Summary
Her presenterer vi menneskelige fettvev enzym-fri mikro-fragmentering ved hjelp av en lukket system enhet. Denne nye metoden gjør det mulig for obtainment av sub-millimeter klynger av fettvev egnet for in vivo transplantasjon, in vitro kultur, og ytterligere celle isolasjon og karakterisering.
Abstract
I det siste tiåret har fettvevet transplantasjon vært mye brukt i plastisk kirurgi og orthopaedics å forbedre vev tilskudd og/eller regenerering. Følgelig, teknikker for høsting og behandling av menneskelig fettvev har utviklet seg for raskt og effektivt å få store mengder vev. Blant disse representerer lukket system teknologi en innovativ og lett-å-bruke systemet til å høste, behandle, og re-injisere raffinert fettvev på kort tid og i samme intervensjon (intra-operativt). Fettvev samles inn av fettsuging, vasket, emulgert, skylles og mekanisk i celle klynger på 0,3 til 0,8 mm. autologous transplantasjon av mekanisk fragmentert fettvev har vist bemerkelsesverdig effekt i ulike terapeutiske indikasjoner som estetisk medisin og kirurgi, ortopedisk og generell kirurgi. Karakterisering av mikro-fragmentert fettvev avdekket tilstedeværelsen av intakt små fartøy innenfor adipocyte klynger; Derfor er inflammasjon nisje igjen Uaffisert. Disse klynger er beriket i inflammasjon celler (dvs. mesenchymal stilk cellen (MSC) forfedre) og in vitro analyse viste en økt frigjøring av vekstfaktorer og cytokiner involvert i vev reparasjon og regenerering, sammenlignet med enzymatisk avledet MSCs. Dette tyder på at den overlegne terapeutiske potensialet i microfragmented fettvev er forklart av en høyere frekvens av presumptive MSCs og forbedret sekretoriske aktivitet. Hvorvidt disse lagt pericytes direkte bidra til høyere vekstfaktor og cytokin produksjon er ikke kjent. Denne klinisk godkjente prosedyren tillater transplantasjon av presumptive MSCs uten behov for ekspansjon og/eller enzymatisk behandling, og dermed omgå kravene i GMP retningslinjer, og redusere kostnadene for celle-baserte terapier.
Introduction
Fettvev, lenge brukt som et fyllstoff i rekonstruktiv og kosmetisk kirurgi, har nylig blitt mer populært i regenererende medisin en gang anerkjent som en kilde for Mesenchymal stamceller (MSCs)1. Lipoaspirates dissosiert enzymatisk til enkelt celle suspensjoner gir en adipocyte-fri stromal vaskulær brøk (SVF) som brukes uendret i pasienten eller, mer vanlig, er kultivert i flere uker i MSCs2.
Men enzym dissosiasjon brudd vevet microenvironments, secluding nabokommunene regulatoriske celler fra presumptive regenererende celler som blir betydelig modifisert av in vitro kultur. For å unngå slike eksperimentelle gjenstander og påfølgende funksjonelle endringer, har det blitt gjort forsøk på å behandle fettvev for terapeutisk bruk og samtidig opprettholde sin opprinnelige konfigurasjon så intakt som mulig3,4. Spesielt, mekanisk vev avbrudd har begynt å erstatte enzymatisk dissosiasjon. For dette formål full nedsenking lukket system mikro-fragmenter lipoaspirates i sub-millimeter, blod-og olje-fri vev klynger (f. eks Lipogems) via en sekvens av sil filtrering og stål marmor indusert avbrudd3. Autologous transplantasjon av mikro-fragmentert fettvev, ved hjelp av denne lukket system teknologi, har vært vellykket i flere indikasjoner, som spenner over kosmetikk, Ortopedi, proctology og gynekologi4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Sammenligning mellom humant mikro-fragmentert fettvev (MAT) innhentet med lukket system enhet og isogenic SVF avslørte at med hensyn til vaskulær/stromal celle distribusjon og sekretoriske aktivitet i kultur, inneholder MAT mer pericytes, som er presumptive MSCs14, og utskiller høyere mengder av vekstfaktorer og cytokiner15.
Den nåværende artikkelen illustrerer enzymet-fri mikro-fragmentering av humant subkutan fettvev ved hjelp av en lukket system enhet, og den videre behandling av slike mikronisert fettvev for in vitro kultur, immunhistokjemi og FACS analyse, for å identifisere celletyper stede og løselige faktorer utskilles (figur 1). Den beskrevne metoden genererer sikkert fett avledet sub-millimeter organoids inneholder levedyktig fettvev celle populasjoner i en intakt nisje, egnet for videre søknader og studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk godkjenning for bruk av menneskelig vev i denne forskningen ble innhentet fra South East Scotland Research etikk Committee (referanse: 16/SS/0103).
1. subkutan abdominal fettvev samling
Merk: Alle instrumenter som brukes i den manuelle Lipo-aspirasjon prosedyren er levert av produsenten av mikro-fragmentering enheten.
- Oppretthold sterilitet for alle væsker, beholdere, instrumenter og det operative området gjennom hele eksperimentet.
- Plasser den mageplastikk prøven (anskaffet av kirurgisk lag i en steril pose uten noen løsning) oppå en kirurgisk klut med huden vendt oppover. Ingen vask er nødvendig. For optimal bruk, Behold prøven ved 4 ° c og behandle fett prøven innen 16 timer etter høsting.
- Injiser 50 til 100 mL av 37 ° c 0,9% NaCl-oppløsning, avhengig av størrelsen på vevsprøven (bruk 50 mL for maksimal en 15 cm2 fettvev overflate og øke volumet tilsvarende), ved hjelp av en en gangs vev infiltrasjon kanyle, i subkutan fettvev. Håndter prøven med hud delen.
- Koble en 10 mL luer låse sprøyte til en en gangs fettsuging kanyle.
- Nøye innføre kanyle inne i fettvev fra kantene. Når du er inne, oppretter du vakuumet inne i sprøyten ved å trekke i stempelet. Hold stempelet i posisjon for hånd for å sikre vakuum sug.
- Lag radial bevegelser inne i fett vevsprøven til sprøyten er full av liposaspiratet. Fjern forsiktig kanyle fra vevet og koble fra sprøyten. Koble til en ny tom sprøyte.
- Gjenta prosedyren inntil 60 mL liposaspiratet er samlet inn.
Merk: Den maksimale mengden liposaspiratet som kan behandles i henhold til typen enhet som brukes. Vennligst referer til produsentens instruksjoner (tabell over materialer).
2. mikro-fragmentering av liposaspiratet
Merk: Denne protokollen er ment for forskningsbruk. Mikro-fragmentering utføres ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig enhet (tabell av materialer).
- Fjern enheten fra pakken og kontroller at hovedenheten er koblet til avfalls posen. Plasser avfalls innsamlings posen på bakken, og sørg for at ventilene er festet til prosess enhets dekslene.
- Koble Terminal spissen på inngangs linjen til saltvanns posen ved å ta opp pose tilkoblingsporten. Oppbevar saltvann posen høyere enn prosesserings enheten.
Merk: For den typen enhet som brukes i denne protokollen, anbefales en 2 000 mL pose med sterilt saltvann. - Kontroller at alle 5 klemmer som er koblet til rørene på kretsene er åpne. Plasser prosesserings enheten i vertikal posisjon med den grå hetten oppover.
- La saltvann løsningen fylle behandlingsenheten. Kontroller at strømmen når avfalls posen. Fjern alle luftbobler fra prosesserings enheten ved å riste den.
Merk: Alle følgende avsnitt må utføres i fravær av luft i prosesserings enheten. - Plasser prosesserings enheten i vertikal posisjon med den blå hetten oppover og Lukk klemmen ved siden av inntastings linjen.
- Begynn å injisere liposaspiratet ved å koble sprøyten til den selv okkluderer ventilen på den blå inngangs korken. Hold prosesserings enheten loddrett under denne prosedyren, og trekk sprøytes stempelet langsomt til alle liposaspiratet er overført til enheten. Gjenta prosessen til alle liposaspiratet er inne i behandlingsenheten.
Merk: For prosesserings enheten som brukes i videoen, legger du til maksimalt 30 mL liposaspiratet på det tidspunktet. Prosedyren kan utføres maksimalt to ganger, inntil 60 mL liposaspiratet er behandlet. - Åpne inn data klemmen for å gjenopprette saltvanns strømmen.
- Rist prosesserings enheten kraftig i minst 2 min, og kontroller regelmessig at saltvanns løsningen strømmer inn i avfalls posen.
- Når saltvann oppløsning i prosesserings enheten blir transparent, etter approximatively 2 min av risting, Plasser enheten med den grå hetten oppover, og Lukk klemmen som ligger på avløpet nær den grå hetten. Det behandlede vevet vil flyte på toppen.
- Fyll en 10 mL luer låse sprøyte med saltoppløsning og koble den til laste ventilen på den blå hetten. Lukk klemmen som ligger nær den blå hetten. Koble en tom 10 mL luer låse sprøyte, med stempelet helt inn, til ventilen på den grå korken.
Merk: Bruk kun luer-sprøyter. - Injiser godt saltvann i prosesserings enheten fra den blå hetten. Sørg for at sprøyten som er koblet til den grå ventilen, derfor fylles med det bearbeidede vevet. Når du har injisert alt saltvann, forsiktig fjerne begge sprøyter.
- Gjenta trinn 2,10 og 2,11 til alt behandlet vev er samlet inn.
Merk: Den gjennomsnittlige avkastningen av MAT er 30 mL fra 60 mL manuell liposaspiratet. Noen vev vil forbli inne i prosesserings enheten og noen klumper kan være tilstede festet til den blå kanten inne i enheten. - På slutten av behandlingen, Fjern alle sprøyter, Lukk alle klemmer, ta av saltvanns posen og kast enheten i henhold til lokale protokoller.
Merk: Behandlingsenheten kan ikke brukes på nytt.
3. fluorescens immunhistokjemi
- Overfør 300-500 μL av MAT til et 1,5 mL rør. Tilsett 1 mL 4% bufret paraformaldehyde (PFA), bland forsiktig for hånd (ingen virvlingen) og la ved 4 ° c over natten (fra 16 til 24 timer).
- Samle prøven og Overfør til et rent 1,5 mL rør som inneholder 1 mL PBS. Gjenta trinnet to ganger for å fjerne PFA overflødig.
- Overfør prøven i 15% (w/v) sukrose i PBS løsning og ruge ved 4 ° c over natten (fra 16 til 24 h)
- Overfør prøven i en brønn av en 24 brønn plate og legge til en embedding løsning laget av 15% sukrose og 7% gelatin (w/v) i PBS. Fyll brønnen halvveis. Ruge for 4 timer ved 37 ° c.
- Overfør prøvene til 4 ° c. Etter 2-4 h for gelatin å stivne, fylle opp brønnen med embedding løsning og la ved 4 ° c over natten.
- Fjern prøvene fra brønnene. Fjern overflødig innebygging sammensatte og fryse på tørr is. Oppbevar prøvene ved-80 ° c.
- Skjær 8-10 μm tykke seksjoner ved hjelp av en kryostaten. For optimal snitting, bruk kryostaten ved-30 ° c. Lysbilder kan lagres ved-80 ° c.
- Før du fortsetter med immunofluorescence, fest seksjonene i 4% PFA i 7 min. Fjern PFA og vask to ganger med lunkent PBS (37 ° c) for å fjerne gelatin fra seksjonene.
- Blokker ikke-spesifikk antistoff binding ved å incubating lysbildene med 10% geit serum i PBS (v/v) for 1 t ved romtemperatur.
- Fortynne primære antistoffer i antistoff fortynningsmiddel eller 0,2% (w/v) storfe serum albumin (BSA) i PBS (w/v): mus anti-Human-NG2 (1:100, lager 0,5 mg/mL), kanin anti-Human-PDGFRβ (1:100, lager 0,15 mg/mL).
- Fjern blokkerings løsningen og tilsett de fortynnede primære antistoffene. Ruge ved 4 ° c over natten.
Merk: Utfør alle inkubasjons skritt fra nå av i mørket. - Fjern den primære antistoffer og vask 3 ganger med PBS for 10 min hver gang.
- Fortynne sekundære antistoffer i antistoff fortynningsmiddel eller 0,2% (w/v) BSA i PBS: geit anti-mus-555 (1:300), geit anti-kanin-647 (1:300). Ruge 1 time ved romtemperatur.
- Fjern sekundære antistoffer og vask tre ganger med PBS for 10 min hver gang.
- Hvis en biotin bøyd Lektiner brukes, bruk avidin/biotin blokkerings sett. Ruge for 10 min med hver reagens leveres med to vasker i mellom med PBS.
- Gjenta blokkering trinn ved incubating lysbildene for 1 t ved romtemperatur med 10% geit serum i PBS.
- Tilsett biotinylated Lektiner, biotinylated Ulex Tiriltunge Lektiner (1:200, lager 2 mg/mL), fortynnet enten i 0,2% BSA (w/v) i PBS eller antistoff fortynningsmiddel. Ruge 1 t og 30 min ved romtemperatur.
- Fjern overflødig biotinylated Lektiner og vask tre ganger med PBS for 10 min hver gang.
- Tilsett sekundær streptavidin bøyd antistoff fortynnet i enten 0,2% (w/v) BSA i PBS eller antistoff fortynningsmiddel. Ruge for 1 time.
- Fjern sekundær antistoff og vask tre ganger med PBS for 10 min hver gang.
- Counterstain kjerner med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:500, Stock 5 mg/mL), fortynnet i 0,2% BSA (w/v) i PBS, for 10 min ved romtemperatur.
- Fjern DAPI løsningen og vask to ganger med PBS, 10 min hver gang.
- Monter lysbildene med et vandig monterings middel. La den tørke helt, enten over natten på benken i mørket eller 1 time ved 37 ° c.
- Hold lysbildene ved 4 ° c i mørket og Hent bilder på et epifluorescence mikroskop.
4. fordøyelse av mikro-fragmentert fettvev og celle isolasjon
- Overfør mikro-fragmentert fettvev til en steril beholder.
- Fersk utgjør fordøyelsen medium ved oppløsning type-II kollagenase i DMEM ved konsentrasjonen av 1 mg/mL.
- Tilsett samme volum av fordøyelsen medium til mikro-fragmentert fettvev (dvs. for 30 mL av prøven legge til 30 mL fordøyelsen medium).
- Plasser den forseglede beholderen i et 37 ° c risting vannbad satt til 120 RPM for 45 min. Vær oppmerksom på at beholderen skal tillate en skikkelig risting av prøven. Hvis en stor beholder ikke er tilgjengelig, bruk 2 50 mL rør (30 mL prøve/fordøyelse medium blanding i hver) plassert horisontalt.
- Etter inkubasjons, blokkere fordøyelsen ved å legge en lik volum av blokkering løsning (2% (v/v) FCS/PBS) og filtrere sekvensielt gjennom 100 μm og 70 μm celle siler.
- Sentrifuger filtrert suspensjon i 5 min ved 200 x g. Kast supernatanten.
- Resuspend pellet i ca. 5 mL erytrocytt lyseringsbuffer (155 mM NH4Cl, 170 mm Tris, pH 7,65). Volumet av buffer kan variere i henhold til erytrocytt forurensning observert i mobilnettet pellet. Ruge ved romtemperatur i 15 min.
- Legg til et likt volum av blokkerende løsning og Filtrer gjennom en 40 μm celle sil.
- Sentrifuger celle fjæringen i 5 minutter ved 200 x g og kast supernatanten.
- Resuspend pellet i blokkerende løsning. Bland godt av pipettering. Count levedyktige celler med Trypan blå eksklusjon på en hemocytometer.
- Bland et lik volum av celle suspensjonen med Trypan blå flekk. Aspirer 10 μL av oppløsningen og plasser den på en hemocytometer.
- Telle antall levende celler (lyse og runde) til stede i minst 5 firkanter og få gjennomsnittet celle nummer. For å inkludere flekken fortynning faktor, multiplisere gjennomsnittet celle nummer med 2. For å få totalt antall levende celler per 1 mL av prøven multiplisere det oppnådde tallet med 104.
Merk: den oppnådde enkelt celle suspensjon, nemlig stromal vaskulær brøk (SVF), kan enten være sådd på 20 000 celler/cm2 i inflammasjon cellevekst medium (DMEM supplert med 20% varme deaktivert FCS, 1% penicillin/Streptomycin og 1% L-glutamin) eller brukes til flyt flowcytometri analyse og sortering. Den gjennomsnittlige avkastningen av kjerne celler i SVF er ca 3 x 104 celler per ml mat. Sortering eksperimenter krever minst 8 x 105 celler for å få nok inflammasjon celler for dyrking.
5. cellemerking og sortering
- Sentrifuger cellen suspensjon ved romtemperatur i 5 min ved 200 x g, og re-suspendere pellet i blokkering medium ved en konsentrasjon på 1 x 106 celler per 100 μL.
- Alikvot minst 50 000 celler for unstained kontroll og fluorescens minus én (FMO) kontroller i polystyren runde bunnen flyt flowcytometri rør. Bruk resten av cellene for flerfarget farging ved å plassere i et annet rør.
Merk: Når innstillingene for eksperimentet er opprettet (dvs. laser intensitet, gating strategi), kan antall celler som brukes for unstained kontroll og FMOs reduseres, hvis de antistoffer som brukes er de samme. - Legg CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) og CD146-BV711 (1:100) antistoffer mot én celle suspensjon for multi-farge flekker. For FMO kontroller, Legg til: for V450 FMO tilsvarende volumer av CD34-PE og CD146-BV711 pluss V450 isotype kontroll; for PE FMO tilsvarende volumer av CD31-V450, CD45-V450 og CD146-BV711 pluss PE isotype kontroll; for BV711 FMO tilsvarende volumer av CD31-V450, CD45-V450 og CD34-PE pluss BV711 isotype kontroll.
- Pipetter forsiktig, eller Vortex langsomt løsningen i røret for å blande og ruge rørene ved 4 ° c i 20 minutter i mørket.
- Forbered kompensasjon kontroll perler. Tilsett 15 μL av positive perler og 15 μL av negative perler til 70 μL av blokkering medium i 3 polystyren runde-Bottom Flow-flowcytometri rør. Legg CD34-PE, CD31-V450 eller CD45-V450, og CD146-BV711 antistoffer, en per tube.
- Forsiktig pipette, eller Vortex langsomt, å blande antistoffer med perler og ruge alle rør ved 4 ° c i 20 min i mørket.
Merk: fremgangsmåten som er beskrevet, kan brukes enten for flyt flowcytometri analyse eller celle sortering. - Forbered oppsamlings rør ved å pre-fukte den indre overflaten av rørene med endothelial vekstmedium (EGM), etterlot ca 50 μL av medium på bunnen av hvert rør.
- Etter antistoff inkubasjons, Fjern overflødig antistoff ved å vaske cellene og perlene med 2 mL blokkerings medium.
- Fjern oppløsningen ved å sentrifugering rørene ved 200 x g i 5 min og forsiktig aspirating supernatanten. Replikere vaske trinnet.
- Resuspend cellene i blokkerende medium ved en endelig konsentrasjon på 1 x 106 celler per 250 μL. Resuspend perlene i 100 μL av blokkering medium.
- Overfør cellene til nye polystyren runde-Bottom Flow flowcytometri rør med celle sil cap. Dette vil tillate forstyrrelse av celle klumper.
- Transporter alle celle-og perle suspensjoner til celle sorteringen på is i mørket.
- Kjør unstained kontroll celler for å etablere bakgrunnen fluorescens og angi spenninger.
- Kjør kompensasjons kontrollrørene for å angi fluorescens kompensasjon.
- Bruk frem spredningsområdet (FSC-A) kontra side punktdiagram (SSC-A) til å identifisere celler, og bruk deretter frem spredningsområdet (FSC-A) vs. scatter-høyde (FSC-H) for å velge enkeltceller.
- Tilsett DAPI, 1 μL av 5 μg/mL oppløsning for hver mL prøve, til unstained kontroll for å sette gating for døde celler (figur 2). Ingen vask er nødvendig etter DAPI farging.
- Kjør isotype kontroller for å opprette bakgrunns fluorescens terskler knyttet til ikke-spesifikk binding, og angi gating.
- Kjøre fargeprøven i flere farger. Ekskluder blodkreft og endothelial celler ved gating på CD31 og CD45 negative celler. Samle pericyte (CD146+ CD34-) og adventitial celle (CD146- CD34+) i prøvetakingsrør (figur 2).
Merk: optimal levedyktig celle gir er ca 2% av den totale Live celle dissosiasjon for pericytes og 1,5% for adventitial celler.
6. cellekultur
- Seed nylig sortert pericytes og adventitial celler i en tetthet på 30 000 til 40 000 celler/cm2 på gelatin belagt kultur plater
- For å belegge kultur platene, dekkplate området med steril 0,2% (w/v) gelatin i PBS løsning (ca 100 μL av oppløsning per cm2). Ruge ved romtemperatur i 10 min og fjerne løsningen. Hold ferske sorterte celler på is under kultur plate belegg.
- Sentrifuger fersk innsamlede celler på 200 x g i 5 min og forsiktig re-suspendere cellen pellet i en passende mengde endothelial vekstmedium (EGM). Hvis antall celler som samles inn er svært lav, unngå sentrifugering og plate direkte de innsamlede cellene.
- Seed cellene på gelatin-belagt plater. Ruge ved 37 ° c i 5% CO2.
- Når cellene har avgjort og levd opp til platen (etter minst 72 h), utveksle EGM med inflammasjon cellevekst medium (DMEM supplert med 20% varme deaktivert FCS, 1% penicillin/Streptomycin og 1% L-glutamin) for både pericytes og adventitial celler.
- Når pericytes og adventitial celler har nådd 80%-90% samløpet, distansere celler med 0,05% Trypsin-EDTA. Samle med 5% FCS/PBS, sentrifuger på 200 x g i 5 min, re-suspendere i inflammasjon cellevekst medium, og deretter passasje cellene fra 1:3 til 1:5 ratio (eller ca 7 000 celler/cm2) på ubehandlede polystyren kultur plater eller flasker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanisk dissosiasjon av manuelle lipoaspirates resulterte i produksjon av mikro-fragmentert fettvev (MAT), bestående av en mengde adipocytter som omslutter et mikrovaskulær nettverk (Figur 3). Immunofluorescence analyse av gelatin-embedded og cryofixed MAT fremhever denne strukturen, viser det vaskulære nettverket preget av endothelial celle markør Ulex Tiriltunge agglutinin 1 (UEA-1) reseptor hovedsakelig bestående av små, kapillær-lignende fartøy ( Figur 4). Spesielt pericytes uttrykker NG2 eller PDGFRβ er normalt fordelt, ensheathing endothelial celler (Figur 4). Disse dataene bekrefter at den mekaniske mikro-fragmentering prosessen ikke påvirker inflammasjon celle rommet. Tilstedeværelsen av inflammasjon celler, både pericytes og adventitial celler, har blitt bekreftet av flyt flowcytometri. Hvis du vil merke celler, blir det brukt et spredningsområde (FSC-A) kontra side punktdiagram (SSC-A) (figur 2a). Den identifiserte celle populasjonen ble ytterligere gated bruke Forward scatter-området (FSC-A) vs Forward scatter høyde (FSC-H) for å velge enkeltceller og levende celler ble identifisert som negativt for DAPI farging (figur 2B-C). CD31 og CD45 markører ble brukt til å ekskludere blodkreft og endothelial celler (figur 2C). Til slutt ble pericytes identifisert som CD146+ CD34- og adventitial celler som CD146- CD34+ (figur 2D). Gating strategien oppsummeres i figur 2. Den samme gating strategien ble fulgt for sortering eksperimenter. FACS-renset MAT pericytes og adventitial celler både viser en spindel for å Stel morfologi i kulturen. Kultur for 8 dager viste at MAT utskiller mer cytokiner (adiponectin, CD14, CD31, CD154, chitinase 3-lignende 1, komplement faktor D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, relaxin-2, ST2, TNF-α, CD87), og angiogenic faktorer (angiogenin, angiostatin, DPPIV, endoglin, HGF, leptin, PDGFAB/BB, PlGF, thrombospondin 2, TIMP4, uPA) in vitro enn SVF. Videre var cytokiner og angiogenic faktorer produsert av både MAT og SVF mer tallrike i MAT supernatanter. Derfor ble MAT fordøyd med kollagenase og plassert i kultur produsert en secretome lik den som ble observert fra konvensjonelle SVF15. Globalt, alle disse dataene viser at mikro-fragmentert fettvev er ikke bare terapeutisk fordelaktig, men også mottagelig for fenotypiske og funksjonelle undersøkelser. Spesielt gjør den lille størrelsen på MAT klynger testing av sekretoriske aktivitet i kulturen, noe som ville være vanskeligere med store fettvev biter.
Figur 1: skjematisk fremstilling av mikro-fragmentering av underhudsfett vev. Liposaspiratet samles inn fra underhudsfett vev ved hjelp av en kanyle. Samlet liposaspiratet er mikro-fragmentert ved hjelp av lukke systemet enheten. Resulterende mikro-fragmentert fettvev (MAT) er sammensatt av flere celletyper inkludert inflammasjon celler og adipocytter. MAT kan brukes i flere tester, inkludert explant kultur og immunhistokjemi, og for celle isolering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representativ gating strategi for inflammasjon celle analyse/sortering fra mat. Et punktdiagram (FSC-A) vs side punktdiagram (SSC-A) brukes til å identifisere celler (A), etterfulgt av spredningsområdet fremover (FSC-a) vs. scatter-høyde (FSC-H) for å velge enkeltceller (B). Levedyktig ikke-endothelial og ikke-blodkreft celler er gated som negativt for DAPI, CD31-V450 og CD45-V450 henholdsvis i samme panel (C). Til slutt identifiseres inflammasjon celler som pericytes (CD146+ CD34-) eller adventitial-celler (CD146- CD34+) (D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: mat morfologi. Bright-felt visning av MAT kultivert i basal medium. Scale bar = 1 000 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: blodkar nettverk i mat. Endothelial celler er farget med UEA-1. Innrammet områder i A er vist forstørret i B og C. pilspisser indikerer pericytes, som har blitt farget med antistoffer mot PDGFRβ og NG2. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papiret beskriver den fysiske fraksjonering, ved hjelp av en lukket system enhet, av menneskelig fettvev i små klynger som viser normal fettvev microanatomy.
Manuelt pustende menneskelige subkutan fettvev og saltvann er lastet inn i en gjennomsiktig plast sylinder som inneholder store Pinball-stil metalliske kuler som, ved kraftig manuell risting av enheten, brudd fettet i sub-millimeter Fragmenter. Vedlagte filtre og utløp tillate fjerning av rusk, blod og fri lipider og MAT er samlet i en sprøyte knyttet til enheten. Her har MAT blitt ytterligere behandlet for immunhistokjemi, Flow flowcytometri og kultur, selv om denne spesifikke enheten ble utviklet i et medisinsk perspektiv, for å erstatte i teatret enzymatisk produsert fettvev stromal vaskulær brøk eller kultur avledet fett stamceller, og faktisk viste seg svært effektiv i plastisk kirurgi og diverse andre celle-baserte terapier4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13.
Derfor, fettvev lenge brukt intakt som bare filler16 avkastning i sin opprinnelige 3-dimensjonal konfigurasjon, etter år med enzymatisk dissosiasjon og in vitro kultur. Dette følger en generell trend å vokse og studere vev i medfødt flercellede ordning snarere enn som spres celle populasjoner, som illustrert ved den økende populariteten til organoids17.
Fettvev fragmentering ved hjelp av denne mekaniske enheten har bevist pålitelig og reproduserbar og ingen endring av den opprinnelige protokollen var alltid nødvendig. Den ordinære tilførsel av humant subkutant fett for eksperimentelle studier er en liposaspiratet samlet for kosmetiske grunner, som er lastet direkte på fragmentering enheten. En begrensning for brukere i forskningslaboratoriet, skjønt, er at fettvev som skal behandles må være forsiktig pustende for hånd, for å opprettholde vev mikroarkitektur så intakt som mulig, og ikke suge ut med en vakuumpumpe som er rutinemessig gjort i drifts Rom. Med mindre en kirurg villig til å samle fett manuelt kan identifiseres, en fersk resected mageplastikk rester kan brukes. Fettet festet til det indre aspektet av abdominal hud kan da være forsiktig og sterilely pustende med sprøyten som følger med settet. Dette er grunnen til at vi har beskrevet dette trinnet i begynnelsen av protokollen (trinn 1).
Hva forklarer faktisk den terapeutiske overlegenhet MATTE over enzymet dissosiert fettvev? Flow flowcytometri analyse av MAT enzymatisk dissosiert umiddelbart etter fraksjonering avdekket en høyere andel av pericytes, kjent som medfødt forløperne av Mesenchymal stamceller14, sammenlignet med total pustende fettvev15 . Mer direkte, den komparative analyse av MAT og SVF kultur supernatanter viste at den tidligere utskiller, kvalitativt og kvantitativt, mer vekstfaktorer og cytokiner involvert indirekte i reparasjon av vev. Disse inkluderer Pro-angiogenic faktorer, samt ulike meglere av Immuno-betennelse15.
Utover disse siste resultatene, gjenstår mye å bli forstått om molekylær grunnlag av MAT terapeutisk potensial. For dette formål representerer metoden her beskrevet en enkel, rask teknikk som er lav effekt på fett nisje og genererer MAT ideell for videre eksperimentell manipulasjon. Fra en hjelpeutstyr synspunkt, forskning er også gjennomført for å forbedre brukbarheten av MAT i klinikken; i denne forbindelse, avgjøre om mikro-fragmentert fettvev kan fryses for forsinket autologous eller allogene administrasjon vises som en prioritet. Til slutt vil det være viktig å avgjøre om andre vev og organer som benmarg, bukspyttkjertel eller skjelettlidelser muskel, å sitere men noen, kan være mikro-fragmentert med samme enhet og gi intakt microvasculature tilhørende cellulære nisjer mottagelig til eksperimentell intervensjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CT er en av grunnleggerne av Lipogems.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Claire Cryer og Fiona Rossi ved University of Edinburgh for deres eksperthjelp med Flow flowcytometri. Vi ønsker også å takke personell på Murrayfield sykehus som bidro ved å gi vevsprøver.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra British Heart Foundation og Lipogems, som leverte fettvev prosessering kits. Human voksen vevsprøver ble anskaffet med full etikk tillatelse fra South East Scotland Research etikk Committee (referanse: 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
