Summary
Hier presenteren we menselijke vetweefsel enzym-vrije micro-fragmentatie met behulp van een gesloten systeem apparaat. Deze nieuwe methode maakt het verkrijgen van sub-millimeter clusters van vetweefsel geschikt voor in vivo transplantatie, in vitro cultuur, en verdere celisolatie en karakterisering.
Abstract
In het afgelopen decennium zijn vetweefsel transplantaties op grote schaal gebruikt in plastische chirurgie en orthopedie om weefsel repletie en/of regeneratie te verbeteren. Dienovereenkomstig zijn technieken voor het oogsten en verwerken van menselijk vetweefsel geëvolueerd om snel en efficiënt grote hoeveelheden weefsel te verkrijgen. Onder deze, de gesloten systeemtechnologie vertegenwoordigt een innovatief en eenvoudig te gebruiken systeem om te oogsten, te verwerken, en opnieuw te injecteren verfijnd vetweefsel in een korte tijd en in dezelfde interventie (intra-operatief). Vetweefsel wordt opgevangen door liposuctie, gewassen, geëmulgeerd, gespoeld en machinaal fijngehakt in celclusters van 0,3 tot 0,8 mm. autologe transplantatie van mechanisch gefragmenteerd vetweefsel heeft opmerkelijke werkzaamheid aangetoond bij verschillende therapeutische indicaties zoals esthetische geneeskunde en chirurgie, orthopedische en algemene chirurgie. Karakterisering van micro-gefragmenteerd vetweefsel onthulde de aanwezigheid van intacte kleine vaten binnen de adipocyten clusters; Vandaar, de perivasculaire niche blijft onperturbed. Deze clusters zijn verrijkt in perivasculaire cellen (dat wil zeggen, mesenchymale stamcel (MSC) voor ouders) en in vitro analyse toonde een verhoogde afgifte van groeifactoren en cytokines die betrokken zijn bij weefselherstel en regeneratie, vergeleken met enzymatisch afgeleide MSCs. Dit suggereert dat het superieure therapeutische potentieel van micro gefragmenteerd vetweefsel wordt verklaard door een hogere frequentie van vermoedelijke MSCs en verbeterde secretoire activiteit. Of deze toegevoegde pericytes rechtstreeks bijdragen aan een hogere groeifactor en de productie van cytokine is niet bekend. Deze klinisch goedgekeurde procedure maakt de transplantatie van vermoedelijke MSCs mogelijk zonder de noodzaak van expansie en/of enzymatische behandeling, waardoor de vereisten van de GMP-richtlijnen worden omzeild en de kosten voor cel-gebaseerde therapieën worden verminderd.
Introduction
Vetweefsel, lang gebruikt als een vuller in reconstructieve en cosmetische chirurgie, is onlangs populairder geworden in regeneratieve geneeskunde, ooit herkend als een bron voor mesenchymale stamcellen (MSCs)1. Lipoaspiraten gezien enzymatisch in eencellige suspensies opleveren een adipocyte-vrije stromale vasculaire fractie (SvF) die ongewijzigd wordt gebruikt in de patiënt of, meer in het algemeen, wordt gekweekt voor enkele weken in MSCS2.
Echter, enzym dissociatie breekt de weefsel micro-omgevingen, afzondering naburige regelgevende cellen van vermoedelijke regeneratieve cellen die aanzienlijk worden gewijzigd door in vitro cultuur. Om dergelijke experimentele artefacten en de daaruit voortvloeiende functionele veranderingen te vermijden, zijn pogingen gedaan om vetweefsel te verwerken voor therapeutisch gebruik, terwijl de oorspronkelijke configuratie zo intact mogelijk was3,4. Met name, mechanische weefsel verstoring is begonnen met het vervangen van enzymatische dissociatie. Hiertoe, de volledige onderdompeling gesloten systeem micro-fragmenten lipoaspirates in sub-millimeter, bloed-en olievrije weefsel clusters (bijvoorbeeld Lipogems) via een opeenvolging van zeef filtratie en staal marmer geïnduceerde verstoring3. Autologe transplantatie van micro-gefragmenteerd vetweefsel, met behulp van deze gesloten systeemtechnologie, is succesvol geweest in meerdere indicaties, spanning van cosmetica, orthopedie, Proctologie en Gynaecologie4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Vergelijking tussen humaan micro-gefragmenteerd vetweefsel (MAT) verkregen met het gesloten systeem apparaat en isogene SVF onthulde dat met betrekking tot de vasculaire/stromale celverdeling en secretoire activiteit in cultuur, MAT meer pericytes bevat, die vermoedelijke MSCs14, en afscheidigt hogere hoeveelheden groeifactoren en cytokines15.
Het huidige artikel illustreert de enzym vrije micro fragmentatie van menselijk subcutaan vetweefsel met behulp van een gesloten systeem apparaat, en de verdere verwerking van dergelijk gemicroniseerd vetweefsel voor in vitro cultuur, immunohistochemie en FACS analyse, om de aanwezige celtypen te identificeren en de oplosbare factoren te scheiden (Figuur 1). De beschreven methode genereert veilig vetweefsel afgeleide sub-millimeter organoïden met levensvatbare vetweefsel celpopulaties in een intacte niche, geschikt voor verdere toepassingen en studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethische goedkeuring voor het gebruik van menselijke weefsels in dit onderzoek werd verkregen uit het onderzoek ethisch comité van Zuidoost-Schotland (Referentie: 16/SS/0103).
1. subcutane abdominale vetweefsel verzameling
Opmerking: Alle instrumenten die in de handmatige LiPo-aspiratie procedure worden gebruikt, worden geleverd door de fabrikant van de micro-fragmentatie inrichting.
- Behoud de steriliteit voor alle vloeistoffen, containers, instrumenten en het operationele gebied gedurende het experiment.
- Plaats de correctie sample (verkregen door het chirurgische team in een steriele zak zonder oplossing) bovenop een chirurgische doek met de huid naar boven gericht. Wassen is niet nodig. Voor optimaal gebruik, houd het monster bij 4 °C en verwerk het adipeus monster binnen 16 uur na het oogsten.
- Injecteer 50 tot 100 mL 37 °C 0,9% NaCl-oplossing, afhankelijk van de grootte van het weefselmonster (gebruik 50 mL voor maximaal een 15 cm2 vetweefsel oppervlak en verhoog het volume dienovereenkomstig), met behulp van een wegwerp weefsel infiltratie canule, in de subcutane vetweefsel. Behandel het preparaat door het cutane gedeelte.
- Sluit een 10 mL Luer Lock spuit aan op een wegwerp liposuccanule.
- Introduceer de canule voorzichtig in het vetweefsel van de randen. Eenmaal binnen maakt u het vacuüm in de spuit door de zuiger te trekken. Houd de zuiger in positie met de hand om de vacuüm afzuiging te verzekeren.
- Maak radiale bewegingen in het vetweefsel monster totdat de spuit vol is van lipoaspiraat. Verwijder voorzichtig de canule uit het weefsel en koppel de spuit los. Sluit een nieuwe lege spuit aan.
- Herhaal de procedure tot 60 mL lipoaspiraat is verzameld.
Opmerking: De maximale hoeveelheid lipoaspirate die kan worden verwerkt wijzigingen op basis van het type apparaat gebruikt. Raadpleeg de instructies van de fabrikant (tabel met materialen).
2. micro-fragmentatie van de lipoaspirate
Opmerking: Dit protocol is bedoeld voor het gebruik van het onderzoek alleen. Micro fragmentatie wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbaar apparaat (tabel met materialen).
- Verwijder het apparaat uit het pakket en controleer of het hoofdtoestel is aangesloten op de Afvalzak. Plaats de afvalopvangzak op de grond en zorg ervoor dat de kleppen zijn vastgezet op de procesunit doppen.
- Sluit de terminale piek van de ingangs leiding aan op de zoute zak door de verbindingspoort van de zak door te prikken. Houd de zoute zak hoger dan de verwerkingseenheid.
Opmerking: Voor het type apparaat dat in dit protocol wordt gebruikt, wordt een zakje van 2.000 mL met steriele zoutoplossing aanbevolen. - Controleer of alle 5 klemmen die zijn aangesloten op de buizen van de circuits open zijn. Plaats de verwerkingseenheid in een verticale positie met de grijze dop naar boven.
- Laat de zoutoplossing de verwerkingseenheid vullen. Controleer of de stroom de Afvalzak bereikt. Verwijder alle luchtbellen van de verwerkingseenheid door het te schudden.
Opmerking: Alle volgende passages moeten worden uitgevoerd bij afwezigheid van lucht in de verwerkingseenheid. - Plaats de verwerkingseenheid in een verticale positie met de blauwe dop naar boven en sluit de klem naast de ingangs leiding.
- Begin met het injecteren van de lipoaspirate door de spuit aan te sluiten op de zelf-occluderende klep van de blauwe ingangs dop. Houd de verwerkingseenheid verticaal tijdens deze procedure en trek langzaam de zuiger van de spuit totdat alle lipoaspiraat is overgebracht naar het apparaat. Herhaal het proces totdat alle lipoaspirate zich in de verwerkingseenheid bevindt.
Opmerking: Voor de verwerkingseenheid die in de video wordt gebruikt, voegt u op dat moment maximaal 30 mL lipoaspiraat toe. De procedure kan tweemaal worden uitgevoerd, tot 60 mL lipoaspirate zijn verwerkt. - Open de ingangsklem om de zout stroom te herstellen.
- Schud de verwerkingseenheid krachtig gedurende minimaal 2 minuten en controleer regelmatig of de zoutoplossing in de Afvalzak stroomt.
- Wanneer de zoutoplossing in de verwerkingseenheid transparant wordt, na ongeveer 2 minuten schudden, plaatst u het apparaat met de grijze dop naar boven en sluit u de klem op de afvoer in de buurt van de grijze dop. Het verwerkte weefsel zal drijven aan de bovenkant.
- Vul een 10 mL Luer Lock spuit met zoutoplossing en sluit deze aan op de laadklep van de blauwe dop. Sluit de klem die zich in de buurt van de blauwe dop bevindt. Sluit een lege 10 mL Luer Lock spuit, met de zuiger volledig ingebracht, op de klep van de grijze dop.
Opmerking: Gebruik alleen Luer Lock spuiten. - Injecteer de zoutoplossing stevig in de verwerkingseenheid van de blauwe dop. Zorg ervoor dat de spuit die is aangesloten op de grijze klep dus wordt gevuld met het verwerkte weefsel. Eenmaal geïnjecteerd alle de zoutoplossing, verwijder voorzichtig beide spuiten.
- Herhaal de stappen 2,10 en 2,11 totdat al het verwerkte weefsel wordt verzameld.
Opmerking: De gemiddelde opbrengst van MAT is 30 mL van 60 mL handmatige lipoaspirate. Sommige weefsels blijven in de verwerkingseenheid en sommige klontjes kunnen aanwezig zijn aan de blauwe rand in het apparaat. - Verwijder aan het einde van de verwerking alle spuiten, sluit alle klemmen, maak de zoute zak los en gooi het apparaat weg volgens de lokale protocollen.
Opmerking: Het verwerkings apparaat kan niet opnieuw worden gebruikt.
3. fluorescentie immunohistochemie
- Breng 300-500 μL MAT over in een buis van 1,5 mL. Voeg 1 ml 4% gebufferde Paraformaldehyde (PFA) toe, meng voorzichtig met de hand (geen vortexing) en laat bij 4 °c 's nachts (van 16 tot 24 uur).
- Verzamel het preparaat en breng het over in een schone 1,5 mL buis met 1 mL PBS. Herhaal de stap twee keer om PFA Excess te verwijderen.
- Breng het preparaat over in 15% (w/v) sucrose in PBS-oplossing en inincuberen bij 4 °C 's nachts (van 16 tot 24 uur)
- Breng het preparaat in een put van een 24-put plaat en voeg een insluitings oplossing van 15% sucrose en 7% gelatine (w/v) in PBS. Vul de put halverwege. Inincuberen gedurende 4 uur bij 37 °C.
- Breng de monsters over naar 4 °C. Na 2-4 h voor de gelatine te stollen, vul de put met de inbedding oplossing en vertrekken bij 4 °C 's nachts.
- Verwijder de monsters uit de putjes. Verwijder overtollige insluit verbinding en Vries op droogijs. Bewaar de monsters bij-80 °C.
- Snijd 8-10 μm dikke delen met een cryostat. Gebruik voor een optimale snijbeweging de cryostaat bij-30 °C. Dia's kunnen worden opgeslagen bij-80 °C.
- Voordat u doorgaat met de immunofluorescentie, repareert u de secties in 4% PFA gedurende 7 min. Verwijder de PFA en was tweemaal met lauwe PBS (37 °C) om gelatine uit de secties te verwijderen.
- Blokkeer niet-specifieke antilichaam binding door de glaasjes met 10% geitenserum in PBS (v/v) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te inbroed.
- Verdun de primaire antilichamen in antistof verdunningsmiddel of 0,2% (w/v) boviene serumalbumine (BSA) in PBS (w/v): muis anti-humaan-NG2 (1:100, voorraad 0,5 mg/mL), konijn anti-humaan-PDGFRβ (1:100, voorraad 0,15 mg/mL).
- Verwijder de blokkerende oplossing en voeg de verdunde primaire antilichamen toe. Incuberen bij 4 °C 's nachts.
Opmerking: Voer alle incubatie stappen vanaf nu in het donker uit. - Verwijder de primaire antilichamen en was 3 keer met PBS gedurende 10 minuten per keer.
- Verdun de secundaire antilichamen in antistof verdunningsmiddel of 0,2% (w/v) BSA in PBS: geit anti-muis-555 (1:300), geit anti-konijn-647 (1:300). Incuberen 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de secundaire antilichamen en was elke keer drie keer met PBS gedurende 10 minuten.
- Als een Biotine geconjugeerd lectine wordt gebruikt, gebruik dan de avidin/Biotine blokkerende Kit. Incuberen gedurende 10 minuten met elk reagens dat wordt meegeleverd met twee wasruimtes tussen met PBS.
- Herhaal de Blokkeer stap door de glaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur te inbroed met 10% geit serum in PBS.
- Voeg de biotinyleerd lectine toe, biotinyleerd ulex europaeus lectine (1:200, voorraad 2 mg/ml), verdund hetzij in 0,2% BSA (w/v) in PBS of antilichaam verdunningsmiddel. Incuberen 1 h en 30 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder overtollige biotinyleerd lectine en was elke keer drie keer met PBS gedurende 10 minuten.
- Voeg het secundaire streptavidine geconjugeerd antilichaam toe, verdund in 0,2% (w/v) BSA in PBS of antilichaam verdunningsmiddel. Incuberen gedurende 1 uur.
- Verwijder het secundaire antilichaam en was elke keer drie keer met PBS gedurende 10 minuten.
- Kernen van het contra vlek met 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, 1:500, voorraad 5 mg/ml), verdund in 0,2% BSA (w/v) in PBS, gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder de DAPI-oplossing en spoel tweemaal met PBS, 10 min elke keer.
- Monteer de dia's met een waterige bevestigingsmiddel. Laat het volledig drogen, ofwel overnachten op de Bank in het donker of 1 uur bij 37 °C.
- Houd de glaasjes op 4 °C in het donker en verkrijg beelden op een epifluorescentie Microscoop.
4. vertering van micro-gefragmenteerd vetweefsel en celisolatie
- Breng het micro-gefragmenteerde vetweefsel over in een steriele container.
- Vers make-up van het verterings medium door het oplossen van type II Collagenase in DMEM bij de concentratie van 1 mg/mL.
- Voeg hetzelfde volume verterings medium toe aan het micro-gefragmenteerde vetweefsel (d.w.z. voor 30 mL monster Voeg 30 mL verterings medium toe).
- Plaats de verzegelde container in een 37 °C schud waterbad ingesteld op 120 rpm voor 45 min. Houd er rekening mee dat de container een goed schudden van het monster mogelijk moet maken. Als een grote container niet beschikbaar is, gebruik dan 2 50 mL tubes (30 mL monster/digestie medium mengsel in elk) horizontaal geplaatst.
- Na de incubatie, Blokkeer de spijsvertering door het toevoegen van een gelijk volume van blokkerende oplossing (2% (v/v) FCS/PBS) en filtreer opeenvolgend door 100 μm en 70 μm celstrainers.
- Centrifugeer de gefilterde suspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g. Gooi het supernatant weg.
- Rebreng de pellet in ongeveer 5 mL erytrocyten lysisbuffer (155 mM NH4Cl, 170 mm tris, pH 7,65). Het volume van de buffer kan variëren afhankelijk van de besmetting van de erytrocyten in de celpellet. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg een gelijk volume blokkerende oplossing toe en filtreer door een celzeef van 40 μm.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 200 x g en gooi het supernatant weg.
- Respendeer de pellet in blokkerende oplossing. Meng goed door pipetten. Graaf levensvatbare cellen met Trypan blauwe uitsluiting op een hemocytometer.
- Meng een gelijk volume van de celsuspensie met Trypan blauwe vlek. Aspirate 10 μL van de oplossing en plaats deze op een hemocytometer.
- Tel het aantal levende cellen (helder en rond) aanwezig in ten minste 5 vierkantjes en krijg het gemiddelde celnummer. Om de vlek verdunningsfactor op te nemen, vermenigvuldigt u het gemiddelde celgetal met 2. Om het totale aantal levende cellen per 1 mL monster te krijgen vermenigvuldigt u het verkregen getal met 104.
Opmerking: de verkregen eencellige suspensie, namelijk de stromale vasculaire fractie (SVF), kan ofwel worden geseerd op 20.000 cellen/cm2 in perivasculaire celgroei medium (DMEM aangevuld met 20% warmte GEÏNACTIVEERD FCS, 1% penicileen/streptomycine en 1% L-glutamine) of gebruikt voor Flowcytometrie analyse en sortering. De gemiddelde opbrengst van nucleated cellen in de SVF is ongeveer 3 x 104 cellen per ml mat. Sorteer experimenten vereisen ten minste 8 x 105 cellen om voldoende perivasculaire cellen voor culturing te verkrijgen.
5. celetikettering en-sortering
- Centrifugeer de celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten bij 200 x gen onderbreek de pellet in het blokkerende medium met een concentratie van 1 x 106 cellen per 100 μL.
- Aliquot ten minste 50.000 cellen voor de Onbevlekte controle en de fluorescentie minus één (FMO) besturingselementen in polystyreen ronde bodem Flow cytometrie buizen. Gebruik de rest van de cellen voor meerkleurige vlekken door in een andere buis te plaatsen.
Opmerking: zodra de instellingen van het experiment zijn vastgesteld (d.w.z. laserintensiteit, gating-strategie), kan het aantal cellen dat wordt gebruikt voor de Onbevlekte controle en de FMOs worden verlaagd, als de gebruikte antilichamen hetzelfde zijn. - Voeg CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) en CD146-BV711 (1:100) antilichamen toe aan de eencellige suspensie voor Multi-Color kleuring. Voor de FMO-besturingselementen, toevoegen: voor de V450 FMO equivalente volumes van CD34-PE en CD146-BV711 plus V450 Isotype-regeling; voor de equivalente PE FMO-volumes van CD31-V450, CD45-V450 en CD146-BV711 plus PE-Isotype regeling; voor de BV711 FMO-equivalente volumes van CD31-V450, CD45-V450 en CD34-PE plus BV711 Isotype-regeling.
- Pipetteer langzaam de oplossing in de buis om de buisjes gedurende 20 minuten in het donker te mengen en inbroed bij 4 °C.
- Compensatie controle kralen voorbereiden. Voeg 15 μL positieve kralen en 15 μL negatieve parels toe aan 70 μL blokkerend medium in 3 polystyreen ronde bodem Flow-cytometrie buizen. Voeg CD34-PE, CD31-V450 of CD45-V450, en CD146-BV711 antilichamen, één per buis.
- Pipetteer, of Vortex langzaam, om de antilichamen met de parels te mengen en inbroed alle buisjes bij 4 °C gedurende 20 minuten in het donker.
Opmerking: de beschreven procedure kan worden gebruikt voor Flowcytometrie-analyse of celsortering. - Bereid Verzamel buisjes voor door het binnenoppervlak van de buisjes met endotheliale groeimedium (EGM) vooraf te bevochtigen, waardoor ongeveer 50 μL medium op de bodem van elke buis wordt gezet.
- Verwijder na antilichaam incubatie het teveel aan antilichamen door de cellen en de kralen te wassen met 2 mL blokkerend medium.
- Verwijder de oplossing door de buisjes gedurende 5 minuten op 200 x g te centrifugeren en het supernatant voorzichtig te aspireren. De wasstap repliceren.
- Respendeer de cellen in het blokkerende medium met een eindconcentratie van 1 x 106 cellen per 250 μL. de parels hervatten in 100 μL blokkerend medium.
- Breng de cellen in nieuwe polystyreen ronde bodem Flow cytometrie buizen met celstrainer dop. Dit zal de verstoring van de celklonten mogelijk maken.
- Transport alle cel en kraal suspensies naar de cel sorteerder op ijs in het donker.
- Voer ongekleurde controle cellen uit om de achtergrond fluorescentie te bepalen en de spanningen in te stellen.
- Voer de compensatie controle buizen uit om de fluorescentie compensatie in te stellen.
- Gebruik het Forward Scatter Area (FSC-A) versus side Scatter Area (SSC-A) om cellen te identificeren en gebruik vervolgens forward Scatter Area (FSC-A) versus forward Scatter Height (FSC-H) om afzonderlijke cellen te selecteren.
- Voeg DAPI, 1 μL van 5 μg/mL oplossing voor elke mL monster, toe aan de Onbevlekte controle om de gating voor dode cellen in te stellen (Figuur 2). Na DAPI-kleuring is geen wasbeurt nodig.
- Voer Isotype-besturingselementen uit om achtergrond fluorescentie drempels met betrekking tot niet-specifieke binding vast te stellen en de gating in te stellen.
- Voer de Multi-Color gekleurd monster. Uitsluiten hematopoietische en endotheliale cellen door gating op CD31 en CD45 negatieve cellen. Verzamel de pericyte (CD146+ CD34-) en ADVENTITIËLE cel (CD146- CD34+) populaties in Verzamel buisjes (Figuur 2).
Opmerking: optimale levensvatbare celopbrengsten zijn ongeveer 2% van de totale Live-celdissociatie voor pericytes en 1,5% voor adventitiële cellen.
6. celcultuur
- Zaai vers gesorteerde pericytes en adventitiële cellen met een dichtheid van 30.000 tot 40.000 cellen/cm2 op gelatine gecoate kweek platen
- Om de kweek platen te bedekken, bedek het plaat oppervlak met steriele 0,2% (w/v) gelatine in PBS-oplossing (ongeveer 100 μL oplossing per cm2). Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en verwijder de oplossing. Bewaar vers gesorteerde cellen op ijs tijdens de coating van de kweek plaat.
- Centrifugeer vers verzamelde cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten en onderbreek de celpellet voorzichtig opnieuw in een passende hoeveelheid endotheliale groeimedium (EGM). Als het aantal verzamelde cellen zeer laag is, vermijd dan de centrifugeren en plaat direct de verzamelde cellen.
- Zaai de cellen op gelatine gecoate platen. Inincuberen bij 37 °C bij 5% CO2.
- Zodra cellen zich hebben gevestigd en gehecht aan de plaat (na ten minste 72 h), Exchange EGM met perivasculaire celgroei medium (DMEM aangevuld met 20% warmte geïnactiveerd FCS, 1% penicillaire/streptomycine en 1% L-glutamine) voor zowel pericytes als adventitiële cellen.
- Zodra pericytes en adventitiële cellen 80%-90% samenloop hebben bereikt, dissociëren cellen met behulp van 0,05% trypsine-EDTA. Verzamel met 5% FCS/PBS, centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten, resuspendeer in perivasculaire celgroei medium en doorgang de cellen van 1:3 tot 1:5 ratio (of bij ongeveer 7.000 cellen/cm2) op ongecoate polystyreen cultuur platen of kolven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mechanische dissociatie van handmatige lipoaspiraten resulteerde in de productie van micro-gefragmenteerd vetweefsel (MAT), bestaande uit een aggregaat van adipocytes omhullende een microvasculaire netwerk (Figuur 3). Immunofluorescentie analyse van gelatine-embedded en cryovaste MAT benadrukt deze structuur, met het vasculaire netwerk gemarkeerd door de endotheliale celmarker ulex europaeus agglutinine 1 (UEA-1)-receptor, voornamelijk bestaande uit kleine, capillaire-achtige vaten ( Figuur 4). Met name pericytes die NG2 of PDGFRβ uitdrukken, worden gewoonlijk gedistribueerd, ensheathing endotheliale cellen (Figuur 4). Deze gegevens bevestigen dat het mechanische micro-fragmentatie proces niet van invloed is op het perivasculaire celcompartiment. De aanwezigheid van perivasculaire cellen, zowel pericytes als adventitiële cellen, is bevestigd door Flowcytometrie. Om cellen te selecteren werd een forward Scatter Area (FSC-A) versus side Scatter Area (SSC-A) poort gebruikt (Figuur 2a). De geïdentificeerde celpopulatie werd verder afgesloten met behulp van voorwaartse spreidings gebied (FSC-A) versus voorwaartse spreidings hoogte (FSC-H) om enkelvoudige cellen te selecteren en levende cellen werden geïdentificeerd als negatief voor DAPI-kleuring (Figuur 2B-C). CD31 en CD45 markers werden gebruikt om hematopoietische en endotheel cellen uit te sluiten (Figuur 2C). Ten slotte werden pericytes als CD146+ CD34- en adventitiële cellen geïdentificeerd als CD146- CD34+ (Figuur 2D). De gating-strategie wordt samengevat in Figuur 2. Dezelfde gating strategie werd gevolgd voor het sorteren van experimenten. FACS-gezuiverde MAT pericytes en adventitiële cellen vertonen beiden een spil om de morfologie van de cultuur te stelleren. De cultuur voor 8 dagen toonde aan dat mat meer cytokinen (adiponectine, CD14, CD31, CD154, Chitinase 3-achtige 1, complement factor D, CD147, GDF-15, igfbp-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, pdgfaa, CCL5, RBP-4, relaxin-2, ST2, TNF-α, CD87), en angiogene factoren (angiogenine, angiostatine, DPPIV, endoglin, HGF, leptin, PDGFAB/BB, PlGF, trombospondin 2, TIMP4, uPA) in vitro dan SVF. Bovendien waren cytokinen en angiogene factoren die door zowel MAT als SVF werden geproduceerd, meer overvloedig in MAT-supernatants. Dienovereenkomstig, MAT verteerd met collagenase en geplaatst in cultuur produceerde een secretome vergelijkbaar met die waargenomen uit conventionele SVF15. Wereldwijd tonen al deze gegevens aan dat micro-gefragmenteerd vetweefsel niet alleen therapeutisch voordelig is, maar ook vatbaar is voor fenotypische en functionele onderzoeken. In het bijzonder, de kleine grootte van MAT clusters testen van secretoire activiteit in de cultuur, die moeilijker zou zijn met grote vetweefsel brokken.
Figuur 1: schematische weergave van de micro-fragmentatie van subcutaan vetweefsel. Lipoaspiraat wordt verzameld van subcutaan vetweefsel met behulp van een canule. Verzamelde lipoaspirate is micro-gefragmenteerd met behulp van de sluitsysteem apparaat. Resulterende micro-gefragmenteerd vetweefsel (MAT) bestaat uit meerdere celtypen, waaronder perivasculaire cellen en adipocytes. MAT kan worden gebruikt in meerdere tests, met inbegrip van de explant cultuur en immunohistochemie, en voor celisolatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve gating strategie voor perivasculaire cel analyse/sortering van mat. Een forward Scatter Area (FSC-A) versus side Scatter Area (SSC-A) poort wordt gebruikt om cellen (a) te identificeren, gevolgd door forward Scatter gebied (FSC-a) vs forward Scatter hoogte (FSC-H) om enkelvoudige cellen (B) te selecteren. Levensvatbare niet-endotheliale en niet-hematopoietische cellen worden afgesloten als negatief voor respectievelijk DAPI, CD31-V450 en CD45-V450, in hetzelfde paneel (C). Ten slotte worden perivasculaire cellen geïdentificeerd als pericytes (CD146+ CD34-) of adventitiële cellen (CD146- CD34+) (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: mat morfologie. Helder-veldzicht van MAT gekweekt in Basaal medium. Schaalbalk = 1.000 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Vasculature-netwerk in mat. Endotheliale cellen worden gekleurd met UEA-1. Boxed gebieden in A zijn vergroot in B en C. pijlpunten geven pericytes aan, die zijn gekleurd met antilichamen tegen PDGFRβ en NG2. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel beschrijft de fysieke fractionering, met behulp van een gesloten systeem apparaat, van menselijke vetweefsel in kleine clusters weergeven van normale vetweefsel micro anatomie.
Handmatig aanzuiging menselijk onderhuidse vetweefsel en zoutoplossing worden geladen in een transparante plastic cilinder met grote flipperkast-achtige metalen bollen die, na krachtig handmatig schudden van het apparaat, het vet in sub-millimeter breken Fragmenten. Bijgevoegde filters en uitlaat maken het elimineren van puin, bloed en vrije lipiden en MAT wordt opgevangen in een spuit gekoppeld aan het apparaat. Hier is MAT met succes verder verwerkt voor immunohistochemie, flow cytometrie en cultuur, hoewel dit specifieke apparaat werd ontwikkeld in een medische perspectief, te vervangen in het theater de enzymatisch geproduceerde vetweefsel stromale vasculaire Fractie of cultuur afgeleide vetweefsel cellen, en bleek inderdaad zeer efficiënt in plastische chirurgie en diverse andere cel-gebaseerde therapieën4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13.
Daarom, vetweefsel lang gebruikt intact als een loutere filler16 keert terug in zijn native 3-dimensionale configuratie, na jaren van enzymatische dissociatie en in vitro cultuur. Dit volgt een algemene trend om te groeien en bestuderen van weefsels in hun aangeboren multicellulaire regeling in plaats van als verspreide celpopulaties, zoals geïllustreerd door de groeiende populariteit van organoïden17.
Vetweefsel fragmentatie met behulp van dit mechanische apparaat heeft bewezen betrouwbaar en reproduceerbaar en geen wijziging van het oorspronkelijke protocol was ooit nodig. De gewone toevoer van humaan onderhuids vet voor experimentele studies is een lipoaspiraat dat wordt verzameld om cosmetische redenen, dat rechtstreeks op het fragmentatie apparaat wordt geladen. Een beperking voor gebruikers in het onderzoek laboratorium is echter dat het vetweefsel dat moet worden verwerkt, voorzichtig met de hand moet worden aangeblazen, om weefsel-microarchitectuur zo intact mogelijk te houden, en niet te zuigen met een vacuümpomp zoals routinematig wordt gedaan in het besturings Kamer. Tenzij een chirurg bereid om handmatig vet te verzamelen kan worden geïdentificeerd, kan een vers geperfectioneerd abdominoplastiek residu worden gebruikt. Het vet dat aan het binnenste aspect van de buikhuid is bevestigd, kan vervolgens zorgvuldig en sterilely worden aangezogen met de spuit die bij de kit wordt geleverd. Dit is de reden waarom we deze stap aan het begin van het protocol hebben beschreven (stap 1).
Wat eigenlijk verklaart de therapeutische superioriteit van mat over enzym gezien vetweefsel? Flowcytometrie analyse van mat enzymatisch dissociatie onmiddellijk na fractionering onthulde een hoger percentage van pericytes, bekend als aangeboren voorlopers van mesenchymale stamcellen14, vergeleken met totaal aanzuiging vetweefsel15 . Meer rechtstreeks toonde de vergelijkende analyse van mat en SvF Culture supernatanten aan dat de voormalige secretes, kwalitatief en kwantitatief, meer groeifactoren en cytokines indirect betrokken waren bij weefselherstel. Deze omvatten Pro-angiogene factoren, evenals diverse bemiddel kers van immuno-ontsteking15.
Afgezien van deze recente resultaten, is er nog veel te begrijpen over de moleculaire basis van het therapeutische potentieel van de MAT. Om dit te doen, de methode hier beschreven vertegenwoordigt een eenvoudige, snelle techniek die lage impact op de vetweefsel niche en genereert mat ideaal voor verdere experimentele manipulatie. Vanuit bijkomend oogpunt wordt er ook onderzoek gedaan om de bruikbaarheid van MAT in de kliniek te verbeteren; in dit verband wordt bepaald of micro-gefragmenteerd vetweefsel voor vertraagde autologe of allogene toediening kan worden bevroren, een prioriteit. Tot slot, het zal belangrijk zijn om te bepalen of andere weefsels en organen zoals het beenmerg, alvleesklier of skeletspieren, om te citeren maar een paar, kan micro-gefragmenteerd met hetzelfde apparaat en bieden intact microcirculatiebed verbonden cellulaire niches vatbaar experimentele interventie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CT is de oprichter van Lipogems.
Acknowledgments
De auteurs willen Claire Cryer en Fiona Rossi van de Universiteit van Edinburgh bedanken voor hun deskundige hulp bij Flow Cytometry. We willen ook het personeel van het Murrayfield-ziekenhuis bedanken, dat bijgedragen heeft aan het verstrekken van weefsel specimens.
Dit werk werd gesteund door subsidies van de British Heart Foundation en Lipogems, die vetweefsel processing kits leverde. Menselijke weefselmonsters voor volwassenen werden verkregen met volledige ethische toestemming van het onderzoek ethisch comité van Zuidoost-Schotland (Referentie: 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
