Summary
Qui, presentiamo micro-frammentazione senza enzimi adiposi umani utilizzando un dispositivo di sistema chiuso. Questo nuovo metodo consente l'ottenimento di ammassi sub-millimetrici di tessuto adiposo adatto per il trapianto in vivo, la coltura in vitro e l'ulteriore isolamento e caratterizzazione delle cellule.
Abstract
Nell'ultimo decennio, i trapianti di tessuto adiposo sono stati ampiamente utilizzati nella chirurgia plastica e nell'ortopedia per migliorare la riproduzione e/o la rigenerazione dei tessuti. Di conseguenza, le tecniche per la raccolta e la lavorazione del tessuto adiposo umano si sono evolute al fine di ottenere rapidamente ed efficientemente grandi quantità di tessuto. Tra questi, la tecnologia del sistema chiuso rappresenta un sistema innovativo e facile da usare per raccogliere, elaborare e reiniettare tessuto adiposo raffinato in breve tempo e nello stesso intervento (intraoperatorio). Il tessuto adiposo viene raccolto mediante liposuzione, lavato, emulsionato, sciacquato e sciacquato meccanicamente in grappoli cellulari da 0,3 a 0,8 mm. Il trapianto autologo di tessuto adiposo frammentato meccanicamente ha dimostrato una notevole efficacia in diverse terapie terapeutiche come la medicina estetica e la chirurgia, la chirurgia ortopedica e generale. La caratterizzazione del tessuto adiposo micro-frammentato ha rivelato la presenza di piccoli vasi intatti all'interno degli ammassi adipociti; quindi, la nicchia perivascolare rimane imperturbata. Questi ammassi sono arricchiti in cellule perivascolari (ad esempio, antenati delle cellule staminali mesenchymal (MSC)) e l'analisi in vitro ha mostrato un maggiore rilascio di fattori di crescita e citochine coinvolte nella riparazione e rigenerazione dei tessuti, rispetto alle MSC di degenerazione enzimaticamente. Ciò suggerisce che il potenziale terapeutico superiore del tessuto adiposo microframmentato è spiegato da una maggiore frequenza di MSC presuntivi e una maggiore attività secretoria. Non è noto se questi periciti aggiunti contribuiscano direttamente a un fattore di crescita più elevato e alla produzione di citochine. Questa procedura clinicamente approvata consente il trapianto di sOTT SONdativi senza la necessità di espansione e/o trattamento enzimatico, aggirando così i requisiti delle linee guida GMP e riducendo i costi per le terapie basate sulle cellule.
Introduction
Tessuto adiposo, a lungo utilizzato come riempitivo in chirurgia ricostruttiva e estetica, è recentemente diventato più popolare nella medicina rigenerativa una volta riconosciuto come fonte per le cellule staminali mesenchymiche (MSC)1. I lipoaspirati dissociati enzimati in sospensioni unicellulari producono una frazione vascolare stromale senza adipociti (SVF) che viene utilizzata inalterata nel paziente o, più comunemente, viene coltivata per diverse settimane in MSC2.
Tuttavia, la dissociazione enzimatica rompe i microambienti tissutali, appartando le cellule regolatorie vicine da cellule rigenerative presunte che diventano notevolmente modificate dalla coltura in vitro. Per evitare tali artefatti sperimentali e conseguenti alterazioni funzionali, sono stati fatti tentativi di elaborare il tessuto adiposo per uso terapeutico, pur mantenendo la sua configurazione nativa il più intatta possibile3,4. In particolare, l'interruzione meccanica dei tessuti ha iniziato a sostituire la dissociazione enzimatica. A tal fine, la full immersion ha chiuso i micro-frammenti di micro-frammenti lipoaspirati in sottomillimetri, cluster di tessuti privi di sangue e olio (ad esempio, Lipogems) attraverso una sequenza di filtrazione setaccio e marmo d'acciaio indotto interruzione3. Il trapianto autologo di tessuto adiposo micro-frammentato, utilizzando questa tecnologia di sistema chiuso, ha avuto successo in molteplici indicazioni, estendendo cosmetici, ortopedici, proctologia e ginecologia4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
Il confronto tra il tessuto adipose umano microframmentato (MAT) ottenuto con il dispositivo di sistema chiuso e la SVF isogenica ha rivelato che per quanto riguarda la distribuzione delle cellule vascolari/stromali e l'attività secretoria nella coltura, il MAT contiene più periciti, che sono presuntistativi MSC14, e secerne maggiori quantità di fattori di crescita e citochine15.
Il presente articolo illustra la microframmentazione senza enzimi del tessuto adiposo sottocutaneo umano utilizzando un dispositivo di sistema chiuso, e l'ulteriore elaborazione di tale tessuto adiposo micronizzato per la coltura in vitro, l'immunohistochimica e l'analisi FACS, per identificare i tipi di cellule presenti e i fattori solubili secreti (Figura 1). Il metodo descritto genera in modo sicuro organoidi sub-millimeter derivati adiposi contenenti popolazioni di cellule adipose vitali in una nicchia intatta, adatta per ulteriori applicazioni e studi.
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Protocol
L'approvazione etica per l'uso dei tessuti umani in questa ricerca è stata ottenuta dal Comitato etico di ricerca del Sud-Est della Scozia (riferimento: 16/SS/0103).
1. Collezione di tessuti adiposi addominali sottocutanei
NOT: Tutti gli strumenti utilizzati nella procedura manuale lipo-aspirazione sono forniti dal produttore del dispositivo di microframmentazione.
- Mantenere la sterilità per tutti i fluidi, contenitori, strumenti e l'area operativa durante l'esperimento.
- Posizionare il campione di abdominoplastica (procurato dall'equipe chirurgica in un sacchetto sterile senza alcuna soluzione) sopra un panno chirurgico con la pelle rivolta verso l'alto. Non è richiesto il lavaggio. Per un uso ottimale, conservare il campione a 4 gradi centigradi ed elaborare il campione adiposo entro 16 h dalla raccolta.
- Iniettare da 50 a 100 mL di 37 ,9% di soluzione NaCl, a seconda delle dimensioni del campione di tessuto (usare 50 mL per un massimo di 15 cm2 superficie del tessuto adiposo e aumentare il volume di conseguenza), utilizzando una cannula di infiltrazione del tessuto usa e getta, nel sottocutaneo Adiposo. Gestire il campione dalla parte cutanea.
- Collegare una siringa di blocco Luer da 10 mL a una cannula a liposuzione usa e getta.
- Introdurre con attenzione la cannula all'interno del tessuto adiposo dai bordi. Una volta dentro, creare il vuoto all'interno della siringa tirando lo stantuffo. Mantenere lo stantuffo in posizione a mano per fissare l'aspirazione del vuoto.
- Fare movimenti radiali all'interno del campione di tessuto adiposo fino a quando la siringa è piena di lipoaspirare. Rimuovere con attenzione la cannula dal tessuto e scollegare la siringa. Collegare una nuova siringa vuota.
- Ripetere la procedura fino a 60 mL di lipoaspirate sono stati raccolti.
NOT: La quantità massima di lipoaspirate che può essere elaborata cambia in base al tipo di dispositivo utilizzato. Si prega di fare riferimento alle istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
2. Microframmentazione del lipoaspirato
NOT: Questo protocollo è destinato solo all'uso della ricerca. La microframmentazione viene eseguita con l'aiuto di un dispositivo disponibile in commercio (Tabella dei materiali).
- Rimuovere il dispositivo dalla confezione e verificare che l'unità principale sia collegata al sacchetto dei rifiuti. Posizionare il sacchetto di raccolta dei rifiuti a terra e assicurarsi che le valvole siano fissate ai tappi delle unità di processo.
- Collegare il picco terminale della linea di ingresso al sacchetto salina perforando la porta di connessione del contenitore. Tenere il sacchetto salina più in alto rispetto all'unità di elaborazione.
NOT: Per il tipo di dispositivo utilizzato in questo protocollo, si consiglia un sacchetto da 2.000 mL di salina sterile. - Verificare che tutti e 5 i morsetti collegati ai tubi dei circuiti siano aperti. Posizionare l'unità di elaborazione in posizione verticale con il tappo grigio verso l'alto.
- Lasciare che la soluzione salina riempia l'unità di lavorazione. Verificare che il flusso raggiunga il sacchetto dei rifiuti. Rimuovere tutte le bolle d'aria dall'unità di elaborazione agitandola.
NOT: Tutti i seguenti passaggi devono essere eseguiti in assenza di aria nell'unità di lavorazione. - Posizionare l'unità di elaborazione in posizione verticale con il tappo blu verso l'alto e chiudere il morsetto accanto alla linea di input.
- Iniziare a iniettare il lipoaspirato collegando la siringa alla valvola autooccluding del tappo di ingresso blu. Mantenere l'unità di elaborazione verticale durante questa procedura e tirare lentamente lo stantuffo della siringa fino a quando tutto il lipoaspirate è stato trasferito all'unità. Ripetere il processo fino a quando tutto il lipoaspirate è all'interno dell'unità di elaborazione.
NOT: Per l'unità di elaborazione utilizzata nel video, aggiungere al momento al massimo 30 mL di lipoaspirate. La procedura può essere eseguita al massimo due volte, fino a 60 mL di lipoaspirate sono stati elaborati. - Aprire il morsetto di ingresso per ripristinare il flusso salina.
- Agitare vigorosamente l'unità di lavorazione per almeno 2 min, controllando regolarmente il flusso della soluzione salina nel sacchetto dei rifiuti.
- Quando la soluzione salina nell'unità di elaborazione diventa trasparente, dopo circa 2 minuti di agitazione, posizionare l'unità con il tappo grigio verso l'alto e chiudere il morsetto situato sullo scarico vicino al tappo grigio. Il tessuto lavorato fluttuerà in alto.
- Riempire una siringa di blocco Luer da 10 mL con una soluzione salina e collegarla alla valvola di carico del tappo blu. Chiudere il morsetto situato vicino al tappo blu. Collegare una siringa di blocco Luer vuota da 10 mL, con lo stantuffo completamente inserito, alla valvola del cappuccio grigio.
NOT: Usa solo le siringhe Lucer lock. - Iniettare saldamente la salina nell'unità di lavorazione dal tappo blu. Assicurarsi che la siringa collegata alla valvola grigia venga quindi riempita con il tessuto lavorato. Una volta iniettata tutta la salina, rimuovere con attenzione entrambe le siringhe.
- Ripetere i passaggi 2.10 e 2.11 fino a quando non viene raccolto tutto il tessuto elaborato.
NOT: La resa media di MAT è di 30 mL da 60 mL di lipoaspirate manuale. Alcuni tessuti rimarranno all'interno dell'unità di lavorazione e alcuni grumi potrebbero essere presenti attaccati al bordo blu all'interno dell'unità. - Al termine della lavorazione, rimuovere tutte le siringhe, chiudere tutti i morsetti, staccare il sacchetto salina e smaltire il dispositivo secondo i protocolli locali.
NOT: Il dispositivo di elaborazione non può essere riutilizzato.
3. Fluorescenza Immunoistochimica
- Trasferire 300-500 l di MAT in un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 1 mL di paraformaldeide tampone (PFA) del 4%), mescolare delicatamente a mano (senza vortice) e lasciare a 4 gradi durante la notte (da 16 a 24 h).
- Raccogliere il campione e trasferirlo in un tubo pulito da 1,5 mL contenente 1 mL di PBS. Ripetere il passaggio due volte per rimuovere l'eccesso di PFA.
- Trasferire il campione in saccarosio 15% (w/v) in soluzione PBS e incubare a 4 gradi centigradi durante la notte (da 16 a 24 h)
- Trasferire il campione in un pozzo di un pozzo 24 pozzo e aggiungere una soluzione di incorporamento fatta di 15% di saccarosio e 7% gelatina (w/v) in PBS. Riempire il pozzo a metà strada. Incubare per 4 ore a 37 .
- Trasferire i campioni a 4 gradi centigradi. Dopo 2-4 h per solidificare la gelatina, riempire il pozzo con la soluzione di incorporamento e lasciare a 4 gradi durante la notte.
- Rimuovere i campioni dai pozzi. Rimuovere il composto di incorporamento in eccesso e congelare sul ghiaccio secco. Conservare i campioni a -80 gradi centigradi.
- Tagliare le sezioni spesse 8-10 m con un criostato. Per una sezionamento ottimale, utilizzare il criostato a -30 gradi centigradi. Le diapositive possono essere conservate a -80 gradi centigradi.
- Prima di procedere con l'immunofluorescenza, fissare le sezioni nel 4% PFA per 7 min. Rimuovere il PFA e lavare due volte con PBS tiepida (37 gradi centigradi) al fine di rimuovere la gelatina dalle sezioni.
- Bloccare il legame degli anticorpi non specifici incubando i vetrini con il siero di capra del 10% in PBS (v/v) per 1 h a temperatura ambiente.
- Diluire gli anticorpi primari nel diluente anticorpo o 0,2% (w/v) albumina di siero bovino (BSA) in PBS (w/v): topo anti-umano-NG2 (1:100, stock 0,5 mg/mL), coniglio anti-umano-PDGFR (1:100, stock 0,15 mg/mL).
- Rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere gli anticorpi primari diluiti. Incubare a 4 gradi centigradi.
NOT: Esegui tutti i passi di incubazione d'ora in tanto al buio. - Rimuovere gli anticorpi primari e lavare 3 volte con PBS per 10 min ogni volta.
- Diluire gli anticorpi secondari nel diluente anticorpo o 0.2% (w/v) BSA in PBS: capra anti-topo- 555 (1:300), capra anti-coniglio- 647 (1:300). Incubare 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovere gli anticorpi secondari e lavare tre volte con PBS per 10 min ogni volta.
- Se viene utilizzata una lectina coniugata di biotina, utilizzare il kit di blocco avidina/biotina. Incubare per 10 min con ogni reagente fornito con due lavatrici in mezzo con PBS.
- Ripetere la fase di blocco incubando i vetrini per 1 h a temperatura ambiente con 10% siero di capra in PBS.
- Aggiungere la lectina biotinylata, l'Ulex europaeus lectinbio biotinylata (1:200, stock 2 mg/mL), diluita nello 0,2% BSA (w/v) in PBS o anticorpa. Incubare 1 h e 30 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere la lectina biotinylata in eccesso e lavare tre volte con PBS per 10 min ogni volta.
- Aggiungere l'anticorpo coniugato streptavidin secondario diluito in BSA 0,2% (w/v) in PBS o anticorpo diluente. Incubare per 1 h.
- Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare tre volte con PBS per 10 min ogni volta.
- Controstain nuclei con 4,6-diamidino_2-fenilindole (DAPI, 1:500, stock 5 mg/mL), diluito in 0.2% BSA (w/v) in PBS, per 10 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione DAPI e lavare due volte con PBS, 10 min ogni volta.
- Montare gli scivoli con un agente di montaggio acquoso. Lasciare asciugare completamente, sia durante la notte sulla panca al buio o 1 h a 37 gradi centigradi.
- Tenere le diapositive a 4 gradi centigradi al buio e acquisire immagini al microscopio a epifluorescenza.
4. Digestione del tessuto adiposo microframmentato e isolamento cellulare
- Trasferire il tessuto adiposo micro-frammentato in un contenitore sterile.
- Appena costituito il mezzo di digestione sciogliendo collagenase di tipo II in DMEM alla concentrazione di 1 mg/mL.
- Aggiungere lo stesso volume del mezzo di digestione al tessuto adiposo micro-frammentato (cioè, per 30 mL di campione aggiungere 30 mL di mezzo di digestione).
- Mettere il contenitore sigillato in un bagno d'acqua agitazione di 37 gradi centigradi impostato a 120 giri/mm per 45 min. Si prega di notare che il contenitore dovrebbe consentire una corretta agitazione del campione. Se non è disponibile un contenitore di grandi dimensioni, utilizzare due tubi da 50 mL (30 mL di miscela media campione/digestione in ciascuno) posizionati orizzontalmente.
- Dopo l'incubazione, bloccare la digestione aggiungendo un volume uguale di soluzione di blocco (2% (v/v) FCS/PBS) e filtrare in sequenza attraverso 100 m e 70 ceppi cellulari.
- Centrifugare la sospensione filtrata per 5 min a 200 x g. Scartare il super-attardato.
- Risospendere il pellet in circa 5 mL di tampone di lisi eritrocite (155 mM NH4Cl, 170 mM Tris, pH 7,65). Il volume del buffer può variare a seconda della contaminazione eritrocita osservata nel pellet cellulare. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Aggiungere un volume uguale di soluzione di blocco e filtrare attraverso un colino cellulare di 40 m.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 200 x g e scartare il supernatante.
- Risospendere il pellet nella soluzione di blocco. Mescolare bene pipettando. Contare le cellule vitali con l'esclusione blu Trypan su un emocitometro.
- Mescolare un volume uguale della sospensione cellulare con la macchia blu Trypan. Aspirate 10 l della soluzione e posizionarlo su un emocitometro.
- Contare il numero di celle vive (luminose e rotonde) presenti in almeno 5 quadrati e ottenere il numero medio di cella. Per includere il fattore di diluizione delle macchie, moltiplicare il numero di cella medio per 2. Per ottenere il numero totale di celle vive per 1 mL di campione moltiplicare il numero ottenuto per 104.
NOTA: La sospensione a cella singola ottenuta, vale a dire la frazione vascolare stromale (SVF), può essere semidata a 20.000 cellule/cm2 nel mezzo di crescita delle cellule perivascolari (DMEM integrato con 20% di calore inattivato FCS, 1% penicillina / streptomicina e 1% L-glutamina) o utilizzato per l'analisi della citometria di flusso e lo smistamento. La resa media delle cellule nucleate nell'SVF è di circa 3 x 104 celle per mL di MAT. Gli esperimenti di smistamento richiedono almeno 8 x 105 cellule per ottenere abbastanza cellule perivascolari per la coltura.
5. Etichettatura e smistamento delle celle
- Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 5 min a 200 x ge sospendere nuovamente il pellet nel mezzo di blocco ad una concentrazione di 1 x 106 cellule per 100 .
- Aliquota almeno 50.000 cellule per il controllo incontaminato e la fluorescenza meno uno (FMO) controlli in polistirolo rotondo flusso a fondo tubi. Utilizzare il resto delle celle per la colorazione multicolore posizionando in un altro tubo.
NOTA: Una volta stabilite le impostazioni dell'esperimento (ad esempio, intensità laser, strategia di gating), il numero di cellule utilizzate per il controllo incontaminato e gli FMO possono essere ridotti se gli anticorpi utilizzati sono gli stessi. - Aggiungere gli anticorpi CD31-V450 (1:400), CD34-PE (1:100), CD45-V450 (1:400) e CD146-BV711 (1:100) alle sospensioni a cella singola per la colorazione multicolore. Per i controlli FMO, aggiungere: per i volumi equivalenti V450 FMO di CD34-PE e CD146-BV711 più V450 controllo isotipo; per i volumi equivalenti PE FMO di controllo CD31-V450, CD45-V450 e CD146-BV711 più PE isotype; per i volumi equivalenti BV711 FMO di controllo isotipo CD31-V450, CD45-V450 e CD34-PE più BV711.
- Delicatamente pipetta, o vortice lentamente la soluzione nel tubo per mescolare e incubare i tubi a 4 gradi centigradi per 20 minuti al buio.
- Preparare perline di controllo di compensazione. Aggiungete 15 l di perline positive e 15 l di perline negative a 70 -L di blocco medio in 3 tubi di flusso a fondo rotondo in polistirolo. Aggiungere gli anticorpi CD34-PE, CD31-V450 o CD45-V450 e CD146-BV711, uno per tubo.
- Delicatamente pipetta, o vortice lentamente, per mescolare gli anticorpi con le perline e incubare tutti i tubi a 4 gradi centigradi per 20 minuti al buio.
NOTA: la procedura descritta può essere utilizzata per l'analisi della citometria del flusso o per l'ordinamento delle celle. - Preparare i tubi di raccolta pre-bagnando la superficie interna dei tubi con mezzo di crescita endoteliale (EGM), lasciando circa 50 .
- Dopo l'incubazione degli anticorpi, rimuovere l'eccesso di anticorpo lavando le cellule e le perline con 2 mL di mezzo di blocco.
- Rimuovere la soluzione centrifugando i tubi a 200 x g per 5 min e aspirando con attenzione il supernatante. Replicare il passaggio di lavaggio.
- Risospendere le cellule in mezzo di blocco ad una concentrazione finale di 1 x 106 cellule per 250 .
- Trasferire le cellule in nuovi tubi di citometria a flusso rotondo-inferiore di polistirolo con tappo di colino cellulare. Ciò consentirà l'interruzione dei grumi cellulari.
- Trasportare tutte le sospensioni di cellule e perline alla selezionatrice cellulare sul ghiaccio al buio.
- Eseguire celle di controllo incontaminate per stabilire la fluorescenza di fondo e impostare le tensioni.
- Eseguire i tubi di controllo della compensazione per impostare la compensazione della fluorescenza.
- Utilizzare l'area di dispersione in avanti (FSC-A) e l'area di dispersione laterale (SSC-A) per identificare le celle, quindi utilizzare l'area di dispersione in avanti (FSC-A) e l'altezza della dispersione in avanti (FSC-H) per selezionare singole celle.
- Aggiungere DAPI, 1 luna di 5 g/mL per ogni mL di campione, al controllo non ordinato per impostare il gating per le celle morte (Figura 2). Non è richiesto il lavaggio dopo la colorazione DAPI.
- Eseguire controlli isotipi per stabilire soglie di fluorescenza in background correlate all'associazione non specifica e impostare il gating.
- Eseguire il campione colorato multicolore. Escludere le cellule ematopoietiche ed endoteliali gating su cellule negative CD31 e CD45. Raccogliere le popolazioni pericite (CD146- CD34-) e di cella avventiziale (CD146- CD34)in tubi di raccolta (Figura 2).
NOTA: I rendimenti cellulari vitali ottimali sono circa il 2% della dissociazione totale delle cellule vive per i periciti e dell'1,5% per le cellule avventiali.
6. Cultura cellulare
- Semi appena smistati periciti e cellule avventiziali ad una densità di 30.000 a 40.000 cellule / cm2 su placchedi di coltura rivestite di gelatina
- Per rivestire le piastre di coltura, coprire l'area della piastra con sterile 0,2% (w/v) gelatina in soluzione PBS (circa 100 - L di soluzione per cm2). Incubare a temperatura ambiente per 10 min e rimuovere la soluzione. Mantenere le cellule appena ordinate sul ghiaccio durante il rivestimento della piastra di coltura.
- Centrifuga cellule appena raccolte a 200 x g per 5 min e sospendere delicatamente il pellet cellulare in una quantità appropriata di mezzo di crescita endoteliale (EGM). Se il numero di cellule raccolte è molto basso, evitare la centrifugazione e placcare direttamente le cellule raccolte.
- Semina le cellule su lastre rivestite di gelatina. Incubare a 37 gradi centigradi nel 5% DI CO2.
- Una volta che le cellule si sono depositate e aderitate alla piastra (dopo almeno 72 h), scambiare EGM con il mezzo di crescita cellulare perivascolare (DMEM integrato con il 20% di calore inattivato da FCS, 1% penicillina / streptomimina e 1% L-glutammina) sia per le cellule periciti che per le cellule adavziali.
- Una volta che periciti e cellule avventitali hanno raggiunto l'80%-90% di confluenza, dissociate le cellule utilizzando 0.05% trypsin-EDTA. Raccogliere con il 5% di FCS/PBS, centrifugare a 200 x g per 5 min, ri-sospendere in mezzo di crescita cellulare perivascolare, e poi passare le cellule da 1:3 a 1:5 rapporto (o a circa 7.000 cellule / cm2) su piastre di coltura di polistirolo non rivestite o flaconi.
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Representative Results
La dissociazione meccanica dei lipoaspiri manuali ha portato alla produzione di tessuto adiposo microframmentato (MAT), costituito da un aggregato di adipociti che avvolgevano una rete microvascolare (Figura 3). L'analisi dell'immunofluorescenza del MAT incorporato nella gelatina e criofissa evidenzia questa struttura, mostrando la rete vascolare contrassegnata dal marcatore di cellule endoteliali Ulex europaeus agglutinininina 1 (UEA-1) costituita principalmente da piccoli vasi capillari ( Figura 4). In particolare, i periciti che esprimono NG2 o PDGF sono normalmente distribuiti, avvolgendo le cellule endoteliali (Figura 4). Questi dati confermano che il processo meccanico di microframmentazione non influisce sul compartimento delle cellule perivascolari. La presenza di cellule perivascolari, sia periciti che cellule avventiali, è stata confermata dalla citometria di flusso. Per selezionare le celle è stata utilizzata un'area di dispersione in avanti (FSC-A) e un cancello dell'area di dispersione laterale (SSC-A)(Figura 2A). La popolazione di cellule identificate è stata ulteriormente recintata utilizzando l'area di dispersione in avanti (FSC-A) e l'altezza di dispersione in avanti (FSC-H) per selezionare singole celle e le cellule vive sono state identificate come negative per la colorazione DAPI (Figura 2B-C). I marcatori CD31 e CD45 sono stati utilizzati per escludere le cellule ematopoietiche ed endoteliali (Figura 2C). Infine, i periciti sono stati identificati come CD146- CD34- e le cellule avventiali come CD146- CD34 (Figura 2D). La strategia di gating è riassunta nella Figura 2. La stessa strategia di gating è stata seguita per gli esperimenti di selezione. Periciti MAT purificati dalla FACS e cellule avventitaliere mostrano entrambi un mandrino alla morfologia stellata nella coltura. La cultura per 8 giorni ha mostrato che il MAT secerne più citochine (adipone, CD14, CD31, CD154, chitinasi 3-like 1, fattore di complemento D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, relaxin-2, ST2, TNF- fattori (angiogenia, angiostatina, DPPIV, endoglin, HGF, leptina, PDGFAB/BB, PlGF, trombostagno 2, TIMP4, uPA) in vitro rispetto a SVF. Inoltre, le citochine e i fattori angiogenici prodotti sia da MAT che da SVF erano più abbondanti nei supernatanti MAT. Di conseguenza, MAT digerito con collagenasi e messo in coltura prodotto un secretoma simile a quello osservato dal convenzionale SVF15. A livello globale, tutti questi dati dimostrano che il tessuto adiposo microframmentato non è solo vantaggioso dal punto di vista terapeutico, ma anche suscettibile alle indagini fenotipiche e funzionali. In particolare, le piccole dimensioni dei cluster MAT consentono di testare l'attività secretoria nella coltura, che sarebbe più difficile con grandi pezzi di tessuto adiposo.
Figura 1: Rappresentazione schematica della microframmentazione del tessuto adiposo sottocutaneo. Il lipoaspirato viene raccolto dal tessuto adiposo sottocutaneo utilizzando una cannula. Il lipoaspirate raccolto è microframmentato utilizzando il dispositivo di sistema di chiusura. Il tessuto adiposo micro-frammentato risultante (MAT) è composto da più tipi di cellule, tra cui cellule perivascolari e adipociti. MAT può essere utilizzato in più test, tra cui coltura explant e immunohistochimica, e per l'isolamento cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di gating rappresentativa per l'analisi/smistamento delle cellule perivascolari dal MAT. Un cancello dell'area di dispersione in avanti (FSC-A) e dell'area di dispersione laterale (SSC-A) viene utilizzato per identificare le celle(A), seguite dall'area di dispersione in avanti (FSC-A) e dall'altezza della dispersione in avanti (FSC-H) per selezionare singole celle (B). Le cellule vitali non endoteliali e non ematopoietiche sono gated come negative per DAPI, CD31-V450 e CD45-V450, nello stesso pannello (C). Infine, le cellule perivascolari sono identificate come cellule periciti (CD146- CD34-) o cellule avventiziali (CD146- CD34)(D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: morfologia MAT. Vista a campo luminoso del MAT coltivato in mezzi basali. Barra di scala : 1.000 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rete di vascolatura in MAT. Le cellule endoteliali sono macchiate con UEA-1. Le aree in scatola in A sono mostrate ingrandite in B e C. Le punte di freccia indicano periciti, che sono stati macchiati usando anticorpi contro PDGFr e NG2. Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo documento descrive la frazione fisica, utilizzando un dispositivo di sistema chiuso, del tessuto adiposo umano in piccoli ammassi che mostrano la normale microanatomia del tessuto adiposo.
Il tessuto adipose umano aspirato manualmente e la soluzione salina vengono caricati in un cilindro di plastica trasparente contenente grandi sfere metalliche in stile flipper che, a forte agitazione manuale del dispositivo, rompono il grasso in sub-millimetri Frammenti. I filtri attaccati e le slet consentono di eliminare detriti, sangue e lipidi liberi e il MAT viene raccolto in una siringa collegata al dispositivo. Qui, MAT è stato ulteriormente elaborato per immunohistochimica, citometria di flusso e coltura, anche se questo dispositivo specifico è stato sviluppato in una prospettiva medica, per sostituire in teatro il tessuto adiposo vascolare stromale frazione o coltura derivata cellule staminali adipose, e infatti dimostrato altamente efficiente in chirurgia plastica e diverse altre terapie basate sulle cellule4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13.
Pertanto, il tessuto adiposo a lungo usato intatto come semplice riempitivo16 ritorna nella sua configurazione nativa tridimensionale, dopo anni di dissociazione enzimatica e cultura in vitro. Questo segue una tendenza generale a crescere e studiare i tessuti nella loro disposizione multicellulare innata piuttosto che come popolazioni di cellule disperse, come dimostra la crescente popolarità degli organoidi17.
La frammentazione del tessuto adiposo con questo dispositivo meccanico si è dimostrata affidabile e riproducibile e non è mai stata necessaria alcuna modifica del protocollo originale. L'offerta ordinaria di grasso sottocutaneo umano per studi sperimentali è un lipoaspirate raccolto per motivi estetici, che viene caricato direttamente sul dispositivo di frammentazione. Una limitazione per gli utenti del laboratorio di ricerca, tuttavia, è che il tessuto adiposo da trattare deve essere delicatamente aspirato a mano, per mantenere la microarchitettura tissutale il più intatta possibile, e non succhiare con una pompa a vuoto come viene regolarmente fatto nel funzionamento stanza. A meno che un chirurgo disposto a raccogliere il grasso manualmente possa essere identificato, può essere utilizzato un residuo di abdominoplastica appena residuo. Il grasso attaccato all'aspetto interno della pelle addominale può quindi essere aspirato con attenzione e sterilità con la siringa fornita con il kit. Questo è il motivo per cui abbiamo descritto questo passaggio all'inizio del protocollo (passaggio 1).
Che cosa spiega effettivamente la superiorità terapeutica del MAT rispetto enzima dissociato tessuto adiposo? L'analisi citometria di flusso del MAT enzimaticamente dissociata immediatamente dopo la frazionazione ha rivelato una percentuale più elevata di periciti, noti come precursori innati di cellule staminali mesenchyli14, rispetto al tessuto adiposo aspirato totale15 . Più direttamente, l'analisi comparativa dei supernatanti della coltura MAT e SVF ha mostrato che gli ex segreti, qualitativamente e quantitativamente, più fattori di crescita e citochine coinvolte indirettamente nella riparazione dei tessuti. Questi includono fattori pro-angiogenici, così come diversi mediatori di immuno-infiammazione15.
Al di là di questi recenti risultati, molto resta da capire per quanto riguarda la base molecolare del potenziale terapeutico MAT. A tal fine, il metodo qui descritto rappresenta una tecnica semplice e veloce che è a basso impatto per la nicchia adiposo e genera MAT ideale per ulteriori manipolazioni sperimentali. Da un punto di vista accessorio, la ricerca è anche condotta per migliorare l'usabilità del MAT nella clinica; a questo proposito, determinare se il tessuto adiposo micro-frammentato può essere congelato per la somministrazione autologa o allogenica ritardata appare come una priorità. Infine, sarà importante determinare se altri tessuti e organi come il midollo osseo, il pancreas o il muscolo scheletrico, per citarne solo alcuni, possono essere micro-frammentati con lo stesso dispositivo e fornire microvasculature intatte associate nicchie cellulari amabili all'intervento sperimentale.
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Disclosures
CT è un fondatore di Lipogems.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Claire Cryer e Fiona Rossi dell'Università di Edimburgo per la loro assistenza esperta con citometria di flusso. Desideriamo anche ringraziare il personale dell'ospedale Murrayfield che ha contribuito fornendo campioni di tessuto.
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della British Heart Foundation e Lipogems, che hanno fornito kit di lavorazione dei tessuti adiposi. Campioni di tessuto umano adulto sono stati acquistati con il pieno permesso etico del Comitato etico di ricerca del Sud Est Scozia (riferimento: 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
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