Summary
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) являются трехмерными структурами, генерируемыми стимулируемыми нейтрофил гранулоцитами. В последние годы стало ясно, что NETs вовлечены в самые разные заболевания. Обнаружение NET в тканях может иметь диагностическую значимость, поэтому необходимы стандартизированные протоколы для маркировки компонентов NET.
Abstract
Нейтрофил гранулоциты, также называемые полиморфоядерными лейкоцитами (ПМН) из-за их лобового ядра, являются наиболее распространенным типом лейкоцитов. Они созревают в костном мозге и высвобождаются в периферийную кровь, где они циркулируют около 6–8 ч; однако, в тканях, они могут выжить в течение нескольких дней. При диапедезе через эндотелий они покидают кровоток, попадают в ткани и мигрируют к месту инфекции после хемотаксических градиентов. Нейтрофилы могут бороться с вторгающимися микроорганизмами с помощью фагоцитоза, деграниации и генерации нейтрофилов внеклеточных ловушек (NET). Этот протокол поможет обнаружить NET в парафинах, встроенных ткани. NETs являются результатом процесса под названием NETosis, который приводит к освобождению ядерных, гранулированных и цитоплазмических компонентов либо из живых (жизненно етоз) или умирающих (суицидальный NETosis) нейтрофилов. В пробирке NET образуют облачные структуры, которые занимают пространство в несколько раз больше, чем у клеток, из которых они спустились. Основой NETs является хроматин, к которому связан выбор белков и пептидов, происходящих из гранул и цитоплазмы. Таким образом, высокая локальная концентрация токсичных соединений сохраняется так, что NETs может захватить и инактивировать различные патогенные микроорганизмы, включая бактерии, грибки, вирусы и паразиты, в то время как диффузия высокоактивных компонентов NET, ведущих к повреждению в соседние ткани ограничены. Тем не менее, в последние годы стало очевидно, что NETs, если генерируется в изобилии или очищается недостаточно, имеют патологический потенциал, начиная от аутоиммунных заболеваний до рака. Таким образом, выявление NET в образцах тканей может иметь диагностическое значение, а обнаружение NET s в болезнении ткани может повлиять на лечение пациентов. Поскольку образцы тканей, встроенные в парафин, являются стандартным образцом, используемым для патологического анализа, было принято решение установить протокол для флуоресцентного окрашивания компонентов NET в парафинах, встроенных в ткани с использованием коммерчески доступных антител.
Introduction
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) имеют сложную трехмерную структуру. Сканирование с высоким разрешением-электронный микроскопический анализ показал, что они состоят из гладких волокон с диаметром 15-20 нм (хроматин) усеяны шаровыми доменами белки и пептиды1,2. При породах in vitro из изолированных нейтрофилов, NET s можно определить путем окрашивания двух или более их компонентов иммунофлуоресценцией (например, гистоны и нейтрофил эластаза (NE). В нестимулированных полиморфонеклеарных лейкоцитах (ПМН) гистоны расположены исключительно в ядре, в то время как NE содержится в гранулах. Во время NETosis, NE входит в ядро, где он обрабатывает гистоны3,4. NETs характеризуются колокализацией компонентов, которые четко разделены на нестимулированных нейтрофилов. Поскольку в настоящее время не существует антител, которые исключительно обнаруживают NET специфические эпитопы (т.е. не реагируют с наивными нейтрофиловами), обнаружение колокализации нейтрофилов белков в NETs является единственным способом идентификации NET.
В тканях NET s вряд ли можно обнаружить с помощью обычных гистологических пятен (например, путем окрашивания гематоксилином/эозина, который изображает NET s как диффузный бледно-голубоватый оттенок). Только в очень изобилии, NETs можно четко отличить с Н И E окрашивания, например, в тромби5. Так как NETs являются диффузными как таковой, структура тканей должна быть сохранена оптимально, поэтому криопрепараты, которые склонны вызывать замораживание артефактов являются неоптимальными для анализа NETs в тканях. Вместо этого, формальдегид фиксации и парафина встраивания было показано, чтобы сохранить структуру NET в ткани хорошо2. (Иммуно-) гистологическая проверка секций парафина-встроенной ткани является стандартным методом патологического анализа. Поскольку ткани в парафиновых блоках сохраняются даже при комнатной температуре (RT), образцы тканей из ежедневной диагностической работы можно сравнить с образцами, которые были подготовлены много лет назад, с вопросами и методами, которые недавно возникли. NETs в тканях не были обнаружены до недавнего времени, и подробный анализ образования и удаления NET в ходе заболеваний может привести к новым знаниям в патогенеза. Использование парафина-встроенных тканей имеет неоценимое преимущество, чтобы позволить анализ архивного материала и проводить ретроспективные исследования6. Несомненно, эти выгоды обходятся дорого. Перед встраиванием в парафин ткани должны быть формальдегидными, обезвожеными и нагреваться выше 50 градусов по Цельсию. Эти процедуры вызывают аутофлуоресценцию тканей, а также маскировку эпитопов.
Чтобы ограничить артефакты фиксации, время фиксации должно быть сведено к минимуму, поэтому размер образцов тканей не должен превышать площадь 20 мм х 30 мм толщиной 3 мм. Образцы такого размера полностью фиксируются после ночной инкубации на RT в формальдегиде, в идеале с последующим прямым обезвоживанием и встраиванием парафина. Кроме того, фиксированные образцы могут храниться в течение 1 или 2 дней в буфере. Для иммунофлуоресценции, фиксатор должен быть свежеприготовлен из параформальдегида, растворенного в подходящем буфере (например, фосфат-буферный солен (PBS) или Трис-буферированный солен (TBS). Во время фиксации препарата температура должна быть ниже 60 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить образование формовной кислоты. Формалин, который является стандартным фиксатором для патологии, не следует использовать, так как он содержит метанол, другие альдегиды, кетоны и фомальную кислоту. Эти примеси приводят к увеличению эпитопной маскировки и значительной аутофлуоресценции тканей.
Для успешной иммуномаркировки, эпитоп маскировки должна быть возвращена в процессе, называемом антиген поиска. Ткань разделы нагреваются в подходящий буфер, который, как полагают, разорвать метиленовые мосты, поэтому эпитопы становятся доступными для антител7. Для обнаружения NETs, тепло-индуцированных эпитопов поиска (HIER) является предпочтительным для других методов, таких как использование протеолитических ферментов. Обычно иммуномаркировка парафиновых секций проводится с помощью одного антитела с последующим перекисниза вторичным антителом, которое обнаруживается с осажденным субстратом. По сравнению с иммунофлюоресценцией, методы обнаружения на основе ферментов имеют более низкое пространственное разрешение из-за диффузии субстрата осадок, и, как правило, одновременное обнаружение более одного антигена ограничено6.
Поскольку в настоящее время не существует антител, которые исключительно связываются с NETs, этот протокол используется для обозначения двух белков, гистона 2B, который является ядерным, и нейтрофил эластаза, который локализован в гранулах. У нестимулированных нейтрофилов эти белки отделяются, но они колокализованы в нейтрофилах, проходящих НЕТоз и в NET. Одновременное обнаружение двух антигенов может быть достигнуто с помощью двух первичных антител, выращенных в разных хозяевах, и двух специфических для видов вторичных антител, маркированных различными флюорохромами. Этот отчет представляет собой стандартизацию нашего ранее опубликованного протокола8 и использует комбинацию двух коммерчески доступных антител, которые надежно окрашивают компоненты NET в парафинах, как свежих, так и архивных, человеческого и муринского происхождения.
Protocol
Протоколы тканей были утверждены Ландесамтом гесунгейтом и Созиалесом, Берлин, Германия (G0121/16). Эксперименты проводились в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU по уходу, благополучию и обращению с животными.
1. Фиксация, обезвоживание, встраивание парафина, секция, монтаж секций
- Приготовьте 2% растворформида, растворив параформальдегид при TBS (pH 7.4). Избегайте нагрева выше 60 градусов по Цельсию. Прохладный для RT. Раствор формальдегида может храниться при -20 градусах Цельсия.
- Поместите свежую ткань (здесь: мышиное легкое) в стеклянную чашку Петри с TBS. С помощью скальпеля расчленить на кусочки размером не более 20 мм х 30 мм х 3 мм. Погрузите образец в 2% раствор формальдегида в TBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем фиксации должен быть не менее 20 раз, что ткани. - Исправить на RT для 8'20 h. Передача образцов в TBS. Место в кассеты.
- Обезвоживание с использованием серии этанола (70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 100%), с каждым шагом продолжительностью 1 ч.
- Очистить образцы 2x в 100% ксилена (диметилбензен), каждый шаг 1 ч.
- Замочите в парафина2х при температуре 60 градусов по Цельсию (температура плавления 54-56 градусов по Цельсию), каждый шаг 1 ч.
- Маунт образцы с помощью встраивания формы, использовать кассету дно в качестве крышки.
- Пусть парафин затвердеть и удалить встраивание формы.
- Подготовка 3 мкм ткани разделов, и пусть они плавают на 37 градусов по Цельсию водяной бане.
- Поплавок разделов на поверхности воды на клей стеклянные горки (Таблица материалов).
- Инкубировать разделы на стеклянных слайдах на ночь при 40 градусах По Цельсию, чтобы связать ткань со стеклом.
2. Регидратация, тепло-индуцированный эпитопный поиск, окрашивание, монтаж, микроскопический анализ
- Разместите секции на стеклянных слайдах в стеллажах и погрузите их в носители, используемые для обезвоживания и очистки, в обратном порядке, с каждым шагом в течение 5 мин: 2x 100% ксилена, этанола серии (2x 100%, 96%, 90%, 80%, 70%).
- Нагрейте водяную баню с температурной горячей пластиной до 70 градусов по Цельсию. Поместите банку, наполненную тепло-индуцированной эпитопной поиска (HIER)-буфер (pH 9; Таблица материалов),содержащий 10% глицерола в качестве температурного буфера, в водяную ванну. Когда буфер HIER достигнет 70 градусов по Цельсию, поместите стойку со слайдами в буферную банку.
- Инкубировать горки в течение 120 мин при 70 градусах По Цельсию.
- Удалите банку из водяной ванны и дайте ей остыть до RT. Промыть разделы 3x с деионизированной водой и один раз с TBS (pH 7.4).
- Тщательно удалите жидкость со слайдов между секциями с прокатной фильтровальной бумагой или ватным тампоном, оставляя секции увлажненными.
- Создайте барьер вокруг секций с гидрофобным барьерным пером.
- Инкубировать разделы в блокирующем буфере (1% бычьего сывороточным альбумином альбумину (BSA), 2% нормальной сыворотке осла, 5% холодноводя рыбой желатином и моющими средствами -Таблица материаловв TBS) на RT в течение 30 минут для предотвращения неспецифического связывания.
- Разбавить первичные антитела в концентрации 1 мкг/мл в блокирующем буфере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для человека и мыши NETs, сочетание кролика антитела против нейтрофил эластаза и куриные антитела против Histone 2B могут быть использованы (Таблица материалов). - Поместите слайды во влажную камеру. Удалить блокирующий буфер и добавить разбавленные первичные антитела без мытья на секции, используя достаточный объем для предотвращения сушки. Печать влажной камеры с парафина пленки и инкубировать ночь на RT.
- Вымойте разделы 3x с TBS по 5 мин каждый.
- Подготовьте рабочее решение вторичных антител в блокирующем буфере. Для обнаружения первичных антител используйте вторичные антитела, выращенные в осле и предварительно усваиваемые против белков сыворотки от нескольких видов(Таблица Материалов). Накройте секции тканей рабочим раствором вторичных антител. Перенесите слайды во влажную камеру, запечатайте парафиновой пленкой. Инкубировать 1 ч на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осел анти кролика сопряжены с Cy2 и осла анти курица сопряжена с Cy3 может быть объединена с ДНК контрпятно. - Вымойте разделы 3x для 5 мин каждый с TBS, затем один раз в течение 5 минут с деионизированной водой.
- Обложка разделов с монтажом среды (Таблица материалов) и применять крышку стекла, избегая образования пузырьков.
- Пусть монтаж среднего затвердеть, а затем проанализировать иммунофлуоресценции с помощью широкоугольного микроскопа с соответствующими фильтрами полосы пройти или конфокальный микроскоп.
Representative Results
Используя этот протокол, net компоненты могут быть успешно обнаружены в парафинах, встроенных ткани как человеческого, так и муринового происхождения. У нестимулированных нейтрофилов H2B расположен исключительно в ядре и нейтрофильной эластазе в гранулах; следовательно, их сигналы флуоресценции не пересекаются. В отличие от этого, во время NETosis и после образования NET, NE, H2B, и ДНК частично colocalize. Если изображены как зеленые, красные и синие сигналы, области colocalization изображены как беловатый наложения(Рисунок 1G, Рисунок 2D, и рисунок 3D). Эта накладка также может быть количественно с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Пиксели от перекрывающихся сигналов, которые являются положительными для зеленого, красного и синего, были использованы для создания фиолетового наложения, изображающего области NET на рисунке 1G' , Рисунок 2D', и Рисунок 3D'. Некоторые из клеток на рисунке 1 и рисунке 2 имеют lobulated ядра, но отрицательныдля для NE. Считается, что эти клетки эозинофил гранулоцитов.
Если секции тканей имеют толщину 2-3 мкм, они могут быть проанализированы с помощью широкоугольной микроскопии с помощью 10x или 20x целей. Пример представлен на рисунке 1, который изображает раздел ткани аппендицита человека окрашенных для NE (зеленый), H2B (красный) и Hoechst 33342 (синий). Панели A, C, E и G относятся к области раздела, содержащей NET, в то время как панели B, D, F и H из другой области одного и того же раздела, который содержит многочисленные нейтрофилы(рисунок 1B,NE), но не NET. Области с массивным образованием NET легко можно найти даже при низких увеличениях, так как все три компонента NET колокализируются, часто в тягучих внеклеточных структурах, которые в накладке трех каналов появляются как беловатые внеклеточные волокна (Рисунок 1G ), фиолетовый наложение на рисунке 1G'.
Окрашивающие узоры обеих областей ткани явно различны, с NE, содержащиеся в гранулах(Рисунок 1B) и ДНК в ядрах(Рисунок 1F). Интересно, что окрашивание h2B довольно слаб в богатых нейтрофилями областях(рисунок 1D) по сравнению с NET-содержащей ткани(рисунок 1C). Это может быть связано с размером антитела (IgY имеет 180 kD по сравнению с 150 kD для IgG), которые могут предотвратить связывание с компактным хроматином в нетронутых ядер, в то время как доступ к H2B облегчается, если хроматин является деконденсированным, как это имеет место в NETs(рисунок 1C).
Для более высокого разрешения, конфокальные микроскопы или широкоугольные микроскопы с деконволюцией должны быть использованы, чтобы свести к минимуму размытие вне фокуса. На рисунке 2 изображена богатая NET область из того же образца аппендицита человека. Это максимальная проекция конфокального стека. NE (зеленый, Рисунок 2A) находится в гранулах, но также обильные внеклеточного, где он colocalizes с H2B (красный, Рисунок 2B) и ДНК (синий, Рисунок 2C). Внеклеточная колокализация приводит к беловатому цветовому сочетанию(рисунок 2D). Эти пиксели положительные для зеленого, красного и синего были использованы для создания фиолетового наложения, представляя NETs на рисунке 2D'.
Рисунок 3 — это деталь центральной части из мышиного легкого, инфицированного туберкулезом Микобактерий (М. ТБ). Условия поиска и окрашивания антигена такие же, как для рисунка 1 и рисунка2. Опять же, колокализация всех трех компонентов NET хорошо видна как беловатые области между нейтрофилами, которые были использованы для создания фиолетового слоя с указанием NETs на рисунке 3D'.
Специфика окрашивания показана на дополнительной рисунке 1,который изображает незначительное окрашивание с контрольными антителами, а дополнительная рисунок 1A,B изображает кролика неиммунной сыворотки (зеленый) и курицы анти-GFP IgY (красный). Рисунок 1 C,D показывает окрашивание со вторичными антителами в одиночку, комбинация была такой же, как был использован в Рисунок 1, Рисунок 2, и рисунок 3. Дополнительная диаграмма 1A,C показывает раздел аппендицита человека, похожий на рисунок 1 и рисунок 2. Дополнительная рисунок 1B, D является мышь легочной ткани похож на рисунок 3. ДНК запятнана Hoechst 33342. Шкала бар представляет 25 мкм.
Рисунок 1: Широкополевая флуоресценция микроскопии парафиновой секции образца аппендицита человека.
Панели A, C, E и G изображают область ткани с NET, в то время как панели B, D, F и H показывают другую область одного и того же раздела, который богат нейтрофиловами, но без образования NET. Окрашивание против NE(A, B; зеленый), H2B(C, D; красный), и ДНК(E, F; синий). Рисунок 1G,H представляет наложение всех трех каналов. Пиксели с интенсивностью от 80 до 256 во всех цветах представляют области перекрывающихся окрашивания для NE, H2B и ДНК и считаются производными от NET или нейтрофилов, проходящих NETosis. Эти пиксели были псевдо-цветные, как фиолетовый в панели G ',где они образуют большую площадь; и в панели H', где только небольшие пятна находятся. Изображения были сделаны с широкоугольным микроскопом с использованием 20x цели, а панель масштаба представляет 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Конфокальная флуоресценция микроскопии компонентов NET в образце аппендицита человека.
Использовался тот же раздел тканей, который использовался на рисунке 1. (A) Окрашивание против NE, (B) Изображение H2B, и (C) Hoechst 33342 окрашивание ДНК. (D) Наложение всех трех каналов. Колокализация всех трех сигналов псевдо-цветной фиолетовый в панели D '. Для этого пиксели с интенсивностью и интенсивностью 80 во всех трех цветах были обнаружены с помощью Volocity 6.3. Фиолетовая область изображает NETs или нейтрофилов, проходящих NETosis. Изображения были сделаны с конфокальной микроскопией в виде стеков и представлены как максимальная проекция. Панель шкалы составляет 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Конфокальная флуоресценция микроскопии компонентов NET в мышонке, зараженной М. ТБ.
Это деталь из центральной части участка полного легкого с массивной нейтрофильной инфильтрацией. (A) NE окрашивания, (B) H2B окрашивания, и (C) окрашивания ДНК. (D) Наложение всех трех каналов. Фиолетовый наложение в панели D' указывает на пиксели с значениями интенсивности в размере 80 фунтов во всех трех цветах, указывающих на нейтрофилы, проходящие NETosis, а также NET. Изображения были сделаны в виде стеков с конфокальным микроскопом и представлены как максимальная проекция. Панель шкалы составляет 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная рисунок 1: Запятнание контроля с несвязанными первичными антителами. Человек(A,C) и ткани мурина (B,D), как было использовано для Рисунок 1 и Рисунок 2, и рисунок 3, соответственно, были окрашены несвязанных первичных антител (A,B) или без первичных антител (C, D). В качестве контроля первичных антител в панелях А и В применялась сыворотка от неиммунизированного кролика и курица IgY против GFP. Вторичные антитела были такими же, как показано во всех других окрашивания, а также используется в панелях C и D. Как и ожидалось, в всех условиях было обнаружено незначительное фоновое окрашивание, иллюстрирующее специфику антител, используемых для рисунка 1, рисунок 2и рисунок 3. Изображения были сделаны с конфокальный микроскоп, ДНК окрашенных с Hoechst 33342, и шкала бар представляет 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Discussion
С ростом осведомленности о роли NETs во время патогенеза9,их обнаружение в тканях от пациентов или экспериментальных животных приобретает все большее значение. Образцы тканей, встроенные в парафин, имеют ряд преимуществ по сравнению с другими препаратами ткани (например, секции криоконсервированных образцов). Сохранение тканей в парафинах-встроенных образцов явно превосходит, и после встроены, образцы сохраняются в течение десятилетий, что позволяет ретроградных исследований. Для обнаружения NETs, которые филигранные структуры, хорошая консервация образцов является предварительным условием, исключающим использование криоконсервированного материала, который склонен к повреждению тканей из-за образования кристаллов льда, которые могут привести к артефактам морфологически напоминающие Сети.
Для оптимального сохранения ткани от экспериментальных животных должны быть исправлены вскоре после смерти, в идеале перфузии, чтобы избежать аутолиза. Как фиксаторные, свежеприготовленные или свежеразмороженые растворы параформальдегида в подходящем буфере, как TBS или PBS руды оптимальным. Это химически определяется в отличие от формилина препараты, используемые для стандартной гистологии, и вызывает меньше ткани аутофлуоресценции. В отличие от этого, ткани человека часто не фиксируется непосредственно после иссечения, и как фиксатор, как правило, 10% разбавления формалин используется, который содержит от 10% до 15% метанола в качестве стабилизатора для предотвращения полимеризации, а также для мультяшной кислоты, других альдегидов и кетонов . Часто, ткань хранится в этом фиксаторе в течение длительного количества времени до встраивания. Результатом может быть автолиза (в зависимости от времени между эксцизией и фиксацией), а также чрезмерное образование метиленовых мостов из-за чрезмерного огорчения. Формальдегидфиксация индуцирует изменения в третичной структуре белков путем формирования внутри- и межмолекулярных метиленовых мостов10. Небелковые компоненты клеток, такие как нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды, не фиксируются напрямую, а обездвижены в трехмерной белковой сети. Для успешной маркировки, метиленовые связи должны быть нарушены, чтобы разоблачить эпитопы в процессе поиска антигена. Это достигается путем нагрева тканевых секций, установленных на слайдах микроскопа в подходящем тепловом буфере поиска антигена (HIER буфер)11. Наше предыдущее исследование проанализировало влияние рН и температуры буферов HIER на обнаружение компонентов NET в парафинизированной ткани, и было установлено, что успешная предобработка тканей для одного компонента часто является неоптимальной для второго компонента8.
В то же время, было установлено, что нагревание ткани до 70 градусов в буфере HIER на рН 9 является хорошим компромиссом для многих компонентов NET и сохранит хорошую консервацию тканей, которая часто скомпрометирована при более высоких температурах. Предлагается использовать время поиска, указанное в качестве отправной точки, но особенно с архивными образцами неизвестных параметров фиксации, интенсивность окрашивания может быть неудовлетворительной. В этом случае, продление или более высокая температура во время процедуры поиска может улучшить эффективность окрашивания. Это также может повлиять на гистон 2B окрашивания igY антитела, используемые в нашем протоколе. Как показано на рисунке 1, деконденсированный хроматин может быть найден в нейтрофилов, проходящих NETosis, а также в NETs пятна гораздо сильнее с этим антителом по сравнению с хроматином в отдыхает нейтрофилов. Это, вероятно, связано с ограниченным доступом молекулы 180 kDa IgY к компактным ядрам и может отличаться после увеличения восстановления эпитопа. Это может усилить связывающую эффективность даже в областях конденсированного хроматина, что приведет к усилению флуоресценции в нормальных ядрах нейтрофилов и других клеток. Разница в эффективности окрашивания между нейтрофиловами, проходящими NETosis и нестимулированных нейтрофилов может быть менее выражена, чем показано на рисунке 1. Области формирования NET по-прежнему будут определены путем совместной локализации NE, H2B и ДНК.
Процедура фиксации может также вызвать значительную аутофлуоресценцию ткани, в основном в голубоватой/ зеленоватой части спектра. Важно, чтобы избежать большей части этой автофлюоресценции с помощью адекватных узких наборов флуоресценции bandpass флуоресценции (широкое поле) или детектор настройки (конфокальный), которые соответствуют максимум выбросов фторхрома, используемых с синим возбуждением, например, Cy2, Alexafluor 488. В крайних случаях автофлюоресценции следует избегать голубоватой/зеленоватой части спектра. Вместо этого, флуоресценция сигналы могут быть обнаружены легче в далекой красной части спектра (например, вторичные антитела в сочетании с Cy 5 или Alexafluor 635), но это требует безфильтрованных черных / белых камер или конфокальных микроскопов. Так как человеческий глаз довольно бесчувственен за 600 нм, гораздо красные сигналы флуоресценции вряд ли могут быть обнаружены с помощью глаз. В любом случае, важно использовать отрицательный контроль (например, неиммунные sera/isotype управления вместо первичных антител или опуская первичные антитела) для определения подходящего времени экспозиции или настройки детектора.
Ткань разделов 1'2 мкм может быть проанализирована с помощью широкоугольных микроскопов с помощью 10x или 20x целей. Эти линзы обеспечивают большую фокусную глубину, поэтому (почти) весь раздел ткани будет в центре внимания. Это может быть использовано для быстрого сканирования участков ткани для областей формирования NET, если они достаточно велики (как на рисунке 1). Колокализация зеленых (NE), красных (H2B) каналов приводит к белому окрашиванию, указывающему области образования NET(рисунок 1G). Для более высоких увеличений необходимы конфокальные или широкоугольные микроскопы с деконволюцией. На рисунке 2 показаны детали образца аппендицита человека, также используемого для рисунка 1. На рисунке 2A,NE локализуется до небольших точек (гранулы), но большая часть внеклеточных, часто образующих полосы, которые перекрываются с H2B(Рисунок 2B) и ДНК(Рисунок 2C). Это colocalization приводит к беловатый наложения с указанием NETs(Рисунок 2D). Очень похожая картина может быть найдена в легкой части мыши, инфицированной М. туберкулеза (рисунок 3).
Представленные здесь образцы характеризуются областями с высокой степенью образования NET, которые могут быть идентифицированы даже при низком увеличении. В зависимости от плотности тканей и соответствующего стимула, образование NET может быть гораздо менее выраженным, вплоть до образования NET небольших групп нейтрофилов (например, при миокардите см. предыдущую публикацию12). Считается, что этот протокол будет способствовать более исследований по NETs в тканях и, надеюсь, помощь в распутывании непризнанных ролей NETs в формировании или профилактике заболеваний.
Disclosures
Источником финансирования этой работы является Общество Макса Планка. Мы благодарим Артуро Зыхлинского за критические прочтения рукописи и Филиппа Сайкали для мышиной ткани.
Acknowledgments
Авторам нечего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumine | Sigma | A7906 | |
| chicken anti Histone 2B antibody | Abcam | ab 134211 | |
| cold water fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| donkey anti chicken antibody, Cy3 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 703-165-155 | |
| donkey anti rabbit antibody, Cy2 conjugated, for multiple labelling | Jackson Immuno Research | 711-225-152 | alternatively Cy5 conjugate, 711-175-152 |
| embedding cassettes | Roth | K116.1 | |
| embedding molds | Sakura | 4162 | |
| embedding station | Microm | AP280 | |
| ethanol | Roth | 9065.4 | |
| filter paper, rolled | OCB | ||
| forceps | Dumont | 7a | |
| glass cylinder with 20 cm diameter | VWR | 216-0075 | |
| glycerol | Roth | 3783.1 | |
| HIER buffer pH 9 | Scytek | TES999 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | 14533 | |
| incubator (dry, up to 40 °C) | Memmert | MMIPP30 | |
| moist chamber (plastic box with tight lid) | Emsa | 508542 | |
| Mowiol 40-88 | Aldrich | 32.459-0 | |
| normal donkey serum | Merck | S30 | |
| PAP-pen ImmEdge | Vector Lab | H-4000 | |
| paraffin microtome | Microm | 355S | water bath included |
| paraformaldehyde | Aldrich | 16005 | |
| petri dishes | Schubert /Weiss | 7020051 | |
| rabbit anti ELANE antibody | Atlas | HPA068836 | |
| racks, jars for microscope slides | Roth | H554.1 H552.1 | |
| scalpel | Braun | Fig.22 | |
| Superfrost Plus glass slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| temperature-controlled hot plate | NeoLab | D6010 | |
| tissue processor for paraffin embedding | Leica | TP1020 | |
| Tris buffered saline TBS | VWR | 788 | |
| Triton X100 | Roth | 3051.4 | |
| Tween 20 | Fluka | 93773 | |
| water bath 37 °C | GFL | 1052 | |
| widefield or confocal microscope | Leica | DMR, SP8 | |
| xylene (dimethylbenzene) | Roth | 9713.3 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLOS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BioMed Central Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation. 84 (3), 300-306 (2004).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Cattoretti, G., et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. Journal of Pathology. 171 (2), 83-98 (1993).
- Yamashita, S., Okada, Y. Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).
- Weckbach, L. T., et al. Midkine drives cardiac inflammation by promoting neutrophil trafficking and NETosis in myocarditis. Journal of Experimental Medicine. 216 (2), 350-368 (2019).
