Summary
在这里，我们介绍人类脂肪组织无酶微分裂使用封闭系统装置。这种新方法允许获得适合体内移植、体外培养以及进一步细胞分离和表征的脂肪组织的亚毫米簇。
Abstract
在过去十年中，脂肪组织移植已广泛应用于整形手术和矫形外科，以提高组织再生和/或再生。因此，采集和处理人类脂肪组织的技术已经发展，以便快速有效地获得大量的组织。其中，封闭系统技术代表一种创新和易于使用的系统，可以在短时间内和在同一干预（操作内）中收获、处理和重新注入精制脂肪组织。脂肪组织通过抽脂、洗涤、乳化、冲洗和机械切碎收集成0.3至0.8 mm的细胞簇。 机械碎片脂肪组织的自体移植在不同治疗中显示出显著疗效适应症，如美容医学和手术，骨科和普通外科。微碎片脂肪组织的特征表明，在脂肪细胞簇中存在完整的小血管;因此，血管内壁不受干扰。这些簇在血管内细胞中富集（即间质干细胞（MSC）祖先），体外分析表明，与酶衍生的MSCs相比，参与组织修复和再生的生长因子和细胞因子的释放增加。这表明，微碎片脂肪组织的优越治疗潜力是由较高的假定MSC频率和增强的分泌活性解释。这些添加的围细胞是否直接导致更高的生长因子和细胞因子生产尚不清楚。这种临床认可的程序允许移植假定的MSCs，而无需扩大和/或酶治疗，从而绕过了GMP指南的要求，并降低了基于细胞的治疗的成本。
Introduction
脂肪组织，长期用作重建和整容手术的填充物，最近已成为再生医学越来越流行，曾经被认为是间质干细胞（MSCs）1的来源。分离到单细胞悬浮液中的脂蛋白产生无脂肪细胞的基质血管分数（SVF），在患者中未改变使用，或者更常见的是，在MSCs2中培养数周。
然而，酶分离会破坏组织微环境，使邻近的调节细胞从假定的再生细胞中分离，这些细胞在体外培养中会大大改性。为了避免这种实验性的伪影和随之而来的功能改变，已经尝试处理脂肪组织用于治疗使用，同时保持其原生结构尽可能完整3，4。值得注意的是，机械组织破坏已经开始取代酶分离。为此，完全浸入式封闭系统通过筛过滤和钢大理石诱导的干扰序列，将脂吸气分光成亚毫米、无血和无油组织簇（如利波格姆）。微碎片脂肪组织的自体移植，使用这种封闭系统技术，已经成功地在多种适应症，包括化妆品，骨科，妇产科4，5，6，7，8，9，10，11，12，13。
使用闭合系统装置获得的人类微碎片脂肪组织（MAT）和同源性SVF的比较表明，在培养的血管/基质细胞分布和分泌活性方面，MAT含有更多的围细胞，即假定MSCs14，并分泌较多的生长因子和细胞因子15。
本文阐述了使用闭合系统装置对人皮下脂肪组织的无酶微分泌，以及对这种微缩脂肪组织的进一步处理，用于体外培养、免疫组织化学和FACS分析，为了识别存在的细胞类型和分泌的可溶性因子（图1）。所述方法安全地生成含有可行脂肪组织细胞群的脂肪衍生亚毫米有机物，适合进一步应用和研究。
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Protocol
本研究中使用人体组织的道德批准来自东南苏格兰研究伦理委员会（参考：16/SS/0103）。
1. 皮下腹腔脂肪组织收集
注：手动裂隙吸气程序中使用的所有仪器均由微碎片装置的制造商提供。
- 在整个实验中，保持所有液体、容器、仪器和操作区域的不育。
- 将腹肌整形样品（由手术小组采购在无菌袋中，没有任何溶液）放在手术布上，皮肤朝上。无需清洗。为获得最佳使用，将样品保持在4°C，并在收获后的16小时内处理脂肪样品。
- 注射50至100 mL的37°C 0.9%NaCl溶液，取决于组织样本的大小（使用50 mL，最大15cm2脂肪组织表面，并相应地增加体积），使用一次性组织渗透管，进入皮下脂肪组织。用皮部分处理试样。
- 将 10 mL Luer 锁注射器连接到一次性抽脂管。
- 小心地从边缘引入脂肪组织内的管状。进入后，通过拉柱塞在注射器内产生真空。用手将柱塞保持在位置，以确保真空吸力。
- 在脂肪组织样本内进行径向运动，直到注射器充满脂量。小心地从组织中取出管条并断开注射器。连接新的空注射器。
- 重复此过程，直到收集了 60 mL 的脂吸量。
注：可处理的最大脂量根据所使用的设备类型而变化。请参阅制造商说明 （材料表）.
2. 脂分的微碎片
注：该协议仅用于研究用途。微碎片是在市售设备（材料表）的帮助下进行的。
- 从包装中取出设备，并验证主装置是否已连接到废袋。将废物收集袋放在地面，并确保阀门固定在工艺单元盖上。
- 通过穿刺袋连接端口，将输入线的端子尖峰连接到盐袋。使盐袋高于加工单元。
注：对于本协议中使用的设备类型，建议使用 2，000 mL 袋无菌盐水。 - 验证连接到电路管的所有 5 个夹具是否打开。将加工单元置于垂直位置，灰色盖朝上。
- 允许盐水溶液填充处理单元。检查流量到达废物袋。通过摇动处理单元中清除所有气泡。
注：在加工单元中没有空气的情况下，必须执行以下所有通道。 - 将处理单元置于垂直位置，向上放置蓝色盖，并关闭输入线旁边的夹具。
- 通过将注射器连接到蓝色输入盖的自遮挡阀，开始注射脂吸量。在此过程中保持处理单元垂直，并缓慢地拉动注射器柱塞，直到所有脂吸剂都转移到该装置。重复此过程，直到所有脂吸气液都位于处理单元内。
注：对于视频中使用的处理单元，在时间添加最多 30 mL 的脂量。该过程最多可执行两次，直到处理 60 mL 的脂吸量。 - 打开输入夹具以恢复盐水流量。
- 大力摇动加工装置至少2分钟，定期检查盐水溶液流入废袋。
- 当处理单元中的盐水溶液变为透明时，在大约 2 分钟的晃动后，将带有灰色盖的装置向上放置，并关闭位于灰色盖附近排水管上的夹具。加工后的组织将漂浮在顶部。
- 用盐水溶液填充 10 mL Luer 锁紧注射器，并将其连接到蓝色盖的装载阀。关闭位于蓝色盖附近的夹具。将空的 10 mL Luer 锁紧注射器（将柱塞完全插入）连接到灰色盖的阀上。
注：仅使用 Luer 锁注射器。 - 将盐水从蓝色盖牢固地注入加工单元。确保连接到灰色阀的注射器因此充满加工后的组织。注射完所有盐水后，小心取出两个注射器。
- 重复步骤 2.10 和 2.11，直到收集所有处理的组织。
注：MAT 的平均收率为 30 mL，从 60 mL 的手动脂量。一些组织将留在加工单元内，有些团块可能附着在单元内的蓝色边缘上。 - 在加工结束时，取出所有注射器，关闭所有夹子，分离盐水袋，并根据当地协议处理设备。
注：无法重复使用处理设备。
3. 荧光免疫化学
- 将 300-500 μL 的 MAT 转移到 1.5 mL 管中。加入1 mL的4%缓冲甲醛（PFA），用手轻轻混合（无涡旋），并在4°C过夜（从16至24小时）。
- 收集试样并转移到含有1 mL PBS的清洁1.5 mL管中。重复此步骤两次以去除 PFA 过量。
- 在PBS溶液中将试样在15%（w/v）蔗糖中转移，并在4°C孵育过夜（从16至24小时）
- 将试样转移到 24 孔板的孔中，并在 PBS 中加入由 15% 蔗糖和 7% 明胶 （w/v） 制成的嵌入溶液。中途填井。在37°C下孵育4小时。
- 将样品转移到4°C。2-4小时后，明胶凝固，用嵌入溶液填充井，并在4°C过夜。
- 从井中取出样品。去除多余的嵌入化合物，并冻结在干冰上。将样品储存在-80°C。
- 使用低温切割 8-10 μm 厚的部分。为了获得最佳切片，请使用-30°C的低温。幻灯片可储存在-80°C。
- 在继续免疫荧光之前，将4%PFA中的部分固定7分钟。取出PFA，用温热的PBS（37°C）洗涤两次，以便从部分中取出明胶。
- 在室温下，用PBS（v/v）中10%山羊血清孵育1小时，以阻断非特异性抗体结合。
- 稀释PBS（w/v）中抗体稀释剂或0.2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）中的原抗体：小鼠抗人-NG2（1：100，库存0.5毫克/mL），兔抗人PDGFR+（1：100，库存0.15毫克/mL）。
- 去除阻滞溶液并添加稀释的原抗体。在4°C孵育过夜。
注：从现在开始在黑暗中执行所有的孵育步骤。 - 去除原抗体，每次用PBS清洗3次10分钟。
- 稀释抗体稀释剂中的二级抗体或0.2%（w/v）在PBS中的BSA：山羊抗小鼠-555（1：300），山羊抗兔-647 （1：300）。在室温下孵育1小时。
- 去除二级抗体，每次用PBS清洗三次10分钟。
- 如果使用生物锡结合的叶酸，请使用阿丁/生物锡阻断试剂盒。孵育10分钟，每个试剂与PBS之间提供两次处理。
- 在室温下用PBS中10%的山羊血清孵育幻灯片1小时，重复阻塞步骤。
- 加入生物异位化叶酸， 生物异位化 Ulex 欧罗巴柳克辛 （1：200， 库存 2 mg/mL）， 稀释在 0.2% BSA （w/v） 在 PBS 或抗体稀释剂.在室温下孵育1小时30分钟。
- 去除多余的生物浸化叶酸，每次用PBS洗涤三次10分钟。
- 在PBS或抗体稀释剂中加入稀释在0.2%（w/v）BSA中的二级链球菌结合抗体。孵育1小时。
- 取出二级抗体，每次用PBS清洗三次，每次10分钟。
- 反染色核与4°C，6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI，1：500，库存5毫克/mL），稀释在0.2%BSA（w/v）在PBS，在室温10分钟。
- 取出 DAPI 溶液，用 PBS 清洗两次，每次 10 分钟。
- 使用水性安装剂安装滑轨。让它完全干燥，在黑暗中在长凳上过夜，或在37°C下1小时。
- 在黑暗中保持4°C的幻灯片，并在荧光显微镜上获取图像。
4. 微碎片脂肪组织和细胞分离的消化
- 将微碎脂肪组织转移到无菌容器中。
- 在浓度为1mg/mL的DMEM中溶解II型胶原酶，以新鲜补齐消化介质。
- 向微碎片脂肪组织添加相同体积的消化介质（即，对于 30 mL 的样品，添加 30 mL 的消化介质）。
- 将密封容器置于 37°C 摇水浴中，设置为 120 rpm 45 分钟。请注意，容器应允许样品适当摇动。如果大型容器不可用，请使用水平放置的两个 50 mL 管（每个管中 30 mL 的样品/消化介质混合物）。
- 孵育后，通过添加相等体积的阻断溶液（2%（v/v）FCS/PBS）来阻止消化，并依次通过100μm和70μm细胞滤网进行过滤。
- 在 200 x g下将过滤的悬浮液离心 5 分钟。丢弃上清液。
- 将颗粒重新悬浮在大约 5 mL 的红细胞溶化缓冲液中（155 mM NH4Cl，170 mM Tris，pH 7.65）。缓冲液的体积可能因细胞颗粒中观察到的红细胞污染而异。在室温下孵育15分钟。
- 添加同等体积的阻滞溶液，并通过40μm细胞过滤器进行过滤。
- 在 200 x g下将细胞悬浮液离心 5 分钟，并丢弃上清液。
- 在堵塞溶液中重新悬浮颗粒。通过移液将混合良好。在血细胞仪上计算具有试青排除的可行细胞。
- 将细胞悬浮液的同等体积与Trypan蓝色染色混合。将溶液吸出10μL，并将其放在细胞仪上。
- 计算至少 5 平方的活细胞（明亮和圆形）的数量，并获取平均细胞数。为了包括染色稀释因子，将平均细胞数乘以2。要获得每 1 mL 样本的活细胞总数，所得数量乘以 104。
注：获得的单细胞悬浮液，即支数血管部分（SVF），可在血管内细胞生长培养基（DMEM补充20%热灭活FCS、1%青霉素/链霉素和1%）的20，000个细胞/cm2上播种L-谷氨酰胺）或用于流式细胞测定分析和分拣。SVF 中成核细胞的平均产量约为 MAT 每 mL 的 3 x 104细胞。分拣实验至少需要8 x 105个细胞才能获得足够的血管前细胞进行培养。
5. 细胞标签和分拣
- 在室温下以200 x g将细胞悬浮液悬浮5分钟，并在阻隔培养基中以每100μL1x106个细胞的浓度重新悬浮颗粒。
- 无价至少50，000个细胞用于未染色的控制和荧光减一（FMO）控制到聚苯乙烯圆底流细胞测定管。将其余细胞放入另一根管中，进行多色染色。
注：一旦建立了实验设置（即激光强度、浇注策略），用于未染色对照和MPO的细胞数量可以减少，如果所使用的抗体相同。 - 在单细胞悬浮液中添加CD31-V450（1：400）、CD34-PE（1：100）、CD45-V450（1：400）和CD146-BV711（1：100）抗体，以便进行多色染色。对于 FMO 控件，添加：对于 V450 FMO 等效卷 CD34-PE 和 CD146-BV711 加上 V450 等型控制;用于 CD31-V450、CD45-V450 和 CD146-BV711 的 PE FMO 等效卷以及 PE 等型控制;用于 BV711 FMO 等效卷 CD31-V450、CD45-V450 和 CD34-PE 加上 BV711 等型控制。
- 轻轻移液器，或涡旋缓慢地将溶液在管中混合，在黑暗中在4°C下孵育管20分钟。
- 准备补偿控制珠子。在3个聚苯乙烯圆底流-细胞测定管中加入15μL的正珠和15μL的负珠子至70μL的阻滞介质。添加 CD34-PE、CD31-V450 或 CD45-V450 和 CD146-BV711 抗体，每管一个。
- 轻轻移液器，或涡流缓慢，将抗体与珠子混合，并在4°C下孵育所有管子20分钟在黑暗中。
注： 所述过程可用于流式细胞测定分析或细胞分选。 - 通过用内皮生长培养基（EGM）预润管的内表面来制备收集管，在每个管的底部留下大约50μL的介质。
- 抗体孵育后，用2mL的阻滞介质清洗细胞和珠子，去除抗体的过剩。
- 将管在 200 x g下离心 5 分钟，并小心地吸散上清液，取出溶液。复制洗涤步骤。
- 以每250μL1x106个细胞的最终浓度在阻断培养基中重新悬浮细胞。在100μL的阻滞培养基中重新悬浮珠子。
- 将细胞转移到新的聚苯乙烯圆底流式细胞测定管，带细胞滤帽。这将允许细胞团块的中断。
- 在黑暗中将所有细胞和珠子悬浮到冰上的细胞分拣机。
- 运行未染色的控制单元以建立背景荧光并设置电压。
- 运行补偿控制管以设置荧光补偿。
- 使用正向散射区域 （FSC-A） 与侧散射区域 （SSC-A） 来识别单元，然后使用正向散射区域 （FSC-A） 与正向散射高度 （FSC-H） 选择单个单元。
- 将DAPI，1μL的5μg/mL溶液，每个mL的样品，添加到未染色的控制，以设置死细胞的门控（图2）。DAPI 染色后无需清洗。
- 运行等型控件以建立与非特定绑定相关的背景荧光阈值，并设置门控。
- 运行多色染色样品。通过注在CD31和CD45阴性细胞上浇注，排除造血细胞和内皮细胞。收集围成体 （CD146+ CD34-） 和入月细胞 （CD146- CD34+） 聚集到收集管 （图 2）.
注：最佳活细胞产量约为围细胞活细胞解离总量的2%，对前兆细胞的1.5%。
6. 细胞培养
- 在明胶涂层培养板上，在30，000至40，000个细胞/cm2的密度下，将新分类的围细胞和幼细胞
- 要涂覆培养板，在 PBS 溶液中用无菌 0.2% （w/v） 明胶覆盖板区域（每 cm2溶液约 100 μL）。在室温下孵育10分钟，取出溶液。在培养板涂布期间，将新鲜分类的细胞保存在冰上。
- 以200 x g将新鲜收集的细胞离心5分钟，并在适量的内皮生长培养基（EGM）中轻轻重新悬浮细胞颗粒。如果收集的细胞数量非常低，请避免离心，并直接将收集的细胞板化。
- 将细胞播种在明胶涂层板上。在5%CO2中孵育37°C。
- 一旦细胞稳定并附着在板上（至少72小时后），用血管内细胞生长培养基（DMEM补充20%热灭活FCS、1%青霉素/链霉素和1%L-谷氨酰胺）交换EGM，用于围细胞和发病细胞。
- 一旦围细胞和胰腺细胞达到80%-90%汇合，分离细胞使用0.05%胰蛋白酶-EDTA。用5%FCS/PBS收集，在200 x g下离心5分钟，在血管内细胞生长培养基中重新悬浮，然后将细胞从1：3到1：5的比例（或约7，000个细胞/厘米2）转移到未涂覆的聚苯乙烯培养板或烧瓶上。
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Representative Results
手动脂吸气的机械分离导致产生微碎片脂肪组织（MAT），由包围微血管网络的脂肪细胞聚集体组成（图3）。明胶嵌入和冷冻MAT的免疫荧光分析突出了这一结构，显示了血管网络标记的内皮细胞标记Ulex europaeus凝胶蛋白1（UEA-1）受体主要由小毛细血管组成（图 4.表达NG2或PDGFR+的围细胞呈正态分布，内皮细胞（图4）。这些数据证实，机械微破碎过程不影响血管外细胞室。流式细胞学已经证实了围脑细胞的存在，包括围细胞和胰位细胞。要选择单元，使用了正向散射区域 （FSC-A） 与侧散射区域 （SSC-A） 门（图 2A）。使用正向散射区（FSC-A）与正向散射高度（FSC-H）进一步封闭识别的细胞群，选择单个细胞，活细胞被确定为DAPI染色的阴性（图2B-C）。CD31和CD45标记用于排除造血细胞和内皮细胞（图2C）。最后，将围细胞确定为CD146+CD34-和超前细胞为CD146- CD34+（图2D）。门控策略如图2所示。对实验的排序也遵循了相同的门控策略。FACS纯化的MAT围细胞和表皮细胞在培养中都表现出一个主轴，以对硬质体形态学。8天的文化表明，MAT分泌更多的细胞因子（二丁基酮， CD14、CD31、CD154、奇蒂酸酶3样1、补充因子D、CD147、GDF-15、IGFBP-2、IL1RA、IP-10、M-CSF、MIF、CXCL9、CCL19、PDGFAA、CCL5、RBP-4、松弛因子-2、ST2、TNF-α、CD87和安焦因子（血管激素、血管他汀、DPPIV、endoglin、HGF、瘦素、PDGFAB/BB、PlGF、血栓庞丁2、TIMP4、uPA）在体外比SVF。此外，MAT和SVF产生的细胞因子和血管生成因子在MAT超生物中更为丰富。因此，MAT用胶原酶消化并置于培养中产生类似于传统SVF15的分泌体。在全球范围内，所有这些数据都表明，微碎片脂肪组织不仅在治疗上有利，而且适合对型型和功能调查。特别是，MAT簇的体积小，允许测试培养中的分泌活动，这将更难与大脂肪组织块。
图1：皮下脂肪组织微分块的原理表。脂质从皮下脂肪组织中收集使用管状。收集的脂分子是使用关闭系统设备进行微碎片化的。产生的微碎片脂肪组织（MAT）由多种细胞类型组成，包括血管前细胞和脂肪细胞。MAT 可用于多种测试，包括植物外培养和免疫设备化学，以及细胞分离。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：从MAT中分析/分类的血管内细胞代表性门控策略。正向散射区域 （FSC-A） 与侧散射区域 （SSC-A） 门用于识别单元（A），然后是正向散射区域 （FSC-A） 与正向散射高度 （FSC-H） 以选择单个单元（B）。可存活的非内皮细胞和非造血细胞分别在同一面板（C） 中作为负极的 DAPI、CD31-V450 和 CD45-V450 进行封闭。最后，血管外细胞被确定为围细胞（CD146+ CD34-） 或新脑细胞 （CD146- CD34+） （D）。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：MAT形态学。基底介质中培养的MAT的明场视图。比例尺 = 1，000 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：MAT中的血管网络。内皮细胞被UEA-1染色。A 中的盒装区域在 B 中显示放大，C. 箭头表示过云，这些圆环被用抗体对 PDGFR® 和 NG2 染色。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文利用闭合系统装置，将人体脂肪组织物理分馏成显示正常脂肪组织微解剖学的小簇。
手动吸气的人类皮下脂肪组织和盐水溶液被装入一个透明塑料圆柱体，里面装着大弹球式金属球，在设备剧烈手动晃动后，将脂肪破裂成亚毫米碎片。附加的过滤器和出口可消除碎屑、血液和游出脂，MAT 被收集到与设备相连的注射器中。在这里，MAT已经成功地进一步加工免疫组织化学，流细胞学和培养，虽然这种特定的设备是在医学角度开发的，以取代在剧院酶产生的脂肪组织位质血管分数或培养衍生的脂肪干细胞，在整形外科和多种其他细胞疗法4，5，6，7，8证明是高效率的，9，10，11，12，13.
因此，脂肪组织长期完整地用作单纯的填充物16返回在其原生三维配置，经过多年的酶分离和体外培养。这遵循一个总的趋势，生长和研究组织在其先天多细胞排列，而不是分散的细胞群，如有机体17的日益普及。
使用这种机械装置的脂肪组织碎片已被证明是可靠和可重复的，不需要修改原始协议。用于实验研究的普通人类皮下脂肪供应是一种出于化妆品原因收集的脂吸剂，直接加载到破碎装置上。然而，研究实验室对用户的一个限制是，要处理的脂肪组织必须用手轻轻吸气，以保持组织微结构尽可能完整，并且不能像操作中通常做的那样用真空泵吸出房间。除非能够识别愿意手动收集脂肪的外科医生，否则可以使用新鲜切除的腹肌残渣。然后，可小心无菌地将附着在腹部皮肤内侧上的脂肪与试剂盒提供的注射器一起吸气。这就是我们在协议开头（步骤 1）中描述此步骤的原因。
究竟是什么解释了MAT对酶分离脂肪组织的治疗优势？分馏后立即对MAT酶分离的流细胞学分析显示，与总吸气脂肪组织15相比，有较大比例的围细胞，称为间质干细胞的先天前兆14.更直接的是，对MAT和SVF培养超生物的比较分析表明，前者在定性和定量上，在组织修复中间接涉及更多的生长因子和细胞因子。这些包括亲血管生成因素，以及免疫炎症的多样化中介15。
除了这些最近的研究结果，关于MAT治疗潜力的分子基础，还有许多有待了解。为此，此处描述的方法代表了一种简单、快速的技术，该技术对脂肪利基的影响较低，并生成 MAT，非常适合进一步的实验操作。从辅助的角度来看，还进行了研究，以提高MAT在临床的可用性;在这方面，确定微碎片脂肪组织是否可以冻结延迟自体或异体管理似乎是一个优先事项。最后，重要的是要确定其他组织和器官，如骨髓，胰腺或骨骼肌，仅举几个，可以微碎片使用相同的设备，并提供完整的微血管相关的细胞利基适合到实验性干预。
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Disclosures
CT 是利波格姆的创始人。
Acknowledgments
作者希望感谢爱丁堡大学的克莱尔·克里尔和菲奥娜·罗西在流式细胞学方面的专家协助。我们还要感谢默里菲尔德医院的人员，他们通过提供组织标本做出了贡献。
这项工作得到了英国心脏基金会和利波格姆斯的资助，后者提供了脂肪组织处理试剂盒。人类成人组织样本是经东南苏格兰研究伦理委员会完全伦理许可采购的（参考：16/SS/0103）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
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