Summary
Nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) er tredimensjonale strukturer generert av stimulert nøytrofile granulocytter. Det har blitt klart i de senere år at NETs er involvert i en rekke sykdommer. Påvisning av NETs i vev kan ha diagnostisk relevans, så standardiserte protokoller for merking NET komponenter er nødvendig.
Abstract
Nøytrofile granulocytter, også kalt polymorfonukleære leukocytter (PMN) på grunn av deres lobulært kjerne, er den mest tallrike typen leukocytter. De modnes i benmargen og slippes ut i perifert blod, der de sirkulerer i ca 6-8 h; men i vev, kan de overleve i dagevis. Ved diapedese gjennom endotelet, de forlater blodstrømmen, skriv vev, og migrere mot området av en infeksjon etter chemotactic gradienter. Nøytrofile kan bekjempe invaderende mikroorganismer ved fagocytose, degranulering, og generering av nøytrofile ekstracellulære feller (Nets). Denne protokollen vil bidra til å oppdage NETs i parafin-embedded vev. NETs er resultatet av en prosess som kalles NETosis, som fører til utgivelsen av kjernefysiske, detaljerte og cytoplasmatiske komponenter enten fra levende (Vital NETosis) eller døende (suicidale NETosis) nøytrofile. In vitro, NETs danner sky-lignende strukturer, som opptar et mellomrom flere ganger større enn i cellene som de nedstammet fra. Ryggraden i NETs er kromatin, som et utvalg av proteiner og peptider som stammer fra granulater og cytoplasma er bundet. Dermed opprettholdes en høy lokal konsentrasjon av giftige forbindelser slik at NETs kan fange og deaktivere en rekke patogener inkludert bakterier, sopp, virus og parasitter, mens diffusjon av de svært aktive NET komponenter som fører til skade i nærliggende vev er begrenset. Likevel, i de senere årene har det blitt klart at NETs, hvis det genereres i overflod eller tømmes utilstrekkelig, har patologiske potensialet spenner fra autoimmune sykdommer til kreft. Påvisning av NETs i vevsprøver kan således ha diagnostisk betydning, og påvisning av NETs i sykt vev kan påvirke behandlingen av pasientene. Siden parafin-embedded vevsprøver er standard prøven som brukes for patologisk analyse, var det søkt å etablere en protokoll for fluorescerende farging av NET komponenter i parafin-embedded vev ved hjelp av kommersielt tilgjengelige antistoffer.
Introduction
De nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) har en kompleks tredimensjonal struktur. Høyoppløselig skanning-elektron mikroskopisk analyse avslørte at de består av glatte fibre med en diameter på 15 − 20 NM (kromatin) besatt med globular domener på > 25 NM som antagelig består av et utvalg på ca 30 granulat og cytoplasmatiske proteiner og peptider1,2. Når det genereres i vitro fra isolerte nøytrofile, kan NETs identifiseres ved farging av to eller flere av deres komponenter ved immunofluorescence (f.eks. histoner og nøytrofile elastase [NE]). I unstimulated polymorfonukleære leukocytter (PMN), er histoner plassert utelukkende i kjernen, mens NE finnes i granulater. Under NETosis går ne inn i kjernen, der den behandler histoner3,4. NETs kjennetegnes av colocalization av komponenter, som er tydelig adskilt i unstimulated nøytrofile. Siden det for tiden ingen antistoffer eksisterer som utelukkende oppdager NET spesifikke epitopes (dvs. ikke reagerer med naive nøytrofile), oppdager colocalization av nøytrofile proteiner i NETs er den eneste måten å identifisere NETs.
I vev kan NETs neppe oppdages av konvensjonelle histologiske flekker (f.eks. ved farging med hematoksylin/eosin [H & E], som fremstiller NETs som et diffus svakt blå skjær). Bare når svært rikelig, kan NETs tydelig skilles med H & E flekker, for eksempel i trombi5. Siden NETs er diffus per se, må vevs strukturen bevares optimalt, så fryse preparater som er tilbøyelige til å indusere fryse gjenstander er suboptimal for analyse av NETs i vev. I stedet har formaldehyd fiksering og parafin embedding blitt vist å bevare NET struktur i vev brønn2. (Immuno-) histologiske inspeksjon av deler av parafin-embedded vev er standard metode for patologisk analyse. Ettersom vev i para fin blokker bevares selv ved romtemperatur (RT), kan vevsprøver fra daglig diagnostisk arbeid sammenlignes med eksemplarer som er utarbeidet år siden, med spørsmål og teknikker som nylig har oppstått. NETs i vev har ikke blitt oppdaget inntil nylig, og detaljert analyse av NET dannelse og fjerning i løpet av sykdommer kan føre til ny innsikt i patogenesen. Bruk av parafin-embedded vev har uvurderlig fordel å tillate analyse av arkivering materiale og å gjennomføre retrospektiv studier6. Unektelig, disse fordelene kommer til en kostnad. Før innebygging i parafin, må vevet være formaldehyd-fast, dehydrert og oppvarmet over 50 ° c. Disse prosedyrene induserer vev autofluorescence så vel som epitope maskering.
For å begrense fiksering gjenstander, bør fiksering tid holdes til et minimum, så størrelsen på vevsprøver bør ikke overstige et område på 20 mm x 30 mm med ~ 3 mm tykkelse. Prøver av denne størrelsen er helt fast etter natten inkubasjons på RT i formaldehyd, ideelt etterfulgt av direkte dehydrering og parafin innebygging. Alternativt kan faste prøver lagres for 1 eller 2 dager i buffer. For immunofluorescence studier, bør bindemiddel være nylaget fra paraformaldehyde oppløst i en passende buffer (f. eks, fosfat-bufret saltvann [PBS] eller Tris-bufret saltvann [TBS]). Under bindemiddel tilberedning må temperaturen holdes under 60 ° c for å hindre dannelse av maursyre syre. Formalin, som er en standard bindemiddel for patologi, bør ikke brukes siden den inneholder metanol, andre aldehyder, ketoner, og maursyre syre. Disse urenheter føre til økt epitope maskering og betydelig vev autofluorescence.
For vellykket immunolabelling, epitope maskering må tilbakestilles i en prosess som kalles antigen henting. Tissue seksjoner varmes opp i en passende buffer, som antas å bryte metylen broer, så epitopes bli tilgjengelig for antistoffer7. For påvisning av NETs foretrekkes varme induserte epitope gjenfinning (HIER) til andre metoder som bruk av proteolytiske enzymer. Immunolabelling av para fin seksjoner utføres rutinemessig med et enkelt antistoff etterfulgt av et peroksidase sekundært antistoff, som oppdages med et fremskynde substrat. Sammenlignet med immunofluorescence, enzymbasert deteksjon metoder har en lavere romlig oppløsning på grunn av diffusjon av underlaget utfelling, og generelt, samtidig påvisning av mer enn ett antigen er begrenset6.
Som for tiden ingen antistoffer eksisterer som utelukkende binder til NETs, denne protokollen brukes til å merke to proteiner, histone 2B, som er kjernefysisk, og nøytrofile elastase, som er lokalisert i granulater. I unstimulated nøytrofile, disse proteinene er separert, men de er colocalized i nøytrofile gjennomgår NETosis og i NETs. Samtidig påvisning av to antigener kan oppnås med to primære antistoffer oppvokst i forskjellige verter og to arter-spesifikke sekundære antistoffer merket med ulike fluorokromer. Denne rapporten er en standardisering av vår tidligere utgitte protokoll8 og bruker en kombinasjon av to kommersielt tilgjengelige antistoffer som pålitelig flekker net komponenter i parafin-embedded vev, både fersk og arkivering, av menneskelig og murine opprinnelse.
Protocol
Vevs protokollene ble godkjent av Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Tyskland (G0121/16). Eksperimenter ble utført i samsvar med det europeiske direktivet 2010/63/EU om Stell, velferd og behandling av dyr.
1. fiksering, dehydrering, para fin innebygging, snitting, montering av seksjoner
- Forbered 2% formaldehyd løsning ved å oppløse paraformaldehyde i TBS (pH 7,4). Unngå oppvarming over 60 ° c. Kult å RT. formaldehyd løsningen kan oppbevares ved-20 ° c.
- Plasser friskt vev (her: mus lunge) til et glass Petri parabol med TBS. Med en skalpell, analysere i stykker ikke overskridelse 20 mm x 30 mm x 3 mm inne størrelse. Dypp prøven i 2% formaldehyd oppløsning i TBS.
Merk: volumet av bindemiddel bør være minst 20x at av vevet. - Fix ved RT for 8 − 20 h. Overfør prøver til TBS. plasseres i kassetter.
- Tørke bruker en serie av etanol (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), med hvert trinn som varer 1 time.
- Clear eksemplarer 2x i 100% xylen (dimethylbenzene), hvert trinn 1 t.
- Sug i parafin 2x ved 60 ° c (Smeltetemperatur 54 − 56 ° c), hvert trinn 1 time.
- Monter prøver ved hjelp av innebygging muggsopp, bruk kassetten bunnen som et deksel.
- La parafin stivne og fjerne innebygging muggsopp.
- Forbered 3 μm vev seksjoner, og la dem flyte på 37 ° c vannbad.
- Float seksjoner på vannflaten på selvklebende glass lysbilder (tabell av materialer).
- Ruge seksjoner på glass glir over natten ved 40 ° c for å bindevevet til glasset.
2. rehydrering, varme induserte epitope gjenfinning, farging, montering, mikroskopisk analyse
- Plasser seksjoner på glass lysbilder i stativer og submerse dem inn i mediene som brukes for dehydrering og clearing, i omvendt rekkefølge, med hvert trinn i 5 min: 2x 100% xylen, etanol-serien (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
- Varm et vannbad med en temperaturstyrt kokeplate til 70 ° c. Plasser en krukke fylt med varme-indusert epitope gjenfinning (HIER)-buffer (pH 9; Tabell av materialer), som inneholder 10% glyserol som en temperatur buffer, i et vannbad. Når HIER-bufferen har nådd 70 ° c, plasserer du stativet med lysbildene i buffer glasset.
- Ruge slides for 120 min ved 70 ° c.
- Fjern glasset fra vannbad og la det avkjøles til RT. skyll seksjonene 3x med deionisert vann og en gang med TBS (pH 7,4).
- Fjern forsiktig væske fra lysbilder mellom seksjoner med rullet filter papir eller bomullspinne, slik at delene blir hydrert.
- Lag barriere rundt seksjoner med en hydrofobe barriere penn.
- Ruge seksjoner i blokkering buffer (1% storfe serum albumin [BSA], 2% normalt esel serum, 5% kaldt vann fisk gelatin og vaskemidler [tabell av materialer] i TBS) ved RT for 30 min for å hindre løs binding.
- Fortynne primære antistoffer ved en konsentrasjon på 1 μg/mL i blokkerings buffer.
Merk: for mennesker og mus garn kan en kombinasjon av kanin antistoff mot nøytrofile elastase og kylling antistoff mot histone 2B brukes (tabell av materialer). - Plasser lysbildene i et fuktig kammer. Fjern blokkerende buffer og tilsett fortynnet primære antistoffer uten å vaske til delene ved hjelp av tilstrekkelig volum for å hindre tørking. Seal fuktig kammer med parafin film og ruge over natten på RT.
- Vask seksjoner 3x med TBS for 5 min hver.
- Forbered arbeider løsning av sekundære antistoffer i blokkering buffer. For påvisning av primære antistoffer, bruke sekundære antistoffer oppvokst i esel og pre-absorbert mot serumproteiner fra flere arter (tabell av materialer). Dekk vev seksjoner medarbeider løsning av sekundære antistoffer. Overfør lysbilder til fuktig kammer, forsegle med para fin film. Ruge for 1 time ved RT.
Merk: Donkey anti kanin bøyd til Cy2 og esel anti kylling bøyd til Cy3 kan kombineres med en DNA counterstain. - Vask seksjoner 3x for 5 min hver med TBS, deretter en gang for 5 min med deionisert vann.
- Dekk seksjoner med festemiddel (tabell over materialer) og påfør dekkglass unngå boble dannelse.
- La montering medium stivne, deretter analysere immunofluorescence ved hjelp av et bredt felt mikroskop med passende band pass filtre eller et konfokalmikroskopi mikroskop.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen, NET-komponenter kan oppdages i parafin-embedded vev både av menneskelig og murine opprinnelse. I unstimulated nøytrofile, H2B ligger utelukkende i kjernen og nøytrofile elastase i granulater; Følgelig, deres fluorescens signalene ikke overlapper hverandre. I kontrast, i løpet av NETosis og etter NET-formasjonen er NE, H2B og DNA delvis colocalize. Hvis de blir avbildet som grønne, røde og blå signaler, fremstilles områder av colocalization som hvitaktig overlegg (figur 1g, figur 2Dog figur 3D). Dette overlegget kan også være kvantifisert ved hjelp av bildeanalyse programvare. Piksler fra overlappende signaler som er positive for grønt, rødt og blått, har blitt brukt til å lage en lilla overlapping som viser nettområder i figur 1g, figur 2Dog figur 3D. Noen av cellene i figur 1 og figur 2 har lobulært kjerner, men er negative for NE. Det antas at disse cellene er eosinophil granulocytter.
Hvis vevs delene har en tykkelse på 2 – 3 μm, kan de analyseres ved hjelp av omfattende felt mikroskopi med 10x eller 20x mål. Et eksempel er presentert i figur 1, som viser en del av humant blindtarmbetennelse vev BEISET for ne (grønn), H2B (rød) og Hoechst 33342 (blå). Paneler A, C, E og G er fra et område i delen som inneholder NETs, mens panelene B, D, F og H er fra et annet område i samme avsnitt, som inneholder mange nøytrofile (figur 1B, ne), men ingen Nets. Områder med massiv NET formasjon kan lett bli funnet selv ved lave forstørrelser, siden alle tre NET komponenter colocalize, ofte i trevlet ekstracellulære strukturer, som i overlegget av de tre kanalene vises som hvitaktig ekstracellulære fibre (figur 1g ), lilla overlegg i figur 1g'.
Farge mønstrene til begge vevs områdene er helt klart forskjellige, med NE som finnes i granulater (fig. 1b) og DNA i kjerner (fig.1F). Interessant nok er farging for H2B ganske svak i nøytrofile-rike områder (figur 1d) SAMMENLIGNET med netto inneholdende vev (figur 1C). Dette kan skyldes størrelsen på antistoff (IgY har 180 kD sammenlignet med 150 kD for IgG), som kan hindre binding til kompakte kromatin i intakte kjerner, mens tilgang til H2B er lettere hvis kromatin er decondensed som tilfellet er i NETs (figur 1C).
For høyere resolution, konfokalmikroskopi mikroskop eller widefield mikroskop med deconvolution være nødt til å bli brukt til å minimere ut-av-fokusere flekk. Figur 2 viser et nett rikt område fra samme humane blindtarmbetennelse prøve. Det er en maksimal projeksjon av en konfokalmikroskopi stabel. NE (grønn, figur 2a) er funnet i granulater, men er også rikelig ekstracellulært, hvor det COLOCALIZES med H2B (rød, figur 2b) og DNA (blå, figur 2C). Ekstracellulære colocalization resulterer i en hvitaktig fargekombinasjon (figur 2D). Disse pikslene positive for grønn, rød og blå har blitt brukt til å lage en lilla overlegg som presenterer NETs i figur 2D.
Figur 3 er en detalj av en sentral del fra en mus lunge smittet med Mycobacterium tuberkulose (M. TB). Antigen gjenfinning og flekker forhold er de samme som for figur 1 og figur 2. Igjen, colocalization av alle tre NET komponenter er godt synlig som hvitaktig områder mellom nøytrofile, som har blitt brukt til å lage en lilla lag som indikerer NETs i figur 3D'.
Det spesielle ved farging er demonstrert i supplerende figur 1, som viser ubetydelig farging med kontroll antistoffer, og supplerende figur 1a, B skildrer kanin ikke-immune serum (grønn) og kylling anti-GFP IgY (rød). Figur 1 C, D viser farging med sekundære antistoffer alene, kombinasjonen var den samme som ble brukt i figur 1, figur 2, og Figur 3. Supplerende figur 1a, C viser en del av menneskelig blindtarmbetennelse ligner på figur 1 og figur 2. Supplerende figur 1B, D er mus lunge vev som ligner på Figur 3. DNA er farget med Hoechst 33342. Skala bar representerer 25 μm.
Figur 1: bred felts fluorescens mikroskopi i en para fin seksjon av en menneskelig blindtarmbetennelse prøve.
Paneler A, C, E og G skildrer et vev område med NETs, mens panelene B, D, F og H viser et annet område av samme seksjon som er rikt på nøytrofile, men uten NET formasjon. Farging er mot NE (A, B; grønn), H2B (C, D; rød) og DNA (E, F; blå). Figur 1g, representerer H overlegget for alle tre kanalene. Piksler med en intensitet mellom 80 og 256 i alle farger representerer områder med overlappende flekker for NE, H2B og DNA, og regnes som avledet fra garn eller nøytrofile som gjennomgår NETosis. Disse pikslene har blitt pseudo-farget som lilla i panel G ', der de danner et stort område; og i panel H ', der bare små flekker er funnet. Bilder ble tatt med et bredt-felt mikroskop med en 20x objektiv, og skala bar representerer 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Konfokalmikroskopi fluorescens mikroskopi av NET-komponenter i et humant blindtarmbetennelse prøve.
Det samme vevs avsnittet som ble brukt i figur 1 ble brukt. (A) FARGING mot ne, (B) skildring av H2B, og (C) Hoechst 33342 farging av DNA. (D) overlegget for alle tre kanalene. Colocalization av alle tre signalene er pseudo-farget lilla i panel D '. For dette ble piksler med en intensitet > 80 i alle tre fargene oppdaget ved hjelp av Volocity 6,3. Det lilla området viser NETs eller nøytrofile som gjennomgår NETosis. Bildene ble tatt med en konfokalmikroskopi mikroskopi som Z-stabler og presentert som maksimal projeksjon. Scale bar representerer 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Konfokalmikroskopi fluorescens mikroskopi av NET-komponenter i en mus lunge infisert med M. TB.
Det er en detalj fra den sentrale delen av en del av en fullstendig lunge med massiv nøytrofile infiltrasjon. (A) ne farging, (B) H2B farging, og (C) DNA farging. (D) overlegget for alle tre kanalene. Den lilla overlegg i panel D ' indikerer piksler med intensitet verdier av > 80 i alle tre farger indikerer nøytrofile gjennomgår NETosis samt garn. Bildene ble tatt som en Z-stabler med et konfokalmikroskopi mikroskop og presentert som maksimal projeksjon. Scale bar representerer 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: fargekontroll med urelaterte primære antistoffer. Human (a, C) og murine vev (B, d) som ble brukt for figur 1 og figur 2, og Figur 3, henholdsvis, ble farget med urelaterte primære antistoffer (A, B) eller uten primære antistoffer (C, d). Som kontroll primære antistoffer i paneler A og B, serum fra en ikke-vaksineres kanin og en kylling IgY mot GFP ble brukt. Sekundære antistoffer var de samme som vist i alle andre flekker og også brukt i paneler C og D. Som forventet, under alle forhold, ble ubetydelig bakgrunn flekker oppdaget, illustrerer spesifisitet av antistoffer som brukes for figur 1, figur 2og Figur 3. Bildene ble tatt med et konfokalmikroskopi mikroskop, DNA farget med Hoechst 33342, og skala bar representerer 25 μm. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Discussion
Med økende bevissthet om rollen til NETs under patogenesen9, er deres oppdagelse i vev fra pasienter eller forsøksdyr stadig økende betydning. Parafin-embedded vevsprøver har en rekke fordeler sammenlignet med andre vevs preparater (f.eks. deler av embryo prøver). Vevet bevaring i parafin-embedded prøver er klart overlegen, og når innebygd, prøvene er bevart i flere ti år, slik at retrograd studier. For påvisning av NETs, som er filigran strukturer, er god prøve bevaring en forutsetning som utelukker bruk av embryo materiale, som er utsatt for vevsskade på grunn av iskrystall formasjon som kan gi opphav til gjenstander morfologisk likner Garn.
For optimal bevaring, bør vev fra eksperimentelle dyr bli fikset kort tid etter døden, ideelt ved å prøve å unngå autolyse. Som bindemiddel, ferskt tilberedt eller fersk tint løsninger av paraformaldehyde i en passende buffer som TBS eller PBS malm optimal. Dette er kjemisk definert i motsetning til formalin preparater som brukes for standard histologi, og induserer mindre vev autofluorescence. I kontrast, menneskelig vev ofte ikke er løst rett etter forbrukeravgift, og som bindemiddel, normalt en 10% fortynning av formalin utnyttes som inneholder 10% til 15% av metanol som en stabilisator for å hindre polymerisering, samt maursyre syre, andre aldehyder, og ketoner . Ofte er vevet lagret i denne bindemiddel for lengre mengder tid før innebygging. Resultatet kan bli autolyse (avhengig av tiden mellom forbruker og fiksering), og overdreven dannelse av metylen broer på grunn av overfixation. Formaldehyd fiksering induserer endringer i tertiær strukturen av proteiner ved dannelsen av intra-og inter-molekylær metylen broer10. Ikke-proteinaktige celle komponenter som nukleinsyre syrer, karbohydrater og lipider er ikke løst direkte, men immobilisert i det tredimensjonale protein nettverket. For vellykket merking, metylen obligasjoner må brytes for å avdekke epitopes i ferd med antigen henting. Dette oppnås ved oppvarming av vev seksjoner montert på mikroskop lysbilder i en passende varme-indusert antigen gjenfinning buffer (HIER buffer)11. Vår forrige studie analyserte påvirkning av pH og temperatur på HIER buffere på påvisning av NET komponenter i paraffinized vev, og det ble funnet at vellykket vev forbehandling for en komponent ofte er suboptimal for en annen komponent8.
I mellomtiden har det blitt funnet at oppvarming av vevet til 70 ° c i HIER buffer på en pH på 9 er et godt kompromiss for mange NET komponenter og vil beholde god vev bevaring, som ofte er kompromittert ved høyere temperaturer. Det foreslås å bruke hentings tiden indikert som et utgangspunkt, men spesielt med arkivering eksemplarer av ukjente fiksering parametre, kan farging intensitet være utilfredsstillende. I dette tilfellet kan forlengelse av eller høyere temperatur under hentingen prosedyren forbedre farging effektivitet. Dette kan også påvirke histone 2B farging av IgY antistoff som brukes i vår protokoll. Som vist i figur 1, kan decondensed kromatin finnes i nøytrofile gjennomgår NETosis så vel som i garn flekker mye sterkere med dette antistoff sammenlignet med kromatin i hvile nøytrofile. Dette skyldes sannsynligvis begrenset tilgang til 180 kDa IgY-molekylet til kompakte kjerner og kan variere etter økt epitope utvinning. Dette kan intensivere bindende effektivitet selv i områder med kondensert kromatin, noe som vil resultere i sterkere fluorescens i normale kjerner av nøytrofile og andre celler. Forskjellen i farging effektivitet mellom nøytrofile gjennomgår NETosis og ikke-stimulert nøytrofile kan være mindre uttalt enn avbildet i figur 1. Områder av NET formasjonen fortsatt ville bli identifisert av co-lokalisering av NE, H2B og DNA.
Fiksering prosedyren kan også indusere betydelig autofluorescence av vevet, hovedsakelig i blå/grønn del av spekteret. Det er viktig å unngå det meste av denne autofluorescence ved å bruke tilstrekkelig smale bånd pass fluorescens filter sett (Wide-Field) eller detektor innstillinger (konfokalmikroskopi) som samsvarer med det maksimale utslippet av fluorokromkonjugert som brukes med blå eksitasjon, for eksempel Cy2, Alexafluor 488. i ekstreme tilfeller av autofluorescence, bør blå/grønn del av spekteret unngås. I stedet, fluorescens signaler kan oppdaget lettere inne det far rød del av det gjenferd (e.g., sekundær Antistoffene forente å CY 5 eller Alexafluor 635), bortsett fra denne behøver filterless sort/hvit kamera eller konfokalmikroskopi mikroskop. Siden det menneskelige øyet er ganske ufølsom utover 600 NM, langt rødt fluorescens signaler kan neppe oppdages ved hjelp av okulars. I alle fall er det viktig å bruke negative kontroller (f. eks ikke-immune Sera/isotype kontroller i stedet for primære antistoffer eller utelate primære antistoffer) for å fastslå passende eksponeringstider eller detektor innstillinger.
Vevs deler på 1 − 2 μm kan analyseres med bred felts mikroskop med 10x eller 20x mål. Disse linsene gir en stor fokal dybde, så (nesten) hele vevet delen vil være i fokus. Dette kan brukes til å raskt skanne vev seksjoner for områder av NET formasjon hvis de er tilstrekkelig store (som i figur 1). Colocalization av de grønne (NE), røde (H2B) og blå (DNA) kanalene resulterer i en hvit farging som indikerer områder av NET dannelse (figur 1g). For høyere forstørrelser, konfokalmikroskopi eller bred-åker mikroskop med deconvolution er på krevd. Figur 2 viser detaljer om den menneskelige blindtarmbetennelse prøven også brukt for figur 1. I figur 2a, NE lokaliseres til små prikker (granulat), men en stor andel er ekstracellulære, ofte danner striper som OVERLAPPER med H2B (figur 2b) og DNA (figur 2C). Dette colocalization resulterer i et hvitaktig overlegg som indikerer NETs (figur 2D). Et lignende mønster finnes i lunge delen av en mus som er infisert med M. tuberkulose (Figur 3).
Prøvene som presenteres her er preget av områder med en høy grad av NET formasjon som kan identifiseres selv ved lav forstørrelse. Avhengig av vevs tettheten og respektive stimulans, NET formasjon kan være mye mindre uttalt, ned til NET dannelse av små grupper av nøytrofile (for et eksempel i Myokarditt, se en tidligere publikasjon12). Det antas at denne protokollen vil bidra til å fremme mer forskning på NETs i vev og forhåpentligvis bistand i rakne ugjenkjennelig roller i dannelsen eller forebygging av sykdommer.
Disclosures
Finansieringen kilden til dette arbeidet er Max Planck Society. Vi takker Arturo Zychlinsky for kritisk lesing manuskriptet og Philippe Saikali for musen vev.
Acknowledgments
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
| cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
| donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
| embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
| embedding molds | Sakura | 4162 | |
| embedding station | Microm | AP280 | |
| ethanol | Roth | 9065.4 | |
| filter paper, rolled | OCB | ||
| forceps | Dumont | 7a | |
| glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
| glycerol | Roth | 3783.1 | |
| HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
| moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
| Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
| normal donkey serum | Merck | S30 | |
| PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
| paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
| paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
| petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
| rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
| racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
| scalpel | Braun | Fig.22 | |
| Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
| tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
| Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
| Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
| Tween 20 | Fluka | 93773 | |
| water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
| widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
| xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).
