Summary
여기서, 우리는 폐쇄된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직 효소-무마이크로 단편화를 제시한다. 이 새로운 방법은 생체 내 이식, 시험관 내 배양, 및 추가적인 세포 격리 및 특성화에 적합한 지방 조직의 서브 밀리미터 클러스터의 획득을 허용한다.
Abstract
지난 10 년 동안, 지방 조직 이식 널리 조직 재생 및 / 또는 재생을 향상시키기 위해 성형 수술 및 정형 외과에 사용되어왔다. 따라서, 인간 지방 조직을 수확하고 가공하는 기술은 다량의 조직을 신속하고 효율적으로 얻기 위해 진화했다. 이 중, 폐쇄 시스템 기술은 수확, 처리, 짧은 시간에 동일한 개입 (수술 중)에서 정제 된 지방 조직을 다시 주입하는 혁신적이고 사용하기 쉬운 시스템을 나타냅니다. 지방 조직은 지방 흡입에 의해 수집, 세척, 유화, 헹구고 0.3 에 0.8 mm의 세포 클러스터로 기계적으로 다진. 기계적으로 단편화 된 지방 조직의 자가 이식은 다른 치료에서 현저한 효능을 보였다 미용 의학 및 수술, 정형 외과 및 일반 수술과 같은 적응증. 미세 단편화 된 지방 조직의 특성화는 지방 세포 클러스터 내에서 손상되지 않은 작은 혈관의 존재를 밝혀; 따라서, 시반 틈새 는 흔들리지 않는 남아있다. 이들 군집은 혈관세포(즉, 중간엽 줄기세포(MSC) 조상)에서 풍부하게 공급되고 시험관내 분석은 효소 유래 중간엽 세포에 비해 조직 수선 및 재생에 관여하는 성장 인자 및 사이토카인의 증가된 방출을 보였다. 이것은 미세 단편화된 지방 조직의 우수한 치료 잠재력이 추정 형 MCS및 향상된 분비 활성의 높은 빈도에 의해 설명된다는 것을 시사한다. 이들 첨가된 pericytes가 더 높은 성장 인자 및 사이토카인 생산에 직접적으로 기여하는지 여부는 알려져 있지 않다. 이 임상적으로 승인된 절차는 확장 및/또는 효소 치료없이 추정 형 MC의 이식을 허용하여 GMP 지침의 요구 사항을 우회하고 세포 기반 치료 비용을 줄일 수 있습니다.
Introduction
회당 조직은 오랫동안 재건 및 성형 수술에서 필러로 사용되어 왔으며, 최근에는 중간엽 줄기 세포 (중간 엽 줄기 세포)의 공급원으로 인식된 재생 의학에서 더 인기를 얻고 있습니다1. 지질흡사염은 단세포 현탁액으로 효소해리되어 환자에서 변경되지 않은 채 사용되거나, 더 일반적으로, MSCs2로몇 주 동안 배양되는 지방세포없는 기질 혈관 분획(SVF)을 산출한다.
그러나, 효소 해리는 시험관 내 문화에 의해 상당히 변형되는 추정 재생 세포로부터 인접한 조절 세포를 외딴 조직 미세 환경을 파열시킵니다. 이러한 실험적 유물 및 그에 따른 기능적 변경을 피하기 위해,가능한한 기본 구성을 그대로 유지하면서 치료용 지방 조직을 처리하려는 시도가3,4. 특히, 기계적 조직 파괴는 효소 해리를 대체하기 시작했습니다. 이를 위해, 완전 침지 폐쇄 시스템은 체 여과 및 강철 대리석 유도중단의서열을 통해 서브 밀리미터, 혈액 및 오일 프리 조직 클러스터(예를 들어, Lipogems)로 리포아스해적을 밀어넣는다 3. 이 폐쇄 된 시스템 기술을 사용하여 마이크로 단편화 된 지방 조직의 자가 이식은 화장품, 정형 외과, 진록학 및부인과에걸쳐 여러 적응증에 성공했습니다 4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13.
폐쇄 된 시스템 장치와 등소 성 SVF로 얻은 인간 미세 단편 지방 조직 (MAT)과의 비교는 혈관 / 기질 세포 분포 및 배양내분비 활성과 관련하여 MAT가 더 많은 pericytes를 함유하고 있음을 밝혀냈습니다. 추정형자엽(14)과더 많은 양의 성장인자와 사이토카인(15)을 분비한다.
본 논문은 폐쇄된 시스템 장치를 이용한 인간 피하 지방 조직의 효소 프리 미세 단편화, 체외 배양, 면역조직화학 및 FACS 분석을 위한 이러한 미세화된 지방 조직의 추가 처리를 도시하고, 현재 존재하는 세포 유형과 분비되는 수용성 인자를 식별하기 위해(그림 1). 기재된 방법은 자연 틈새 시장에서 생존 가능한 지방 조직 세포 집단을 포함하는 지방 유래 서브 밀리미터 오르가노이드를 안전하게 생성하며, 추가 의 응용 및 연구에 적합합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구에서 인간 조직의 사용에 대 한 윤리적 승인 은 동남 스코틀랜드 연구 윤리 위원회 (참조: 16/SS/0103)에서 얻었다.
1. 피하 복부 지방 조직 수집
참고: 수동 리포 포인스 절차에 사용되는 모든 계측기는 마이크로 단편화 장치의 제조업체에서 제공합니다.
- 실험 전반에 걸쳐 모든 유체, 용기, 기기 및 작동 영역에 대해 멸균을 유지합니다.
- 피부가 위쪽을 향하고 있는 수술용 천 위에 복부 성형술 샘플(수술 팀이 어떤 해결책도 없이 멸균 봉투에 조달)을 놓습니다. 세탁은 필요하지 않습니다. 최적의 사용을 위해 시료를 4°C로 유지하고 수확 후 16시간 이내에 지방 샘플을 처리합니다.
- 37 °C 0.9 % NaCl 용액의 50 ~ 100 mL을 주입, 조직 샘플의 크기에 따라 (최대 사용 50 mL 최대 15 cm2 지방 조직 표면과 그에 따라 부피를 증가), 일회용 조직 침투 캐뉼라를 사용하여, 피하로 지방 조직. 절단 부품으로 시편을 처리합니다.
- 일회용 지방 흡입 캐뉼라에 10 mL 루어 잠금 주사기를 연결합니다.
- 조심스럽게 가장자리에서 지방 조직 내부의 캐뉼러를 소개합니다. 내부에 들어가면 플런저를 당겨 주사기 내부에 진공을 만듭니다. 진공 흡입을 고정하기 위해 플런저를 손으로 제자리에 고정하십시오.
- 주사기가 리포아스해적로 가득 차게 될 때까지 지방 조직 샘플 내부의 방사형 움직임을 확인합니다. 조심스럽게 조직에서 캐뉼라를 제거하고 주사기를 분리하십시오. 새 빈 주사기를 연결합니다.
- 리포아흡기 60 mL가 수집될 때까지 절차를 반복합니다.
참고: 처리될 수 있는 리포아흡기의 최대량은 사용되는 장치의 종류에 따라 변경된다. 메이커 의 안내(자료 표)를참고 하십시오.
2. 리포아스해적의 미세 단편화
참고: 이 프로토콜은 연구 용도로만 사용됩니다. 마이크로 단편화는 시판되는장치(재료표)의도움으로 수행된다.
- 포장에서 장치를 분리하고 본체가 쓰레기 봉투에 연결되어 있는지 확인합니다. 폐기물 수거 봉투를 바닥에 놓고 밸브가 공정 장치 캡에 고정되어 있는지 확인하십시오.
- 입력 라인의 단자 스파이크를 백 연결 포트를 관통하여 식염수 백에 연결합니다. 식염수 봉투를 가공 장치보다 높게 유지하십시오.
참고: 이 프로토콜에 사용되는 장치 유형의 경우 멸균 식염수 2,000 mL 백을 사용하는 것이 좋습니다. - 회로의 튜브에 연결된 5개의 클램프가 모두 열려 있는지 확인합니다. 처리 장치를 회색 캡을 위쪽으로 수직 위치에 놓습니다.
- 식염수 용액이 처리 장치를 채울 수 있도록 합니다. 흐름이 폐기물 봉투에 닿는지 확인합니다. 그것을 흔들어 처리 장치에서 모든 기포를 제거합니다.
참고: 다음 의 모든 구절은 처리 장치에 공기가 없는 상태에서 수행해야 합니다. - 처리 장치를 파란색 캡이 있는 수직 위치에 놓고 입력 라인 옆에 클램프를 닫습니다.
- 주사기를 청색 입력 캡의 자체 폐쇄 밸브에 연결하여 리포아흡기를 주입하기 시작합니다. 이 절차 동안 처리 장치를 수직으로 유지하고 모든 리포아흡기가 장치로 옮겨질 때까지 주사기 플런저를 천천히 당깁니다. 모든 리포아스해적이 처리 장치 내부에 들어올 때까지 이 과정을 반복합니다.
참고: 비디오에 사용된 처리 장치의 경우, 당시 최대 30mL의 리포아스해적을 추가합니다. 절차는 리포아흡기의 60 mL가 처리 될 때까지, 두 번 최대 수행 할 수 있습니다. - 입력 클램프를 열어 식염수 흐름을 복원합니다.
- 적어도 2 분 동안 처리 장치를 적극적으로 흔들어 식염수 용액이 폐기물 봉투로 흐르는지 정기적으로 확인하십시오.
- 처리 장치의 식염수 용액이 투명하게 변하면 약 2 분 동안 흔들린 후 회색 캡이있는 장치를 위쪽으로 놓고 회색 캡 근처의 배수구에있는 클램프를 닫습니다. 처리 된 조직은 상단에 떠있을 것입니다.
- 식염수로 10mL Luer 잠금 주사기를 채우고 파란색 캡의 로딩 밸브에 연결합니다. 파란색 캡 근처에 있는 클램프를 닫습니다. 빈 10mL Luer 잠금 주사기를 플런저를 완전히 삽입하여 회색 캡의 밸브에 연결합니다.
참고: 루어 잠금 주사기만 사용하십시오. - 블루 캡에서 식염수를 가공 장치에 단단히 주입합니다. 회색 밸브에 연결된 주사기가 결과적으로 처리 된 조직으로 채워지는지 확인하십시오. 모든 식염수에 주입한 후 두 주사기를 조심스럽게 제거하십시오.
- 모든 처리된 조직이 수집될 때까지 2.10 단계 및 2.11단계를 반복합니다.
참고: MAT의 평균 수율은 수동 리포아스해적의 60 mL에서 30 mL입니다. 일부 조직은 처리 장치 내부에 남아 있으며 일부 덩어리는 장치 내부의 파란색 가장자리에 부착 되어 있을 수 있습니다. - 처리가 끝나면 모든 주사기를 제거하고 모든 클램프를 닫고 식염수 백을 분리하고 로컬 프로토콜에 따라 장치를 폐기하십시오.
참고: 처리 장치를 다시 사용할 수 없습니다.
3. 형광 면역 성 화학
- 300-500 μL의 MAT를 1.5 mL 튜브로 옮김. 4% 버퍼링된 파라포름알데히드(PFA)의 1 mL를 넣고 손으로 부드럽게 섞은 후(와르질 없음) 밤새 4°C(16~24시간)에 둡니다.
- 시편을 수집하고 1 mL의 PBS를 포함하는 깨끗한 1.5 mL 튜브로 옮김. 단계를 두 번 반복하여 PFA 과잉을 제거합니다.
- PBS 용액에서 15% (v) 자당으로 시편을 옮기고 밤새 4 °C에서 배양하십시오 (16에서 24 h까지).
- 시편을 24개의 웰 플레이트로 옮기고 PBS에 15% 자당과 7% 젤라틴(w/v)으로 만든 임베딩 용액을 추가합니다. 우물을 중간에 채웁니다. 37 °C에서 4 시간 동안 배양하십시오.
- 샘플을 4°C로 옮김. 젤라틴이 고형화될 때 2-4시간 후에, 임베딩 용액으로 우물을 채우고 밤새 4°C에서 둡니다.
- 우물에서 샘플을 제거합니다. 여분의 임베딩 화합물을 제거하고 드라이 아이스에 얼립니다. 샘플을 -80°C에 보관합니다.
- 저온 극저온을 사용하여 8-10 μm 두께의 섹션을 잘라냅니다. 최적의 단면화의 경우 - 30°C에서 저온 사용을 하십시오. 슬라이드는 -80 °C에서 저장할 수 있습니다.
- 면역형광을 진행하기 전에, 섹션의 4% PFA를 7분 동안 고정시켰다.
- 실온에서 1시간 동안 PBS(v/v)에서 10% 염소 혈청으로 슬라이드를 배양하여 비특이적 항체 결합을 차단합니다.
- 항체 희석제 또는 0.2% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA)에서 PBS (w/v)에서 1 차 항체를 희석: 마우스 항-인간-NG2 (1:100, 스톡 0.5 mg/mL), 토끼 항-인간-PDGFRβ (1:100, 스톡 0.15 mg/mL).
- 차단 용액을 제거하고 희석 된 1 차 항체를 추가하십시오. 밤새 4°C에서 배양합니다.
참고: 어둠 속에서 지금부터 모든 인큐베이션 단계를 수행합니다. - 1차 항체를 제거하고 매번 10분 동안 PBS로 3회 세척합니다.
- PBS에서 항체 희석제 또는 0.2% (w/v) BSA에서 이차 항체를 희석: 염소 항마우스-555(1:300), 염소 항-토끼-647(1:300). 실온에서 1 h를 배양하십시오.
- 이차 항체를 제거하고 매번 10 분 동안 PBS로 세 번 씻으하십시오.
- 비오틴 컨쥬게이션 렉틴을 사용하는 경우 아비딘/비오틴 차단 키트를 사용하십시오. PBS와 사이에 2개의 세스와 함께 제공되는 각 시약으로 10분 동안 배양한다.
- PBS에서 10% 염소 혈청으로 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 인큐베이션하여 차단 단계를 반복합니다.
- 생동감 있는 렉틴, 생물질화된 울렉스 유로파에우스 렉틴(1:200, 스톡 2 mg/mL)을 첨가하여 PBS 또는 항체 희석제에서 0.2% BSA(w/v)로 희석합니다. 실온에서 1 시간 및 30 분 배양하십시오.
- 여분의 생체 폐화 렉틴을 제거하고 매번 10 분 동안 PBS로 세 번 씻어 내주세요.
- PBS 또는 항체 희석제에서 0.2% (w/v) BSA에서 희석된 이차 스트렙타비딘 컨쥬게이트 항체를 추가합니다. 1 시간 동안 배양하십시오.
- 이차 항체를 제거하고 매번 10 분 동안 PBS로 세 번 씻어.
- 4′,6-디아미디노-2-페니린돌 (DAPI, 1:500, 스톡 5 mg/mL)으로 희석된 4′,6-디아미디노-2-페니린돌(DAPI, 1:500, 스톡 5 mg/mL)으로 희석된 카운터스테인 핵은 실온에서 10분 동안 PBS에서 0.2% BSA(w/v)로 희석됩니다.
- DAPI 용액을 제거하고 매번 10분씩 PBS로 두 번 세척합니다.
- 수성 마운팅 에이전트로 슬라이드를 장착합니다. 밤새 벤치에서 또는 37°C에서 1시간 동안 완전히 건조시키십시오.
- 슬라이드를 어둠 속에서 4 °C로 유지하고 epifluoresccence 현미경으로 이미지를 수집합니다.
4. 미세 단편지방 조직 및 세포 분리의 소화
- 마이크로 단편화된 지방 조직을 멸균 용기로 옮김을 옮김으로 옮김.
- DMEM에서 1 mg/mL의 농도로 타입-II 콜라게나아제를 용해시켜 소화 매체를 신선하게 구성합니다.
- 마이크로 단편화된 지방 조직에 동일한 양의 소화 배지를 추가합니다(즉, 30 mL의 시료에 대해 30 mL의 소화 배지를 추가합니다).
- 밀봉된 용기를 37°C의 수조에 넣고 45분 동안 120 rpm으로 설정합니다. 용기는 시료를 적절히 흔들어 야 합니다. 큰 용기를 사용할 수 없는 경우, 수평으로 배치된 50mL 튜브 2개(각각 30mL의 샘플/소화 배지 혼합물)를 사용하십시오.
- 배양 후, 동일한 부피의 차단 용액(2% (v/v) FCS/PBS)을 첨가하여 소화를 차단하고 100 μm 및 70 μm 세포 스트레이너를 통해 순차적으로 여과합니다.
- 200 x g에서5 분 동안 여과 된 현탁액을 원심 분리기. 상급제는 버리십시오.
- 적혈구 리시즘 완충제의 약 5 mL에서 펠릿을 다시 중단 (155 mM NH4Cl, 170 mM 트리스, pH 7.65). 완충액의 부피는 세포 펠릿에서 관찰되는 적혈구 오염에 따라 달라질 수 있다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 동일한 부피의 차단 용액을 추가하고 40 μm 셀 스트레이너를 통해 필터링하십시오.
- 200 x g에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하고 상한체를 버립니다.
- 차단 용액에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 파이펫팅으로 잘 섞으세요. 혈세포계에 Trypan 파란색 제외와 가능한 세포를 계산합니다.
- 트립판 블루 얼룩과 셀 서스펜션의 동일한 볼륨을 혼합. 용액의 10 μL을 흡인하고 혈세포계에 놓습니다.
- 적어도 5 제곱에 존재하는 라이브 셀 (밝고 둥근)의 수를 계산하고 평균 셀 번호를 가져옵니다. 얼룩 희석 인자를 포함하기 위해, 평균 셀 수를 2로 곱한다. 샘플의 1 mL 당 라이브 셀의 총 수를 얻으려면 얻은 수를 104로곱합니다.
참고: 얻어진 단세포 현탁액, 즉 기질 혈관 분수 (SVF)는, 경막 세포 성장 매체에 있는 20,000세포/cm2에서 시드될 수 있습니다 (DMEM은 20% 열 불활성화 FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1%로 보충됨) L-글루타민) 또는 유세포분석 분석 및 선별에 사용된다. SVF에서 핵세포의 평균 수율은 MAT의 mL당 약 3 x 104 세포이다. 선별 실험은 배양에 충분한 세포를 얻기 위해 적어도 8 x 105 세포를 필요로한다.
5. 셀 라벨링 및 분류
- 세포 현탁액을 실온에서 200 x g에서5분 동안 원심분리하고, 100 μL당 1 x 106 세포의 농도로 차단 배지에서 펠릿을 다시 현탁한다.
- Aliquot 적어도 50,000 세포는 얼룩이 없는 대조군 및 형광마이너스 1(FMO)을 폴리스티렌 둥근 바닥 유동 세포 분석 튜브로 대조한다. 다른 튜브에 배치하여 다색 염색을 위해 세포의 나머지 부분을 사용합니다.
참고: 일단 실험의 설정이 확립되면 (즉, 레이저 강도, 게이팅 전략), 스테인드되지 않은 제어 및 AMO에 사용되는 세포의 수는 동일하게 사용되는 항체를 감소시킬 수 있다. - 다중 컬러 염색을 위한 단일 세포 현탁액에 CD31-V450(1:400), CD34-V450(1:100), CD45-V450(1:400) 및 CD146-BV711(1:100) 항체를 추가합니다. FMO 컨트롤의 경우 CD34-PE 및 CD146-BV711 및 V450 등방형 제어의 V450 FMO 동등한 볼륨을 추가하십시오. CD31-V450, CD45-V450 및 CD146-BV711 및 PE 등방형 제어의 PE FMO 동등한 볼륨; BV711 FMO 동등한 볼륨의 CD31-V450, CD45-V450 및 CD34-PE 플러스 BV711 등방형 제어.
- 부드럽게 피펫, 또는 와류는 천천히 혼합하고 어둠 속에서 20 분 동안 4 °C에서 튜브를 배양 튜브에 용액을 소용돌이.
- 보상 제어 구슬을 준비합니다. 3개의 폴리스티렌 라운드 바닥 유동 세포 분석 튜브에서 포지티넨 비드 15 μL과 음의 구슬 15μL을 차단 매체의 70 μL에 추가합니다. CD34-PE, CD31-V450 또는 CD45-V450 및 CD146-BV711 항체를 튜브당 하나씩 추가합니다.
- 부드럽게 피펫, 또는 소용돌이 천천히, 구슬과 항체를 혼합하고 어둠 속에서 20 분 동안 4 °C에서 모든 튜브를 배양.
참고: 설명된 절차는 유세포 분석 또는 세포 분류에 사용할 수 있습니다. - 내피 성장 배지 (EGM)로 튜브의 내부 표면을 미리 적시고 각 튜브의 바닥에 약 50 μL의 배지를 남겨 두어 수집 튜브를 준비합니다.
- 항체 배양 후, 세포및 비드를 차단 배지의 2 mL로 세척하여 항체의 과잉을 제거한다.
- 튜브를 200 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 조심스럽게 상류를 흡입하여 용액을 제거하십시오. 세탁 단계를 복제합니다.
- 250 μL당 1 x 106 세포의 최종 농도에서 차단 배지에서 세포를 다시 중단. 차단 배지의 100 μL에서 비드를 다시 중단한다.
- 세포 스트레이너 캡을 사용하여 새로운 폴리스티렌 라운드 바닥 유량 세포 분석 튜브로 세포를 옮니다. 이것은 세포 덩어리의 중단을 허용할 것입니다.
- 모든 세포와 비드 현탁액을 어둠 속에서 얼음의 세포 선별기로 운반합니다.
- 얼룩지지 않은 제어 셀을 실행하여 배경 형광을 설정하고 전압을 설정합니다.
- 보정 제어 튜브를 실행하여 형광 보정을 설정합니다.
- 정방향 산란 영역(FSC-A) 대 측면 분산 영역(SSC-A)을 사용하여 셀을 식별한 다음 정방향 분산 영역(FSC-A) 대 정방향 산란 높이(FSC-H)를 사용하여 단일 셀을 선택합니다.
- 시료의 각 mL에 대해 5 μg/mL의 DAPI를 1 μL, 염색되지 않은 대조군을 추가하여 죽은 세포에 대한 게이팅을 설정합니다(그림2). DAPI 염색 후에는 세탁이 필요하지 않습니다.
- 아이소타입 컨트롤을 실행하여 비특이적 바인딩과 관련된 백그라운드 형광 임계값을 설정하고 게이팅을 설정합니다.
- 여러 가지 색상의 스테인드 샘플을 실행합니다. CD31 및 CD45 음성 세포에 게이팅하여 조혈 및 내피 세포를 배제하십시오. 회비(CD146+ CD34-) 및 출현 세포(CD146- CD34+) 모집단을 수집 튜브로 수집한다(도2).
참고: 최적 생존 세포 수율은 pericytes를 위한 총 살아있는 세포 해리의 대략 2%이고 출현 세포를 위한 1.5%입니다.
6. 세포 배양
- 젤라틴 코팅 배양 플레이트에 30,000 ~ 40,000 세포 / cm2의 밀도로 새로 분류 된 pericytes 및 출현 세포
- 배양 판을 코팅하려면 PBS 용액에서 멸균 0.2 % (w / v) 젤라틴으로 플레이트 영역을 덮습니다 (cm2당 약 100 μL). 실온에서 10 분 동안 배양하고 용액을 제거하십시오. 배양 플레이트 코팅 중에 갓 분류된 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
- 원심분리기는 200 x g에서 5분 동안 갓 채취한 세포를 내피 성장 배지(EGM)의 적당량으로 세포 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시한다. 수집 된 세포의 수가 매우 낮은 경우, 원심 분리를 피하고 수집 된 세포를 직접 플레이트.
- 젤라틴 코팅 플레이트에 세포를 씨앗. 5%CO2에서37 °C에서 배양하십시오.
- 일단 세포가 정착하고 플레이트에 부착되면 (적어도 72 시간 후), EGM을 경피세포 성장 배지 (DMEM보충제 20% 열 불활성화 FCS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민)와 교환하여 pericytes 및 출현 세포 모두에 대해.
- 일단 회구 및 출현 세포가 80%-90% 합류에 도달하면, 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 해리한다. 5 % FCS / PBS로 수집, 5 분 동안 200 x g의 원심 분리기를 다시 포근 세포 성장 배지에서 다시 중단 한 다음 1 : 3 내지 1 : 5 비율 (또는 약 7,000 세포 /cm2)에서코팅되지 않은 폴리스티렌 배양 플레이트 또는 플라스크에 세포를 통과시십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
수동 지질 파괴자의 기계적 해리는 미세 혈관 네트워크를 포위하는 지방세포의 집합체로 구성된 미세 단편화된 지방 조직(MAT)의 생산을 초래하였다(그림3). 젤라틴 임베디드 및 극저온 MAT의 면역형 광형 분석이 구조를 강조하여 내피 세포 마커 Ulex europaeus agglutinin 1 (UEA-1) 수용체에 의해 표시된 혈관 네트워크를 나타내는 것은 주로 작고 모세관과 같은 혈관으로 구성됩니다. 그림 4). 특히 NG2 또는 PDGFRβ를 발현하는 중구는 일반적으로 내피 세포를 내피(그림4)로분포한다. 이러한 데이터는 기계적 미세 단편화 과정이 혈관 간 세포 구획에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인한다. 경막세포, 둘 다 pericytes 및 출현 세포의 존재는, 유세포세포에 의해 확인되었습니다. 전향 산란 영역(FSC-A) 대 측면 산란 영역(SSC-A) 게이트를 셀을 선택하려면(도2A)를사용하였다. 확인된 세포 집단은 단일 세포를 선택하고 살아있는 세포를 선택하기 위해 전방 산란 면적(FSC-A) 대 전방 산란 높이(FSC-H)를 사용하여 추가로 게이트화되었고 DAPI 염색에 대해 음성으로확인되었다(도 2B-C). CD31 및 CD45 마커는 조혈 및 내피 세포를 배제하기 위해사용되었다(도 2C). 마지막으로, 회구는 CD146+ CD34-및 출현 세포로서 CD146-CD34+로 확인되었다(도 2D). 게이팅 전략은 그림 2에요약되어 있습니다. 선별 실험을 위해 동일한 게이팅 전략이 뒤따랐습니다. FACS 정제 된 MAT pericytes 및 출현 세포는 모두 배양에서 형태를 스텔레이하는 스핀들을 나타낸다. 8일 동안의 배양은 MAT가 더 많은 사이토카인(아디포넥틴, CD14, CD31, CD154, 키티나아제 3조, 보색인 D, CD147, GDF-15, IGFBP-2, IL1RA, IP-10, M-CSF, MIF, CXCL9, CCL19, PDGFAA, CCL5, RBP-4, 이완-2, ST2, TF-, 인자(안지오제닌, 안지오스타틴, DPPIV, 엔도글린, HGF, 렙틴, PDGFAB/BB, PlGF, 트롬보스폰딘 2, TIMP4, uPA) SVF보다 시험관내. 더욱이, MAT와 SVF 둘 다에 의해 생성된 사이토카인 및 혈관신생 인자는 MAT 과민제에서 더 풍부했다. 이에 따라, MAT는 콜라게나아제와 함께 소화하고 배양에 배치하여 종래의 SVF15에서관찰되는 것과 유사한 분비를 생산한다. 전 세계적으로, 이러한 모든 데이터는 미세 단편화된 지방 조직이 치료적으로 유리할 뿐만 아니라, 또한 phenotypic 및 기능적 조사를 할 수 있다는 것을 보여줍니다. 특히, MAT 클러스터의 작은 크기는 큰 지방 조직 덩어리로 더 어려울 것이다 배양에서 분비 활동의 시험을 허용합니다.
그림 1: 피하 지방 조직의 미세 단편화의 개략적 표현. Lipoaspirate는 캐뉼라를 사용하여 피하 지방 조직에서 수집됩니다. 수집된 리포아스해적은 근접 시스템 장치를 사용하여 마이크로 단편화된다. 생성된 미세 단편화된 지방 조직(MAT)은 혈관 세포 및 지방세포를 포함한 여러 세포 유형에 의해 구성된다. MAT는 이식 배양 및 면역히스토화학을 포함한 다중 시험, 및 세포 분리에 사용될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MAT에서 혈관 간 세포 분석/선별을 위한 대표적인 게이팅 전략. 전방 산란 영역(FSC-A) 대 측면 산란 영역(SSC-A) 게이트는셀(A)을식별하는 데 사용되며, 그 다음에 순방향 산란 영역(FSC-A) 대 순방향 산란 높이(FSC-H)를 선택하여 단일셀(B)을선택합니다. 실행 가능한 비내피 및 비조혈전 세포는 동일한패널(C)에서각각 DAPI, CD31-V450 및 CD45-V450에 대해 음성으로 게이트된다. 마지막으로, 골반 세포는 회구(CD146+ CD34-) 또는 출현 세포(CD146- CD34+)로 확인된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MAT 형태. 기초 매체에서 배양 된 MAT의 밝은 필드보기. 배율 표시줄 = 1,000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: MAT의 혈관 구조 네트워크. 내피 세포는 UEA-1로 염색된다. A에 있는 박스된 지역은 PDGFRβ 및 NG2에 대하여 항체를 사용하여 염색된 pericytes를 나타내는 B 및 C. 화살촉에서 확대된 것을 보여주었습니다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 논문은 폐쇄 된 시스템 장치를 사용하여 인간 지방 조직을 정상적인 지방 조직 미세 해부학을 나타내는 작은 클러스터로 물리적 분획에 대해 설명합니다.
수동으로 흡인 된 인간 피하 지방 조직 과 식염수 용액은 장치의 격렬한 수동 흔들림시 지방을 밀리미터 단위로 파열시키는 큰 핀볼 스타일의 금속 구체가 들어있는 투명한 플라스틱 실린더에 로드됩니다. 조각. 부착된 필터와 콘센트를 통해 이물질, 혈액 및 무료 지질을 제거할 수 있으며 MAT는 장치에 연결된 주사기로 수집됩니다. 여기서 MAT는 면역 조직 화학, 유세포 분석 및 배양을 위해 성공적으로 처리되었지만, 이 특정 장치는 의학적 관점에서 개발되었지만, 혈관세포 조직 기질 혈관을 극치적으로 대체합니다. 분수 또는 배양 유래 지방 줄기 세포, 실제로 성형 수술 및 다양한 다른 세포 기반 요법에서 매우 효율적인 것으로 입증4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13.
따라서, 지방 조직은 효소 해리 및 시험관 내 배양의 년 후에, 그것의 네이티브 3 차원 구성에 반환 단순한 필러(16)로 그대로 사용. 이는 오가노이드17의증가하는 인기에 의해 예시된 바와 같이 분산된 세포 집단보다는 그들의 타고난 다세포 배열에서 조직을 성장하고 연구하는 일반적인 경향을 따른다.
이 기계 장치를 사용한 지방 조직 단편화는 신뢰할 수 있고 재현 성이 입증되었으며 원래 프로토콜의 수정이 이제까지 필요하지 않았습니다. 실험 연구를 위한 인간 피하 지방의 일반적인 공급은 성형화 장치에 직접 로드되는 미용상의 이유로 수집된 리포아흡기입니다. 그러나 연구 실험실의 사용자에 대한 제한은 처리될 지방 조직이 손으로 부드럽게 흡인되어야 하며, 조직 미세 아키텍처를 가능한 한 온전하게 유지하고, 일상적으로 작동되는 것처럼 진공 펌프로 흡입하지 않아야 한다는 것입니다. 룸. 수동으로 지방을 수집하고자하는 외과 의사가 식별 할 수없는 한, 갓 절제 복부 성형술 잔류 물을 사용할 수 있습니다. 복부 피부의 내부 측면에 부착 된 지방은 키트와 함께 제공되는 주사기로 신중하고 멸균 될 수 있습니다. 이것이 프로토콜의 시작 부분에서 이 단계를 설명한 이유입니다(1단계).
실제로 효소 해리 지방 조직을 통해 MAT의 치료 우수성을 설명하는 것은 무엇입니까? 분획 직후 에이코시아적으로 해리된 MAT의 유세포분석 분석은 중간엽줄기세포(14)의선천적 전신으로 알려진 pericytes의 더 높은 비율을 밝혀냈으며, 총 흡인지방조직(15)과 비교하였다. . 보다 직접적으로, MAT 및 SVF 배양 과민제의 비교 분석은 이전의 분비물, 질적 및 정량적으로, 더 많은 성장 인자 및 사이토카인이 조직 수복에 간접적으로 관여하는 것으로 나타났다. 이들은 면역 염증의 다양한 중재자뿐만 아니라 프로 혈관 신생 인자(15)를포함한다.
이러한 최근의 결과를 넘어, MAT 치료 전위내성의 분자적 기초에 관하여 많은 이해가 남아 있다. 이를 위해, 여기서 설명한 방법은 지방 틈새 에 대한 저충격이고 추가적인 실험 조작에 이상적인 MAT를 생성하는 간단하고 빠른 기술을 나타낸다. 보조 관점에서, 연구는 또한 클리닉에서 MAT의 유용성을 향상시키기 위해 수행됩니다; 이와 관련하여, 미세 단편화된 지방 조직이 지연된 자가 투여를 위해 동결될 수 있는지 또는 동종 투여를 결정할 수 있는지 를 결정하는 것이 우선순위로 나타난다. 마지막으로, 골수, 췌장 또는 골격 근과 같은 다른 조직과 장기가 몇 가지를 인용할 수 있는지 여부를 결정하는 것이 중요할 것입니다. 실험적 개입에.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CT는 리포젬의 창립자입니다.
Acknowledgments
저자는 플로우 세포 측정에 대한 전문가의 도움을 에든버러 대학에서 클레어 크라이어와 피오나 로시에게 감사하고 자합니다. 우리는 또한 조직 표본을 제공함으로써 기여 머레이 필드 병원의 직원에게 감사드립니다.
이 작품은 지방 조직 처리 키트를 공급 영국 심장 재단과 Lipogems에서 보조금에 의해 지원되었다. 인간 성인 조직 샘플은 동남 스코틀랜드 연구 윤리위원회의 완전한 윤리 허가로 조달되었습니다 (참조: 16/SS/0103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Buffered paraformaldehyde (PFA) | VWR chemicals | 9317.901 | |
| 0.9% NaCl Solution | Baxter | 3KB7127 | |
| AlexaFluor 555 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21422 | |
| AlexaFluor 647 goat anti-Rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | |
| Ammonium chloride | fisher chemicals | 1158868 | |
| Antigent Diluent | Life Technologies | 3218 | |
| Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus | BD Biosciences | 560497 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Life Technologies | 4303 | |
| BD LSR Fortessa 5-laser flow cytometer | BD Biosciences | Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V450/50 for DAPI and V450 antibodies; Laser 561nm (Yellow-green) – filter YG582/15 for PE antibodies; Laser 405 nm (violet)/375 nm (UV) – filter V710/50 for BV711 antibodies | |
| Biotinylated Ulex europaeus lectin | Vector Laboratories | Vector-B1065 | |
| BV711 Mouse IgG1, k Isotype Control | BD Biosciences | 563044 | |
| CD146-BV711 | BD Biosciences | 563186 | |
| CD31-V450 | BD Biosciences | 561653 | |
| CD34-PE | BD Biosciences | 555822 | |
| CD45-V450 | BD Biosciences | 560367 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | stock concentration: 5mg/mL |
| Disposable liposuction cannula (LGI 13 G x185 mm – AR 13/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Diva software 306 (v.6.0) | BD Biosciences | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate | Life Technologies | 61965026 | |
| EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKitTM | Lonza | CC-3156 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FlowJo (v.10.0) | FlowJo | ||
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Gelatin | Acros Organics | 410870025 | |
| Lipogems Surgical Kit | Lipogems | LG SK 60 | |
| Mouse anti human- NG2 | BD Biosciences | 554275 | stock concentration: 0.5 mg/mL |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Polystirene round bottom 5 mL tube with cell strainer snap cap | BD Biosciences | 352235, 25/Pack | |
| Polystyrene round bottom 5 mL tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| Rabbit anti human - PDGFRb | Abcam | 32570 | stock concentration: 0.15 mg/mL |
| Streptavidin conjugated-488 | Life Technologies | S32354 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100-5kg | |
| Tissue infiltration cannula (17 G x 185 mm-VG 17/18) | Lipogems | provided in the Lipogems surgical kit | |
| Tris base | fisher chemicals | BP152-500 | |
| Type- II Collagenase | Gibco | 17101-015 | |
| V450 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560373 | |
| Widefield Zeiss observer | Zeiss | Objective used: Plan-Apo 20x/0.8 | |
| Zeiss Colibri7 LED light source ( LEDs: 385, 475, 555, 590, 630 nm) | Zeiss | DAPI: UV, excitation 385 nm; 488: Blue, excitation 475 nm; 555: Green, excitation 555 nm; 647:Red, excitation 630 nm |
References
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering Journal. 7 (2), 211-228 (2001).
- Schäffler, A., et al. Concise review: Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Bianchi, F., et al. A new non enzymatic method and device to obtain a fat tissue derivative highly enriched in pericyte-like elements by mild mechanical forces from human lipoaspirates. Cell Transplantation. 2, 2063-2077 (2013).
- Raffaini, M., Tremolada, C. Micro fractured and purified adipose tissue graft (Lipogems) can improve the orthognathic surgery outcomes both aesthetically and in postoperative healing. CellR4. 2 (4), (2014).
- Cestaro, G., et al. Intersphincteric anal lipofilling with micro-fragmented fat tissue for the treatment of faecal incontinence: preliminary results of three patients. Wideochir Inne Tech Maloinwazyjne. 10 (2), 337-341 (2015).
- Fantasia, J., et al. Microfractured and purified adipose tissue (Lipogems system) injections for treatment of atrophic vaginitis. Journal of Urology Research. 3 (7), 1073-1075 (2016).
- Saibene, A. M., et al. Transnasal endoscopic microfractured fat injection in glottic insufficiency. B-ENT. 11 (3), 229-234 (2015).
- Giori, A., et al. Recovery of function in anal incontinence after micro-fragmented fat graft (Lipogems) injection: two years follow up of the first 5 cases. CellR4. 3 (2), (2015).
- Tremolada, C., et al. Adipose mesenchymal stem cells and regenerative adipose tissue graft (Lipogems) for musculoskeletal regeneration. European Journal of Muscoloskeletal Diseases. 3 (2), 57-67 (2014).
- Striano, R. D., et al. Non-responsive knee pain with osteoarthritis and concurrent meniscal disease treated with autologous micro-fragmented adipose tissue under continuous ultrasound guidance. CellR4. 3 (5), (2015).
- Randelli, P., et al. Lipogems product treatment increases the proliferation rate of human tendon stem cells without affecting their stemness and differentiation capability. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Bianchi, F., et al. Lipogems, a new modality off at tissue handling to enhance tissue repair in chronic hind limb ischemia. CellR4. 2 (6), (2014).
- Benzi, R., et al. Microfractured lipoaspirate may help oral bone and soft tissue regeneration: a case report. CellR4. 3 (3), (2015).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3, 301-313 (2008).
- Vezzani, B., et al. Higher pericyte content and secretory activity of micro-fragmented human adipose tissue compared to enzymatically derived stromal vascular fraction. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 876-886 (2018).
- Coleman, S. R. Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (3), 108S-120S (2006).
- Editorial: An update on organoid research. Nature Cell Biology. 20 (6), 633 (2018).
