Summary
. בעזרת מכשיר מערכת סגור שיטה חדשה זו מאפשרת בידור של אשכולות תת-מילימטר של רקמת האדיפוז המתאימים להשתלה vivo, בתרבות החוץ-גופית ובבידוד תאים נוסף ואפיון.
Abstract
במהלך העשור האחרון, השתלות רקמה באמצעות שימוש נרחב בכירורגיה פלסטית ובאורתופדיה כדי לשפר את הרקמה החוזרת של רקמות ו/או התחדשות. לפיכך, טכניקות לקציר ועיבוד של רקמת השומן האנושית התפתחו כדי להשיג במהירות וביעילות כמויות גדולות של רקמות. בין השאר, טכנולוגיית המערכת הסגורה מייצגת מערכת חדשנית וקלה לשימוש כדי לקצור, לעבד ולהזריק מחדש את רקמת השומן המעודנת בזמן קצר ובאותה התערבות (בשיתוף פעולה). רקמת אדיפוז נאסף על ידי שאיבת שומן, שטף, אמולסיה, שטיפת ובטחון מכני לתוך אשכולות תאים של 0.3 כדי 0.8 מ"מ. השתלת אוטוולוגי של רקמת אדיפוז בצורה מכנית הראתה יעילות יוצאת דופן בטיפולי שונות אינדיקציות כגון רפואה אסתטית וניתוח, אורתופדיה וניתוח כללי. אפיון מיקרו-רקמה מפוצלת חשף את נוכחותם של כלי קטן ללא פגע בתוך אשכולות האדיפוציטים; ולכן, הנישה הפריסקולרית נותרה לא מודאג. אשכולות אלה מועשרים בתאי וסקולריים (כלומר, תא גזע mesenchymal (MSC) אבות) ובניתוח חוץ גופית הראה שחרור מוגבר של גורמי גדילה וציטוקינים מעורבים תיקון רקמות והתחדשות, לעומת MSCs נגזר אנזימטי. הדבר מצביע על כך שהפוטנציאל הטיפולי המעולה של רקמת השומן המפוצלים מוסבר בתדירות גבוהה יותר של שוערת MSCs ופעילות הפרשה המשופרת. בין אם הוספת קרום הלב הוסיף במישרין לגורם גדילה גבוה יותר וייצור ציטוקין אינו ידוע. זו הליך מאושר קליני מאפשר השתלת שוערת MSCs ללא צורך התרחבות ו/או טיפול אנזימטי, ובכך לעקוף את הדרישות של הנחיות GMP, וצמצום העלויות עבור טיפולים מבוססי תאים.
Introduction
ברקמת אדיפוז, שימוש ממושך כמילוי בניתוחים קוסמטיים, הפכה לאחרונה לפופולרית יותר ברפואת ההתחדשות המוכרת כמקור לתאי גזע mesenchymal (MSCs)1. ליפופוטים הנתק אנזימטי לתוך תא יחיד השעיות בהספקויות התשואה של מסטרומה ללא שימוש מרובה וסקולרית (SVF) המשמשת בלתי מחולקת במטופל או, בדרך כלל, היא תרבותית במשך מספר שבועות לתוך MSCs2.
עם זאת, דיסוציאציה האנזים מרוכל את מיקרוסביבות הרקמה, secluding תאים הרגולציה השכנה מתאי משובי שוערת הפכו שונה במידה ניכרת על ידי תרבות מבחנה. כדי למנוע ממצאים ניסיוניים כאלה ושינויים פונקציונליים הסוגר, נעשו ניסיונות לעבד את רקמת האדיפוז לשימוש טיפולית תוך שמירה על התצורה הטבעית שלה בשלמותה ככל האפשר3,4. בעיקר, הפרעה ברקמה המכנית החלה להחליף את הדיסוציאציה האנזימטית. למטרה זו, מערכת סגורה טבילה מלאה מיקרו שברי ליפוף לתוך תת מילימטר, דם ושמן אשכולות רקמות (g., ליפופיטים) באמצעות רצף של סינון מסננת ושיבוש פלדה שיש מושרה3. השתלת אוטוולוגי של רקמת אדיפוז מקוטעת, באמצעות טכנולוגיית מערכת סגורה זו, הצליחה במספר רב של סימנים, מוצרי קוסמטיקה מורחבים, אורטופדיה, פרוטולוגיה ו גינקולוגיה4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
השוואה בין מיקרו-רקמת השומן האנושי מפוצל (MAT) המתקבל עם התקן מערכת סגורה ואיזוגניים SVF חשף כי ביחס כלי דם/סטרומה הפצת תאים ופעילות הפרשה בתרבות, MAT מכיל יותר קרום הלב, אשר שוערת MSCs14, ו מפריש כמויות גבוהות יותר של גורמי צמיחה ציטוקינים15.
המאמר הנוכחי ממחיש את הפיצול נטול האנזימים של רקמת השומן התת עורית האנושית באמצעות מכשיר מערכת סגור, והעיבוד הנוסף של רקמת השומן המיקרובית הזאת לתרבות החוץ-גופית, ניתוח האימונוהיסטוכימיה ו-FACS, על מנת לזהות את סוגי התאים הקיימים ואת הגורמים המוסיסים (איור 1). השיטה המתוארת יוצרת באופן בטוח שיטת האדיפוז משני מילימטר המכיל אוכלוסיות של תאים בעלי שומן קיימא בנישה שלמה, המתאימה ליישומים ולמחקרים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אישור אתי לשימוש ברקמות האדם במחקר זה התקבל מתוך ועדת האתיקה של דרום מזרח סקוטלנד מחקר (התייחסות: 16/SS/0103).
1. אוסף רקמות הבטן התת עורית
הערה: כל המכשירים המשמשים את הנוהל הידני שאיבת שומן מסופקים על ידי היצרן של המכשיר מיקרו פיצול.
- שמרו על עקרות עבור כל הנוזלים, המכולות, המכשירים והאזור המבצעי במהלך הניסוי.
- מניחים את דגימת מתיחת הבטן (באמצעות הצוות הכירורגי בשקית סטרילית ללא כל פתרון) על גבי מטלית כירורגית עם העור הפונה כלפי מעלה. אין צורך בכביסה. לשימוש אופטימלי, יש לשמור את הדגימה ב -4 ° c ולעבד את דגימת האדיפוז בתוך 16 שעות של קציר.
- הכנס 50 ל 100 mL של 37 ° צ' 0.9% הפתרון, בהתאם לגודל של דגימת הרקמה (השתמש ב50 mL עבור מקסימום15 ס"מ משטח רקמת אדיפוז ולהגדיל את העוצמה בהתאם), באמצעות צינורית חד פעמיות חדירה לרקמות, לתוך תת עורית . רקמת שומן . לטפל בדגימה ליד החלק העורית
- חברו מזרק מנעול של 10 מ ל. לצינורית שאיבת שומן חד פעמית
- הציגו בקפידה את הצינורית בתוך רקמת השומן מהשוליים. ברגע הפנימי, ליצור את הוואקום בתוך המזרק על ידי משיכת הבוכנה. לשמור את הבוכנה במיקום ביד כדי לאבטח את שאיבה ואקום.
- ליצור תנועות רדיאליות בתוך דגימת רקמת השומן עד המזרק מלא ליפוף. הסר בזהירות את הצינורית מהרקמה ונתק את המזרק. חבר מזרק חדש וריק.
- חזור על ההליך עד 60 mL של ליפוף שנאספו.
הערה: הכמות המירבית של ליפוף שניתן לעבד שינויים בהתאם לסוג ההתקן המשמש. עיין בהוראות היצרן (טבלת חומרים).
2. מיקרו-פיצול של ליפוף
הערה: פרוטוקול זה נועד לשימוש מחקרי בלבד. מיקרו-פיצול מבוצע בעזרת מכשיר מסחרי זמין (טבלת חומרים).
- הסר את ההתקן מהחבילה וודא שהיחידה הראשית מחוברת לשקית הפסולת. הניחו את שקית איסוף הפסולת על הקרקע והקפידו לוודא שהשסתומים מאובטחים ליחידת התהליכים.
- חבר את היתד הטרמינל של קו הקלט לשקית המלח על ידי פירסינג ביציאת החיבור לשקית. שמור את שקית המלח. גבוה יותר מיחידת העיבוד
הערה: עבור סוג המכשיר המשמש בפרוטוקול זה, שקית 2,000 mL של תמיסת מלח סטרילי מומלץ. - ודא שכל 5 התפסים המחוברים לצינורות המעגלים פתוחים. מניחים את יחידת העיבוד בתנוחה אנכית עם הכובע האפור כלפי מעלה.
- אפשר לתמיסת המלח למלא את יחידת העיבוד. בדקו שהזרימה מגיעה לשקית האשפה. הסר את כל בועות האוויר מיחידת העיבוד על-ידי טלטול.
הערה: יש לבצע את כל המעברים הבאים בהיעדר אוויר ביחידת העיבוד. - מקם את יחידת העיבוד במיקום אנכי עם המכסה הכחול כלפי מעלה וסגור את התפס שליד קו הקלט.
- התחל להזריק ליפוף על ידי חיבור המזרק לשסתום האוטם העצמי של כובע הקלט הכחול. השאר את יחידת העיבוד אנכית במהלך הליך זה ולאחר מכן למשוך לאט את המזרק עד שכל ליפוף הועבר ליחידה. חזור על התהליך עד שכל ליפוף הוא בתוך יחידת העיבוד.
הערה: עבור יחידת עיבוד המשמש וידאו, להוסיף מקסימום 30 מ ל של ליפוף בזמן. ההליך ניתן לבצע מקסימום פעמיים, עד 60 mL של ליפוף כבר עובדו. - פתח את תפס הקלט כדי לשחזר את זרימת המלח.
- מטלטל נמרצות את יחידת העיבוד עבור 2 דקות לפחות, באופן קבוע בודק את זרימת התמיסה מלוחים לתוך שקית הפסולת.
- כאשר פתרון מלוחים ביחידת העיבוד הופך שקוף, לאחר approximatively 2 דקות של טלטול, למקם את היחידה עם הכובע האפור כלפי מעלה, ולסגור את התפס ממוקם על הניקוז ליד הכובע האפור. הרקמה המעובדת. תצוצף בפסגה
- מלא מזרק מנעול של 10 מ"ל עם תמיסת מלח וחבר אותו לשסתום הטעינה של הכיפה הכחולה. סגור את התפס הממוקם ליד הכיפה הכחולה. חבר מזרק ריק מנעל לוייר 10 mL, כאשר הבוכנה הוכנסה לחלוטין, אל שסתום הכיפה האפורה.
הערה: השימוש Luer לנעול מזרקים בלבד. - הכנס בחוזקה את התמיסת מלח ליחידת העיבוד מהמכסה הכחול. ודאו שמזרק המחובר לשסתום האפור מתמלא ברקמה המעובדת. ברגע שהוא הזריק את כל התמיסת מלח, בזהירות להסיר את שני מזרקים.
- חזור על שלבים 2.10 ו-2.11 עד לאיסוף כל הרקמה המעובדת.
הערה: התשואה הממוצעת של MAT הוא 30 מ ל מ 60 mL של ליפוף ידנית. רקמות מסוימות יישארו בתוך יחידת העיבוד וחלק ממקבצים עשויים להיות מחוברים לקצה הכחול בתוך היחידה. - בסוף העיבוד, להסיר את כל הזרקים, לסגור את כל התפסים, לנתק את השקית מלוחים ולהיפטר המכשיר על פי פרוטוקולים מקומיים.
הערה: לא ניתן להשתמש מחדש בהתקן העיבוד.
3. ביוקרינה אימונוהיסטוכימיה
- העבר 300-500 μL של MAT לתוך שפופרת 1.5 mL. מוסיפים 1 מ ל של 4% פאראפורמלדהיד באגירה, מערבבים בעדינות ביד (ללא הורטקנג) ויוצאים ב -4 ° c ללילה (מ -16 עד 24 שעות).
- לאסוף את הדגימה ולהעביר שפופרת נקי 1.5 mL המכיל 1 מ ל של PBS. חזור על השלב פעמיים כדי להסיר את העודפי הכדורגלן.
- העברת הדגימה ב 15% (w/v) סוכות בתמיסה PBS ו-דגירה ב 4 ° צ' לילה (מ 16 עד 24 שעות)
- העבר את הדגימה בבאר של 24 צלחת ולהוסיף פתרון הטבעה העשוי 15% סוכרוז ו 7% ג'לטין (w/v) ב-PBS. . תמלא את הבאר בחצי הדרך מודטה עבור 4 h ב 37 ° c.
- העבירו את הדגימות ל -4 ° c. לאחר 2-4 h על הג כדי לחזק, למלא את היטב עם פתרון הטבעה ולעזוב ב 4 ° c בלילה.
- . הסר את הדגימות מבארות הסר משטח הטבעה עודף והקפא על קרח יבש. אחסן את הדגימות ב-80 ° c.
- גזור 8-10 יקרומטר סעיפים עבים באמצעות קריוסטט. השתמשו בקריוסטט ב -30 ° c. ניתן לאחסן שקופיות ב--80 ° c.
- לפני שממשיכים עם האימונולובורנציה, יש לתקן את הסעיפים ב -4% בכיוון כיתה של הערוץ 7 דקות. הסירו את הבלוסים ושטפו פעמיים עם PBS (37 ° c) כדי להסיר את הג מהסעיפים.
- חסימת כריכת נוגדנים שאינה ספציפית על ידי המסת את השקופיות עם 10% סרום עז ב-PBS (v/v) עבור 1 h בטמפרטורת החדר.
- לדלל את הנוגדנים העיקריים של הנוגדן מדלל או 0.2% (w/v) פרה סרום אלבומין (BSA) ב-PBS (w/v): העכבר נגד האדם-NG2 (1:100, מניות 0.5 mg/mL), ארנב אנטי אנושי-PDGFRβ (1:100, מניות 0.15 mg/mL).
- הסר את פתרון חסימת ולהוסיף את הנוגדנים הראשוניים מדולל. מודטה ב -4 ° c ללילה.
הערה: בצע את כל צעדי הדגירה מעתה והלאה בחשכה. - הסר את הנוגדנים העיקריים ולשטוף 3 פעמים עם PBS עבור 10 דקות בכל פעם.
- לדלל את הנוגדנים משני ב-הנוגדן מדלל או 0.2% (w/v) BSA ב PBS: עז נגד עכבר-555 (1:300), עז אנטי ארנב-647 (1:300). . משטח 1 בטמפרטורת החדר
- הסר את הנוגדנים המשניים ושטוף שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות בכל פעם.
- אם נעשה שימוש בביוטין הנמצא בשימוש, השתמש בערכת החסימות avidin/ביוטין. דגירה עבור 10 דקות עם כל מגיב מסופק עם שני שוטף בין עם PBS.
- חזור על הצעד החוסם על ידי המסת את השקופיות עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם 10% סרום עז ב-PBS.
- להוסיף את לקטין biotinylated הביוטין, Ulex מלאי (1:200, מניות 2 מ"ג/mL), מדולל או 0.2% BSA (w/v) ב-PBS או מדלל נוגדן. מודקון 1 h ו 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסירו את העודף הביוטילטין ושטוף שלוש פעמים עם PBS במשך 10 דקות בכל פעם.
- הוסף את הנוגדן streptavidin מעלה מצוב מדולל ב או 0.2% (w/v) BSA ב-PBS או מדלל נוגדן. . מודטה לשעה
- להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף שלוש פעמים עם PBS עבור 10 דקות בכל פעם.
- גרעיני נגד כתמים עם 4 ′, 6-diamidino-2-פנייילידול (DAPI, 1:500, מלאי 5 מ"ג/mL), מדולל ב 0.2% BSA (w/v) ב PBS, עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את פתרון DAPI ושטוף פעמיים עם PBS, 10 דקות בכל פעם.
- הר את השקופיות עם סוכן הרכבה מימית. תנו לו להתייבש לחלוטין, או לילה על הספסל בחושך או 1 h ב 37 ° c.
- שמור את השקופיות ב 4 ° c בחושך ולרכוש תמונות על מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית.
4. העיכול של רקמת שומן מקוטעת ובידוד תאים
- . לתוך מכולה סטרילית
- טרי לפצות על בינוני העיכול על ידי המסת סוג-II הקולגן ב DMEM בריכוז של 1 מ"ג/mL.
- הוסיפו את אותו כמות העיכול של מדיום לרקמת השומן המפוצלת (כלומר, עבור 30 מ ל של מדגם הוסף 30 מ ל של מדיום לעיכול).
- הניחו את המכולה האטומה באמבט מים ב37 ° c, שנקבע ל-120 סל"ד עבור 45 דקות. אנא שימו לב כי על המיכל לאפשר טלטול נאות של המדגם. אם מיכל גדול אינו זמין, השתמש 2 50 mL צינורות (30 מ ל של מדגם/העיכול תערובת בינונית בכל אחד) ממוקם אופקית.
- לאחר הדגירה, לחסום את העיכול על ידי הוספת כמות שווה של פתרון חסימה (2% (v/v) fcs/PBS) ולסנן ברצף דרך 100 יקרומטר ו 70 מכשירי הסלולר יקרומטר.
- צנטריפוגה את ההשעיה מסוננים עבור 5 דקות ב 200 x g. . מחק את הסופרנטאנט
- השהה מחדש את הגלולה בקירוב 5 מ ל של מאגר לפירוק אריתרופואריציט (155 מ"מ NH4Cl, 170 mM טריס, pH 7.65). נפח המאגר עשוי להשתנות בהתאם לזיהום האריתרופומינציה הנצפה בגלולה התאית. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
- הוסף כמות שווה של פתרון חסימה וסנן דרך מסננת תא 40 יקרומטר.
- צנטריפוגה את ההשעיה התא עבור 5 דקות ב 200 x g ולהיפטר supernatant.
- השהה מחדש את הגלולה. בפתרון חסימה מערבבים היטב על ידי ליטוף. הרוזן תאים עם הדרה של טריקון. כחול על הומוטומטר
- מערבבים כמות שווה של השעיית התא עם הכתם הכחול של טרימין. מתיף 10 μL של הפתרון ומניחים אותו על הומוציטומטר.
- לספור את מספר התאים החיים (בהיר ועגול) נוכח לפחות 5 ריבועים ולקבל את מספר התא הממוצע. כדי לכלול את גורם הדילול הכתמים, הכפל את מספר התא הממוצע ב-2. כדי לקבל את המספר הכולל של תאים חיים עבור 1 mL של המדגם להכפיל את המספר המתקבל על ידי 104.
הערה: השעיה תא יחיד שהושג, כלומר שבר כלי הדם סטרומה (SVF), יכול להיות נזרע ב 20,000 תאים/cm2 ב perivascular תא הצמיחה בינונית (dmem שיושלם עם 20% חום מופעל fcs, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו 1% L-גלוטמין) או משמש לזרימה cy, לנסות ניתוח ומיון. התשואה הממוצעת של תאים נוקלאובטים ב-SVF היא כ 3 x 104 תאים לכל ML של MAT. ניסויים מיון דורשים לפחות 8 x 105 תאים כדי להשיג מספיק תאים perivascular דם עבור culturing.
5. התוויות ומיון תאים
- צנטריפוגה את ההשעיה התא בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות ב 200 x g, ו להשעות מחדש את הגלולה בינונית חוסמת בריכוז של 1 x 106 תאים לכל 100 μl.
- Aliquot לפחות 50,000 תאים עבור השליטה בלתי מוכתם ואת הזריחה פחות אחד (FMO) שולטת לתוך פוליסטירן בחלק התחתון הזרימה cy, לנסות צינורות. השתמש בשאר התאים לצביעת מרובה צבעים על-ידי הצבת בשפופרת אחרת.
הערה: לאחר שנקבעו ההגדרות של הניסוי (כלומר, עוצמת לייזר, אסטרטגיית מעבר), מספר התאים המשמשים עבור הפקד הבלתי מוכתם וניתן לצמצם את FMOs, אם הנוגדנים הנמצאים בשימוש זהים. - הוסף CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) ו CD146-BV711 (1:100) נוגדנים להשעיה של התא היחיד עבור כתמים מרובי צבעים. עבור הפקדים של FMO, הוסף: עבור אמצעי האחסון המקבילים V450 FMO של CD34-PE ו-CD146-BV711 בתוספת V450 בקרה; עבור אמצעי האחסון המקבילים מסוג PE FMO של CD31-V450, CD45-V450 וCD146-BV711 בנוסף לפקד PE isotype; עבור אמצעי האחסון המקבילים BV711 FMO של CD31-V450, CD45-V450 ו-CD34-PE ובפקד BV711 isotype.
- בעדינות פיפטה, או מערבולת לאט את הפתרון בצינור כדי לערבב לבין הצינורות ב 4 ° c עבור 20 דקות בחושך.
- הכינו חרוזי בקרת פיצויים. הוסף 15 μL של חרוזים חיוביים 15 μL של חרוזים שליליים כדי 70 μL של חסימת בינוני ב 3 פוליסטירן בתחתית הזרימה התחתונה-cy, לנסות צינורות. הוסף CD34-PE, CD31-V450 או CD45-V450 ו-CD146-BV711 נוגדנים, אחד לכל צינור.
- בעדינות פיפטה, או מערבולת לאט, כדי לערבב את הנוגדנים עם חרוזים ומודטים את כל הצינורות ב 4 ° c עבור 20 דקות בחושך.
הערה: ההליך המתואר יכול לשמש עבור הניתוח cy, לנסות או מיון התאים של הזרימה. - להכין צינורות איסוף ידי הרטבת מראש את המשטח הפנימי של צינורות עם בינונית צמיחה אנדותל (EGM), עוזב כ 50 μL של בינוני בתחתית כל צינור.
- לאחר דגירה הנוגדן, להסיר את עודפי הנוגדן על ידי שטיפת התאים ואת החרוזים עם 2 מ ל חסימה בינונית.
- הסר את הפתרון על ידי תפרידו את הצינורות ב 200 x g עבור 5 דקות ובזהירות מזהם את supernatant. שכפל את צעד הכביסה.
- השהה מחדש את התאים באמצעי חסימה בריכוז סופי של 1 x 106 תאים לכל 250 μl. השהה את החרוזים ב 100 μl של חסימת בינונית.
- העבר את התאים לתוך פוליסטירן חדש לעגל בתחתית הזרימה cy, לנסות צינורות עם כובע מסננת תאים. זה יאפשר הפרעה של גושי תאים.
- להעביר את כל התא ואת השעיות חרוז לסדרן התא על קרח בחושך.
- הפעל תאי בקרה שאינם מוכתמים כדי ליצור את הזריחה ברקע וקבע את המתח.
- הפעל את שפופרות בקרת הפיצוי כדי להגדיר את פיצוי הזריחה.
- השתמש באזור פיזור קדמי (FSC-A) לעומת אזור פיזור צדדי (המרכז לתקשורת מקומית-א) כדי לזהות תאים ולאחר מכן השתמש באזור פיזור קדמי (FSC-A) לעומת גובה פיזור הקדמי (FSC-H) כדי לבחור תאים בודדים.
- הוסף DAPI, 1 μL של 5 פתרון μg/mL עבור כל mL של מדגם, כדי לקבוע את החסימה של תאים מתים (איור 2). אין צורך בכביסה לאחר צביעת DAPI.
- הפעל פקדים מסוג isotype כדי ליצור סף של זריחה ברקע הקשור לאיגוד שאינו ספציפי והגדר את הסיכום.
- הפעל את הדגימה הצבעונית הצבעונית. הוצא את תאי המטפאות והאנדותל באמצעות הCD31 וCD45 תאים שליליים. לאסוף את התאים (CD146+ CD34-) ואת התא האדואלי (CD146- CD34+) אוכלוסיות לתוך צינורות אוסף (איור 2).
הערה: התפוקה המיטבית של תאים מיטביים מהווה כ -2% מהדיסוציאציה הכוללת של התא החי לקיולוציטים ו-1.5% לתאים האדוניים.
6. תרבית תאים
- זרעים ממוינים לקרום הלב ותאי האדוורתיים בצפיפות של 30,000 עד 40,000 תאים/cm2 על לוחות תרבות מצופה ג'לטין
- כדי לחלוק את לוחיות התרבות, לכסות את אזור הצלחת עם סטרילי 0.2% (w/v) ג'לטין בפתרון PBS (כ 100 μL של פתרון לכל ס מ2). דגירה בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות ולהסיר את הפתרון. שמור על תאים טריים ממוינים על קרח במהלך ציפוי לוחית התרבות.
- צנטריפוגה התאים שנאספו טרי ב 200 x g עבור 5 דקות ובעדינות להשעות מחדש את הגלולה התא בכמות מתאימה של בינונית צמיחה אנדותל (egm). אם מספר התאים שנאספו נמוך מאוד, למנוע את צנטריפוגה ואת הלוח ישירות התאים שנאספו.
- הזרע את התאים על לוחות מצופים ג'לטין. מודטה ב 37 ° c ב 5% CO2.
- לאחר התאים התיישבו ודבק את הצלחת (לאחר לפחות 72 h), החלפת EGM עם הצמיחה הפריסקולרית תא בינונית (DMEM שיושלם עם 20% חום מופעל FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% L-גלוטמין) הן תאים קרום המוח והן האדוולבית.
- ברגע שתאי הקרום והאדוולוציטים הגיעו ל-80%-90% זרימה, הנתק תאים באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA. לאסוף עם 5% FCS/PBS, צנטריפוגה ב 200 x g עבור 5 דקות, להשעות מחדש בינוני הצמיחה של תא הפרינימי, ולאחר מכן מעבר את התאים מ 1:3 ליחס 1:5 (או בערך 7,000 תאים/ס"מ2) על לוחיות התרבות פוליסטירן מצופה או מבחנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דיסוציאציה מכנית של ליפותים ידנית הביא לייצור של מיקרו מפוצל רקמת אדיפוז (MAT), המורכב של צבירה של adipocytes עוטף רשת microvascular (איור 3). Immunofluorescence ניתוח של ג'לטין מוטבע ו קריוקבוע MAT מדגיש מבנה זה, מראה את הרשת כלי הדם מסומן על ידי סמן תא אנדותל Ulex europaeus 1 (ULEX-1) קולטן בעיקר המורכב של קטן, נימים כמו ספינות ( איור 4). בעיקר קרום הלב המבטא NG2 או PDGFRβ מופצים בדרך כלל, לנדן תאים אנדותל (איור 4). נתונים אלה מאשרים כי תהליך מיקרו הפיצול המכני אינו משפיע על תא התא הפרינימי. הנוכחות של התאים הפריסקולרית, הן התאים לקרום הלב והאדולציטים, אושרה על ידי הזרמת cy, לנסות. כדי לבחור בתאים באזור פיזור קדמי (FSC-A) לעומת אזור פיזור צדדי (מקום מהאס-מע-א) בשימוש (איור 2א). האוכלוסייה תא מזוהה היה מגודרת יותר באמצעות אזור פיזור הקדמי (FSC-A) לעומת גובה פיזור קדימה (FSC-H) כדי לבחור תאים בודדים ותאים חיים זוהו שלילי לצביעת DAPI (איור 2B-C). CD31 ו CD45 סמנים שימשו כדי להוציא את התאים המטבטיים והאנדותל (איור 2ג). בסופו של דבר זוהו כדוריותהקרום CD146+ CD34 והתאים האדואדתיים כCD146- CD34+ (איור 2ד). אסטרטגיית הסיכום מסוכמות באיור 2. אותה אסטרטגיית העליה. הלכה לצורך מיון ניסויים FACS-מטוהרים מחצלת בתאי הלב והתאים האדווקטילים הן מוצגים כציר ליצירת מורפולוגיה בתרבות. תרבות 8 ימים הראה כי MAT מפריש ציטוקינים יותר (adiponectin, CD14, CD31, CD154, chitinase 3-כמו 1, גורם משלים D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-שדרתי, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA CCL5, RBP-4, הפעל-2, ST2, TNF-α, CD87), ו-אנגיוגנטי גורמים (אנגיוגניב, אנגיוסטטין, DPPIV, אנדוגלין, HGF, לפטין, PDGFAB/BB, PlGF, thrombospondin 2, TIMP4, חופה) במבחנה מאשר SVF. יתר על כן, ציטוקינים וגורמי אנגיוגנטיים המיוצרים על ידי MAT ו-SVF היו שופע יותר ב supernatants MAT. לפיכך, MAT מתעכל עם הקולגן והניח בתרבות המיוצר הסוד דומה לזה שנצפה מ-SVF קונבנציונלי15. באופן גלובלי, כל הנתונים הללו מדגימים שרקמת השומן המפוצלים אינה רק מהווה יתרון מבחינה רפואית, אלא גם מקלה על החקירות האלה והפונקציונליות. בפרט, גודל קטן של אשכולות MAT מאפשר בדיקה של פעילות הפרשה בתרבות, אשר יהיה קשה יותר עם חתיכות גדולות רקמת השומן.
איור 1: ייצוג סכמטי של הפיצול הזעיר של רקמת השומן התת עורית. ליפוף נאסף מרקמת השומן התת עורית באמצעות צינורית. ליפוף שנאסף הוא מיקרו מפוצלים באמצעות התקן מערכת סגור. כתוצאה מיקרו-רקמת אדיפוז מפוצל (MAT) מורכב על ידי סוגי תאים מרובים כולל תאים perivascular ו אדיפוציטים. MAT ניתן להשתמש במספר בדיקות, כולל תרבות הבדיקה ואימונוהיסטוכימיה, ועל בידוד התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הנציגה המייצגת את האסטרטגיה של ניתוח תאים פריסקולרית/מיון מ MAT. אזור פיזור קדמי (FSC-A) לעומת אזור פיזור צדדי (המרכזלתקשורת מקומית-a) משמש לזיהוי תאים (א), ואחריו אזור פיזור קדמי (Fsc-A) לעומת גובה פיזור העברה (Fsc-H) כדי לבחור תאים בודדים (B). תאים שאינם ניתנים לאנדותל ושאינם המטבטיים מגודרת כשלילי עבור DAPI, CD31-V450 ו CD45-V450 בהתאמה, באותו פאנל (C). בסופו של דבר, התאים הפריסקולריים מזוהים כמו קרום הלב (CD146+ CD34-) או תאים אדואדלי (CD146- CD34+) (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מורפולוגיה MAT. תצוגת שדה בהיר של MAT תרבותי במדיום הבזאלי. סרגל בקנה מידה = 1,000 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: רשת ואסיקובלטורה ב MAT. תאי האנדותל מוכתמים ב-UEA-1. האזורים המוחלקים ב-A מוגדלים ב-B ו-C ראשי החצים מצביעים על קרום הלב, אשר הוכתם בנוגדנים נגד PDGFRβ ו NG2. סרגל בקנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נייר זה מתאר את המהומה הפיזית, באמצעות התקן מערכת סגור, של רקמת השומן האנושית לאשכולות קטנים המציגים מיקרואנטומיה רגילה של רקמת השומן.
באופן ידני מרעיף רקמה תת עורית ותמיסת מלח מלוחים לתוך גליל פלסטיק שקוף המכיל כדורים גדולים בסגנון פינבול מתכתי כי, על ניעור נמרץ של המכשיר, קרע את השומן לתוך תת מילימטר שברי. מסננים ועודפים מצורפים מאפשרים סילוק פסולת, דם ושומנים חינם MAT הוא נאסף במזרק המקושר למכשיר. כאן, MAT כבר בהצלחה מעובד נוסף עבור אימונוהיסטוכימיה, זרימה cy, לנסות ותרבות, למרות המכשיר הספציפי הזה פותחה בפרספקטיבה רפואית, להחליף בתיאטרון את הייצור האנזימטי המיוצר רקמה וסקולרית כלי דם שבר או התרבות הנגזרת תאי גזע מאדיפוז, ואכן הוכיחו ביעילות רבה בניתוחים פלסטיים ובטיפולים מגוונים מבוססי תא4,5,6,7,8, . תשע,עשר,11,12,13
לכן, רקמת האדיפוז משמשת לאורך שנים רבות כמילוי בלבד16 מחזור בתצורת יליד תלת מימדי, לאחר שנות של דיסוציאציה אנזימטית ותרבות מבחנה. זה בעקבות מגמה כללית לגדול וללמוד רקמות בהסדר שלהם רב-תאיים מולדים ולא כמו אוכלוסיות תאים מפוזרים, כפי שמודגם על ידי הפופולריות הגוברת של אורגנואידים17.
הפיצול של רקמת אדיפוז באמצעות מכשיר מכני זה הוכיח אמין ומוכח ולא היה צורך בשינוי הפרוטוקול המקורי. האספקה הרגילה של השומן התת עורית האנושי למחקרים ניסיוניים הוא ליפוף שנאסף מסיבות קוסמטיות, אשר נטען ישירות על המכשיר פיצול. מגבלה עבור משתמשים במעבדת המחקר, למרות, היא כי רקמת האדיפוז להיות מעובד חייב להיות מוקשה בעדינות על ידי יד, כדי לשמור על מיקרוארכיטקטורת רקמות ללא פגע ככל האפשר, ולא לשאוב החוצה עם משאבת ואקום כפי שנעשה באופן שגרתי בפעולה חדר. אלא אם כן מנתח מוכן לאסוף שומן ידנית ניתן לזהות, שאריות מתיחת בטן טרי מחדש ניתן להשתמש. השומן מחובר ההיבט הפנימי של העור הבטן יכול להיות אז בזהירות משופחת הסטרלי עם המזרק המסופק עם הערכה. זוהי הסיבה שתיארנו את השלב הזה בתחילת הפרוטוקול (שלב 1).
מה בעצם מסביר את העליונות הטיפולית של המזרן על רקמת השומן של האנזים? הזרמת cy, ניתוח של MAT אנזימטי באופן מיידי לאחר שבירה חשפה שיעור גבוה יותר של קרום הלב, המכונה החלוצים המולדת של תאי גזע mesenchymal14, לעומת הסכום הכולל של רקמת השומן15 . באופן ישיר יותר, הניתוח השוואתי של מחצלת ו-SVF תרבות supernatants הראו כי מפריש לשעבר, באיכות וכימות, גורמי צמיחה יותר ציטוקינים מעורבים בעקיפין תיקון רקמות. אלה כוללים גורמים פרו-אנגיוגנטיים, כמו גם מגשרים מגוונים של דלקת חיסונית15.
מעבר לתוצאות האחרונות, נותר הרבה להבין בנוגע לבסיס המולקולרי של הפוטנציאל הטיפולי MAT. לשם כך, השיטה המתוארת כאן מייצגת טכניקה פשוטה ומהירה שהיא השפעה נמוכה לנישה האדיפוז ומייצרת MAT אידיאלית לטיפול ניסיוני נוסף. מנקודת מבט משניים, מחקר מבוצע גם כדי לשפר את השימושיות של MAT במרפאה; במובן זה, קביעה האם ניתן להקפיא את רקמת השומן המפוצלת לקבלת מעקב מושהה או לניהול אלוגנמית, המופיעה כעדיפות. לבסוף, זה יהיה חשוב לקבוע אם רקמות אחרות ואיברים כגון מח העצם, הלבלב או שריר השלד, כדי לצטט אבל כמה, יכול להיות מיקרו-מפוצל עם אותו התקן ולספק שלמים מיקרוvasקולטורה הקשורים נישות הסלולר מאפשר להתערבות ניסויית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CT הוא מייסד של ליפואבני חן.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות קלייר Cryer ו פיונה רוסי באוניברסיטת אדינבורו על הסיוע המומחים שלהם עם הזרימה cy, לנסות. אנו גם רוצים להודות לאנשי בית החולים Murrayfield שתרמו על ידי מתן דגימות רקמה.
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים של קרן הלב הבריטית וליפואבני חן, אשר סיפק ערכות עיבוד רקמה ברקמת אדיפוז. דגימות רקמה של מבוגרים אנושיים הושגו עם הרשאת אתיקה מלאה של ועדת האתיקה של דרום מזרח סקוטלנד מחקר (התייחסות: 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
