Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

सेल फेनोटाइपिंग और सेलेग्नोम विशेषता के लिए मानव वसा ऊतक सूक्ष्म विखंडन

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60117

Summary

यहाँ, हम मानव वसा ऊतक एंजाइम मुक्त सूक्ष्म विखंडन एक बंद प्रणाली डिवाइस का उपयोग कर प्रस्तुत करते हैं. इस नई विधि विवो प्रत्यारोपण में के लिए उपयुक्त वसा ऊतक के उप मिलीमीटर समूहों की प्राप्ति की अनुमति देता है, इन विट्रो संस्कृति में, और आगे सेल अलगाव और विशेषता.

Abstract

पिछले दशक में, वसा ऊतक प्रत्यारोपण व्यापक रूप से प्लास्टिक सर्जरी और आर्थोपेडिक्स में इस्तेमाल किया गया है ऊतक repletion और / तदनुसार, मानव वसा ऊतक की कटाई और प्रसंस्करण के लिए तकनीक विकसित की है ताकि जल्दी और कुशलता से ऊतक की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए. इनमें से, बंद प्रणाली प्रौद्योगिकी फसल के लिए एक अभिनव और आसान करने के लिए उपयोग प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है, प्रक्रिया, और फिर से एक कम समय में और एक ही हस्तक्षेप में परिष्कृत वसा ऊतक सुई (इंट्रा ऑपरेटिव). वसा ऊतक liposuction द्वारा एकत्र किया जाता है, धोया, पायसी, कुल्ला और 0.3 से 0.8 मिमी के सेल समूहों में यांत्रिक रूप से कीमा बनाया. यांत्रिक रूप से खंडित वसा ऊतक के Autologous प्रत्यारोपण विभिन्न चिकित्सकीय में उल्लेखनीय प्रभावकारिता दिखाया गया है इस तरह के सौंदर्य चिकित्सा और सर्जरी, आर्थोपेडिक और सामान्य सर्जरी के रूप में संकेत। सूक्ष्म-खंडित वसा ऊतक की विशेषता से एडिपोसाइट समूहों के भीतर बरकरार छोटे जहाजों की उपस्थिति का पता चला; इसलिए, पेरिवास्कुलर आला unperturbed छोड़ दिया है. इन समूहों perivascular कोशिकाओं में समृद्ध कर रहे हैं (यानी, mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) पूर्वजों) और इन विट्रो विश्लेषण में विकास कारकों और ऊतक की मरम्मत और पुनर्जनन में शामिल cytokines की वृद्धि हुई रिहाई से पता चला, एंजाइमी रूप से व्युत्पन्न MSCs की तुलना में. यह पता चलता है कि microfragmented वसा ऊतक के बेहतर चिकित्सीय क्षमता अनुमानित एमएससी और बढ़ाया स्रावी गतिविधि की एक उच्च आवृत्ति द्वारा समझाया गया है. क्या इन जोड़ा pericytes सीधे उच्च विकास कारक में योगदान और cytokine उत्पादन ज्ञात नहीं है. इस चिकित्सकीय अनुमोदित प्रक्रिया के विस्तार और / या एंजाइमी उपचार की आवश्यकता के बिना अनुमानित एमएससी के प्रत्यारोपण की अनुमति देता है, इस प्रकार जीएमपी दिशा निर्देशों की आवश्यकताओं को दरकिनार, और सेल आधारित चिकित्सा के लिए लागत को कम करने.

Introduction

वसा ऊतक, लंबे पुनर्निर्माण और कॉस्मेटिक सर्जरी में एक भराव के रूप में इस्तेमाल किया, हाल ही में एक बार mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (एमएससी)1के लिए एक स्रोत के रूप में मान्यता प्राप्त पुनर्योजी चिकित्सा में अधिक लोकप्रिय हो गया है। Lipoaspirates एक सेल निलंबन में enzymaticly अलग एक adipocyte मुक्त stromal संवहनी अंश (SVF) है कि रोगी में unaltered प्रयोग किया जाता है या, अधिक सामान्यतः, एमएससी2में कई हफ्तों के लिए सुसंस्कृत है उपज.

हालांकि, एंजाइम वियोजन ऊतक microenvironments टूटता है, अनुमानित पुनर्योजी कोशिकाओं है कि काफी इन विट्रो संस्कृति में द्वारा संशोधित हो से पड़ोसी नियामक कोशिकाओं को अलग. इस तरह के प्रयोगात्मक कलाकृतियों और परिणामस्वरूप कार्यात्मक परिवर्तन से बचने के लिए, चिकित्सीय उपयोग के लिए वसा ऊतक को संसाधित करने के प्रयास किए गए हैं, जबकि इसके मूल विन्यास को यथासंभव बरकरार रखने के लिए3,4. विशेष रूप से, यांत्रिक ऊतक विघटन एंजाइमी वियोजन को बदलने के लिए शुरू कर दिया है। इस अंत में, पूर्ण विसर्जन बंद प्रणाली सूक्ष्म टुकड़े lipoaspirates उप मिलीमीटर में, रक्त और तेल मुक्त ऊतक समूहों (जैसे, Lipogems) छलनी निस्पंदन और इस्पात संगमरमर प्रेरित व्यवधान के एक दृश्य के माध्यम से3. सूक्ष्म खंडित वसा ऊतक के ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण, इस बंद प्रणाली प्रौद्योगिकी का उपयोग कर, कई संकेतों में सफल रहा है, सौंदर्य प्रसाधन फैले, आर्थोपेडिक्स, प्रोक्टोलॉजी और स्त्री रोग4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.

मानव सूक्ष्म-खंडित वसा ऊतक (मैट) के बीच तुलना बंद प्रणाली डिवाइस और isogenic SVF के साथ प्राप्त पता चला है कि संवहनी / अनुमानित एमएससी14, और वृद्धि कारकों और साइटोकिन्स15की अधिक मात्रा का स्राव करता है .

वर्तमान लेख एक बंद प्रणाली डिवाइस का उपयोग कर मानव subcutaneous वसा ऊतक के एंजाइम मुक्त सूक्ष्म विखंडन दिखाता है, और इन विट्रो संस्कृति, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और FACS विश्लेषण के लिए इस तरह के micronized वसा ऊतक के आगे प्रसंस्करण, वर्तमान सेल प्रकारों और घुलनशील कारकों की पहचान करने के लिए (चित्र 1)। वर्णित विधि सुरक्षित रूप से एक बरकरार आला में व्यवहार्य वसा ऊतक कोशिका आबादी युक्त वसा व्युत्पन्न उप मिलीमीटर organoids उत्पन्न करता है, आगे अनुप्रयोगों और अध्ययन के लिए उपयुक्त.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस शोध में मानव ऊतकों के उपयोग के लिए नैतिक अनुमोदन दक्षिण पूर्व स्कॉटलैंड अनुसंधान आचार समिति से प्राप्त किया गया था (संदर्भ: 16/

1. उपत्वचा पेट वसा ऊतक संग्रह

नोट: मैनुअल लिपो-आकांक्षा प्रक्रिया में इस्तेमाल सभी उपकरणों सूक्ष्म-खंडन डिवाइस के निर्माता द्वारा प्रदान की जाती हैं।

  1. प्रयोग के दौरान सभी तरल पदार्थ, कंटेनर, उपकरणों, और परिचालन क्षेत्र के लिए बाँझपन बनाए रखें।
  2. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ त्वचा के साथ एक शल्य चिकित्सा कपड़े के शीर्ष पर abdominoplasty नमूना (किसी भी समाधान के बिना एक बाँझ बैग में शल्य चिकित्सा टीम द्वारा प्राप्त) रखें। कोई धोने की आवश्यकता है. इष्टतम उपयोग के लिए, नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और वसा के नमूने को कटाई के 16 घंटे के भीतर संसाधित करें।
  3. ऊतक नमूने के आकार के आधार पर 50 से 100 एमएल का इंजेक्शन लगाना (अधिकतम 15 सेमी2 वसा ऊतक सतह के लिए 50 एमएल का उपयोग करें और तदनुसार मात्रा में वृद्धि), डिस्पोजेबल ऊतक घुसपैठ कैनुला का उपयोग करते हुए, subcutaneous में वसा ऊतक. त्वचीय भाग द्वारा नमूना को संभालना।
  4. एक डिस्पोजेबल liposuction कैनुला के लिए एक 10 एमएल Luer ताला सिरिंज कनेक्ट करें।
  5. किनारों से वसा ऊतक के अंदर cannula ध्यान से परिचय. एक बार अंदर, प्लंजर खींच कर सिरिंज के अंदर वैक्यूम बनाएँ। वैक्यूम चूषण को सुरक्षित करने के लिए प्लंजर को हाथ से स्थिति में रखें।
  6. वसा ऊतक नमूने के अंदर रेडियल आंदोलनों बनाओ जब तक सिरिंज lipoaspirate से भरा है. ध्यान से ऊतक से cannula निकालें और सिरिंज डिस्कनेक्ट. एक नया खाली सिरिंज कनेक्ट करें।
  7. प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि 60 एमएल लिपोस्पिरेट एकत्र न हो।
    नोट: lipoaspirate की अधिकतम राशि है कि इस्तेमाल किया डिवाइस के प्रकार के अनुसार परिवर्तन संसाधित किया जा सकता है. कृपया निर्माता निर्देशों को देखें (सामग्री की तालिका)

2. लिपोस्पिरेट का सूक्ष्म-विखंडन

नोट: यह प्रोटोकॉल केवल शोध उपयोग के लिए है। सूक्ष्म विखंडन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरण(सामग्रीतालिका) की सहायता से किया जाता है।

  1. पैकेज से डिवाइस निकालें और सत्यापित करें कि मुख्य इकाई अपशिष्ट बैग से जुड़ा है. जमीन पर अपशिष्ट संग्रह बैग प्लेस और सुनिश्चित करें कि वाल्व प्रक्रिया इकाई टोपी के लिए सुरक्षित हैं.
  2. बैग कनेक्शन पोर्ट भेदी द्वारा नमकीन बैग के लिए इनपुट लाइन के टर्मिनल स्पाइक कनेक्ट करें। नमकीन बैग प्रसंस्करण इकाई से अधिक रखें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त डिवाइस के प्रकार के लिए, बाँझ नमकीन के एक 2,000 एमएल बैग की सिफारिश की है।
  3. सत्यापित करें कि सर्किट की ट्यूबों से जुड़े सभी 5 clamps खुले हैं. प्रसंस्करण इकाई को ऊपर की ओर धूसर कैप के साथ ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखें।
  4. संसाधन इकाई को भरने के लिए लवण समाधान की अनुमति दें। जाँच करें कि प्रवाह अपशिष्ट बैग तक पहुँचता है. यह मिलाते हुए प्रसंस्करण इकाई से सभी हवा बुलबुले निकालें।
    नोट: प्रसंस्करण इकाई में वायु के अभाव में निम्नलिखित सभी मार्ग निष्पादित किए जाने चाहिए।
  5. ऊपर की ओर नीले रंग की टोपी के साथ एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में प्रसंस्करण इकाई प्लेस और इनपुट लाइन के बगल में दबाना बंद करें।
  6. नीले इनपुट कैप के स्व-ऑक्लूइंग वाल्व के लिए सिरिंज को जोड़कर लिपोस्पिरेट को इंजेक्शन लगाना शुरू करें। इस प्रक्रिया के दौरान प्रसंस्करण इकाई ऊर्ध्वाधर रखें और धीरे-धीरे सीरिंज प्लंजर को तब तक खींचते हैं जब तक कि सभी लिपोस्पिरेट को यूनिट में स्थानांतरित नहीं कर दिया जाता। प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक सभी lipoaspirate प्रसंस्करण इकाई के अंदर है.
    नोट: वीडियो में प्रयुक्त प्रसंस्करण इकाई के लिए, समय पर अधिकतम 30 एमएल lipoaspirate जोड़ें। प्रक्रिया अधिकतम दो बार किया जा सकता है, जब तक lipoaspirate के 60 एमएल संसाधित किया गया है.
  7. लवणीय प्रवाह को पुनर्स्थापित करने के लिए इनपुट क्लैम्प खोलें.
  8. जोरदार 2 मिनट के लिए प्रसंस्करण इकाई हिला कम से कम, नियमित रूप से अपशिष्ट बैग में नमकीन समाधान प्रवाह की जाँच.
  9. जब प्रसंस्करण इकाई में नमकीन समाधान पारदर्शी हो जाता है, लगभग 2 मिनट के झटकों के बाद, ऊपर की ओर ग्रे टोपी के साथ इकाई जगह है, और ग्रे टोपी के पास नाली पर स्थित दबाना बंद करें। संसाधित ऊतक शीर्ष पर तैरने होंगे।
  10. नमकीन समाधान के साथ एक 10 एमएल Luer ताला सिरिंज भरें और यह नीले रंग की टोपी के लोडिंग वाल्व से कनेक्ट. नीली टोपी के पास स्थित क्लैम्प बंद करें। एक खाली 10 एमएल Luer ताला सिरिंज कनेक्ट, प्लंजर के साथ पूरी तरह से डाला, ग्रे टोपी के वाल्व के लिए.
    नोट: केवल Luer लॉक सिरिंजों का उपयोग करें.
  11. मजबूती से नीले टोपी से प्रसंस्करण इकाई में नमकीन सुई. सुनिश्चित करें कि ग्रे वाल्व से जुड़ा सिरिंज फलस्वरूप संसाधित ऊतक से भरा जा रहा है। एक बार सभी नमकीन इंजेक्शन होने के बाद, ध्यान से दोनों सिरिंजों को हटा दें।
  12. सभी संसाधित ऊतक एकत्र किया जाता है जब तक चरण 2.10 और 2.11 दोहराएँ.
    नोट: मेट की औसत उपज मैनुअल lipoaspirate के 60 एमएल से 30 एमएल है। कुछ ऊतक प्रसंस्करण इकाई के अंदर रहेंगे और कुछ क्लंप इकाई के अंदर नीले किनारे से जुड़े हुए हो सकते हैं।
  13. प्रसंस्करण के अंत में, सभी सिरिंजों को हटा दें, सभी clamps बंद करें, नमकीन बैग को अलग करें और स्थानीय प्रोटोकॉल के अनुसार डिवाइस का निपटान करें।
    नोट: संसाधन डिवाइस पुन: उपयोग नहीं किया जा सकता है।

3. फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. मैट के 300-500 डिग्री सेल्सियस को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4% बफर पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) का 1 एमएल जोड़ें, हाथ से धीरे से मिश्रण करें (कोई भंवर नहीं) और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें (16 से 24 ज)।
  2. नमूना लीजिए और पीबीएस के 1 एमएल युक्त एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण। PFA अतिरिक्त को दूर करने के लिए दो बार कदम दोहराएँ.
  3. पीबीएस समाधान में 15% (w/v) सुक्रोज में नमूना स्थानांतरित करें और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (16 से 24 ज)
  4. एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में नमूना स्थानांतरण और एक embedding समाधान 15% sucrose और 7% जिलेटिन (w/v) PBS में से बना जोड़ें. अच्छी तरह से आधे रास्ते भरें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए इनक्यूबेट।
  5. नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। जिलेटिन के लिए 2-4 एच के बाद ठोस करने के लिए, embedding समाधान के साथ अच्छी तरह से भरने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस रात में छोड़ दें।
  6. कुओं से नमूने निकालें. अतिरिक्त embedding यौगिक निकालें और सूखी बर्फ पर फ्रीज. -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने संग्रहीत करें।
  7. एक cryostat का उपयोग कर 8-10 मीटर मोटी वर्गों काट. इष्टतम अनुभागीकरण के लिए, -30 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोस्टैट का उपयोग करें। स्लाइड -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. इम्यूनोफ्लोरेसिस के साथ आगे बढ़ने से पहले, 7 मिनट के लिए 4% पीएफए में वर्गों को ठीक करें। पीएफए निकालें और वर्गों से जिलेटिन को हटाने के लिए गुनगुने पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) से दो बार धोएं।
  9. कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए पीबीएस (v/v) में 10% बकरी सीरम के साथ स्लाइड इनक्यूबेट करके गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग ब्लॉक करें।
  10. पीबीएस (w/v) में एंटीबॉडी diluent या 0.2% (w/v) गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें: माउस विरोधी मानव-NG2 (1:100, स्टॉक 0.5 mg/mL), खरगोश विरोधी मानव-PDGFR] (1:100, स्टॉक 0.15 mg/
  11. अवरुद्ध समाधान निकालें और पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: अंधेरे में अब से सभी ऊष्मायन कदम प्रदर्शन करते हैं।
  12. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और हर बार 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ 3 बार धोएं।
  13. पीबीएस में एंटीबॉडी diluent या 0.2% (w/v) बीएसए में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला: बकरी विरोधी माउस- 555 (1:300), बकरी विरोधी खरगोश- 647 (1:300). कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट 1 एच।
  14. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और पीबीएस के साथ हर बार 10 मिनट के लिए तीन बार धो लें।
  15. यदि एक बायोटिन संयुग्मी लैक्टिन का उपयोग किया जाता है, तो एविडिन/बायोटिन ब्लॉकिंग किट का उपयोग करें। पीबीएस के साथ बीच में दो washes के साथ प्रदान की प्रत्येक अभिकर्मक के साथ 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  16. पीबीएस में 10% बकरी सीरम के साथ कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए स्लाइड इनक्यूबेट करके अवरुद्ध कदम दोहराएँ।
  17. बीबीएस या एंटीबॉडी में बायोटिनिनलेटिड लेक्टिन, बायोटिनीलेटिड उल्लेक्स यूरोपियस लेक्टिन (1:200, स्टॉक 2 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें, या तो 0.2% बीएसए (w/v) में पतला। कमरे के तापमान पर 1 एच और 30 मिनट इनक्यूबेट।
  18. अतिरिक्त biotinylated लैक्टिन निकालें और 10 मिनट के लिए हर बार पीबीएस के साथ तीन बार धो लें.
  19. पीबीएस या एंटीबॉडी diluent में या तो 0.2% (w/v) बीएसए में पतला माध्यमिक streptavidin संयुग्मी एंटीबॉडी जोड़ें। 1 ज के लिए इनक्यूबेट।
  20. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और पीबीएस के साथ तीन बार 10 मिनट के लिए हर बार धो लें.
  21. 4 के साथ काउंटर स्टेन न्यूक्लिय,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:500, स्टॉक 5 mg/mL), पीबीएस में 0.2% बीएसए (w/
  22. DAPI समाधान निकालें और PBS, 10 मिनट हर बार के साथ दो बार धो लें.
  23. एक जलीय बढ़ते एजेंट के साथ स्लाइड माउंट. इसे पूरी तरह से सूखने दें, या तो रात भर अंधेरे में बेंच पर या 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच।
  24. स्लाइड को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें और एक एपिफ्लोरेसी माइक्रोस्कोप पर छवियों को प्राप्त करें।

4. सूक्ष्म खंडित वसा ऊतक और कोशिका अलगाव का पाचन

  1. सूक्ष्म खंडित वसा ऊतक को एक बाँझ कंटेनर में स्थानांतरित करें।
  2. डीएमईएम में टाइप-II कोलाज को भंग करके पाचन माध्यम को 1 मिलीग्राम/एमएल की एकाग्रता पर ताजा करें।
  3. सूक्ष्म-खंडित वसा ऊतक में पाचन माध्यम की एक ही मात्रा जोड़ें (यानी, नमूना के 30 एमएल के लिए 30 एमएल पाचन माध्यम जोड़ें)।
  4. सील कंटेनर को 37 डिग्री सेल्सियस में रखें, पानी के स्नान को 45 मिनट के लिए 120 आरपीएम के लिए सेट करें। कृपया ध्यान दें कि कंटेनर नमूने की एक उचित मिलाते हुए की अनुमति चाहिए. यदि कोई बड़ा कंटेनर उपलब्ध नहीं है, तो क्षैतिज रूप से रखे गए दो 50 एमएल ट्यूब (30 एमएल प्रतिदर्श/पाचन माध्यम मिश्रण) का उपयोग करें।
  5. ऊष्मायन के बाद, अवरुद्ध समाधान (2% (v/v) FCS/PBS) के बराबर मात्रा जोड़कर पाचन को अवरोधित करें और 100 डिग्री उ और 70 डिग्री मीटर सेल प्रतिभेदियों के माध्यम से क्रमिक रूप से फ़िल्टर करें।
  6. 200 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए फ़िल्टरकिए गए निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। महादलित को त्याग दें।
  7. एरिथ्रोसाइट lysis बफर (155 एमएम एनएच4सीएल, 170 एमएम ट्रिस, पीएच 7.65) के लगभग 5 एमएल में गोली को पुन: निलंबित करें। बफर की मात्रा सेलुलर गोली में मनाया एरिथ्रोसाइट संदूषण के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  8. समाधान को अवरुद्ध करने की समान मात्रा जोड़ें और 40 डिग्री मीटर सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें.
  9. 200 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को त्याग दें।
  10. समाधान को अवरुद्ध करने में गोली को पुन: निलंबित करें। पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। एक हेमोसाइटोमीटर पर ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण के साथ व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें।
    1. Trypan नीले दाग के साथ सेल निलंबन के एक बराबर मात्रा मिक्स. समाधान के 10 डिग्री सेल्सियस के रूप में आक्षेपित करें और इसे एक हीमोसाइटमापी पर रखें।
    2. कम से कम 5 वर्गों में मौजूद जीवित कोशिकाओं (चमकदार और गोल) की संख्या की गणना करें और माध्य कोशिका संख्या प्राप्त करें। आदेश में दाग कमजोर पड़ने कारक शामिल करने के लिए, 2 से मतलब सेल संख्या गुणा. प्रति 1 एमएल प्रति जीवित कोशिकाओं की कुल संख्या प्राप्त करने के लिए प्राप्त संख्या को 104से गुणा करें ।
      नोट: प्राप्त एकल सेल निलंबन, अर्थात् stromal संवहनी अंश (SVF), या तो 20,000 कोशिकाओं पर बीज किया जा सकता है / L-glutamine) या प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और छँटाई के लिए इस्तेमाल किया. SVF में नाभिक कोशिकाओं की औसत उपज लगभग 3 x 104 कोशिकाओं मेट के प्रति एमएल है. छंटनी प्रयोगों के लिए कम से कम 8 x 105 कोशिकाओं को culturing के लिए पर्याप्त perivascular कोशिकाओं को प्राप्त करने की आवश्यकता है.

5. सेल लेबलिंग और छँटाई

  1. 200 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और 1 x 106 कोशिकाओं प्रति 100 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता पर माध्यम को अवरुद्ध करने में गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. अलीकोट कम से कम 50,000 कोशिकाओं unstained नियंत्रण और फ्लोरोसेंट शून्य से एक (FMO) polystyrene दौर नीचे प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूबों में नियंत्रित करता है. एक और ट्यूब में रखकर बहुरंगा धुंधला के लिए कोशिकाओं के बाकी का प्रयोग करें.
    नोट: एक बार प्रयोग की सेटिंग्स स्थापित किया गया है (यानी, लेजर तीव्रता, gating रणनीति), unstained नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की संख्या और FMOs कम किया जा सकता है, अगर, एंटीबॉडी इस्तेमाल किया ही कर रहे हैं.
  3. बहु-रंग धुंधला के लिए एकल सेल निलंबन के लिए CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) और CD146-BV711 (1:100) एंटीबॉडी जोड़ें. FMO नियंत्रण के लिए, जोड़ें: CD34-PE और CD146-BV711 प्लस V450 समप्रकार नियंत्रण के V450 FMO बराबर वॉल्यूम के लिए; CD31-V450, CD45-V450 और CD146-BV711 प्लस पीई समप्रकार नियंत्रण के पीई FMO समकक्ष संस्करणों के लिए; CD31-V450, CD45-V450 और CD34-PE प्लस BV711 आइसोटाइप नियंत्रण के BV711 FMO बराबर वॉल्यूम के लिए।
  4. धीरे से पिपेट, या भंवर धीरे-धीरे ट्यूब में समाधान मिश्रण और अंधेरे में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट करने के लिए।
  5. मुआवजा नियंत्रण मोती तैयार करें. 3 polystyrene गोल-नीचे प्रवाह-साइटोमेट्री ट्यूबों में अवरुद्ध माध्यम के 70 डिग्री सेल्सियस करने के लिए सकारात्मक मोती के 15 डिग्री एल और नकारात्मक मोती के 15 डिग्री एल जोड़ें। CD34-पीई, CD31-V450 या CD45-V450, और CD146-BV711 एंटीबॉडी, एक प्रति ट्यूब जोड़ें.
  6. धीरे-धीरे पिपेट, या भंवर धीरे-धीरे, मोतियों के साथ एंटीबॉडी मिश्रण करने के लिए और अंधेरे में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: वर्णित प्रक्रिया या तो प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण या सेल छँटाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. अंत:स्तरीय वृद्धि माध्यम (EGM) के साथ ट्यूबों की भीतरी सतह को पूर्व गीला करके संग्रह ट्यूब तैयार करें, प्रत्येक ट्यूब के तल पर लगभग 50 डिग्री सेल्सियस मध्यम को छोड़ दें।
  8. एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं और अवरुद्ध माध्यम के 2 एमएल के साथ मोती धोने से एंटीबॉडी की अतिरिक्त निकालें।
  9. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर ट्यूब centrifuging द्वारा समाधान निकालें और ध्यान से supernatant aspirating. धोने के कदम की नकल.
  10. 1 x 106 कोशिकाओं प्रति 250 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता पर माध्यम को अवरोधित करने में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें. मोतियों को अवरुद्ध माध्यम के 100 डिग्री एल में पुन: निलंबित करें।
  11. सेल छलनी टोपी के साथ नए polystyrene दौर नीचे प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूबों में कोशिकाओं को स्थानांतरित। यह सेल clumps के विघटन की अनुमति देगा.
  12. अंधेरे में बर्फ पर सेल सॉर्टर के लिए सभी सेल और मनका निलंबन परिवहन।
  13. पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट स्थापित करने और voltages सेट करने के लिए unstained नियंत्रण कोशिकाओं चलाएँ.
  14. फ्लोरोसेंट मुआवजा सेट करने के लिए मुआवजा नियंत्रण ट्यूब चलाएँ.
  15. कक्षों की पहचान करने के लिए अग्रेषित स्कैटर क्षेत्र (FSC-A) बनाम साइड स्कैटर क्षेत्र (SSC-A) का उपयोग करें, और तब एकल कक्षों का चयन करने के लिए अग्रेषित स्कैटर क्षेत्र (FSC-A) बनाम अग्रेषित स्कैटर हाइट (FSC-H) का उपयोग करें.
  16. मृत कोशिकाओं के लिए गैटिंग सेट करने के लिए डीएपीआई, प्रत्येक एमएल नमूने के लिए 5 डिग्री ग्राम/एमएल समाधान का 1 $L जोड़ें, मृत कोशिकाओं के लिए गैटिंग सेट करने के लिए अनिर्दित नियंत्रण में (चित्र 2)। DAPI धुंधला के बाद कोई धोने की आवश्यकता है.
  17. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग से संबंधित पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट थ्रेशोल्ड स्थापित करने और गेटिंग सेट करने के लिए समप्रकार नियंत्रण चलाएँ.
  18. बहु-रंग दाग नमूना चलाएँ। CD31 और CD45 नकारात्मक कोशिकाओं पर gating द्वारा हेमेटोपोएटिक और endothelial कोशिकाओं को छोड़ दें. परिकायी (CD146+ CD34- )और आगमनात्मक सेल (CD146- CD34+) जनसंख्या को संग्रह ट्यूबों में ले लीजिए (चित्र 2) .
    नोट: इष्टतम व्यवहार्य सेल पैदावार pericytes के लिए कुल लाइव सेल वियोजन का लगभग 2% और adventitial कोशिकाओं के लिए 1.5% कर रहे हैं.

6. सेल संस्कृति

  1. बीज ताजा हल pericytes और adventitial कोशिकाओं के घनत्व पर 30,000 करने के लिए 40,000 कोशिकाओं /
  2. संस्कृति प्लेटों को कोट करने के लिए, पीबीएस विलयन में 0ण्2% (w/v) जिलेटिन (लगभग 100 डिग्री सेल्सियस प्रति सेमी2)के साथ प्लेट क्षेत्र को कवर करें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट और समाधान को हटा दें। संस्कृति प्लेट कोटिंग के दौरान बर्फ पर ताजा हल कोशिकाओं रखें।
  3. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर नए सिरे से एकत्र कोशिकाओं और धीरे endothelial विकास माध्यम (EGM) की एक उचित मात्रा में सेल गोली फिर से निलंबित। यदि एकत्र कोशिकाओं की संख्या बहुत कम है, तो अपकेंद्रण से बचें और सीधे एकत्र किए गए कोशिकाओं को प्लेट करें।
  4. जिलेटिन लेपित प्लेटों पर कोशिकाओं को बीज। 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।
  5. एक बार कोशिकाओं को बस गया है और थाली का पालन किया (कम से कम 72 एच के बाद), perivascular सेल विकास माध्यम के साथ ईजीएम विनिमय (DMEM 20% गर्मी निष्क्रिय FCS के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन /
  6. एक बार pericytes और adventitial कोशिकाओं तक पहुँच गए हैं 80%-90% संगम, 0.05% trypsin-EDTA का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग. 5% FCS/PBS के साथ लीजिए, 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रण, perivascular सेल विकास माध्यम में फिर से निलंबित, और फिर 1:3 से 1:5 अनुपात (या लगभग 7,000 कोशिकाओं / सेमी2)uncoated polystyrene संस्कृति प्लेटों या फ्लास्क पर कोशिकाओं को पारित.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

मैनुअल लिपोएपिरेट्स का यांत्रिक वियोजन के परिणामस्वरूप सूक्ष्म-खंडित वसा ऊतक (मैट) का उत्पादन हुआ, जिसमें माइक्रोवास्कुलर नेटवर्क को घेरने वाले एडिपोसाइट्स का एक समुच्चय होताहै। जिलेटिन-एम्बेडेड और क्रायोफिक्स्ड मेट का इम्यूनोफ्लोरेसन विश्लेषण इस संरचना पर प्रकाश डाला गया है, एंडोथेलियल सेल मार्कर यूलेक्स यूरोपियस एग्लूटिनिन 1 (यूईए-1) रिसेप्टर मुख्य रूप से छोटे, केशिका-जैसे जहाजों से मिलकर संवहनी नेटवर्क दिखा रहा है ( चित्र 4) . विशेष रूप से NG2 या PDGFR व्यक्त pericytes सामान्य रूप से वितरित कर रहे हैं, ensheathing endothelial कोशिकाओं (चित्र 4). ये आंकड़े इस बात की पुष्टि करते हैं कि यांत्रिक सूक्ष्म विखंडन प्रक्रिया परिसंवहनी कोशिका डिब्बे को प्रभावित नहीं कर रही है। पेरिवास्कुलर कोशिकाओं की उपस्थिति, दोनों pericytes और adventitial कोशिकाओं, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पुष्टि की गई है. कक्षों का चयन करने के लिए एक अग्र स्कैटर क्षेत्र (FSC-A) बनाम पार्श्व स्कैटर क्षेत्र (SSC-A) द्वार का उपयोग किया गया था (चित्र 2)। एकल कोशिकाओं का चयन करने के लिए अग्र प्रकीर्ण क्षेत्र (एफएससी-ए) बनाम अग्र तितर बितर ऊंचाई (एफएससी-एच) का उपयोग करते हुए पहचानकी गई सेल जनसंख्या को डीएपीआई धुंधला के लिए नकारात्मक के रूप में पहचाना गया था (चित्र 2बी-सी)। सीडी31 और सीडी 45 मार्कर ों का उपयोग हेमेटोपोएटिक और एंडोथेलियल कोशिकाओं को बाहर करने के लिए किया गया था (चित्र 2)। अंत में, pericytes CD146+ CD34 के रूप में पहचान की गई- और adventitial कोशिकाओं CD146 के रूप में- CD34+ ( चित्र2डी)। गेटिंग कार्यनीति को चित्र 2में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। प्रयोगों को छांटने के लिए एक ही गैटिंग रणनीति का पालन किया गया था। FACS-शुद्ध मेट pericytes और adventitial कोशिकाओं दोनों संस्कृति में आकारिकी stallate करने के लिए एक धुरी प्रदर्शन. 8 दिनों के लिए संस्कृति से पता चला है कि मेट अधिक साइटोकिन्स स्रावित करता है (adiponectin, CD14, CD31, CD154, chitinase 3 की तरह 1, पूरक कारक डी, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, आईपी-10, एम-सीएसएफ, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFA, CCL5, RBP-4, आराम -8 कारकों (एंजियोजेनिन, एंजियोस्टेटिन, DPPIV, endoglin, HGF, leptin, PDGFAB/BB, PlGF, थ्रोम्बोस्पॉन्डिन 2, TIMP4, uPA) एसवीएफ से इन विट्रो में. इसके अलावा, मेट और एसवीएफ दोनों द्वारा उत्पादित साइटोकिन्स और एंजियोजेनिक कारक मैट सुपरनेट्स में अधिक प्रचुर मात्रा में थे। तदनुसार, मेट कोलैनेस के साथ पचा और संस्कृति में रखा एक secretome है कि पारंपरिक SVF15से मनाया के समान का उत्पादन किया. वैश्विक स्तर पर, इन सभी आंकड़ों से पता चलता है कि सूक्ष्म-खंडित वसा ऊतक न केवल चिकित्सकीय रूप से लाभप्रद है, बल्कि फीनोटाइपिक और कार्यात्मक जांच के लिए भी अनुकूल है। विशेष रूप से, मैट समूहों के छोटे आकार संस्कृति में स्रावी गतिविधि के परीक्षण की अनुमति देता है, जो बड़े वसा ऊतक खंड के साथ और अधिक कठिन हो जाएगा.

Figure 1
चित्र 1: उपस्त्वज वसा ऊतक के सूक्ष्म-विखंडन का योजनाबद्ध निरूपण। वसाश्यित एक कैनुला का उपयोग करके स्त्वकियेदार वसा ऊतक से एकत्र किया जाता है। एकत्र lipoaspirate बंद प्रणाली डिवाइस का उपयोग कर सूक्ष्म fragmented है. परिणामी सूक्ष्म-खंडित वसा ऊतक (मैट) पेरिवास्कुलर कोशिकाओं और एडिपोसाइट्स सहित कई सेल प्रकारों से बना होता है। मेट कई परीक्षणों में इस्तेमाल किया जा सकता है, explant संस्कृति और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सहित, और सेल अलगाव के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: perivascular सेल विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि gating रणनीति / एक अग्र प्रकीर्ण क्षेत्र (FSC-A) बनाम साइड स्कैटर क्षेत्र (SSC-A) द्वार का उपयोग कोशिकाओं(A) की पहचान करने के लिए किया जाता है, जिसके बाद अग्र स्कैटर क्षेत्र (FSC-A) बनाम अग्र प्रकीर्णक ऊँचाई (FSC-H) एकल कक्षों का चयन करने के लिए(B)का उपयोग किया जाता है। व्यवहार्य गैर-endothelial और गैर hematopoietic कोशिकाओं DAPI के लिए नकारात्मक के रूप में द्वार कर रहे हैं, CD31-V450 और CD45-V450, एक ही पैनल में (सी). अंत में, perivascular कोशिकाओं pericytes के रूप में पहचान कर रहे हैं (CD146+ CD34-) या आकस्मिक कोशिकाओं (CD146- CD34+) (डी) . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: मेट आकारिकी. बेसल माध्यम में सुसंस्कृत मेट का उज्ज्वल क्षेत्र दृश्य। 1,000 m स्केल करें. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: MAT में Vasculature नेटवर्क. एंडोथेलियल कोशिकाओं UEA-1 के साथ दाग रहे हैं। ए में बॉक्स्ड क्षेत्रों में बी और सी एरोहेड्स में बढ़े हुए दिखाए जाते हैं, जो pericytes का संकेत देते हैं, जिन्हें PDGFR] और NG2 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके दाग दिया गया है। स्केल बार ] 50 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह कागज शारीरिक प्रभाजन का वर्णन करता है, एक बंद प्रणाली डिवाइस का उपयोग कर, मानव वसा ऊतक के छोटे समूहों में सामान्य वसा ऊतक microanatomy प्रदर्शित.

मैन्युअल रूप से aspirated मानव subcutaneous वसा ऊतक और नमकीन समाधान बड़े पिनबॉल शैली धातु क्षेत्रों युक्त एक पारदर्शी प्लास्टिक सिलेंडर में लोड कर रहे हैं कि, डिवाइस के जोरदार मैनुअल मिलाते हुए पर, उप मिलीमीटर में वसा टूटना टुकड़े. संलग्न फिल्टर और आउटलेट मलबे को नष्ट करने की अनुमति, रक्त और मुक्त लिपिड और मेट डिवाइस से जुड़े एक सिरिंज में एकत्र की है. यहाँ, मेट सफलतापूर्वक आगे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए संसाधित किया गया है, प्रवाह साइटोमेट्री और संस्कृति, हालांकि इस विशिष्ट उपकरण एक चिकित्सा परिप्रेक्ष्य में विकसित किया गया था, थिएटर में बदलने के लिए enzymaticly उत्पादित वसा ऊतक stromal संवहनी अंश या संस्कृति वसा स्टेम कोशिकाओं व्युत्पन्न, और वास्तव में प्लास्टिक सर्जरी और विविध अन्य सेल आधारित चिकित्सा4,5,6,7,8, में अत्यधिक कुशल साबित 9,10,11,12,13.

इसलिए, वसा ऊतक लंबे समय से अपने मूल 3-आयामी विन्यास में एक मात्र भराव16 रिटर्न के रूप में बरकरार इस्तेमाल किया, एंजाइमी वियोजन के वर्षों के बाद और इन विट्रो संस्कृति में. यह एक सामान्य प्रवृत्ति के बाद विकसित करने के लिए और उनकी सहज बहुकोशिकीय व्यवस्था में ऊतकों के अध्ययन के बजाय बिखरे हुए सेल आबादी के रूप में, organoids17की बढ़ती लोकप्रियता से सचित्र के रूप में .

इस यांत्रिक उपकरण का उपयोग कर वसा ऊतक विखंडन विश्वसनीय और reproduible साबित हो गया है और मूल प्रोटोकॉल का कोई संशोधन कभी आवश्यक था. प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए मानव subcutaneous वसा की साधारण आपूर्ति कॉस्मेटिक कारणों के लिए एकत्र एक lipoaspirate है, जो सीधे विखंडन डिवाइस पर भरी हुई है. अनुसंधान प्रयोगशाला में उपयोगकर्ताओं के लिए एक सीमा है, हालांकि, यह है कि वसा ऊतक संसाधित किया जा करने के लिए धीरे हाथ से aspirated होना चाहिए, ऊतक microarchitecture के रूप में संभव के रूप में बरकरार बनाए रखने के लिए, और एक वैक्यूम पंप के साथ बाहर चूसना नहीं के रूप में नियमित रूप से संचालन में किया जाता है कमरा. जब तक वसा को मैन्युअल रूप से इकट्ठा करने के लिए तैयार सर्जन की पहचान नहीं की जा सकती है, एक ताजा resected abdominoplasty अवशेषों का इस्तेमाल किया जा सकता है. पेट की त्वचा के भीतरी पहलू से जुड़ी वसा तो ध्यान से किया जा सकता है और बाँझ किट के साथ प्रदान सिरिंज के साथ aspirated. यही कारण है कि हमने प्रोटोकॉल (चरण 1) की शुरुआत में इस चरण का वर्णन किया है।

क्या वास्तव में एंजाइम अलग वसा ऊतक पर मेट की चिकित्सीय श्रेष्ठता बताते हैं? मेट एंजाइमीके विश्लेषण के प्रवाह साइटोमिति विश्लेषण के तुरंत बाद भिन्न भिन्न-भिन्न अंशीकरण से पता चला कि मेसेन्काइमल स्टेम सेल14के सहज अग्रदूतों के रूप में जाना जाता है, जैसा कि कुल aspirated वसा ऊतक 15 के साथ तुलना में pericytes के एक उच्च अनुपात से पता चला . अधिक सीधे, मेट और SVF संस्कृति supernatants के तुलनात्मक विश्लेषण से पता चला है कि पूर्व स्रावों, गुणात्मक और मात्रात्मक, अधिक विकास कारकों और cytokines ऊतक की मरम्मत में परोक्ष रूप से शामिल. इनमें प्रो-एंजियोजेनिक कारक, साथ ही इम्यूनो-सूजन15के विविध मध्यस्थ शामिल हैं।

इन हाल के परिणामों के अलावा, बहुत MAT चिकित्सीय क्षमता के आणविक आधार के बारे में समझा जा करने के लिए रहता है. यह अंत करने के लिए, यहाँ वर्णित विधि एक सरल, तेजी से तकनीक है कि वसा आला करने के लिए कम प्रभाव है और आगे प्रयोगात्मक हेरफेर के लिए मेट आदर्श उत्पन्न करता है का प्रतिनिधित्व करता है. एक सहायक दृष्टिकोण से, अनुसंधान भी क्लिनिक में मेट की प्रयोज्य में सुधार करने के लिए आयोजित किया जाता है; इस संबंध में, यह निर्धारित करना कि क्या सूक्ष्म-खंडित वसा ऊतक को विलंबित ऑटोलॉगस या एलोजेनिक प्रशासन के लिए जमे हुए किया जा सकता है या एक प्राथमिकता के रूप में प्रकट होता है। अंत में, यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा कि क्या अन्य ऊतकों और अंगों जैसे अस्थि मज्जा, अग्न्याशय या कंकाल की मांसपेशी, का हवाला देते हैं, लेकिन कुछ, एक ही डिवाइस के साथ सूक्ष्म-फ़्रेग्मेंट किया जा सकता है और बरकरार microvasculature संबद्ध सेलुलर niches अनुकूल प्रदान कर सकते हैं प्रयोगात्मक हस्तक्षेप करने के लिए.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सीटी Lipogems के एक संस्थापक है.

Acknowledgments

लेखकों के प्रवाह cytometry के साथ अपने विशेषज्ञ सहायता के लिए एडिनबर्ग विश्वविद्यालय में क्लेयर Cryer और Fiona Rossi शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. हम मर्रेफील्ड अस्पताल के उन कर्मियों को भी धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने ऊतक नमूने प्रदान करके योगदान दिया।

यह काम ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन और Lipogems, जो वसा ऊतक प्रसंस्करण किट की आपूर्ति से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. मानव वयस्क ऊतक नमूने दक्षिण पूर्व स्कॉटलैंड अनुसंधान आचार समिति की पूर्ण नैतिकता की अनुमति के साथ खरीद रहे थे (संदर्भ: 16/

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Buffered paraformaldehyde (PFA) VWR chemicals 9317.901
0.9% NaCl Solution Baxter 3KB7127
AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG  Life Technologies A21422
AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG Life Technologies  A21245
Ammonium chloride fisher chemicals 1158868
Antigent Diluent Life Technologies 3218
Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus BD Biosciences 560497
Avidin/Biotin Blocking Kit Life Technologies 4303
BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer  BD Biosciences Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies 
Biotinylated Ulex europaeus lectin Vector Laboratories Vector-B1065
BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control BD Biosciences 563044
CD146-BV711 BD Biosciences 563186
CD31-V450 BD Biosciences 561653
CD34-PE BD Biosciences 555822
CD45-V450 BD Biosciences 560367
DAPI Life Technologies D1306 stock concentration: 5mg/mL
Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18)   Lipogems  provided in the Lipogems surgical kit
Diva software 306 (v.6.0) BD Biosciences
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate Life Technologies 61965026
EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM Lonza  CC-3156
Fetal Calf Serum (FCS) Sigma-Aldrich F2442
FlowJo (v.10.0) FlowJo
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Gelatin Acros Organics 410870025
Lipogems Surgical Kit Lipogems  LG SK 60
Mouse anti human- NG2 BD Biosciences 554275 stock concentration: 0.5 mg/mL
PE Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 555749
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap  BD Biosciences 352235, 25/Pack
Polystyrene round bottom 5 mL tubes BD Biosciences 352003
Rabbit anti human - PDGFRb Abcam 32570 stock concentration: 0.15 mg/mL
Streptavidin conjugated-488 Life Technologies  S32354
Sucrose Sigma-Aldrich 84100-5kg
Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18)  Lipogems  provided in the Lipogems surgical kit
Tris base fisher chemicals BP152-500
Type- II Collagenase Gibco 17101-015
V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control BD Biosciences 560373
Widefield Zeiss observer Zeiss Objective used: Plan-Apo 20x/0.8
Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) Zeiss DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm;  555: Green, excitation 555 nm;  647:Red, excitation 630 nm 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
  2. Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  3. Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
  4. Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
  5. Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
  6. Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
  7. Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
  8. Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
  9. Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
  10. Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
  11. Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
  12. Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
  13. Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
  15. Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
  16. Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
  17. Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).

Tags

जीव विज्ञान अंक 152 सूक्ष्म विखंडन वसा ऊतक mesenchymal स्टेम सेल स्ट्रॉमल संवहनी अंश pericyte एडिपोटिरियल सेल
सेल फेनोटाइपिंग और सेलेग्नोम विशेषता के लिए मानव वसा ऊतक सूक्ष्म विखंडन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vezzani, B., Gomez-Salazar, M.,More

Vezzani, B., Gomez-Salazar, M., Casamitjana, J., Tremolada, C., Péault, B. Human Adipose Tissue Micro-fragmentation for Cell Phenotyping and Secretome Characterization. J. Vis. Exp. (152), e60117, doi:10.3791/60117 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter