데 사용되었습니다. 도 1 과 도 2의 일부 세포는 핵을 로브화했지만 NE에 대해 부정적입니다. 이들 세포는 호산구 과립구인 것으로 여겨진다.
조직 단면도의 두께가 있는 경우에 2-3 μm, 그(것)들은 10x 또는 20x 목표를 사용하여 광시야 현미경 검사법에 의해 분석될 수 있습니다. 예는 NE(녹색), H2B(빨간색) 및 Hoechst 33342(파란색)에 대해 염색된 인간 맹장염 조직의 단면을 도시하는 도 1에제시되어 있다. 패널 A, C, E 및 G는 NED를 포함하는 섹션의 영역에서 온 반면, 패널 B, D, F 및 H는 수많은 호중구(그림1B,NE)를 포함하지만 NET는 포함하지 않는 동일한 섹션의 다른 영역에서 온 것입니다. 거대한 그물 형성을 가진 지역은 쉽게 낮은 배율에서도 찾아낼 수 있습니다, 모든 3개의 그물 분대가 동자화하기 때문에, 수시로 3개의 채널의 중첩에서 희끄무레한 세포외 섬유로 나타나는 끈적끈적한 세포외 구조물에서(그림 1G) ), 그림 1G의보라색 오버레이'.
두 조직 영역의 염색 패턴은 명확하게 다르다, NE는 과립에 포함(그림 1B)핵에서 DNA(그림 1F). 흥미롭게도, H2B에 대한 염색은 호중구가 풍부한 부위에서 다소 약하다(도1D)는NET 함유 조직에 비해(도 1C). 이는 항체의 크기(IgY는 IgG를 위한 150 kD에 비해 180 kD를 가지고 있음)에 기인할 수 있으며, 이는 그대로 핵에서 소형 염색질에 결합하는 것을 방지할 수 있으며, H2B에 대한 접근은 NETs의 경우와 같이 염색체가 데콘덴화되는 경우 촉진될 수있다(그림 1C).
더 높은 해상도의 경우, 초점 외의 흐림 효과를 최소화하기 위해 공초점 현미경 또는 데콘볼루션이 있는 광시야 현미경을 사용해야 합니다. 그림 2는 동일한 인간 부속염 표본으로부터 의 한 그물 풍부한 영역을 나타낸 다. 공초점 스택의 최대 투영입니다. NE(녹색, 도 2A)는과립에서 발견되지만 또한 세포외적으로 풍부하며, 여기서 H2B(적색, 도 2B)및 DNA(파란색, 도 2C)와동local화한다. 세포외 동국화는 희끄무레한 색상 조합을 초래한다(그림2D). 녹색, 빨간색 및 파란색에 대해 양수 이러한 픽셀은 그림 2D'에서 NET를 표시하는 보라색 오버레이를 만드는 데 사용되었습니다.
도 3은 결핵균(M. tb)에 감염된 마우스 폐로부터의 중앙 부분의 세부사항이다. 항원 회수 및 염색 조건은 도 1 및 도 2와동일합니다. 다시 말하지만, 세 가지 NET 성분의 공동 국소화는 호중구 사이의 희끄무레한 영역으로 명확하게 볼 수 있으며, 이는 그림 3D에서NET를 나타내는 보라색 층을 만드는 데 사용되었습니다 .
염색의 특이성은 대조항체로 무시할 수 있는 염색을 묘사하는 보충도 1,및 보충도 1A, B는 토끼 비면역 혈청(녹색) 및 닭항-GFP IgY(적색)를 묘사한다. 그림 1 C,D는 이차 항체만으로 염색을 나타내고, 조합은 도1, 도2, 및 도 3에서사용하였던 것과 동일했다. 보조 도 1A, C는 그림 1 및 그림 2와 유사한 인간 부속염의 섹션을 나타낸다. 보조 도 1B, D는 도 3과유사한 마우스 폐 조직이다. DNA는 Hoechst 33342로 염색됩니다. 축척 막대는 25 μm를 나타냅니다.
그림 1: 인간 장수염 샘플의 파라핀 섹션의 광시야형 현미경 검사법.
패널 A, C, E 및 G는 NET가 있는 조직 영역을 묘사하는 반면, 패널 B, D, F 및 H는 호중구가 풍부하지만 NET 형성이 없는 동일한 섹션의 다른 영역을 보여줍니다. 염색은 NE(A, B; 녹색), H2B(C, D; 빨간색) 및 DNA(E, F; 파란색)에 대한 것입니다. 그림 1G,H는 세 채널 모두의 오버레이를 나타낸다. 모든 색상의 강도가 80에서 256 사이의 픽셀은 NE, H2B 및 DNA에 대해 겹치는 얼룩 영역을 나타내며 NETosis를 받는 NET 또는 호중구에서 파생된 것으로 간주됩니다. 이 픽셀은 패널 G에서보라색으로 의사 색으로 되어 있으며, 이 픽셀은 넓은 영역을 형성합니다. 그리고 패널 H'에서작은 반점만 발견됩니다. 이미지는 20x 대한 목적을 사용하여 광시야 현미경으로 촬영되었으며 스케일 바는 25 μm를 나타냅니다.
그림 2: 인간 부록염 샘플에서 NET 성분의 공초점 형광 현미경 검사법.
도 1에 사용된 동일한 조직 절편을 사용하였다. (A)NE에 대한 염색,(B) H2B의 묘사, 및(C)Hoechst 33342 DNA 염색. (D)세 채널 모두의 오버레이입니다. 세 가지 신호 의 동국화는 패널 D에서 의사 색 보라색입니다. 이를 위해 Volocity 6.3을 사용하여 세 가지 색상 모두에서 강도 >80의 픽셀을 감지했습니다. 보라색 지역은 NETosis를 겪고 NETs 또는 호중구를 묘사합니다. 이미지는 Z 스택으로 공초점 현미경 검사법으로 촬영하고 최대 투영으로 제시되었다. 배율 막대는 25 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: M. tb에감염된 마우스 폐에 있는 NET 분대의 공초점 형광 현미경 검사법.
그것은 거대한 호중구 침투가있는 완전한 폐의 중앙 부분에서 세부 사항입니다. (A)NE 염색,(B)H2B 염색 및(C)DNA 염색. (D)세 채널 모두의 오버레이입니다. 패널 D'의 보라색 오버레이는 NEToSIS및 NET를 겪고 있는 호중구를 나타내는 세 가지 색상 모두에서 강도 값이 >80인 픽셀을 나타냅니다. 이미지는 공초점 현미경을 가진 Z 스택으로 촬영하고 최대 투영으로 제시되었습니다. 배율 막대는 25 μm을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 관련 없는 1 차적인 항체를 가진 염색 통제. 인간(A,C)및 뮤린조직(B,D)은 도 1 및 도 2에사용되었고, 도 3은각각 관련없는 1차 항체(A,B)또는 1차 항체 없이 염색하였다(C,D). 패널 A 및 B에서 제어 1차 항체로서, 면역되지 않은 토끼및 GFP에 대하여 닭 IgY로부터의 혈청이 적용되었다. 이차 항체는 다른 모든 염색에서 도시된 바와 동일하였고 또한 패널 C 및 D에서 사용되었다. 예상대로, 모든 조건에서 무시할 수 있는 배경 염색이 검출되었고, 도 1, 도 2및 도 3에사용되는 항체의 특이성을 도시하였다. 이미지는 공초점 현미경으로 촬영, Hoechst 33342로 염색 된 DNA, 스케일 바는 25 μm를 나타냅니다.
Discussion
병인발생시 NET의 역할에 대한 인식이 높아짐에 따라 환자 또는 실험 동물로부터 조직에서의 검출이 점점 더 중요해지고 있습니다. 파라핀 내장 조직 샘플은 다른 조직 제제(예를 들어, 저온 보존된 시편의 단면도)에 비해 많은 장점을 갖는다. 파라핀 내장 샘플의 조직 보존은 분명히 우수하며, 일단 삽입되면 샘플이 수십 년 동안 보존되어 역행 연구가 가능합니다. 선조 구조인 NET를 검출하기 위해 양호한 시료 보존은 얼음 결정 형성으로 인해 조직 손상이 발생하기 쉬운 저온 보존 물질의 사용을 배제하는 전제 조건이며, 이는 형태학적으로 유사한 유물을 야기할 수 있습니다. 그물.
최적의 보존을 위해 실험 동물의 조직은 자가 분해를 피하기 위해 이상적으로 관류에 의해 사후 직후에 고정해야합니다. TBS 또는 PBS 광석과 같은 적당한 완충액에서 파라포름알데히드의 고정, 신선 하게 제조 또는 갓 해동된 용액으로 최적입니다. 이것은 표준 조직학에 사용되는 포르말린 제제와 는 대조적으로 화학적으로 정의되며, 적은 조직 자가 형광을 유도한다. 대조적으로, 인간 조직은 종종 절제 후 직접 고정되지 않으며, 고정제로, 일반적으로 포르말린의 10 % 희석은 중합을 방지하기 위해 안정제로 메탄올의 10 % ~ 15 %를 포함하는 활용, 뿐만 아니라 포름산, 다른 알데히드, 케톤 . 종종 조직은 포함하기 전에 오랜 시간 동안이 고정제에 저장됩니다. 결과는 자동 해(절제와 고정 사이의 시간에 따라 다름) 및 과다한 수정으로 인한 메틸렌 브리지의 과도한 형성일 수 있습니다. 포름알데히드 고정은 인트라-및 분자 간 메틸렌브리지(10)의형성에 의해 단백질의 삼차 구조의 변화를 유도한다. 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 비단백질 세포 성분은 직접 고정되지 않고 3차원 단백질 네트워크에서 고정됩니다. 성공적인 라벨링을 위해, 메틸렌 결합은 항원 검색 과정에서 에피토프를 노출시키기 위해 깨져야 한다. 이는 적합한 열 유도 항원 회수 완충제(HIER buffer)(11)에서현미경 슬라이드상에 장착된 조직 섹션의 가열에 의해 달성된다. 우리의 이전 연구는 파라핀화된 조직에서 NET 성분의 검출에 대한 HIER 완충제의 pH 및 온도의 영향을 분석하였으며, 한 성분에 대한 성공적인 조직 전처리가 종종 제2 성분에 대해 최적이 아닌 것으로 나타났다8.
그 동안, 9의 pH에서 HIER 버퍼에서 70 °C로 조직을 가열하는 것은 많은 NET 구성 요소에 대한 좋은 타협이며, 종종 더 높은 온도에서 손상되는 좋은 조직 보존을 유지하는 것으로 나타났습니다. 시작점으로 표시된 검색 시간을 사용하는 것이 제안되지만, 특히 알려지지 않은 고정 매개변수의 보관 시편에서는 염색 강도가 만족스럽지 않을 수 있습니다. 이 경우, 회수 절차 동안 온도의 연장 또는 더 높은 염색 효율을 향상시킬 수 있다. 이것은 또한 우리의 프로토콜에 사용된 IgY 항체의 히스톤 2B 염색에 영향을 미칠 수 있다. 그림 1에나타난 바와 같이, 데콘덴세드 염색질은 NETosis를 겪고 있는 호중구뿐만 아니라 NETs 에서 발견될 수 있으며, 이 항체로 훨씬 더 강한 얼룩은 호중구를 쉬는 크로마틴에 비해 훨씬 더 강하다. 이것은 아마 압축 핵에 180 kDa IgY 분자의 제한된 접근 때문이 증가 된 에피토프 회복 후에 다를 수 있습니다. 이것은 응축된 염색질의 지역에서조차 결합 효율성을 강화할 수 있습니다, 호중구및 그밖 세포의 일반적인 핵에 있는 강한 형광 귀착될 것입니다. NETosis를 겪고 있는 호중구와 비자극된 호중구 사이의 염색 효율의 차이는 그림 1에묘사된 것보다 덜 두드러질 수 있습니다. 그물 형성의 지역은 아직도 NE, H2B 및 DNA의 공동 현지화에 의해 확인될 것입니다.
고정 절차는 또한 스펙트럼의 푸르스름 / 녹색 부분에서 주로 조직의 상당한 자가 형광을 유도 할 수 있습니다. 청색 여기와 함께 사용되는 불소의 방출 최대값과 일치하는 적절한 협대역 광형 필터 세트(와이드 필드) 또는 검출기 설정(공초점)을 사용하여 이러한 자동 형광의 대부분을 피하는 것이 중요합니다(예: Cy2, Alexafluor) 488. 극단적 인 자가 형광의 경우 스펙트럼의 푸르스름 / 녹색 부분을 피해야합니다. 대신, 형광 신호는 스펙트럼의 먼 빨간 부분 (예를 들어, Cy 5 또는 Alexafluor 635에 결합된 이차 항체)에서 쉽게 검출될 수 있지만, 이것은 필터링이 없는 흑백 카메라 또는 공초점 현미경을 필요로 한다. 인간의 눈은 600 nm를 초과하여 다소 민감하지 않으므로, 멀리 적색 형광 신호는 거의 안구를 사용하여 검출 될 수 없다. 어쨌든, 적당한 노출 시간 또는 검출기 설정을 결정하기 위하여 부정적인 통제 (예를 들면, 1 차적인 항체 또는 생략하는 1 차적인 항체 대신에 비면역 혈청/이소타입 통제)를 사용하는 것이 중요합니다.
1-2 μm의 조직 단면도는 10x 또는 20x 목표를 사용하여 광시야 현미경으로 분석될 수 있습니다. 이 렌즈는 큰 초점 깊이를 제공하므로 (거의) 전체 조직 섹션이 초점에 있을 것입니다. 이는 충분히 큰 경우 (그림 1에서와같이) NET 형성 부위에 대한 조직 섹션을 신속하게 스캔하는 데 사용할 수 있습니다. 녹색(NE), 적색(H2B) 및 청색(DNA) 채널의 공동 국소화는 그물 형성영역을 나타내는 백색 염색을 초래한다(도1G). 더 높은 배율을 위해서는 공초점 또는 데콘볼루션이 있는 광시야 현미경이 필요합니다. 도 2는 도 1에사용되는 인간 장수염 시편의 세부 사항을 나타낸다. 도 2A에서,NE는 작은 점(과립)으로 국소화되지만, 큰 비율은 세포외이며, 종종 H2B(그림 2B)와 중첩되는 줄무늬를 형성한다(도2C). 이러한 공동 지역화는 NET(그림2D)를나타내는 희끄무레한 오버레이를 초래합니다. M. 결핵에 감염된 마우스의 폐 섹션에서 매우 유사한 패턴을 발견할 수있다(그림 3).
여기에 제시된 시편은 낮은 배율에서도 식별할 수 있는 높은 수준의 NET 형성을 가진 영역을 특징으로 합니다. 조직 밀도 및 각각의 자극에 따라, NET 형성은 호중구의 작은 그룹의 NET 형성에 이르기까지 훨씬 덜 발음 될 수 있습니다 (심근염의 예로, 이전 간행물12참조). 이 프로토콜은 조직에 있는 NETs에 대한 더 많은 연구를 육성하고 질병의 대형 또는 예방에 있는 NETs의 인식되지 않는 역할을 해명하는 것을 희망하는 도움이 될 것이라는 점을 믿습니다.
Disclosures
이 작품의 자금 원천은 막스 플랑크 소사이어티입니다. 우리는 비판적으로 마우스 조직에 대한 원고와 필립 Saikali을 읽어 아르투로 Zychlinsky 감사합니다.
Acknowledgments
저자는 공개 할 것이 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
| cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
| donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
| embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
| embedding molds | Sakura | 4162 | |
| embedding station | Microm | AP280 | |
| ethanol | Roth | 9065.4 | |
| filter paper, rolled | OCB | ||
| forceps | Dumont | 7a | |
| glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
| glycerol | Roth | 3783.1 | |
| HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
| moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
| Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
| normal donkey serum | Merck | S30 | |
| PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
| paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
| paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
| petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
| rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
| racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
| scalpel | Braun | Fig.22 | |
| Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
| tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
| Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
| Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
| Tween 20 | Fluka | 93773 | |
| water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
| widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
| xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).
