Summary
Här presenterar vi Human fettvävnad enzym-fri mikro-fragmentering med hjälp av en sluten system enhet. Denna nya metod gör det möjligt att obtainmenten av sub-millimeter kluster av fettvävnad som lämpar sig för in vivo transplantation, in vitro-kultur, och ytterligare cell isolering och karakterisering.
Abstract
Under det senaste decenniet har fettvävnad transplantationer använts i stor utsträckning i plastikkirurgi och ortopedi för att förbättra vävnad tillskott och/eller förnyelse. Följaktligen, tekniker för skörd och bearbetning av mänskliga fettvävnad har utvecklats för att snabbt och effektivt få stora mängder vävnad. Bland dessa, den slutna systemteknik representerar en innovativ och lätt att använda system för att skörda, bearbeta, och åter injicera raffinerad fettvävnad på kort tid och i samma intervention (Intra-operativt). Fettvävnad samlas in genom fettsugning, tvättad, emulgerade, sköljas och mals mekaniskt till cell kluster på 0,3 till 0,8 mm. autolog transplantation av mekaniskt fragmenterad fettvävnad har visat anmärkningsvärd effekt vid olika terapeutiska indikationer såsom estetisk medicin och kirurgi, ortopediska och allmän kirurgi. Karakterisering av mikro-fragmenterad fettvävnad avslöjade närvaron av intakt små fartyg inom fettceller-kluster; Därför är perivaskulär nisch kvar unperturbed. Dessa kluster är berikade i perivaskulära celler (dvs., mesenkymala stamceller (MSC) förfäder) och in vitro-analys visade en ökad frisättning av tillväxtfaktorer och cytokiner inblandade i vävnad reparation och förnyelse, jämfört med enzymatiskt härledda MSCs. Detta tyder på att den överlägsna terapeutiska potentialen av mikrofragmenterad fettvävnad förklaras av en högre frekvens av presumtiva MSCs och förbättrad sekretorisk aktivitet. Om dessa extra pericyter direkt bidrar till högre tillväxtfaktor och cytokin produktion är inte känd. Detta kliniskt godkända förfarande möjliggör transplantation av presumtiva MSCs utan behov av expansion och/eller enzymatisk behandling, vilket kringgår kraven i GMP-riktlinjer och sänker kostnaderna för cellbaserade terapier.
Introduction
Fettvävnad, länge används som fyllmedel i rekonstruktiv och kosmetisk kirurgi, har nyligen blivit mer populär i regenerativ medicin en gång erkänd som en källa för mesenkymala stamceller (MSCs)1. Lipoaspirates dissocierade enzymatiskt till encelliga suspensioner ger en adipocyte-fri stromacellstumörer vaskulär fraktion (SVF) som används oförändrat i patienten eller, oftare, odlas i flera veckor i MSCs2.
Men, enzym dissociation spricker vävnaden mikromiljöer, avskildhet angränsande reglerande celler från presumtiva regenerativa celler som blir avsevärt ändras genom in vitro-kultur. För att undvika sådana experimentella artefakter och därav funktionella förändringar, försök har gjorts för att bearbeta fettvävnad för terapeutiskt bruk samtidigt som den ursprungliga konfigurationen så intakt som möjligt3,4. I synnerhet har mekaniska vävnads störningar börjat ersätta enzymatisk dissociation. För detta ändamål, hela nedsänkning slutna systemet mikro-fragment lipoaspirates i sub-millimeter, blod-och oljefri vävnad kluster (t. ex., Lipogems) via en sekvens av SIL filtrering och stål marmor inducerad störningar3. Autolog transplantation av mikro-fragmenterad fettvävnad, med hjälp av denna slutna systemteknik, har varit framgångsrik i flera indikationer, spänner kosmetika, ortopedi, proktologi och gynekologi4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Jämförelse mellan humant mikrofragmenterad fettvävnad (Matt) som erhållits med den slutna systemenheten och ISOGEN SVF visade att med avseende på vaskulär/stromalcellsdistribution och sekretorisk aktivitet i kulturen innehåller MAT mer pericyter, som presumtiva MSCs14, och utsöndrar högre halter av tillväxtfaktorer och cytokiner15.
Den nuvarande artikeln illustrerar enzymet-fri mikro-fragmentering av mänskliga subkutan fettvävnad med hjälp av en sluten system enhet, och ytterligare bearbetning av sådana mikroniserade fettvävnad för in vitro-kultur, immunohistokemi och FACS analys, för att identifiera de celltyper som finns och de lösliga faktorerna som utsöndras (figur 1). Den beskrivna metoden genererar säkert fett härledda sub-millimeter organoider som innehåller livskraftiga fettvävnad cellpopulationer i en intakt nisch, lämplig för ytterligare tillämpningar och studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiska godkännanden för användning av mänskliga vävnader i denna forskning erhölls från South East Scotland Research etik Committee (referens: 16/SS/0103).
1. subkutan Bukfettvävnad insamling
Anmärkning: Alla instrument som används i manuell Lipo-aspiration förfarande tillhandahålls av tillverkaren av mikro-fragmentering enhet.
- Behåll sterilitet för alla vätskor, behållare, instrument och det operativa området under hela experimentet.
- Placera bukplastik provet (upphandlas av Operations teamet i en steril påse utan någon lösning) ovanpå en kirurgisk trasa med huden vänd uppåt. Ingen tvätt krävs. För optimal användning, håll provet vid 4 ° c och bearbeta fett provet inom 16 timmar efter skörd.
- Injicera 50 till 100 mL 37 ° c 0,9% NaCl-lösning, beroende på vävnads provets storlek (Använd 50 mL för högst 15 cm2 fettvävnad yta och öka volymen i enlighet med detta), med hjälp av en engångsvävnad infiltration kanyl, i den subkutana fettvävnad. Hantera preparatet med den kutana delen.
- Anslut en 10 mL luer lock spruta till en disponibel fettsugning kanyl.
- Försiktigt införa kanyl inuti fettvävnad från kanterna. En gång inuti, skapa vakuum inuti sprutan genom att dra i kolven. Håll kolven i läge för hand för att säkra vakuum sugningen.
- Gör radiella rörelser inuti fettvävnad provet tills sprutan är full av lipoaspirate. Ta försiktigt bort kanylen från vävnaden och dra ur sprutan. Anslut en ny tom spruta.
- Upprepa proceduren tills 60 mL lipoaspirate har samlats in.
Anmärkning: Den maximala mängden lipoaspirate som kan bearbetas ändras beroende på vilken typ av enhet som används. Se tillverkarens anvisningar (tabell över material).
2. mikro-fragmentering av lipoaspirate
Anmärkning: Detta protokoll är endast avsett för Forskningsanvändning. Mikrofragmentering utförs med hjälp av en kommersiellt tillgänglig enhet (tabell över material).
- Ta bort enheten från förpackningen och kontrollera att huvudenheten är ansluten till avfalls påsen. Placera uppsamlingspåsen på marken och se till att ventilerna är säkrade till process enhetens lock.
- Anslut terminalen spetsen av inmatnings ledningen till saltlösning påsen genom att tränga in påsen Anslutningsport. Håll koksalt påsen högre än bearbetningsenheten.
Anmärkning: För den typ av anordning som används i detta protokoll rekommenderas en 2 000 mL påse steril saltlösning. - Kontrollera att alla 5 klämmor som är anslutna till rören i kretsarna är öppna. Placera bearbetningsenheten i vertikalt läge med det gråa locket uppåt.
- Låt saltlösningen fylla bearbetningsenheten. Kontrollera att flödet når avfalls påsen. Ta bort alla luftbubblor från bearbetningsenheten genom att skaka den.
Anmärkning: Alla följande passager skall utföras i avsaknad av luft i bearbetningsenheten. - Placera bearbetningsenheten i vertikalt läge med det blå locket uppåt och Stäng klämman bredvid inmatnings linjen.
- Börja injicera lipoaspirate genom att ansluta sprutan till den själv ockluderande ventilen på det blå ingångs locket. Håll bearbetningsenheten vertikalt under denna procedur och dra långsamt sprutkolven tills alla lipoaspirate har överförts till enheten. Upprepa processen tills alla lipoaspirate är inne i bearbetningsenheten.
Anmärkning: För behandlingsenheten som används i videon, tillsätt maximalt 30 mL lipoaspirate vid den tidpunkten. Förfarandet kan utföras maximalt två gånger, tills 60 mL lipoaspirate har behandlats. - Öppna ingångs klämman för att återställa koksalt flödet.
- Skaka bearbetningsenheten kraftigt i minst 2 minuter och kontrollera regelbundet att saltlösningen flödar in i avfalls påsen.
- När saltlösning i behandlingsenheten vänder transparent, efter approximativt 2 min av skakningar, placera enheten med den grå locket uppåt, och Stäng klämman ligger på avloppet nära den grå locket. Den bearbetade vävnaden kommer att flyta på toppen.
- Fyll en 10 mL luerlockspruta med saltlösning och Anslut den till laddnings ventilen på den blå hatten. Stäng klämman som sitter nära den blå hylsan. Anslut en tom 10 mL luer lock spruta, med kolven helt insatt, till ventilen av grå locket.
Anmärkning: Använd endast Luer-låsprutor. - Injicera saltlösning ordentligt i behandlingsenheten från den blå hatten. Se till att sprutan som är ansluten till den grå ventilen därför fylls med den bearbetade vävnaden. När du har injicerat all saltlösning, ta försiktigt bort båda sprutorna.
- Upprepa steg 2,10 och 2,11 tills all bearbetad vävnad samlas in.
Anmärkning: Den genomsnittliga avkastningen av mattan är 30 mL från 60 mL av manuell lipoaspirate. En del vävnad kommer att finnas kvar inuti bearbetningsenheten och vissa klumpar kan förekomma fästa vid den blå kanten inuti enheten. - I slutet av bearbetningen, ta bort alla sprutor, Stäng alla klämmor, lossa saltlösning påsen och kassera enheten enligt lokala protokoll.
Anmärkning: Det går inte att återanvända bearbetningsenheten.
3. fluorescens immunohistokemi
- Överför 300-500 μL MAT till en 1,5 mL tub. Tillsätt 1 mL 4% buffrad PARAFORMALDEHYD (PFA), blanda försiktigt för hand (ingen vortexing) och lämna vid 4 ° c över natten (från 16 till 24 h).
- Samla upp preparatet och överför det till ett rent 1,5 mL-rör innehållande 1 mL PBS. Upprepa steget två gånger för att ta bort PFA-överskott.
- Överför preparatet i 15% (vikt/volym) sackaros i PBS-lösning och inkubera vid 4 ° c över natten (från 16 till 24 timmar)
- Överför preparatet i en brunn på en 24-välsplattan och tillsätt en inbäddnings lösning gjord av 15% sackaros och 7% gelatin (w/v) i PBS. Fyll brunnen halvvägs. Inkubera i 4 h vid 37 ° c.
- Överför proverna till 4 ° c. Efter 2-4 h för gelatin att stelna, fylla upp väl med inbäddnings lösning och lämna vid 4 ° c över natten.
- Ta bort proverna från brunnarna. Ta bort överflödig bädda förening och frysa på torris. Förvara proverna vid-80 ° c.
- Skär 8-10 μm tjocka sektioner med en kryostat. För optimal snittning, Använd kryostaten vid-30 ° c. Diabilder kan förvaras vid-80 ° c.
- Innan du fortsätter med immunofluorescens, fixera avsnitten i 4% PFA i 7 min. ta bort PFA och tvätta två gånger med ljummet PBS (37 ° c) för att ta bort gelatin från sektionerna.
- Blockera icke-specifik antikroppsbindning genom att ruinera bilderna med 10% get serum i PBS (v/v) i 1 h vid rumstemperatur.
- Späd de primära antikropparna i antikropps spädningsmedel eller 0,2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS (w/v): mus anti-human-NG2 (1:100, lager 0,5 mg/mL), kanin anti-human-PDGFRβ (1:100, lager 0,15 mg/mL).
- Ta bort den blockerande lösningen och tillsätt de utspädda primära antikropparna. Inkubera vid 4 ° c över natten.
Anmärkning: Utför alla inkubations steg från och med nu i mörkret. - Ta bort de primära antikropparna och tvätta 3 gånger med PBS i 10 minuter varje gång.
- Späd ut de sekundära antikropparna i antikropps spädningsmedel eller 0,2% (w/v) BSA i PBS: get anti-Mouse-555 (1:300), get anti-Rabbit-647 (1:300). Inkubera 1 h vid rumstemperatur.
- Ta bort de sekundära antikropparna och tvätta tre gånger med PBS i 10 minuter varje gång.
- Om en biotin konjugerad lektin används, Använd Avidin/biotin blockeringssats. Inkubera i 10 minuter med varje reagens försedd med två tvättar däremellan med PBS.
- Upprepa blockerande steg genom att Inkubera bilderna i 1 h vid rumstemperatur med 10% get serum i PBS.
- Tillsätt biotinylerade lektin, en ulex europaeus lektin (1:200, lager 2 mg/ml), utspädd antingen i 0,2% BSA (w/v) i PBS eller antikropps spädningsvätska. Inkubera 1 h och 30 min vid rumstemperatur.
- Ta bort överflödig en lektin och tvätta tre gånger med PBS för 10 min varje gång.
- Tillsätt den sekundära konjugerat konjugerade antikroppen utspädd i antingen 0,2% (w/v) BSA i PBS eller antikropps spädningsvätska. Inkubera i 1 h.
- Ta bort den sekundära antikroppen och tvätta tre gånger med PBS i 10 minuter varje gång.
- Motfärgning kärnor med 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:500, lager 5 mg/mL), utspädd i 0,2% BSA (w/v) i PBS, för 10 min vid rumstemperatur.
- Ta bort DAPI-lösningen och tvätta två gånger med PBS, 10 min varje gång.
- Montera bilderna med ett vattenfast monteringsmedel. Låt den torka helt, antingen över natten på bänken i mörker eller 1 h vid 37 ° c.
- Håll diabilderna vid 4 ° c i mörker och hämta bilder i ett epifluorescensmikroskop.
4. nedbrytning av mikrofragmenterad fettvävnad och cell isolering
- Överför den mikrofragmenterade fettvävnaden till en steril behållare.
- Nytillverka matsmältningen mediet genom att upplösa typ II-kollagenas i DMEM vid koncentrationen 1 mg/mL.
- Tillsätt samma volym av matsmältningen medium till mikro-fragmenterad fettvävnad (dvs. för 30 mL prov Tillsätt 30 mL av matsmältningen medium).
- Placera den förseglade behållaren i en 37 ° c skakning vattenbad inställd på 120 RPM för 45 min. Observera att behållaren bör möjliggöra en ordentlig skakning av provet. Om en stor behållare inte är tillgänglig, Använd 2 50 mL rör (30 mL prov/matsmältning medium blandningen i varje) placeras horisontellt.
- Efter inkubering, blockera matsmältningen genom att lägga till en lika volym av blockerande lösning (2% (v/v) FCS/PBS) och filtrera sekventiellt genom 100 μm och 70 μm cell silar.
- Centrifugera den filtrerade fjädringen i 5 minuter vid 200 x g. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera pelleten i cirka 5 mL erytrocytlysbuffert (155 mM NH4Cl, 170 mm Tris, pH 7,65). Buffertvolymen kan variera beroende på den erytrocytkontamination som observerats i den cellulära pelleten. Inkubera i rumstemperatur i 15 min.
- Lägg till en lika volym av blockerande lösning och filtrera genom en 40 μm cell SIL.
- Centrifugera cellsuspensionen i 5 min vid 200 x g och Kassera supernatanten.
- Omsuspendera pelleten i blockerande lösning. Blanda väl genom pipettering. Räkna livskraftiga celler med Trypan blå uteslutning på en hemocytometer.
- Blanda en lika volym av cellsuspensionen med Trypan blå fläcken. Aspirera 10 μL av lösningen och placera den på en hemocytometer.
- Räkna antalet levande celler (ljusa och runda) som finns i minst 5 rutor och få medelvärdet av cellnumret. För att inkludera fläck utspädningsfaktorn, multiplicera medelvärdet av cellnumret med 2. För att få det totala antalet levande celler per 1 mL prov multiplicera det erhållna antalet med 104.
Anmärkning: den erhållna enda cellsuspensionen, nämligen stromacellstumörer vaskulär fraktion (SVF), kan antingen seedas på 20 000 celler/cm2 i perivaskulär celltillväxt medium (DMEM kompletteras med 20% VÄRMEINAKTIVERADE FCS, 1% penicillin/streptomycin och 1% (L-glutamin) eller används för analys och sortering av flödescytometri. Den genomsnittliga avkastningen av nukleerade celler i SVF är cirka 3 x 104 celler per ml mat. Sortering experiment kräver minst 8 x 105 celler för att få tillräckligt perivaskulära celler för odling.
5. märkning och sortering av celler
- Centrifugera cellsuspensionen vid rumstemperatur i 5 min vid 200 x g, och återsuspendera pelleten i blockerande medium vid en koncentration av 1 x 106 celler per 100 μl.
- Alikvot minst 50 000 celler för obefläckade kontroll och fluorescens minus en (FMO) kontroller i polystyren runda botten flödescytometri rör. Använd resten av cellerna för flerfärgad färgning genom att placera i ett annat rör.
Obs: när inställningarna för experimentet har fastställts (dvs. laserintensitet, gating strategi), antalet celler som används för obefläckade kontroll och FMOs kan minskas, om, de antikroppar som används är desamma. - Lägg till CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) och CD146-BV711 (1:100) antikroppar mot Single cellsuspensionen för flerfärgad färgning. För FMO-kontrollerna, Lägg till: för V450 FMO-ekvivalent volymerna CD34-PE och CD146-BV711 plus V450 isotypen-kontroll. för PE FMO-ekvivalent volymerna CD31-V450, CD45-V450 och CD146-BV711 plus PE-isotypkontroll. för BV711 FMO-ekvivalent volymerna CD31-V450, CD45-V450 och CD34-PE plus BV711 isotypen-kontroll.
- Pipettera försiktigt eller skaka långsamt lösningen i röret för att blanda och inkubera rören vid 4 ° c under 20 min i mörker.
- Förbered kompensations kontroll pärlor. Tillsätt 15 μL av de positiva pärlorna och 15 μL av de negativa pärlorna till 70 μL blockerande medium i 3 polystyren rundbottenflödescytometry-rör. Tillsätt CD34-PE, CD31-V450 eller CD45-V450, och CD146-BV711 antikroppar, en per tub.
- Pipettera försiktigt, eller skaka långsamt, för att blanda antikropparna med pärlorna och inkubera alla tuber vid 4 ° c under 20 min i mörker.
Anmärkning: den beskrivna proceduren kan användas antingen för flödescytometrianalys eller cell sortering. - Förbered uppsamlings rören genom att förvätta den inre ytan av rören med endotelial tillväxtmedium (EGM), vilket ger cirka 50 μL medium på undersidan av varje tub.
- Efter antikropps inkubering, ta bort överskottet av antikroppar genom att tvätta cellerna och pärlorna med 2 mL blockerande medium.
- Ta bort lösningen genom att centrifugering rören på 200 x g i 5 min och noggrant Aspirera supernatanten. Replikera tvättsteget.
- Omsuspendera cellerna i blockerande medium vid en slutlig koncentration av 1 x 106 celler per 250 μl. Omsuspendera pärlorna i 100 μl blockerande medium.
- Överför cellerna till nya polystyren rundbottenflödescytometerrör med cellsil Cap. Detta kommer att möjliggöra störningar av cell klumpar.
- Transportera alla cell-och pärlupphängningar till cell Sorteraren på is i mörkret.
- Kör obefläckade kontrollceller för att etablera bakgrundsfluorescens och ställa in spänningar.
- Kör kompensations kontroll rören för att ställa in fluorescenskompensationen.
- Använd främre spridningsområde (FSC-A) mot sido spridningsområde (SSC-A) för att identifiera celler och Använd sedan Forward scatter-området (FSC-A) vs Forward scatter-höjd (FSC-H) för att välja enskilda celler.
- Tillsätt DAPI, 1 μL 5 μg/mL lösning för varje mL prov, till den obefläckade kontrollen för att ställa in gating för döda celler (figur 2). Ingen tvättning krävs efter DAPI-färgning.
- Kör isotypen-kontroller för att etablera bakgrundfluorescenströsklar relaterade till icke-specifik bindning och Ställ in gating.
- Kör flerfärgade provet. Utesluta hematopoietiska och endotelceller genom att gating på CD31 och CD45 negativa celler. Samla in pericyt (CD146+ CD34-) och ADVENTITIAL cell (CD146- CD34+) populationer i uppsamlings rör (figur 2).
Obs: optimala lönsamma cell avkastningar är cirka 2% av den totala levande cell dissociation för pericyter och 1,5% för adventitial celler.
6. cell kultur
- Utsäde färskt sorteras pericyter och adventitial celler vid en densitet av 30 000 till 40 000 celler/cm2 på gelatin belagda kultur tallrikar
- För att belägga kultur plattorna, täck plattan området med steril 0,2% (w/v) gelatin i PBS lösning (cirka 100 μL lösning per cm2). Inkubera i rumstemperatur i 10 minuter och ta bort lösningen. Håll nyligen sorterade celler på is under odling plattan beläggning.
- Centrifugera nyinsamlade celler vid 200 x g i 5 min och försiktigt åter suspendera cellpelleten i en lämplig mängd endotelial tillväxtmedium (EGM). Om antalet celler som samlas in är mycket låg, Undvik centrifugering och plattan direkt de insamlade cellerna.
- Frö cellerna på gelatin-belagda plattor. Inkubera vid 37 ° c i 5% CO2.
- När celler har löst och anslutit sig till plattan (efter minst 72 h), utbyte EGM med perivaskulär celltillväxt medium (DMEM kompletteras med 20% Värmeinaktiverade FCS, 1% penicillin/streptomycin och 1% L-glutamin) för både pericyter och adventitial celler.
- När pericyter och adventitial celler har nått 80%-90% Confluence, separera celler med 0,05% trypsin-EDTA. Samla med 5% FCS/PBS, Centrifugera vid 200 x g i 5 min, Återsuspendera i perivaskulär celltillväxt medium, och sedan passage cellerna från 1:3 till 1:5 förhållandet (eller på cirka 7 000 celler/cm2) på obestruket polystyren kultur plattor eller flaskor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanisk dissociation av manuella lipoaspirates resulterade i produktion av mikro-fragmenterad fettvävnad (Matt), som består av en mängd adipocyter omsluter ett mikrovaskulära nätverk (figur 3). Immunofluorescensanalys av gelatin-inbäddat och kryofast matta belyser denna struktur, som visar det vaskulära nätverket som kännetecknas av endotelceller markör ulex europaeus kall 1 (UEA-1) receptor huvudsakligen består av små, kapillärliknande fartyg ( Figur 4). Särskilt pericyter som uttrycker NG2 eller PDGFRβ fördelas normalt, ensheathing endotelceller (figur 4). Dessa uppgifter bekräftar att den mekaniska mikrofragmenteringsprocessen inte påverkar det perivaskulära cell facket. Närvaron av perivaskulära celler, både pericyter och adventitial celler, har bekräftats av flödescytometri. För att välja celler används ett Forward scatter-område (FSC-a) mot sido spridningsområde (SSC-A) (figur 2a). Den identifierade cellpopulationen var ytterligare gated med hjälp av Forward scatter-området (FSC-A) vs Forward scatter höjd (FSC-H) för att välja enskilda celler och levande celler identifierades som negativa för DAPI färgning (figur 2B-C). CD31 och CD45 markörer användes för att utesluta hematopoietiska och endotelceller (figur 2C). Slutligen identifierades pericyter som CD146+ CD34- och adventitial celler som CD146- CD34+ (figur 2D). Den gating strategin sammanfattas i figur 2. Samma gating strategi följdes för sortering experiment. FACS-renad MAT pericyter och adventitial celler båda uppvisar en spindel till stellate morfologi i kulturen. Kultur för 8 dagar visade att MAT utsöndrar mer cytokiner (adiponectin, CD14, CD31, CD154, Chitinase 3-liknande 1, komplement faktor D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, relaxin-2, ST2, TNF-α, CD87), och angiogena faktorer (angiogenin, angiostatin, DPPIV, endoglin, HGF, leptin, PDGFAB/BB, PlGF, trombospondin 2, TIMP4, uPA) in vitro än SVF. Dessutom var cytokiner och angiogena faktorer som produceras av både MAT och SVF mer rikliga i MAT supernatants. Följaktligen, MAT smält med kollagenase och placeras i kulturen producerade en sekretom liknande den som observerats från konventionella SVF15. Globalt, alla dessa uppgifter visar att mikro-fragmenterad fettvävnad är inte bara terapeutiskt fördelaktig, men också mottaglig för fenotypiska och funktionella undersökningar. I synnerhet, den lilla storleken på MAT kluster möjliggör testning av sekretoriska aktivitet i kulturen, vilket skulle vara svårare med stora fettvävnad bitar.
Figur 1: schematisk representation av mikrofragmenteringen av subkutan fettvävnad. Lipoaspirate samlas in från subkutan fettvävnad med hjälp av en kanyl. Insamlade lipoaspirate är mikro-fragmenterad med hjälp av nära systemet enheten. Resulterande mikro-fragmenterad fettvävnad (MAT) består av flera celltyper inklusive perivaskulära celler och adipocyter. MAT kan användas i flera tester, inklusive explantat kultur och immunohistokemi, och för cell isolering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativ gating strategi för perivaskulär cell analys/sortering från mat. Ett Forward scatter-område (FSC-A) vs Side scatter Area (SSC-A) grind används för att identifiera celler (a), följt av Forward scatter-området (FSC-a) vs Forward scatter höjd (FSC-H) för att välja enstaka celler (B). Livskraftiga icke-endoteliala och icke-hematopoietiska celler är gated som negativa för DAPI, CD31-V450 och CD45-V450 respektive, i samma panel (C). Slutligen, perivaskulära celler identifieras som pericyter (CD146+ CD34-) eller adventitial celler (CD146- CD34+) (D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mat morfologi. Ljust-sätta in beskådar av MAT kultiverat i basal medel. Scale bar = 1 000 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Vasculature nätverk i matta. Endotelceller färgas med UEA-1. Boxed områden i A är visade förstorade i B och C. pilspetsar indikerar pericyter, som har färgas med antikroppar mot PDGFRβ och NG2. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna uppsats beskriver den fysiska fraktionering, med hjälp av en sluten system enhet, av mänsklig fettvävnad i små kluster som visar normal fettvävnad mikroanatomi.
Manuellt aspirrankade mänskliga subkutana fettvävnad och saltlösning lastas i en genomskinlig plast cylinder som innehåller stora Flipper-stil metalliska sfärer som, vid kraftig manuell skakning av anordningen, bristning fettet i sub-millimeter Fragment. Bifogade filter och utlopp gör det möjligt att eliminera skräp, blod och fria lipider och matta samlas i en spruta som är kopplad till enheten. Här har MAT framgångsrikt vidarebehandlats för immunohistokemi, flödescytometri och kultur, även om denna specifika enhet utvecklades i ett medicinskt perspektiv, att ersätta i teatern den enzymatiskt producerade fettvävnad stromacellstumörer vaskulär fraktion eller kultur som härrör fett stamceller, och faktiskt visat sig mycket effektiv i plastikkirurgi och olika andra cellbaserade terapier4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13.
Därför, fettvävnad länge används intakt som en ren filler16 återvänder i sin ursprungliga 3-dimensionell konfiguration, efter år av enzymatisk dissociation och in vitro-kultur. Detta följer en generell tendens att växa och studera vävnader i deras medfödda flercelliga arrangemang snarare än som spridda cellpopulationer, vilket illustreras av den växande populariteten av organoider17.
Fettvävnad fragmentering med denna mekaniska anordning har visat tillförlitlig och reproducerbar och ingen ändring av det ursprungliga protokollet var någonsin nödvändigt. Det vanliga utbudet av humant subkutant fett för experimentella studier är en lipoaspirate samlas in av kosmetiska skäl, som laddas direkt på fragmenteringen enheten. En begränsning för användare i forskningslaboratoriet är dock att fettvävnad som skall bearbetas måste försiktigt aspireras för hand, för att bibehålla vävnad mikroarkitektur så intakt som möjligt, och inte suga ut med en vakuumpump som rutinmässigt görs i operativ Rum. Om inte en kirurg villig att samla in fett manuellt kan identifieras, en nyresected bukplastik rester kan användas. Fettet fäst vid den inre aspekten av buk huden kan sedan försiktigt och sterilely aspireras med sprutan försedd med satsen. Detta är skälet till att vi har beskrivit detta steg i början av protokollet (steg 1).
Vad som faktiskt förklarar den terapeutiska överlägsenheten av mattan över enzymet dissocierade fettvävnad? Flödescytometri analys av MAT enzymatiskt dissocierade omedelbart efter fraktionering visade en högre andel av pericyter, känd som medfödda föregångare av mesenkymala stamceller14, jämfört med total aspirerad fettvävnad15 . Mer direkt, den jämförande analys av mat och svf kultur samman supernatanterna visade att den tidigare utsöndrar, kvalitativt och kvantitativt, mer tillväxtfaktorer och cytokiner inblandade indirekt i vävnad reparation. Dessa inkluderar Pro-angiogena faktorer, samt olika mediatorer av Immuno-inflammation15.
Utöver dessa nya resultat, mycket återstår att förstå när det gäller molekylära grund av MAT terapeutisk potential. För detta ändamål, den metod som beskrivs här representerar en enkel, snabb teknik som är liten inverkan på fett nisch och genererar matta idealisk för ytterligare experimentell manipulation. Från en underordnad synvinkel, forskning bedrivs också för att förbättra användbarheten av mattan i kliniken; i detta hänseende förefaller det som en prioritering att avgöra om mikrofragmenterad fettvävnad kan frysas för fördröjd autolog eller allogen administrering. Slutligen, det kommer att vara viktigt att avgöra om andra vävnader och organ såsom benmärg, bukspottkörteln eller skelettmuskulaturen, att citera men några, kan vara mikro-fragmenterad med samma enhet och ge intakt mikrovaskulär associerade cellulära nischer mottaglig till experimentell intervention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CT är en av grundarna av Lipogems.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Claire Cryer och Fiona Rossi vid universitetet i Edinburgh för deras experthjälp med Flow cytometry. Vi vill också tacka Personalen på Murrayfield Hospital som bidrog genom att tillhandahålla vävnadsprover.
Detta arbete stöddes av bidrag från British Heart Foundation och Lipogems, som levererade fettvävnad bearbetning kit. Prover på human vävnad från vuxna har anskaffats med full etik behörighet från forskningsetiska kommittén i sydöstra Skottland (referens: 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
