Summary
هنا ، ونحن نقدم الإنسان الانسجه الدهنية خاليه من انزيم التجزئة الصغيرة باستخدام جهاز مغلق النظام. هذه الطريقة الجديدة تسمح لحصول علي من مجموعات المليمتر من الانسجه الدهنية المناسبة في زرع الجسم المجري, في المختبر الثقافة, والمزيد من العزلة الخلية وتوصيف.
Abstract
في العقد الماضي ، كانت عمليات زرع الانسجه الدهنية تستخدم علي نطاق واسع في الجراحة التجميلية وتقويم العظام لتعزيز أعاده الانسجه و/أو التجدد. وبناء علي ذلك ، تطورت تقنيات حصاد ومعالجه الانسجه الدهنية البشرية من أجل الحصول بسرعة وكفاءه علي كميات كبيره من الانسجه. ومن بين هذه التقنيات ، تمثل تكنولوجيا النظام المغلق نظاما مبتكرا وسهل الاستخدام لحصاد الانسجه الدهنية المكررة ومعالجتها وأعاده حقنها في وقت قصير وفي نفس التدخل (داخل العملية). يتم جمع الانسجه الدهنية عن طريق شفط الدهون ، وغسلها ، مستحلب ، شطف ومفروم ميكانيكيا في مجموعات الخلايا من 0.3 إلى 0.8 مم. وقد أظهرت الذاتي زرع الانسجه الدهنية مجزاه ميكانيكيا فعاليه ملحوظة في مختلف العلاجية مؤشرات مثل الطب التجميلي والجراحة ، والعظام والجراحة العامة. وكشف توصيف الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا عن وجود السفن الصغيرة السليمة داخل مجموعات الخلايا الشحمية ؛ التالي ، ترك مشكاة الاوعيه الدموية غير مضطرب. وقد أثريت هذه التكتلات في خلايا الاوعيه الدموية (اي أسلاف الخلايا الجذعية (MSC)) واظهر التحليل في المختبر زيادة في الإفراج عن عوامل النمو والخلوية المشاركة في إصلاح الانسجه وتجديدها ، بالمقارنة مع MSCs انزيمي المشتقة. وهذا يوحي بان الإمكانات العلاجية المتفوقة للانسجه الدهنية المجزاه تفسر بتردد اعلي من MSCs المفترض والنشاط سيكريتوري المحسنة. وما إذا كانت هذه الإضافات المضافة تساهم مباشره في زيادة عامل النمو ولا يعرف إنتاج السايسيسين. يسمح هذا الاجراء الذي تمت الموافقة عليه سريريا بزرع MSCs المفترض دون الحاجة إلى التوسع و/أو العلاج الانزيمي ، التالي تجاوز متطلبات GMP المبادئ التوجيهية ، والحد من تكاليف العلاجات القائمة علي الخلايا.
Introduction
الانسجه الدهنية ، وتستخدم لفتره طويلة كحشو في الجراحة الترميمية والتجميلية ، وقد أصبحت في الاونه الاخيره أكثر شعبيه في الطب التجديدي المعترف بها مره واحده كمصدر للخلايا الجذعية المسسبي (MSCs)1. الدهون الانزيميه المنفصلة في المعلقات أحاديه الخلية تسفر عن كسر الاوعيه الدموية اللحمية الخالية من الخلايا الشحمية (SVF) التي يتم استخدامها دون تغيير في المريض أو ، أكثر شيوعا ، يتم استزراعها لعده أسابيع في MSCs2.
ومع ذلك ، تفكك الانزيم تمزق بيئات الانسجه الصغرى ، عزله الخلايا التنظيمية المجاورة من الخلايا التجديدية المفترضة التي تصبح تعديلا كبيرا من قبل في المختبر الثقافة. لتجنب مثل هذه التحف التجريبية والتعديلات الوظيفية المترتبة علي ذلك ، بذلت محاولات لمعالجه الانسجه الدهنية للاستخدام العلاجي مع الحفاظ علي تكوينها الأصلي كما سليمه قدر الإمكان3،4. وعلي وجه الخصوص ، بدات اضطرابات الانسجه الميكانيكية لتحل محل التفكك الانزيمي. وتحقيقا لهذه الغاية ، الغمر الكامل مغلقه نظام الأجزاء الصغيرة الدهنية في الخلايا الفرعية ملليمتر ، والدم والنفط خاليه من مجموعات الانسجه (علي سبيل المثال ، ليبوجواهر) عن طريق سلسله من غربال الترشيح والرخام الصلب الناجم عن انقطاع3. الزرع الذاتي للانسجه الدهنية المجزاه جزئيا ، باستخدام هذه التكنولوجيا المغلقة للنظام ، كان ناجحا في مؤشرات متعددة ، والتي تغطي مستحضرات التجميل ، وجراحه العظام ، وطب المستقيم وامراض النسائية4،5، 6،7،8،9،10،11،12،13.
وكشفت المقارنة بين الانسجه الدهنية الدقيقة المجزاه البشرية (حصيره) التي تم الحصول عليها مع جهاز النظام المغلق و SVF العصبية انه فيما يتعلق بتوزيع الخلايا الوعائية/اللحمية والنشاط سيكريتوري في الثقافة ، حصيره يحتوي علي المزيد من بيريسيلات ، والتي هي المفترض MSCs14، ويفرز كميات اعلي من عوامل النمو و السايتوكينات15.
وتوضح هذه المادة التجزئة الصغرى الخالية من الانزيمات للانسجه الدهنية تحت الجلد البشرية باستخدام جهاز مغلق ، والمزيد من معالجه هذه الانسجه الدهنية المجهرية للثقافة الانبوبيه ، والمناعي ، وتحليل النظام ، من أجل تحديد أنواع الخلايا الموجودة والعوامل القابلة للذوبان التي يفرزها (الشكل 1). الطريقة الموصوفة بأمان يولد الدهنية المشتقة من الملليمتر العضوي الذي يحتوي علي خلايا الانسجه الدهنية قابله للحياة في مكانه سليمه ، ومناسبه لمزيد من التطبيقات والدراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول علي الموافقة الاخلاقيه لاستخدام الانسجه البشرية في هذا البحث من لجنه أخلاقيات البحوث في جنوب شرق اسكتلندا (المرجع: 16/SS/0103).
1. جمع الانسجه الدهنية تحت الجلد البطن
ملاحظه: يتم توفير جميع الاداات المستخدمة في الاجراء اليدوي لشفط الدهون من قبل الشركة المصنعة للجهاز الصغير التجزئة.
- الحفاظ علي العقم لجميع السوائل والحاويات والاداات ، ومنطقه العمليات طوال التجربة.
- ضع عينه شد البطن (التي تم شراؤها من قبل الفريق الجراحي في كيس معقم بدون اي محلول) فوق قطعه قماش جراحيه مع الجلد الذي يواجه صعودا. لا يلزم الغسيل. للاستخدام الأمثل ، والحفاظ علي العينة في 4 درجه مئوية ومعالجه العينة الدهنية في غضون 16 ساعة من الحصاد.
- حقن 50 إلى 100 مل من 37 درجه مئوية 0.9 ٪ محلول كلوريد الصوديوم ، اعتمادا علي حجم عينه الانسجه (استخدام 50 mL للحد الأقصى 15 سم2 سطح الانسجه الدهنية وزيادة حجم وفقا لذلك) ، وذلك باستخدام القابل للتصرف الانسجه تسلل cannula ، في تحت الجلد الانسجه الدهنية. التعامل مع العينة من قبل الجزء الجلدي.
- قم بتوصيل حقنه قفل Luer 10 مل إلى cannula المتاح لشفط الدهون.
- بعناية إدخال قني داخل الانسجه الدهنية من الحواف. مره واحده في الداخل ، وخلق فراغ داخل حقنه عن طريق سحب المكبس. الحفاظ علي المكبس في الموقف باليد لتامين شفط فراغ.
- جعل الحركات الشعاعية داخل عينه الانسجه الدهنية حتى الحقنه مليئه بالدهون. قم بازاله الكانولا بعناية من النسيج وافصل الحقنه. قم بتوصيل حقنه فارغه جديده.
- كرر الاجراء حتى يتم جمع 60 مل من ليبوسات.
ملاحظه: الحد الأقصى لكميه الدهون التي يمكن معالجتها بالتغييرات وفقا لنوع الجهاز المستخدم. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).
2-التفتيت الجزئي للدهون الشحمية
ملاحظه: هذا البروتوكول مخصص للاستخدام البحثي فقط. يتم تنفيذ التجزئة الدقيقة بمساعده جهاز متاح تجاريا (جدول المواد).
- قم بازاله الجهاز من الحزمة وتحقق من ان الوحدة الرئيسية متصلة بكيس النفايات. وضع كيس جمع النفايات علي الأرض والتاكد من ان يتم تامين الصمامات لوحدات العملية القبعات.
- قم بتوصيل الارتفاع النهائي لخط الإدخال إلى الكيس الملحي عن طريق اختراق منفذ توصيل الحقيبة. حافظ علي الكيس الملحي اعلي من وحده المعالجة.
ملاحظه: لنوع الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول ، يوصي بحقيبة 2,000 مل من المحلول الملحي المعقم. - تحقق من ان جميع المشابك 5 متصلة أنابيب الدوائر مفتوحة. ضع وحده المعالجة في وضع عمودي مع الغطاء الرمادي للأعلى.
- السماح للحل الملحي لملء وحده المعالجة. تاكد من ان التدفق يصل إلى كيس النفايات. أزاله جميع فقاعات الهواء من وحده المعالجة عن طريق هز ذلك.
ملاحظه: يجب ان يتم تنفيذ جميع المقاطع التالية في غياب الهواء في وحده المعالجة. - ضع وحده المعالجة في وضع عمودي مع الغطاء الأزرق صعودا واغلق المشبك بجوار خط الإدخال.
- أبدا بحقن الدهون عن طريق توصيل الحقنه بالصمام انسداد الذاتي لغطاء الإدخال الأزرق. الحفاظ علي وحده المعالجة العمودية خلال هذا الاجراء وسحب ببطء المكبس حقنه حتى تم نقل جميع الدهون إلى الوحدة. كرر العملية حتى تكون جميع الدهون داخل وحده المعالجة.
ملاحظه: لوحده المعالجة المستخدمة في الفيديو ، أضف الحد الأقصى 30 مل من الدهون الدهنية في ذلك الوقت. يمكن اجراء العملية بحد اقصي مرتين ، حتى 60 مل من الدهون الشحمية التي تمت معالجتها. - فتح المشبك الإدخال لاستعاده تدفق المالحة.
- يهز بقوة وحده المعالجة لمده 2 دقيقه علي الأقل ، والتحقق بانتظام من تدفق محلول ملحي في كيس النفايات.
- عندما يتحول المحلول الملحي في وحده المعالجة إلى الشفافية ، بعد دقيقتين تقريبا من الاهتزاز ، ضع الوحدة مع الغطاء الرمادي للأعلى ، واغلق المشبك الموجود علي الاستنزاف بالقرب من الغطاء الرمادي. الانسجه المعالجة سوف تطفو في الأعلى.
- ملء حقنه قفل Luer 10 مل مع محلول ملحي وتوصيله إلى صمام التحميل من الغطاء الأزرق. اغلق المشبك الموجود بالقرب من الغطاء الأزرق. قم بتوصيل حقنه قفل Luer 10 مل فارغه ، مع المكبس المدرج بالبالكامل ، إلى صمام الغطاء الرمادي.
ملاحظه: استخدام المحاقن قفل Luer فقط. - حقن المحلول الملحي بقوة في وحده المعالجة من الغطاء الأزرق. تاكد من ان الحقنه المتصلة بالصمام الرمادي يتم ملؤها بالانسجه المعالجة. مره واحده بعد ان حقن كل المالحة ، وأزاله بعناية كل من المحاقن.
- كرر الخطوات 2.10 و 2.11 حتى يتم جمع كافة الانسجه المعالجة.
ملاحظه: متوسط الغلة من حصيره هو 30 مل من 60 مل من الدهون اليدوية. وسوف تبقي بعض الانسجه داخل وحده المعالجة وبعض كتل قد تكون موجودة تعلق علي الحافة الزرقاء داخل الوحدة. - في نهاية المعالجة ، وأزاله جميع المحاقن ، وإغلاق جميع المشابك ، وفصل كيس ملحي والتخلص من الجهاز وفقا للبروتوكولات المحلية.
ملاحظه: لا يمكن أعاده استخدام جهاز المعالجة.
3. مضان مناعي
- نقل 300-500 μL من حصيره إلى أنبوب 1.5 mL. أضافه 1 مل من 4 ٪ مؤقتا بارافورمالدهيد (PFA) ، مزيج بلطف باليد (لا فورتيكنج) وترك في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها (من 16 إلى 24 ساعة).
- جمع العينة ونقلها إلى أنبوب 1.5 mL نظيفه تحتوي علي 1 مل من برامج تلفزيونيه. كرر الخطوة مرتين لأزاله الزائدة PFA.
- نقل العينة في 15 ٪ (ث/الخامس) السكروز في حل الخدمات التلفزيونية واحتضان في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها (من 16 إلى 24 ساعة)
- نقل العينة في بئر من 24 لوحه جيدا وأضافه حل تضمين المصنوعة من السكروز 15 ٪ و 7 ٪ الجيلاتين (ث/ف) في الخدمات التلفزيونية. أملا البئر في منتصف الطريق. احتضان لمده 4 ساعات في 37 درجه مئوية.
- نقل العينات إلى 4 درجه مئوية. بعد 2-4 h للحصول علي الجيلاتين ليصلب ، تملا البئر مع حل تضمين وترك في 4 °C بين عشيه وضحيها.
- أزاله العينات من الآبار. أزاله مركب التضمين الزائد وتجميد الجليد الجاف. تخزين العينات في-80 درجه مئوية.
- قطع المقاطع السميكة 8-10 μm باستخدام التبريد. للحصول علي المستوي الأمثل ، استخدم التبريد عند-30 درجه مئوية. يمكن تخزين الشرائح في-80 درجه مئوية.
- قبل المضي قدما مع المناعي ، إصلاح الأقسام في 4 ٪ PFA لمده 7 دقائق. أزاله PFA ويغسل مرتين مع الفاترة تلفزيوني (37 درجه مئوية) من أجل أزاله الجيلاتين من الأقسام.
- منع الأجسام المضادة غير محدده ملزمه من خلال احتضان الشرائح مع 10 ٪ مصل الماعز في الخدمات التلفزيونية العامة (v/v) لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
- تمييع الأجسام المضادة الاساسيه في مخفف الأجسام المضادة أو 0.2 ٪ (ث/ف) الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسنيين) في الاذاعه التلفزيونية (w/v): الماوس المضادة للإنسان-NG2 (1:100 ، الأسهم 0.5 ملغ/مل) ، أرنب المضادة ل0.15 1:100 الإنسان
- أزاله الحل حظر وأضافه الأجسام المضادة الاساسيه المخففة. احتضان في 4 °C بين عشيه وضحيها.
ملاحظه: تنفيذ جميع الخطوات حضانة من الآن فصاعدا في الظلام. - أزاله الأجسام المضادة الاساسيه ويغسل 3 مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه في كل مره.
- تمييع الأجسام المضادة الثانوية في مخفف الأجسام المضادة أو 0.2 ٪ (ث/ف) جيش الصرب البوسنيين في الاذاعه التلفزيونية: الماعز المضادة للماوس-555 (1:300) ، الماعز المضادة لأرنب-647 (1:300). احتضان 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله الأجسام المضادة الثانوية ويغسل ثلاث مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه في كل مره.
- إذا تم استخدام البيوتين مترافق لكتين, استخدام avidin/البيوتين حجب عده. احتضان لمده 10 دقيقه مع كل كاشف المقدمة مع اثنين من يغسل في ما بين مع تلفزيوني.
- كرر خطوه الحجب من خلال احتضان الشرائح لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة مع 10% مصل الماعز في الخدمات التلفزيونية.
- أضافه لكتين الحيوية, بيونكس اوليكس يوروريوس لكتين (1:200, الأسهم 2 مغ/مل), المخفف اما في 0.2% بوسنيا (w/v) في الجسم التلفزيوني أو الأجسام المضادة diluent. احتضان 1 ساعة و 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله الزائدة الحيوية لكتين ويغسل ثلاث مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه في كل مره.
- أضافه العقديات الثانوية مترافق الأجسام المضادة المخفف في اي 0.2 ٪ (ث/ف) جيش الصرب البوسنيين في تلفزيوني أو الأجسام المضادة diluent. احتضان لمده 1 ساعة.
- أزاله الأجسام المضادة الثانوية ويغسل ثلاث مرات مع تلفزيوني لمده 10 دقيقه في كل مره.
- النوى مضاده للبقع مع 4 ′ ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI ، 1:500 ، الأسهم 5 ملغ/مل) ، المخفف في 0.2 ٪ بوسنيا (w/v) في الخدمات التلفزيونية ، لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- أزاله الحل DAPI ويغسل مرتين مع تلفزيوني ، 10 دقيقه في كل مره.
- جبل الشرائح مع عامل تصاعد مائي. ندعه يجف تماما ، اما بين عشيه وضحيها علي مقاعد البدلاء في الظلام أو 1 ح في 37 درجه مئوية.
- الحفاظ علي الشرائح في 4 درجه مئوية في الظلام والحصول علي الصور علي المجهر الكتابي.
4. هضم الانسجه الدهنية المجزاه الصغرى وعزل الخلايا
- نقل الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا إلى حاويه معقمه.
- الطازجة تشكل المتوسطة الهضم عن طريق تذويب النوع الثاني كولاجيناز في DMEM في تركيز 1 مغ/مل.
- أضافه نفس حجم الهضم المتوسطة إلى الانسجه الدهنية المجزاه الصغرى (اي ، ل 30 مل من عينه أضافه 30 مل من متوسط الهضم).
- وضع الحاوية مختومه في 37 درجه مئوية يهز حمام المياه تعيين إلى 120 دوره في الدقيقة ل 45 min. يرجى ملاحظه ان الحاوية يجب ان تسمح اهتزاز السليم للعينه. إذا كانت حاويه كبيره غير متوفرة ، استخدم أنابيب 2 50 mL (30 مل من العينة/الهضم خليط متوسط في كل) وضعت أفقيا.
- بعد الحضانة ، ومنع الهضم عن طريق أضافه كميه متساوية من حل الحجب (2 ٪ (v/v) FCS/تلفزيوني) وتصفيه بالتتابع من خلال 100 μm و 70 μm الخلية strainers.
- الطرد المركزي التعليق المصفاة لمده 5 دقائق في 200 x g. تجاهل الخارقة.
- أعاده تعليق بيليه في ما يقرب من 5 مل من كريات تحلل العازلة (155 mM NH4Cl ، 170 mm تريس ، pH 7.65). قد يختلف حجم المخزن المؤقت وفقا للتلوث الكريات الذي لوحظ في الكريات الخلوية. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 15 دقيقه.
- أضافه كميه متساوية من حل الحجب وتصفيه من خلال مصفاه خليه 40 μm.
- الطرد المركزي تعليق الخلية لمده 5 دقائق في 200 x g وتجاهل supernatant.
- أعاده تعليق بيليه في حل الحظر. اخلط جيدا عن طريق التنضيد. عد الخلايا القابلة للحياة مع الاستبعاد الأزرق الترلون علي مقياس الكريات الدموية.
- اخلطي كميه متساوية من تعليق الخلية مع الصبغة الزرقاء من التريكان. يستنشق 10 μL من المحلول ووضعه علي مقياس الكريات الدموية.
- احسب عدد الخلايا الحية (الساطعة والمستديرة) الموجودة في 5 مربعات علي الأقل واحصل علي رقم الخلية المتوسط. من أجل تضمين عامل تخفيف وصمه عار ، وضرب متوسط عدد الخلايا بنسبه 2. للحصول علي العدد الإجمالي للخلايا الحية لكل 1 مل من عينه تتضاعف العدد الذي تم الحصول عليه بنسبه 104.
ملاحظه: الحصول علي تعليق خليه واحده ، وهي كسر الاوعيه الدموية (SVF) ، يمكن ان تكون اما المصنفة في 20,000 خلايا/سم2 في متوسط نمو الخلايا الوعائية (dmem تستكمل مع 20 ٪ الحرارة النشطة FCS ، 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين و 1 ٪ L-الجلوتامين) أو تستخدم لتحليل تدفق الخلوي والفرز. الغلة متوسطه من [نوتد] خلايا في ال [سفف] تقريبا 3 [اكس] 104 خلايا لكل [مل] من حصيره. تتطلب الاختبارات الفرز ما لا يقل عن 8 x 105 خلايا للحصول علي ما يكفي من خلايا الاوعيه الدموية لزراعه.
5-وسم الخلايا وفرزها
- الطرد المركزي تعليق الخلية في درجه حرارة الغرفة لمده 5 دقائق في 200 x g، وأعاده تعليق بيليه في حجب المتوسطة في تركيز 1 × 106 خلايا لكل 100 μl.
- Aliquot علي الأقل 50,000 خلايا للسيطرة غير ملون والفلورية ناقص واحد (FMO) الضوابط في البوليسترين جولة أسفل أنابيب التدفق الخلوي. استخدام بقية الخلايا لتلطيخ متعدد ألوان عن طريق وضع في أنبوب آخر.
ملاحظه: بمجرد إنشاء إعدادات التجربة (اي ، كثافة الليزر ، استراتيجية النابضة) ، يمكن تقليل عدد الخلايا المستخدمة للتحكم غير الملون و FMOs ، إذا ، الأجسام المضادة المستخدمة هي نفسها. - أضافه CD31-V450 (1:400) ، CD34 (1:100) ، CD45-V450 (1:400) و CD146-BV711 (1:100) الأجسام المضادة لتعليق خليه واحده لتلطيخ متعدد ألوان. بالنسبة لعناصر التحكم الخاصة ب FMO ، أضف: لV450 المكافئة ل FMO من CD34 و CD146 بالاضافه إلى V450 التحكم في النمط; لوحدات التخزين المكافئة PE FMO من CD31-V450 و CD45 V450 و CD146 بالاضافه إلى عنصر تحكم النمط PE; لBV711 المكافئة ل FMO من CD31-V450 و CD45 V450 و CD34-PE بالاضافه إلى التحكم في النمط الBV711.
- ماصه برفق ، أو دوامه ببطء الحل في أنبوب لخلط واحتضان الأنابيب في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه في الظلام.
- اعداد حبات التحكم في التعويض. أضافه 15 μL من الخرز الإيجابي و 15 μL من الخرز السلبية إلى 70 μL من حجب المتوسطة في 3 البوليسترين جولة أسفل أنابيب التدفق الخلوي. أضافه CD34 ، CD31-V450 أو CD45 V450 ، والأجسام المضادة CD146-BV711 ، واحد لكل أنبوب.
- ماصه برفق ، أو دوامه ببطء ، لخلط الأجسام المضادة مع الخرز واحتضان جميع الأنابيب في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه في الظلام.
ملاحظه: يمكن استخدام الاجراء الموصوف اما لتحليل التدفق الخلوي أو فرز الخلايا. - اعداد أنابيب جمع من قبل ترطيب السطح الداخلي للأنابيب مع متوسط نمو بطانية (غير عادي) ، وترك ما يقرب من 50 μL من المتوسطة في الجزء السفلي من كل أنبوب.
- بعد حضانة الأجسام المضادة ، وأزاله الزائدة من الأجسام المضادة عن طريق غسل الخلايا والخرز مع 2 مل من منع المتوسطة.
- أزاله الحل عن طريق يطرد الأنابيب في 200 x g ل 5 دقيقه ويستنشق بعناية supernatant. تكرار خطوه الغسيل.
- أعاده تعليق الخلايا في منع المتوسطة في تركيز نهائي من 1 × 106 خلايا لكل 250 Μl. أعاده تعليق الخرز في 100 μl من حجب المتوسطة.
- نقل الخلايا إلى البوليسترين الجديد جولة أسفل أنابيب التدفق الخلوي مع غطاء مصفاه الخلية. وهذا سيسمح بتعطيل كتل الخلايا.
- نقل جميع الخلايا والمعلقات حبه إلى فأرز الخلية علي الجليد في الظلام.
- تشغيل خلايا التحكم غير الملون لتاسيس الفلورية الخلفية وتعيين الفولتية.
- تشغيل أنابيب التحكم التعويض لتعيين التعويض مضان.
- استخدام منطقه مبعثر إلى الامام (FSC-A) مقابل ناحية مبعثر الجانب (SSC-A) لتحديد الخلايا ، ومن ثم استخدام ناحية مبعثر إلى الامام (FSC-A) مقابل ارتفاع مبعثر إلى الامام (FSC-H) لتحديد خلايا واحده.
- أضافه DAPI ، 1 μL من 5 ميكروغرام/مل الحل لكل مل من عينه ، إلى السيطرة غير ملون لتعيين النابضة للخلايا الميتة (الشكل 2). لا يلزم الغسيل بعد تلطيخ DAPI.
- قم بتشغيل عناصر تحكم النمط لتاسيس عتبات الخلفية المتعلقة بالربط غير المحدد وتعيين النابض.
- تشغيل العينة الملونة متعددة ألوان. استبعاد الخلايا التي تكون الدم والبطانية عن طريق النابضة علي CD31 و CD45 الخلايا السالبة. جمع السكان pericyte (CD146 + CD34)والخلايا الخلوية ( CD146-CD34 +) في أنابيب جمع (الشكل 2).
ملاحظه: إنتاجيه الخلايا القابلة للاستمرار الأمثل هي تقريبا 2% من التفكك الكلي للخلايا الحية ل pericytes و 1.5% لخلايا التهوية.
6-ثقافة الخلية
- البذور الطازجة فرزها perسيلات والخلايا التهوية في كثافة 30,000 إلى 40,000 الخلايا/سم2 علي لوحات الجيلاتين المغلفة الثقافة
- لمعطف لوحات الثقافة ، وتغطيه منطقه لوحه مع العقيمة 0.2 ٪ (ث/الخامس) الجيلاتين في حل تلفزيوني (تقريبا 100 μL من محلول لكل سم2). احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه وأزاله الحل. الحفاظ علي فرز الخلايا الطازجة علي الجليد خلال طلاء لوحه الثقافة.
- الطرد المركزي الخلايا التي تم جمعها حديثا في 200 x g لمده 5 دقائق وأعاده التعليق برفق بيليه الخلية في كميه مناسبه من متوسط نمو بطانية (غير عادي). إذا كان عدد الخلايا التي تم جمعها منخفض جدا ، تجنب طرد ولوحه مباشره الخلايا التي تم جمعها.
- بذور الخلايا علي لوحات الجيلاتين المغلفة. احتضان في 37 درجه مئوية في 5 ٪ CO2.
- مره واحده واستقرت الخلايا والتمسك لوحه (بعد ما لا يقل عن 72 h) ، تبادل غير عادي مع متوسط نمو الخلايا الوعائية (DMEM تستكمل مع 20 ٪ الحرارة النشطة FCS ، 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين و 1 ٪ L-الجلوتامين) لكل من الخلايا الخلوية والتهوية.
- مره واحده وقد وصلت pericytes والخلايا التهوية 80 ٪-90 ٪ التقاء ، والخلايا الانفصال باستخدام 0.05 ٪ تريبسين-أدتا. جمع مع 5 ٪ FCS/تلفزيوني ، جهاز الطرد المركزي في 200 x g لمده 5 دقائق ، أعاده التعليق في متوسط نمو الخلايا الوعائية ، ومن ثم مرور الخلايا من 1:3 إلى 1:5 نسبه (أو في حوالي 7,000 الخلايا/سم2) علي لوحات الثقافة البوليسترين غير المصقول أو قوارير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ادي التفكك الميكانيكي للدهون اليدوية إلى إنتاج الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا (MAT) ، والتي تتكون من مجموعه من الخلايا الشحمية التي تغلف شبكه الاوعيه المجهرية (الشكل 3). تحليل المناعية من الجيلاتين-جزءا لا يتجزا من كريوفيكسيد ويسلط الضوء علي هذا الهيكل ، وتبين شبكه الاوعيه الدموية التي تميزت بعلامة الخلية البطانية Ulex يوروريوس راصات 1 (UEA-1) مستقبلات تتكون أساسا من الصغيرة ، مثل الاوعيه الشعرية ( الشكل 4). ومن الملاحظ ان الخلايا البطانية التي تعبر عن NG2 أو PDGFRβ هي التي يتم توزيعهابشكلخاص ، وهي الخلية الغشائية المغلفة (الصورة 4). تؤكد هذه البيانات ان عمليه التجزئة الجزئية الميكانيكية لا تؤثر علي حجره الخلايا الوعائية. وقد تاكد وجود خلايا الاوعيه الدموية ، كل من الخلايا الخلوية والخلوية ، من خلال تدفق الخلية. لتحديد خلايا منطقه مبعثر إلى الامام (FSC-A) مقابل منطقه مبعثر الجانب (SSC-A) تم استخدام بوابه (الشكل 2ا). تم تحديد عدد الخلايا المحددة باستخدام منطقه مبعثرة إلى الامام (FSC-A) مقابل ارتفاع مبعثر إلى الامام (FSC-H) لتحديد خلايا واحده وتم تحديد الخلايا الحية علي انها سلبيه لتلطيخ DAPI (الشكل 2ب-ج). واستخدمت علامات CD31 و CD45 لاستبعاد الخلايا الغذائية والبطانية (الشكل 2ج). وأخيرا ، تم تحديد الخلاياالCD146ه والCD34ه والخلوية علي انها CD146- CD34 + (الشكل 2د). ويرد في الشكل 2موجز لاستراتيجية الوضع. واتبعت الاستراتيجية نفسها لفرز التجارب. Facs-تنقيه حصيره pericytes والخلايا التهوية علي حد سواء يحمل المغزل إلى المورفولوجية النجميه في الثقافة. وأظهرت الثقافة لمده 8 أيام ان حصيره يفرز المزيد من السايتوكينات (اديبونكتين ، CD14, CD31, CD154, chitinase 3-مثل 1, تكمله عامل D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-السائل الدماغي الشوكي, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, ارتخاء-2, ST2, TNF-α, CD87), والاوعيه العوامل (angiogenin ، angiogenin ، DPPIV ، endoglin ، HGF ، ليبتين ، PDGFAB/BB ، PlGF ، الخثاري 2 ، TIMP4 ، uPA) في المختبر من SVF. وعلاوة علي ذلك ، كانت السايتوكينات وعوامل الاوعيه الدموية التي تنتجها كل من حصيره و SVF أكثر وفره في حصيره سوبرناتانتس. وفقا لذلك ، مات هضمها مع كولاجيناز ووضعها في الثقافة أنتجت سيكريسوم مماثله لتلك التي لوحظت من SVF التقليدية15. وعلي الصعيد العالمي ، تبين جميع هذه البيانات ان الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا ليست مفيده بشكل علاجي فحسب ، بل هي أيضا قابله للتحقيقات الظاهرية والوظيفية. علي وجه الخصوص ، وحجم صغير من مجموعات حصيره يسمح اختبار النشاط سيكريتوري في الثقافة ، والتي من شانها ان تكون أكثر صعوبة مع قطع الانسجه الدهنية الكبيرة.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للتجزئة الجزئية للانسجه الدهنية تحت الجلد. يتم جمع ليبوتيسات من الانسجه الدهنية تحت الجلد باستخدام cannula. الدهون المجمعة هي مجزاه جزئيا باستخدام جهاز إغلاق النظام. تتكون الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا (حصيره) من قبل أنواع متعددة من الخلايا بما في ذلك خلايا الاوعيه الدموية والبويضات الشحمية. يمكن استخدام حصيره في اختبارات متعددة ، بما في ذلك الثقافة المفسرة والمناعي ، ولعزل الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استراتيجية تمثيليه لتحليل خلايا الاوعيه الدموية/الفرز من حصيره. وتستخدم منطقه مبعثرة إلى الامام (FSC-A) مقابل منطقه مبعثرة جانبيه (SSC-A) لتحديد الخلايا (ا) ، متبوعه بمنطقه مبعثرة إلى الامام (Fsc-a) مقابل ارتفاع مبعثر إلى الامام (Fsc-H) لتحديد خلايا واحده (B). الخلايا القابلة للحياة غير البطانية وغير التي تكون الدم هي بوابات سلبيه ل DAPI ، CD31-V450 و CD45-V450 علي التوالي ، في نفس اللوحة (C). وأخيرا ، يتم تحديد خلايا الاوعيه الدموية علي انها بيريسيلات (CD146 + CD34) أو الخلاياالخلوية (CD146- CD34 +) (د). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تشكل الحصيرة. رؤية الحقل الساطع من حصيره مثقف في المتوسطة القاعدية. شريط مقياس = 1,000 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: شبكه الاوعيه الدموية في حصيره. ملطخه الخلايا البطانية مع UEA-1. وأظهرت المناطق محاصر في A الموسع في B و c. نصال تشير pericytes ، التي تم ملطخه باستخدام الأجسام المضادة ضد PDGFRβ و NG2. شريط مقياس = 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه الورقة التجزئة الفيزيائية ، باستخدام جهاز مغلق ، من الانسجه الدهنية البشرية إلى مجموعات صغيره تعرض التشريح المجهري للانسجه الدهنية العادية.
يتم تحميل الانسجه الدهنية تحت الجلد الإنسان يدويا ومحلول ملحي في اسطوانه بلاستيكية شفافة تحتوي علي الكرات المعدنية الكبيرة علي غرار الكرات التي ، عند اهتزاز دليل قوي من الجهاز ، وتمزق الدهون في الفرعية ملليمتر شظايا. المرشحات المرفقة ومنفذ يسمح القضاء علي الحطام والدم والدهون الحرة ويتم جمع حصيره في حقنه مرتبطة بالجهاز. هنا, وقد تم بنجاح معالجه حصيره لمناعي, تدفق الخلوية والثقافة, علي الرغم من ان هذا الجهاز محدده تم تطويرها في منظور طبي, ليحل محل في المسرح انزيمي أنتجت الانسجه الدهنية الاوعيه الدموية اللحمية كسر أو الثقافة المستمدة من الخلايا الجذعية الدهنية ، وأثبتت في الواقع كفاءه عاليه في الجراحة التجميلية والعلاجات الأخرى القائمة علي الخلايا المختلفة4،5،6،7،8، 9،10،11،12،13.
ولذلك ، الانسجه الدهنية المستخدمة لفتره طويلة سليمه باعتبارها مجرد حشو16 يعود في التكوين الأصلي 3-الابعاد ، بعد سنوات من التفكك الانزيمي والثقافة في المختبر. وهذا يتبع اتجاها عاما لزراعه ودراسة الانسجه في ترتيبها متعدد الخلايا الفطرية بدلا من السكان الخلية المشتتة ، كما يتضح من تزايد شعبيه العضوية17.
وقد ثبت تجزئه الانسجه الدهنية باستخدام هذا الجهاز الميكانيكية موثوق بها واستنساخها وليس من الضروري اي تعديل للبروتوكول الأصلي. العرض العادي من الدهون تحت الجلد البشري للدراسات التجريبية هو الدهنية التي تم جمعها لأسباب تجميلية ، والتي يتم تحميلها مباشره علي جهاز التفتيت. وهناك قيد للمستخدمين في مختبر البحوث ، علي الرغم من ذلك ، هو ان الانسجه الدهنية التي يجب معالجتها يجب ان يستنشق بلطف باليد ، للحفاظ علي الانسجه المجهرية كما سليمه قدر الإمكان ، وليس تمتص مع مضخة فراغ كما يتم بشكل روتيني في التشغيل غرفه. ما لم يتم التعرف علي الجراح الراغب في جمع الدهون يدويا ، يمكن استخدام بقايا شد البطن التي تم تقسيمها حديثا. الدهون المرتبطة بالجانب الداخلي من جلد البطن يمكن بعد ذلك ان تكون بعناية ومعقمه يستنشق مع حقنه المقدمة مع عده. وهذا هو السبب في اننا وصفنا هذه الخطوة في بداية البروتوكول (الخطوة 1).
ما يفسر في الواقع التفوق العلاجي من حصيره علي الانسجه الدهنية فصل الانزيم ؟ تحليل تدفق الخلوية من حصيره انزيمي فصل مباشره بعد تجزئه كشفت نسبه اعلي من pericytes ، المعروفة باسم الرائدات الفطرية من الخلايا الجذعية المسمارية14، بالمقارنة مع مجموع الانسجه الدهنية يستنشق15 . أكثر مباشره, التحليل المقارن لل حصيره و SVF الثقافة الفائقة أظهرت ان يفرز السابق, نوعيا وكميا, المزيد من عوامل النمو و السايتوكينات تشارك بشكل غير مباشر في إصلاح الانسجه. وتشمل هذه العوامل الموالية للاوعيه الدموية, فضلا عن وسطاء متنوعة من المناعي-التهاب15.
وبعد هذه النتائج الاخيره ، لا يزال هناك الكثير مما ينبغي فهمه فيما يتعلق بالأساس الجزيئي للإمكانيات العلاجية لل MAT. ولهذه الغاية ، تمثل الطريقة الموصوفة هنا تقنيه بسيطه وسريعة ذات تاثير منخفض علي المشكاة الدهنية وتولد حصيره مثاليه لمزيد من التلاعب التجريبي. من وجهه نظر اضافيه ، يتم اجراء البحوث أيضا لتحسين قابليه استخدام حصيره في العيادة ؛ وفي هذا الصدد ، فان تحديد ما إذا كان من الممكن تجميد الانسجه الدهنية المجزاه جزئيا بالنسبة للاداره الذاتية المتاخره أو المخلوطة بالجينات يبدو كاولويه. وأخيرا ، سيكون من المهم تحديد ما إذا كانت الانسجه والأعضاء الأخرى مثل نخاع العظم ، البنكرياس أو الهيكل العظمي العضلات ، علي سبيل المثال لا الحصر ، يمكن ان تكون مجزاه متناهية الصغر مع نفس الجهاز وتوفير الاوعيه الدموية المرتبطة الخلايا الدقيقة سليمه قابله إلى التدخل التجريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CT هو مؤسس ليبوجواهر.
Acknowledgments
ويود المؤلفون ان يشكروا كلير كراير وفيونا روسي في جامعه ادنبره علي مساعدتهم الخبيرة في قياس التدفق الخلوي. ونود أيضا ان نشكر موظفي مستشفي موراريفيلد الذين ساهموا في تقديم عينات من الانسجه.
وكان هذا العمل مدعوما بمنح من مؤسسه القلب البريطانية والأحجار الكريمة ، التي زودت مجموعات تجهيز الانسجه الدهنية. وتم شراء عينات من انسجه الكبار البشرية باذن أخلاقي كامل من لجنه الأخلاقيات البحثية في جنوب شرق اسكتلندا (المرجع: 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
