Summary
Здесь мы представляем микрофрагментацию жировой ткани человека без микрофрагментации с помощью закрытого системного устройства. Этот новый метод позволяет получить субмиллиметровые кластеры жировой ткани, пригодные для трансплантации in vivo, культуры in vitro, а также дальнейшей изоляции клеток и характеристик.
Abstract
В последнее десятилетие, жировые пересадки тканей были широко использованы в пластической хирургии и ортопедии для повышения истощения тканей и / или регенерации. Соответственно, методы сбора и обработки жировой ткани человека эволюционировали для того, чтобы быстро и эффективно получать большое количество тканей. Среди них технология закрытой системы представляет собой инновационную и простую в использовании систему сбора, обработки и повторной инъекции рафинированной жировой ткани за короткое время и в рамках того же вмешательства (внутриоперативно). Адипоза собирается путем липосакции, промывают, эмульгируют, промывают и измельчаются механически в клеточные кластеры от 0,3 до 0,8 мм. Автологическая трансплантация механически фрагментированной жировой ткани показала замечательную эффективность в различных терапевтических кластерах такие показания, как эстетической медицины и хирургии, ортопедической и общей хирургии. Характеристика микрофрагментированной жировой ткани выявила наличие нетронутых мелких сосудов в адипоцитных кластерах; следовательно, периваскулярная ниша остается невозмутимым. Эти кластеры обогащаются в периваскулярных клетках (т.е. предках мезенхимальных стволовых клеток (MSC) и in vitro анализ показал повышенное высвобождение факторов роста и цитокинов, участвующих в восстановлении и регенерации тканей, по сравнению с ферментативно полученными МСК. Это говорит о том, что превосходный терапевтический потенциал микрофрагментированной жировой ткани объясняется более высокой частотой предполагаемых МСК и повышенной секреторной активностью. Вносят ли эти добавленные перициты непосредственно более высокий фактор роста и производство цитокинов, неизвестно. Эта клинически утвержденная процедура позволяет трансплантации предполагаемых MSCs без необходимости расширения и / или ферментативного лечения, таким образом, в обход требований Руководящих принципов GMP, и снижение расходов на клеточной терапии.
Introduction
Адипоза ткани, давно используется в качестве наполнителя в реконструктивной и косметической хирургии, в последнее время стал более популярным в регенеративной медицине, когда-то признан в качестве источника мезенхимальных стволовых клеток (MSCs)1. Lipoaspirates диссоциированных ферментативно в одноклеточных суспензий дают адипоцитов свободной стромальной сосудистой фракции (SVF), который используется без изменений в пациента или, чаще всего, культивируется в течение нескольких недель в MSCs2.
Тем не менее, диссоциация ферментов разрывает микроокружение тканей, уединяя соседние регулятивные клетки от предполагаемых регенеративных клеток, которые значительно модифицируются культурой in vitro. Чтобы избежать таких экспериментальных артефактов и последующим функциональным изменениям, были предприняты попытки обработать жировую ткань для терапевтического использования, сохраняя при этом свою родную конфигурацию как можно более нетронутой3,4. Примечательно, что нарушение механической ткани начало заменять ферментативную диссоциацию. С этой целью полное погружение закрытой системы микрофрагментов липоаспирируется в субмиллиметр, кровь и безмасляные тканевые кластеры (например, липогемы) через последовательность фильтрации сито и стального мрамора, индуцированного нарушения3. Автологическая трансплантация микрофрагментированной жировой ткани, используя эту технологию замкнутой системы, была успешной в нескольких показаниях, охватывающих косметику, ортопедию, проктологию и гинекологию4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Сравнение микрофрагментированной жировой ткани человека (MAT), полученной с помощью закрытого системного устройства и изогенного SVF, показало, что в отношении распределения сосудистых/стромальных клеток и секреторной активности в культуре, MAT содержит больше перицитов, которые предполагаемых MSCs14, и выделяет более высокое количество факторов роста и цитокинов15.
В настоящей статье иллюстрируется безферментно-микрофрагментация подкожной жировой ткани человека с помощью закрытого системного устройства, а также дальнейшая обработка такой микронизированной жировой ткани для культуры пробирки, иммуногистохимии и анализа FACS, для того, чтобы определить типы клеток настоящее время и растворимые факторы выделяются (Рисунок 1). Описанный метод безопасно генерирует жировые производные субмиллиметровые органоиды, содержащие жизнеспособные популяции адиповых клеток ткани в нетронутой нише, пригодных для дальнейшего применения и исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этическое разрешение на использование человеческих тканей в этом исследовании было получено от Комитета по этике исследований юго-восточной Шотландии (справка: 16/SS/0103).
1. Подкожный брюшной жировой ткани Коллекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Все приборы, используемые в ручной процедуре липоасии, предоставляются производителем микрофрагментационного устройства.
- Поддержание стерильности для всех жидкостей, контейнеров, инструментов и рабочей области на протяжении всего эксперимента.
- Поместите образец абдоминопластики (закупленный хирургической бригадой в стерильный мешок без раствора) поверх хирургической ткани с кожей, обращенной вверх. Мытье не требуется. Для оптимального использования держите образец при 4 градусах Цельсия и обработайте жировой образец в пределах 16 ч после сбора урожая.
- Вводят от 50 до 100 мл 37 градусов по Цельсию 0,9% NaCl раствор, в зависимости от размера образца ткани (использовать 50 мл для максимума 15 см2 жировой ткани поверхности и увеличить объем соответственно), используя одноразовые ткани инфильтрации канюли, в подкожный жировой ткани. Обвязать образец кожной частью.
- Подключите 10 мл шприца Luer блокировки к одноразовой канюле липосакции.
- Тщательно введите канюлю внутри жировой ткани от краев. Оказавшись внутри, создайте вакуум внутри шприца, потянув поршень. Держите поршень в положении вручную, чтобы обеспечить вакуумвной всасывания.
- Сделайте радиальные движения внутри образца жировой ткани, пока шприц не будет полон липоаспирати. Аккуратно удалите канюлу из ткани и отключите шприц. Подключите новый пустой шприц.
- Повторите процедуру до 60 мл липоаспирати.
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное количество липоаспирата, которое может быть обработано, изменяется в зависимости от типа используемого устройства. Пожалуйста, обратитесь к инструкциям производителя(Таблица материалов).
2. Микрофрагментация липоаспирати
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен только для использования исследований. Микрофрагментация выполняется с помощью коммерчески доступного устройства(Таблица материалов).
- Удалите устройство из упаковки и убедитесь, что основной блок подключен к мусорной сумке. Поместите мешок для сбора отходов на землю и убедитесь, что клапаны закреплены за крышками блока обработки.
- Подключите пик терминала входиной линии к солин-мешку, пронзив порт соединения мешка. Держите соленовый мешок выше, чем обрабатывающая единица.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для типа устройства, используемого в этом протоколе, рекомендуется мешок стерильного соля размером 2000 мл. - Убедитесь, что все 5 зажимов, подключенных к трубам схем, открыты. Поместите обрабатывающую единицу в вертикальное положение с серой крышкой вверх.
- Разрешить солью для заполнения обрабатывающего блока. Убедитесь, что поток достигает мусорного мешка. Удалите все пузырьки воздуха из обрабатывающего устройства, встряхивая его.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие проходы должны выполняться при отсутствии воздуха в обрабатываемом блоке. - Поместите обрабатывающую единицу в вертикальное положение с синей крышкой вверх и закройте зажим рядом с вхоложской линией.
- Начните инъекционные липоаспираты, соединяя шприц с самооклюзивным клапаном синей входная крышка. Держите блок обработки вертикальной во время этой процедуры и медленно потяните шприц поршень, пока все липоаспираты были переданы в устройство. Повторите этот процесс до тех пор, пока все липоаспираты не будут внутри обрабатывающего устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обрабатывающего устройства, используемого в видео, добавьте максимум 30 мл липоаспиратив в то время. Процедура может быть выполнена максимум дважды, до 60 мл липоаспирати. - Откройте входный зажим для восстановления сольного потока.
- Энергично встряхните перерабатывающий блок не менее 2 мин, регулярно проверяя поток соленого раствора в мусорный мешок.
- Когда сольный раствор в обрабатывающей установке станет прозрачным, после приблизительно 2 мин тряски поместите блок с серой крышкой вверх и закройте зажим, расположенный на стоке возле серой крышки. Обработанная ткань будет плавать в верхней части.
- Заполните 10 мл шприца Luer блокировки с сольным раствором и подключите его к погрузочному клапану синей крышки. Закройте зажим, расположенный рядом с синей крышкой. Подключите пустой 10 мл Luer блокировки шприца, с поршень полностью вставлен, к клапану серой крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только шприцы luer lock. - Твердо впрысните солин в обрабатывающую единицу из синей крышки. Убедитесь, что шприц, подключенный к серому клапану, впоследствии заполняется обработанной тканью. После введения всех сольники, тщательно удалить оба шприца.
- Повторите шаги 2.10 и 2.11 до тех пор, пока не будет собрана вся обработанная ткань.
ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя урожайность MAT составляет 30 мл от 60 мл ручного липоаспирати. Некоторые ткани останутся внутри обрабатывающего устройства, а некоторые сгустки могут присутствовать, прикрепленные к синему краю внутри устройства. - В конце обработки удалите все шприцы, закройте все зажимы, отсоедините соленовый мешок и утилизируйте устройство в соответствии с местными протоколами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство обработки не может быть повторно использовано.
3. Флуоресценция иммуногистохимия
- Перенесите 300-500 л МАТ в трубку 1,5 мл. Добавьте 1 мл 4% буферизированного параформальдегида (PFA), аккуратно перемешайте вручную (без вихря) и оставьте при 4 градусах Цельсия на ночь (от 16 до 24 ч).
- Соберите образец и перенесите на чистую трубку 1,5 мл, содержащую 1 мл PBS. Повторите шаг дважды, чтобы удалить избыток PFA.
- Передача образца в 15% (w/v) сахарозе в растворе PBS и инкубировать при 4 градусах Цельсия за ночь (от 16 до 24 ч)
- Перенесите образец в колодец из 24 скважины и добавьте встраивающий раствор из 15% сахарозы и 7% желатина (w/v) в PBS. Заполните колодец на полпути. Инкубировать 4 ч при 37 градусах Цельсия.
- Перенесите образцы на 4 градуса Цельсия. После 2-4 ч для желатина, чтобы затвердеть, заполнить хорошо с встраиванием раствор и оставить на 4 градуса Цельсия на ночь.
- Удалите образцы из колодцев. Удалить избыток встраиваемого соединения и заморозить на сухом льду. Храните образцы при -80 градусах По Цельсию.
- Вырезать 8-10 мкм толщиной разделов с помощью криостата. Для оптимального сечения используйте криостат при -30 градусов по Цельсию. Слайды могут храниться при -80 градусах Цельсия.
- Перед началом работы с иммунофлуоресценции, исправить разделы в 4% PFA в течение 7 мин. Удалить ПФЕ и мыть дважды с теплой PBS (37 градусов по Цельсию) для того, чтобы удалить желатин из разделов.
- Блок неспецифических связывания антител путем инкубации слайдов с 10% козьей сыворотки в PBS (v/v) в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Разбавить первичные антитела в разбавителе антител или 0,2% (w/v) бычьей сыворотки альбумина (BSA) в PBS (w/v): мышь анти-человек-NG2 (1:100, запас 0,5 мг/мл), кролик анти-человек-PDGFR (1:100, запас 0,15 мг/мл).
- Удалить блокирующий раствор и добавить разбавленные первичные антитела. Инкубировать при 4 градусах Цельсия на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все инкубационные шаги отныне в темноте. - Удалить первичные антитела и вымыть 3 раза с PBS в течение 10 минут каждый раз.
- Разбавить вторичные антитела в разбавителе антител или 0,2% (w/v) BSA в PBS: коза анти-мышь- 555 (1:300), коза анти-кролик- 647 (1:300). Инкубировать 1 ч при комнатной температуре.
- Удалить вторичные антитела и мыть три раза с PBS в течение 10 минут каждый раз.
- Если биотин конъюгированный лектин используется, используйте комплект блокирования авидуцина/биотина. Инкубировать в течение 10 минут с каждым реагентом при условии, с двумя моетами между ними с PBS.
- Повторите блокирующий шаг, инкубируя слайды в течение 1 ч при комнатной температуре с 10% козьей сыворотки в PBS.
- Добавьте биоинтинилатный лектин, биотинилаподированный Ulex europaeus lectin (1:200, запас 2 мг/мл), разбавленный либо в 0,2% BSA (w/v) в PBS или антитела дианима. Инкубировать 1 ч и 30 мин при комнатной температуре.
- Удалите избыток биотинилапотного лектина и мыть три раза с PBS в течение 10 минут каждый раз.
- Добавить вторичный стрептавидин конъюгированных антител, разбавленных в любом 0,2% (w/v) BSA в PBS или антитела разбавителя. Инкубировать 1 ч.
- Удалить вторичные антитела и мыть три раза с PBS в течение 10 минут каждый раз.
- Противостопоковые ядра с 4",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, 1:500, запас 5 мг/мл), разбавленный в 0,2% BSA (w/v) в PBS, в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Удалите раствор DAPI и промойте дважды pbS, 10 минут каждый раз.
- Смонтировать горки с aqueous монтажным агентом. Дайте ему высохнуть полностью, либо на ночь на скамейке в темноте или 1 ч при 37 градусах Цельсия.
- Держите слайды при 4 градусах По цельсию в темноте и приобретайте изображения на микроскопе эпифлюоресценции.
4. Пищеварение микрофрагментированной жировой ткани и клеточная изоляция
- Перенесите микрофрагментированную жировую ткань в стерильный контейнер.
- Свежее составить среду пищеварения путем растворения коллагенеза типа II в DMEM при концентрации 1 мг/мл.
- Добавьте такой же объем среды пищеварения к микрофрагментированной жировой ткани (т.е. за 30 мл образца добавить 30 мл среды пищеварения).
- Поместите запечатанный контейнер в 37 градусов по Цельсию встряхивания водяной бане установить до 120 об/мин в течение 45 минут. Обратите внимание, что контейнер должен обеспечить правильное встряхивание образца. Если большой контейнер недоступен, используйте две трубки 50 мл (30 мл смеси образца/переваривания в каждой) помещенной горизонтально.
- После инкубации, блокировать пищеварение, добавив равный объем блокирующего раствора (2% (v/v) FCS/PBS) и фильтровать последовательно через 100 мкм и 70 мкм ячейки strainers.
- Центрифуга фильтрованную подвеску в течение 5 мин при 200 х г. Отбросьте супернатант.
- Отрежь гранулу примерно в 5 мл буфера лициса эритроцита (155 мМ Nh4Cl, 170 мМ Трис, рН 7,65). Объем буфера может варьироваться в зависимости от эритроцита загрязнения наблюдается в клеточной гранулы. Инкубировать при комнатной температуре 15 мин.
- Добавьте равный объем блокирующего раствора и процедите через ситечко 40 мкм.
- Centrifuge клеточной подвески в течение 5 мин на 200 х г и отказаться от супернатанта.
- Приостановите блокировку гранул в блокирующем растворе. Хорошо перемешать путем пипетки. Подсчитайте жизнеспособные клетки с синим исключением Трипан на гемоситометре.
- Смешайте равный объем клеточной подвески с трипан синим пятном. Аспир10 л раствора и поместите его на гемоситометр.
- Подсчитайте количество живых ячеек (ярких и круглых), присутствующих по крайней мере в 5 квадратов и получите средний номер ячейки. Для того, чтобы включить фактор разбавления пятен, умножьте среднее число клеток на 2. Чтобы получить общее количество живых клеток на 1 мл образца, умножайте полученное число на 104.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученная одноклеточная суспензия, а именно стромальная сосудистая фракция (SVF), может быть либо посеяна при 20 000 клетках/см2 в среде роста периваскулярных клеток (DMEM дополнена 20% теплоинактивированным FCS, 1% пенициллин/стрептомицин и 1% L-глютамин) или используется для анализа цитометрии потока и сортировки. Средняя урожайность нуклеидных клеток в SVF составляет примерно 3 х 104 ячейки на мл МАТ. Сортировка экспериментов требует по крайней мере 8 х 105 клеток, чтобы получить достаточно периваскулярных клеток для культивирования.
5. Маркировка и сортировка ячеек
- Centrifuge клеточной подвески при комнатной температуре в течение 5 мин при 200 х г,и повторно приостановить гранулы в блокирующей среде в концентрации 1 х 106 ячеек на 100 л.
- Aliquot по крайней мере 50000 клеток для неокрашенных контроля и флуоресценции минус один (FMO) контролирует в полистирол круглый нижний поток цитометрии труб. Используйте остальные клетки для многоцветного окрашивания, поместив в другую трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: После установки эксперимента были установлены (т.е. интенсивность лазера, стратегия gating), число клеток, используемых для неокрашенного контроля и FMOs может быть уменьшена, если, используемые антитела одинаковы. - Добавьте антитела CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) и CD146-BV711 (1:100) антитела к одноклеточной подвеске для многоцветного окрашивания. Для управления FMO добавьте: для v450 FMO эквивалентные объемы CD34-PE и CD146-BV711 плюс изотипный контроль V450; для эквивалентных объемов PE FMO CD31-V450, CD45-V450 и CD146-BV711 плюс контроль pe изотипа; для эквивалентных объемов BV711 FMO CD31-V450, CD45-V450 и CD34-PE плюс изотипный контроль BV711.
- Аккуратно пипетка, или вихрь медленно раствор в трубке, чтобы смешать и инкубировать трубки при 4 кв КС в течение 20 минут в темноте.
- Подготовьте компенсационный контроль бисера. Добавьте 15 зЛ положительных шариков и 15 л отрицательных бусин ок 70 л блокирующей среды в 3 полистирола круглого дна потока-цитометрии труб. Добавьте антитела CD34-PE, CD31-V450 или CD45-V450 и антитела CD146-BV711, по одному на трубку.
- Аккуратно пипетка, или вихрь медленно, чтобы смешать антитела с бисером и инкубировать все трубы при 4 градусах по Цельсию в течение 20 минут в темноте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная процедура может быть использована либо для анализа цитометрии потока, либо для сортировки клеток. - Подготовка трубки сбора предварительно смачивания внутренней поверхности труб с эндотелиальной среды роста (EGM), оставляя около 50 л среднего на дне каждой трубки.
- После инкубации антител, удалить избыток антител путем мытья клеток и бисера с 2 мл блокирующей среды.
- Удалите раствор, центрифугируя трубки при 200 х г в течение 5 мин и тщательно успокоив супернатант. Повторите шаг стирки.
- Resuspend клетки в блокирующей среде при конечной концентрации 1 х 106 ячеек на 250 л. Resuspend бусы в 100 л блокирующей среды.
- Передача клеток в новый полистирол круглого дна потока цитометрии трубки с клеточной крышкой ситечко. Это позволит нарушить сгустки клеток.
- Транспортируйте все суспензии клеток и бисера на сортировку клеток на льду в темноте.
- Запустите неокрашенные контрольные элементы, чтобы установить фоновую флуоресценцию и установить напряжение.
- Запустите трубки контроля компенсации, чтобы установить компенсацию флуоресценции.
- Используйте переднюю область рассеяния (FSC-A) против области бокового рассеяния (SSC-A) для идентификации ячеек, а затем используйте область переднего рассеяния (FSC-A) против высоты переднего рассеяния (FSC-H) для выбора отдельных ячеек.
- Добавьте DAPI, 1 кЛ 5 мкг/мл раствор для каждого мл образца, к неокрашенному контролю, чтобы установить gating для мертвых клеток (Рисунок 2). После окрашивания DAPI после окрашивания DAPI не требуется стирка.
- Запустите элементы управления изотипом для установления фоновых порогов флуоресценции, связанных с неспецифической связыванием, и установите gating.
- Выполнить многоцветный окрашенный образец. Исключите гематопоитические и эндотелиальные клетки, нанося на CD31 и CD45 отрицательные клетки. Соберите перицит (CD146и CD34- )и авантюрные ячейки (CD146- CD34)популяций в трубки для сбора(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные жизнеспособные выходы клеток составляют примерно 2% от общей диссоциации живых клеток для перицитов и 1,5% для авантюрных клеток.
6. Культура клеток
- Семена свежесортированных перицитов и авантюрных клеток при плотности от 30 000 до 40 000 клеток/см2 на пластинах культуры с желатиновым покрытием
- Чтобы покрыть культурные пластины, накройте область пластины стерильным 0,2% (w/v) желатином в растворе PBS (примерно 100 л раствора насм 2). Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут и удалить раствор. Держите свежесортированные клетки на льду во время покрытия культурных плит.
- Центрифуга свежесобранных клеток на 200 х г в течение 5 минут и осторожно повторно приостановить клеточной гранулы в соответствующем количестве эндотелиальной среды роста (EGM). Если количество собранных клеток очень низкое, избегайте центрифугирования и пластины непосредственно собранных клеток.
- Семя клеток на пластинах с желатином покрытием. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в 5% CO2.
- После того, как клетки поселились и придерживаются пластины (после по крайней мере 72 ч), обмен EGM с периваскулярной среды роста клеток (DMEM дополнены 20% тепла инактивированных FCS, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% L-глутамамин) для перицитов и авантюрных клеток.
- После того, как перициты и авантюрные клетки достигли 80%-90% слияния, разъединяют клетки, используя 0,05% трипсин-ЭДТА. Соберите с 5% FCS/PBS, центрифуги на 200 х г в течение 5 минут, повторно приостановить в периваскулярных клеточных среды роста, а затем пройти клетки от 1:3 до 1:5 соотношение (или примерно на 7000 клеток / см2) на непокрытую полистирол культуры пластин или колб.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Механическая диссоциация ручных липоаспират, приведшая к выработке микрофрагментированной жировой ткани (МАТ), состоящей из агрегата адипоцитов, окутывающих микрососудистую сеть(рисунок 3). Иммунофлуоресценция анализ желатин-встроенных и криофиксированных MAT подчеркивает эту структуру, показывая сосудистую сеть отмечены эндотелиальный маркер клеток Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1) рецептор в основном состоящий из небольших, капилляроподобных сосудов ( Рисунок 4). Примечательно, что перициты, выражающие NG2 или PDGFR, обычно распространяются, эншеатинг эндотелиальные клетки (Рисунок 4). Эти данные подтверждают, что процесс механической микрофрагментации не влияет на отсек периваскулярных клеток. Наличие периваскулярных клеток, как перицитов, так и авантюрных клеток, было подтверждено цитометрией потока. Для выбора ячеек использовалась область переднего рассеяния (FSC-A) против боковой области рассеяния (SSC-A)(рисунок 2A). Идентифицированная популяция клеток была дополнительно закрытой, используя область переднего рассеяния (FSC-A) против высоты переднего рассеяния (FSC-H) для выбора одиночных ячеек и живых клеток, которые были определены как отрицательные для окрашивания DAPI(рисунок 2B-C). CD31 и CD45 маркеры были использованы для исключения гематопогетических и эндотелиальных клеток(рисунок 2C). Наконец, перициты были определены как CD146и CD34- и авантюрные клетки как CD146- CD34( Рисунок 2D). Стратегия gating обобщена на рисунке 2. Для сортировожения экспериментов следовала та же стратегия gating. FACS-очищенные перициты MAT и авантюрные клетки оба exhibit шпиндель для того чтобы stellate морфология в культуре. Культура в течение 8 дней показала, что MAT выделяет больше цитокинов (адипонектин, CD14, CD31, CD154, хитиназа 3-как 1, дополняют фактор D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, relaxin-2, ST2, TFgio факторы (ангиогенин, ангиостатин, DPPIV, эндоглин, HGF, лептин, PDGFAB/BB, PlGF, тромбопонпендин 2, TIMP4, uPA) в пробирке, чем SVF. Кроме того, цитокины и ангиогенные факторы, производимые как MAT, так и SVF, были более обильными в супернатантах MAT. Соответственно, MAT переваривается с коллагенеза и помещенв в культуру производится секретом похож на наблюдаемый из обычных SVF15. Во всем мире все эти данные свидетельствуют о том, что микрофрагментированная жировая ткань не только терапевтически выгодна, но и поддается фенотипическим и функциональным исследованиям. В частности, небольшой размер кластеров MAT позволяет тестировать секреторную активность в культуре, что было бы сложнее с большими жировыми кусками ткани.
Рисунок 1: Схематическое представление микрофрагментации подкожной жировой ткани. Липоаспиратсобирает собирается из подкожной жировой ткани с помощью канюли. Собранный липоаспиратит микрофрагментируется с помощью устройства близкой системы. В результате микрофрагментированная жировая ткань (МАТ) состоит из нескольких типов клеток, включая периваскулярные клетки и адипоциты. MAT может быть использован в нескольких тестах, в том числе explant культуры и иммуногистохимии, а также для изоляции клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представительная стратегия анализа периваскулярных клеток/сортировки из MAT. Передняя область рассеяния (FSC-A) против области бокового рассеяния (SSC-A) ворота используются для идентификации ячеек(A),а затем вперед области рассеяния (FSC-A) против вперед рассеять высоту (FSC-H) для выбора одиночных ячеек (B). Жизнеспособные неэндотелиальные и негематопоитические клетки закрыты как отрицательные для DAPI, CD31-V450 и CD45-V450 соответственно, в той же панели (C). Наконец, периваскулярные клетки идентифицируются как перициты (CD146и CD34- )или авантюрные клетки (CD146- CD34)(D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: МОРФология MAT. Яркий вид MAT, культивированный в базальном носителе. Шкала бар 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Васкулатурная сеть в МАТ. Эндотелиальные клетки окрашены UEA-1. Коробочные области в A показаны увеличенными в B и C. Arrowheads указывают на перициты, которые были окрашены с помощью антител против PDGFR и NG2. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается физическое фракционирование, с помощью закрытого системного устройства, жировой ткани человека в небольшие кластеры, демонстрирующие нормальную микроанатомию жировой ткани.
Вручную аспирированные человеческие подкожные жировые ткани и соленовый раствор загружаются в прозрачный пластиковый цилиндр, содержащий большие металлические сферы в стиле пинбола, которые, после энергичного ручного встряхивания устройства, разрывают жир на субмиллиметр Фрагменты. Прикрепленные фильтры и розетки позволяют устранить мусор, кровь и свободные липиды, а МАТ собирается в шприц, связанный с устройством. Здесь, MAT была успешно дальнейшей обработки для иммуногистохимии, потока цитометрии и культуры, хотя это конкретное устройство было разработано в медицинской точки зрения, чтобы заменить в театре ферментативно производства жировой ткани стромальной сосудистой фракции или культуры производных жировые стволовые клетки, и действительно оказался весьма эффективным в пластической хирургии и различных других клеточных терапии4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13.
Таким образом, жировая ткань давно используется нетронутыми в качестве простого наполнителя16 возвращается в своей родной 3-мерной конфигурации, после многих лет ферментативной диссоциации и культуры в пробирке. Это следует за общей тенденцией для того чтобы вырасти и изучить ткани в их врожденном multicellular расположении довольно чем как рассеянные населенности клетки, как проиллюстрировано растущей славолюбием органоидов17.
Фрагментация жировой ткани с помощью этого механического устройства оказалась надежной и воспроизводимой, и никакая модификация первоначального протокола никогда не была необходима. Обычная поставка человеческого подкожного жира для экспериментальных исследований – это липоаспират, собранный по косметическим причинам, который загружается непосредственно на осколочные устройства. Ограничение для пользователей в исследовательской лаборатории, однако, является то, что жировая ткань для обработки должны быть аккуратно аспирированы вручную, для поддержания ткани микроархитектуры как нетронутой, как это возможно, а не высасывать с вакуумным насосом, как это обычно делается в операционной Номер. Если хирург, желающий собирать жир вручную может быть идентифицирован, недавно резецированных остатков абдоминопластики могут быть использованы. Толстяк прикрепленный к внутреннему аспекту брюшной кожи может после этого быть тщательно и стерильно аспирирован с шприцем обеспеченным с комплектом. Именно по этой причине мы описали этот шаг в начале протокола (шаг 1).
Что на самом деле объясняет терапевтическое превосходство MAT над ферментом, разрозненных жировой ткани? Анализ цитометрии потока MAT, ферментативно диссоциированный сразу после фракционирования, выявил более высокую долю перицитов, известных как врожденные предшественники мезенхимальных стволовых клеток14, по сравнению с общей аспирированной жировой тканью15 . Более непосредственно, сравнительный анализ MAT и SVF культуры supernatants показали, что бывшие секреты, качественно и количественно, больше факторов роста и цитокинов, участвующих косвенно в восстановлении тканей. К ним относятся проангиогенные факторы, а также разнообразные посредники иммуновоспаления15.
Помимо этих последних результатов, многое еще предстоит понять в отношении молекулярной основы MAT терапевтического потенциала. С этой целью описанный здесь метод представляет собой простую, быструю технику, которая оказывает низкую отдачу от жировой ниши и создает MAT, идеально подходящий для дальнейших экспериментальных манипуляций. С вспомогательной точки зрения, исследования также проводятся для улучшения удобства использования MAT в клинике; в этом отношении в качестве приоритета представляется определение того, может ли микрофрагментированная жировая ткань быть заморожена для задержки аутологичного или аллогенного введения. Наконец, важно определить, являются ли другие ткани и органы, такие как костный мозг, поджелудочная железа или скелетные мышцы, чтобы привести, но несколько, могут быть микро-фрагментированные с тем же устройством и обеспечить нетронутыми микроваскулярной связанных клеточных ниш поддается экспериментального вмешательства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
КТ является основателем Lipogems.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Клэр Крайер и Фиону Росси из Эдинбургского университета за экспертную помощь в цитометрии потока. Мы также хотели бы поблагодарить персонал больницы Мюррейфилд, который внес свой вклад, предоставив образцы тканей.
Эта работа была поддержана грантами Британского фонда сердца и Lipogems, которые поставляли комплекты для обработки жировой ткани. Образцы тканей взрослых людей были закуплены с полным разрешением этики Комитета по этике исследований юго-восточной Шотландии (справка: 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
