Summary
本报告强调了从微胶质或血液巨噬细胞分离细胞外囊泡(EV)的时间顺序要求。微胶质衍生的EV被评价为神经外生长的调节器,而血液巨噬细胞衍生的EV在体外检测中控制C6胶质瘤细胞入侵时被研究。目标是更好地了解这些EV功能作为免疫中介器在特定微环境中。
Abstract
中枢神经系统(CNS)的神经炎状态在生理和病理状况中起着关键作用。微胶质,大脑中的常驻免疫细胞,有时渗入骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM),调节其微环境在中枢神经系统的炎症特征。现在人们承认,免疫细胞的细胞外囊泡(EV)种群充当免疫中介。因此,它们的收集和隔离对于识别其内容,但也评估其对受体细胞的生物影响也很重要。本数据强调了从微胶质细胞或血液巨噬细胞(包括超中心化和大小排除色谱(SEC)步骤中分离EV的时间顺序要求。非靶向蛋白组分析允许将蛋白质特征验证为EV标记,并特征为生物活性EV含量。微胶质衍生的EV也功能地用于神经元的主要培养,以评估它们作为中微子生长中免疫中介的重要性。结果表明,微胶质衍生的EV有助于促进体外微子的生长。同时,血液巨噬细胞衍生的EV在C6胶质瘤细胞的球体培养物中作为免疫中介器,结果表明这些EV在体外控制胶质瘤细胞入侵。本报告强调了评估EV介导免疫细胞功能的可能性,但也了解这种通信的分子基础。这种破译可以促进使用天然囊泡和/或体外制备治疗性囊泡,以模仿中枢神经系统病理学微环境中的免疫特性。
Introduction
许多神经病理学与神经炎症状态有关,这是一种日益被考虑的复杂机制,但由于免疫过程多种多样,并且依赖于细胞环境,因此仍难以理解。事实上,中枢神经系统疾病没有系统地涉及相同的激活信号和免疫细胞群,因此亲炎反应很难作为病理的原因或后果来评价。大脑常驻巨噬细胞称为"微胶质",似乎在神经和免疫系统之间的接口1。微胶质有一个骨髓起源,从原始造物病期间的蛋黄囊派生,以殖民大脑,而外周巨噬细胞从胎儿肝脏在决定性的造物形成过程中,成为外周巨噬细胞2。微胶质细胞与神经元和神经元衍生的胶质细胞(如星形细胞和寡核糖3)通信。最近的几项研究表明,微胶质在中枢神经系统发育和成人组织平衡过程中,以及与神经退行性疾病44、55相关的炎症状态中,都涉及神经元可塑性。否则,血脑屏障的完整性可能会在其他中枢神经系统疾病中受损。免疫反应,特别是在胶质细胞瘤多肠癌中,不仅由微胶质细胞支持,因为血脑屏障通过血管生成过程和淋巴血管的存在6,77重组。因此,在整个肿瘤依赖性血管生成机制8中,脑肿瘤中出现了一个大的骨髓衍生巨噬细胞(BMDM)。癌细胞对渗透的BMDM有显著影响,导致免疫抑制特性和肿瘤生长9。因此,由于细胞起源和激活信号多种多样,免疫细胞与其大脑微环境之间的通信是难以理解的。因此,在生理条件下,对免疫细胞相关分子特征的功能进行鉴定是很有趣的。在这方面,通过释放细胞外囊泡(EV),可以研究免疫细胞和细胞微环境之间的细胞-细胞通信。
在调节健康及病理状况的,免疫功能方面,EV正研究得越来越多。可以考虑两个种群,外体和微囊。它们呈现不同的生物发生和大小范围。外泌体是直径±30~150nm的囊泡,由内体系统生成,在多孔体(MVB)与等离子膜融合期间分泌。微囊直径约为100~1000纳米,由细胞等离子膜14外萌芽产生。由于外泌体与微囊歧视仍难以根据大小和分子模式来实现,因此本文仅使用"EV"一词。CNS的EV相关通信代表了一种祖先机制,因为研究表明它们与无脊椎动物物种(包括线虫、昆虫或阴叶15、16),16有牵连。此外,结果显示,EV可以与不同物种的细胞通信,表明这种机制是一个关键锁系统,首先基于囊泡和受体细胞之间的表面分子识别,然后允许接受调子16,17。16,事实上,EV含有许多分子,如蛋白质(如酶、信号转导、生物成因)、脂质(如神经酰胺、胆固醇)或核酸(例如DNA、mRNA或miRNA),作为受体细胞活动的直接或间接调节剂14。这就是为什么方法学研究也进行免疫细胞分离EV和充分表征他们的蛋白质特征18,19。18,
最早的研究表明,在Wnt3a-或血清素依赖活化20,21,21之后,从原培养大鼠微胶质中释放外体是一种诱导机制。在CNS的功能中,微胶质衍生的EV调节突触神经质释放通过神经元的预显终端促进神经元兴奋性控制22,23。22,微胶衍生的EV也可以传播细胞因子介导的炎症反应在大大脑区域24,25。24,重要的是,收费型受体家族的多样化配体可能会激活微胶质26中特定EV的生产。例如,体外研究表明,LPS激活的微胶质BV2细胞系产生微分EV含量,包括亲炎细胞因子27。因此,通过自身的EV种群,包括EV对受体细胞的影响和EV内容的识别,可以评估中枢神经系统中免疫细胞亚群的功能多样性、微胶质和渗透性BMDM。
我们之前描述了在微胶质和BMDM衍生的EV分离16,19,19后的功能特性的方法。在本报告中,我们建议独立评估微胶质衍生的EV对神经质外生长的影响,以及巨噬细胞衍生的EV对胶质瘤细胞聚合控制的影响。本研究还提出了对EV分数进行广泛的蛋白质组分析,以验证EV分离程序,并识别生物活性蛋白特征。EV内容的有益效果和分子破译可以帮助它们可能操纵,并作为脑疾病的治疗剂使用。
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Protocol
1. 微胶质/巨噬细胞的主要文化
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微胶质的主要文化
- 培养商业大鼠原生微胶质(2 x 106细胞)(见材料表)在Dulbecco的改良鹰介质(DMEM)中补充10%无异体血清、100 U/mL青霉素、100微克/mL链球菌素和9.0克/L葡萄糖,37°C和5%CO2 。2
- 收集48小时培养后的条件介质,然后进行 EV 隔离。
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巨噬细胞的主要培养
- 培养商业大鼠原发性巨噬细胞(1 x 106细胞),在制造商提供的介质中(参见材料表),温度为37°C,CO2为5%,具有无外体血清。2
- 收集24小时培养后的条件介质,然后进行与 EV 隔离。
2. 隔离电动汽车
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EV 与空调介质的预隔离
- 将条件培养介质从微胶质或巨噬细胞培养(步骤 1.1.2 或 1.2.2)转移到圆锥形管中。
- 在室温 (RT) 下,在 1,200 x g下离心 10 分钟,以颗粒细胞。
- 将上清液转移到新的锥形管中。在 RT 时以 1,200 x g的离心机 20 分钟,以消除凋亡体。
- 将上清液转移到 10.4 mL 聚碳酸酯管中,并将管转移到 70.1 Ti 转子中。在 100,000 x g下超离心机,在 4 °C 下 90 分钟,以颗粒 EV。
- 丢弃上清液,在 200 μL 0.20 μm 过滤磷酸盐缓冲液盐水 (PBS) 中重新悬浮含有 EV 的颗粒。
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隔离电动汽车
- 准备自制尺寸排除色谱柱(SEC)
- 空一个玻璃色谱柱(长度:26厘米;直径:0.6厘米)(见材料表),清洗和消毒。
- 在柱的底部放置一个 60 μm 过滤器。
- 用交联的琼脂凝胶过滤基质堆叠柱,以创建直径为 0.6 厘米、高度为 20 厘米的固定相。
- 用 50 mL 0.20 μm 过滤 PBS 冲洗相位。储存在4°C,以便以后在必要时使用。
- 将重新悬浮的 EV 颗粒放在 SEC 柱的固定相的顶部。
- 收集 20 个 250 μL 的连续分数,同时在固定相的顶部继续添加 0.20 μm 过滤 PBS,以防止柱干燥。如有必要,将分数储存在 -20 °C。
注:储存时间超过一周,可在-80°C下进行,以保持分子分析的EV完整性。
- 准备自制尺寸排除色谱柱(SEC)
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SEC分数的矩阵辅助激光脱电电位(MALDI)质谱分析
- 按照第 2.2 节所述,继续 EV 隔离。
- 使用 200 μL 肽校准混合溶液重新悬浮 EV 颗粒(参见材料表)。
- 按照第 2.2.1 节到 2.2.3 节所述,继续进行 EV 收集。
- 使用真空集中器完全干燥分数。
- 用10μL0.1%的三氟酸(TFA)重新组成分数。
- 在 MALDI 抛光钢靶板上将 1 μL 的重组分数与 1 μL 的 β-氰酸 -4-羟基辛酸 (HCCA) 基质混合。
- 使用 MALDI 质谱仪分析所有分数。
- 使用专用软件分析生成的光谱(参见材料表)。
3. 电动汽车的特性
- 纳米粒子跟踪分析(NTA)
注:NTA分析使用纳米粒子跟踪分析仪器(参见材料表)和自动注射器泵进行。- 使用 0.20 μm 过滤 PBS 从步骤 2.2.3 对每个 SEC 分数进行稀释(范围为 1:50 到 1:500)。
- 涡旋消除 EV 聚合的解决方案。
- 将稀释后的溶液放入 1 mL 注射器中,并将其放入自动注射器泵中。
- 调整摄像机设置以屏幕增益级别 (3) 和摄像机级别 (13)。
- 单击"运行"并启动以下脚本。
- 将样品装入分析室(输液率:1,000,15 s)。
- 减少和稳定视频录制的速度流量(输注率:25 为 15 s)。捕获三个连续的 60 s 粒子流视频。
- 在视频分析之前调整摄像机级别 (13) 和检测阈值 (3)。单击"设置"*好的,开始分析,并在分析完成后单击"导出"。
- 在每个分数分析之间,用 1 mL 0.20 μm 过滤 PBS 进行洗涤。
- 电子显微镜分析
- 隔离第 2 节中所述的 EV。
注:不需要无菌条件。 - 重复第 3.1 节以量化 EV。
注:只有正分数用于 EM 分析。 - 使用 50 kDa 离心滤波器(参见材料表)浓缩含 EV 的 SEC 分数。
- 在30μL的2%甲醛(PFA)中重新悬浮浓缩EV。
- 将样品的10μL加载到碳涂层铜网格上。
- 在潮湿的环境中孵育20分钟。
- 重复步骤 3.2.5 和 3.2.6,以很好地吸收网格上的样品。
- 在 RT 中将电网转移到 PBS 中 1% 谷醛的下降 5 分钟。
- 用超纯水清洗样品几次。
- 将样品在冰上对比10分钟,混合4%醋酸酯和2%甲基纤维素(1:9,v/v)。使用滤纸去除混合物的过量。
- 干燥样品,并在200千伏的透射电子显微镜下观察(参见材料表)。
- 隔离第 2 节中所述的 EV。
- 西方斑点分析
- 蛋白质提取
- 重复步骤 3.2.1 到 3.2.3 以隔离和浓缩电动汽车。
- 混合50μL的RIPA缓冲液(150 mM氯化钠[NaCl],50 mM三酯,5 mM乙二醇-双乙酯(2-氨基乙酰乙酯)-N,N,N+,N+-四乙酸[EGTA], 2 mM 乙烯二胺-四乙酸 [EDTA], 100 mM 氟化钠 [NaF], 10 mM 硫酸钠, 1% Nonidet P-40, 1 mM 苯甲烷磺酸素氟化物 [PMSF], 1x 蛋白酶抑制剂) 与 EV 样品 (25 μL 产生的滤芯上的 EV 浓度) 为 5 min 在冰上提取蛋白质.
- 5 s(振幅:500 W;频率:20 kHz)的声波,冰上3次。
- 在4°C时,在20,000 x g处离心,将车辆碎片移走10分钟。
- 收集上清液,用布拉德福德蛋白测定法测量蛋白质浓度。
- 硫酸钠磺酸聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和西印迹
- 将蛋白质提取物 (30 μg) 与 5c 莱姆利样品缓冲液 (v/v) 混合。
- 将蛋白质混合物装入12%聚丙烯酰胺凝胶上。
- 使用 TGS 缓冲液(25 mM Tris pH 8.5、192 mM 甘氨酸和 0.1% SDS)在 70 V 下迁移凝胶中的蛋白质,15 分钟和 120 V 45 分钟。
- 在230 V时将蛋白质转移到半干燥系统中的硝基纤维素膜30分钟。
- 在 RT 时用阻塞缓冲液饱和膜 1 小时(0.05% Tween 20 w/v,5% 奶粉在 0.1 M PBS 中,pH 7.4)。
- 用小鼠单克隆抗人热冲击蛋白90(HSP90)在阻断缓冲液中稀释的抗体(1:100)在4°C下孵育膜过夜。
- 使用 PBS-Tween(PBS,0.05% Tween 20 v/v)清洗膜三次,15 分钟。
- 在RT孵育膜1小时,用山羊马萝卜过氧化物酶-偶联抗小鼠IgG二次抗体稀释在阻塞缓冲液(1:10,000)。
注:仅使用辅助抗体执行负控制。 - 重复洗涤步骤(步骤 3.3.2.7)。
- 使用增强的化学发光 (ECL) 西印迹基板套件显示膜(参见材料表)。
- 蛋白质提取
- 蛋白酶分析
- 蛋白质提取和凝胶内消化
- 重复步骤 3.2.1 到 3.2.3 以隔离和集中电动汽车。重复步骤 3.3.1 进行 EV 蛋白质提取。
- 在 12% 聚丙烯酰胺凝胶的堆叠凝胶中执行蛋白质迁移。
- 在RT中用coomassie蓝色固定凝胶中的蛋白质20分钟。
- 去除每个彩色凝胶片,并切成1毫米3的小片。
- 用每种溶液的300μL连续清洗凝胶片:超纯水15分钟,100%丙酸酯(ACN)15分钟,100m碳酸氢铵(NH4HCO 3)15分钟3,ACN:100 mM NH4HCO 3(1:1,v/v)15分钟,100%ACN连续搅拌5分钟。3
- 使用真空集中器干燥完全凝胶片。
- 在56°C下,使用100 μL的100μL NH4HCO3,含有10mM二硫硫醇,在56°C下1小时,进行蛋白质还原。
- 在 RT 黑暗中,使用 100 μL 的 100 μL NH4HCO3进行蛋白质烷基化,含有 50 mM 碘化酰胺,在黑暗中 45 分钟。
- 用每种溶液的 300 μL 连续清洗凝胶片:NH4HCO3的 100 mM 15 分钟,ACN:20 mM NH4HCO 3(1:1,v/v)15 分钟,100% ACN 持续搅拌 5 分钟。3
- 使用真空集中器完全干燥凝胶片。
- 在20 mM NH4HCO3中,在37°C下过夜,用50μL的胰蛋白素(12.5微克/米)进行蛋白质消化。
- 从凝胶中提取消化的蛋白质,在37°C下,在37°C下用50μL100%ACN提取30分钟,然后在RT中连续搅拌15分钟。
- 重复以下提取程序两次:50 μL 5%TFA在20 mM NH4HCO3溶液中连续搅拌20分钟。
- 加入 100 μL 100% ACN,持续搅拌 10 分钟。
- 使用真空集中器干燥消化的蛋白质,并在 20 μL 中重新悬浮 0.1% TFA。
- 使用带有C18反向相介质的10μL移液器尖端对样品进行脱盐和浓缩肽(参见材料表)和具有ACN:0.1%的福酸(FA)(80:20,v/v)的蛋白精肽。
- 使用真空集中器完全干燥样品,重新悬浮在 20 μL 的 ACN:0.1% FA (2:98, v/v) 用于液相色谱串联质谱仪 (LC-MS/MS)。
- LC-MS/MS 分析
- 将消化的肽加载到LC-MS/MS仪器中,并根据其他地方42详细描述的参数进行样品和数据分析。
- 原始数据分析
- 使用标准参数处理质谱数据,以识别每个样品的蛋白质并将每个样本的已识别蛋白质与定量蛋白质组学软件包进行比较。
- 使用标准参数导出预测蛋白质网络和生物过程的软件中来自EV阳性样品的排他性和过度代表蛋白列表。
- 将分数中已识别的蛋白质列表与 Exocarta 开放访问数据库中的前 100 个 EV 标记进行比较(参见材料表)。
- 蛋白质提取和凝胶内消化
4. 功能性电动汽车效果测定
- PC-12细胞系的Neurite外生长测定
- 培养PC12细胞系在完整的DMEM介质(2 mM L-谷氨酰胺,10%胎儿马血清(FHS),5%胎儿牛血清(FBS),100 UI/mL青霉素,100微克/mL链球菌霉素)。
注:在整个过程中,血清是无外生体。 - 在 24 孔板中添加盖玻璃(所有孔);用聚D-莱辛(0.1毫克/mL)和种子260,000个细胞/孔覆盖板。
- 在5%CO2以下的37°C下孵育细胞。
- 孵育24小时后,将介质改为DMEM分化介质(DMEM与2 mM L-谷氨酰胺,0.1%FHS,100 UI/mL青霉素,100微克/mL链球菌霉素)与1 x 106微胶质EV(从步骤1.1.2起)。
注:在分化介质中,无需微胶质 EV即可执行控制条件。 - 在播种后的第 4 天,用 100 μL 的完整 DMEM 介质加载所有井。
- 在播种后的第7天,用4%PFA在RT上固定细胞20分钟,用PBS冲洗三次(每10分钟)。
- 在4°C下用红胺偶联性邻苯二苯二胺对细胞染色30分钟,用PBS冲洗3次(每次10分钟)。
- 在 RT 上用稀释的 Hoechst 33342 (1:10,000) 染色细胞 30 分钟,然后用 PBS 冲洗 3 次(每次 10 分钟)。
- 将盖玻璃安装在带有荧光安装介质的幻灯片上(参见材料表)。
- 使用共聚焦显微镜分析幻灯片,拍摄每张幻灯片的 5 张随机图像。
- 使用自动定量软件(总神经内粒长度)测量神经衰弱的生长,如其他地方43详细描述的那样。
- 培养PC12细胞系在完整的DMEM介质(2 mM L-谷氨酰胺,10%胎儿马血清(FHS),5%胎儿牛血清(FBS),100 UI/mL青霉素,100微克/mL链球菌霉素)。
- 大鼠原神经元的Neurite外生长
- 用聚D滑苯(0.1毫克/米)和层压(20微克/米L)涂抹8井玻璃滑道。
- 培养大鼠在适当的培养基中的商业原神经元(见材料表),通过每口电镀50,000个细胞,并在5%CO2下37°C孵育细胞48小时。2
注:在整个过程中,血清是无外体的。 - 将 1 x 106微胶质 EV 添加到神经元培养基中,并在 5% CO2低于 5% 的 37°C 下孵育 48 小时以上。
注:在神经元培养基中,没有微胶质EV,控制条件。 - 按照步骤 4.1.6 到 4.1.9 修复和染色细胞。
- 按照步骤 4.1.10 和 4.1.11 分析幻灯片。
- 胶质瘤细胞入侵
- 在全DMEM介质中重新悬浮C6大鼠胶质瘤细胞(含有10%FBS的DMEM,2 mM L-谷氨酰胺,1倍抗生素),在20μL的最终浓度为8,000个细胞时含有5%的胶原蛋白。
注:在整个过程中,血清是无外体的。 - 在60毫米组织培养盘的底部放置5 mL的PBS。将细胞悬浮液的 20 μL(8,000 个细胞)的盖子和沉积液滴倒置到盖子底部。
- 将盖子倒置到PBS填充的底部腔室上,以37°C和5%CO2孵育板72小时2,直到形成细胞球形。
- 将 1 x 108巨噬细胞 EV(从步骤 1.2.2)添加到 2.2 mg/mL 胶原蛋白混合物(2 mL 牛胶原蛋白 I 型溶液 [3 mg/mL],250 μL 的 10 倍最小必需介质 (MEM) 和 500 μL 的 0.1 M 氢氧化钠)。
注:控制条件在胶原蛋白混合物中不含巨噬细胞EV。 - 将含有EV的胶原蛋白混合物分布在24孔板中,用于嵌入细胞球体。
- 将新形成的细胞球体植入每个孔的中心。
- 在 37°C 和 5% CO2下孵育板 30 分钟,将凝胶凝固。
- 此后,在每个井的胶原基上叠加400 μL的完整DMEM介质。
- 在37°C和5%CO2下孵育整个系统共6天。
注:使用 4x/0.10 N.A. 目标使用倒置光学显微镜通过数字摄影监控球体中的细胞入侵。 - 每天获取每口井的图像。
- 使用软件处理图像和量化细胞球形区域的入侵,如前面所述的细节42。
注:入侵和球形区域每天正常化到第0天测量的入侵和球形区域。
- 在全DMEM介质中重新悬浮C6大鼠胶质瘤细胞(含有10%FBS的DMEM,2 mM L-谷氨酰胺,1倍抗生素),在20μL的最终浓度为8,000个细胞时含有5%的胶原蛋白。
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Representative Results
将生物效应归因于细胞外囊泡 (EV) 的主要挑战之一是能够将 EV 与整个培养介质隔离开来。在本报告中,我们提出了一种使用超中心(UC)和大小排除色谱(SEC)的方法,该方法与蛋白质特征的大规模分析相结合,以验证EV标记物并识别生物活性化合物。巨噬细胞或微胶质衍生的EV分别在24小时或48小时培养后与条件介质分离(图1)。
图 1:细胞外囊泡 (EV) 收集和隔离策略。通过连续的离心步骤,从微胶质或巨噬细胞调节介质中分离凋亡体体和细胞碎片。从上清器中,EV 被超中心(UC)隔离。含有EV的UC颗粒被加载到柱上,并通过大小排除色谱(SEC)在20个不同的洗脱分数中分离出来。如进一步步骤(电子显微镜、纳米粒子跟踪分析和蛋白镜分析)中所揭示的,SEC分数被汇集并组织成1F-EV-、2F-EV+和3F-EV-。请点击此处查看此图形的较大版本。
该方法遵循连续的离心步骤:第一个去除细胞,第二个去除细胞碎片和凋亡体。然后,将上清剂转移到新管中,在100,000 x g下进行超中心化90分钟。囊泡与最终UC颗粒中的蛋白质聚合体一起收集。SEC 列用于根据化合物的大小分离化合物并删除聚合(图 1)。为了确认EV的隔离,每个SEC分数都遵循了纳米粒子跟踪分析(图2A)。
图 2:分析 SEC 分数。(A) SEC 分数的纳米粒子跟踪分析 (NTA)。每个 SEC 分数中的粒子总数都随条形图一起显示。橙色条形图显示三个连续的 EV+ 分数 (F5+F7)。(B, C)NTA 腔室的屏幕截图显示 SEC 分数之间的颗粒流存在显著差异。(D) 互补的 MALDI 质谱分析。从另一个含有EV的UC颗粒中,在 SEC 分离之前添加了一个标准控制肽集,以验证 SEC 战略的性能。使用矩阵辅助激光脱硫电化 - 飞行时间 (MALDI-TOF) 分析每个 SEC 分数,以确定标准正分数。在第九个光谱(分数1到9)中,没有观察到任何信号。以下分数(分数 10 到 20)可以检测这些自由标准,从而确认 SEC 程序能够将 EV (F5+F7) 与可溶性组件 (F10_F20) 分离。(E) 作为 EV 标记的初步分析,对 SEC 分数进行西方斑点分析。EV+ 分数 (F5+F7) 作为一个样本 (2F-VE+) 汇集在一起,而 EV- 分数(分别为 F1+F4 和 F8+F20)被汇集在另外两个称为 1F-EV- 和 3F-EV-的样本中。结果表明,与其他分数(1F-EV-和3F-EV-)相比,2F-EV+中的热休克蛋白90(HSP90)(EV正标记)信号的存在,以及细胞裂化酶中作为正控制的存在。(F, G)EV阳性样品(2F-EV+)的电子显微镜分析。连续两次放大的观察显示,EV的尺寸范围约为100nm(白色箭头)和400纳米(箭头)。请点击此处查看此图形的较大版本。
分数 5、6 和 7 中的颗粒数明显高于前一个 (F1+F4) 和以下 (F8+F20)。即使以下分数中观察到了几个粒子(图2B,C),也可以看到这些分数中的粒子流。这种分离并不能阻止 F5+F7 以外的分数可能含有少量囊泡,甚至防止 EV 富分数 F5 到 F7 可能含有分子污染物。为了确保 F5+F7 分数不会污染共吸分子,有必要遵循 SEC 程序中不同化合物的时间程洗脱。为此,控制肽标准被添加到与以前使用的类似UC颗粒中。使用 SEC 程序再次分离此制剂。然后,进行了矩阵辅助激光解电电拉和飞行时间(MALDI)质谱分析,以确定在其中解说标准的SEC分数(图2D)。由于质量范围,本分析只遵循肽标准的离子化产品。结果表明,这些产品在10至20分分数中可检测,表明任何可溶性蛋白质不能与EV(F5+F7)相同的分数中洗脱。这些结果证实了这种方法对将电动汽车与非EV组件分离的兴趣。即使假设 F8_F20 分数可能包含电动汽车的剩余分数,我们在以下实验中决定在称为 2F-EV+ 的单个样本中结合 EV 阳性分数 (F5_F7)。我们还将其他 SEC 分数组合成两个样本,称为 1F-EV-(F1+F4)和 3F-EV-(F8+F20)。出于几个原因,我们分组了三个样本。首先,SEC分数的数量将增加分子分析的时间,也可以增加体外研究的功能。EV阳性SEC分数分别显示较低的颗粒数,也危及分子化合物的检测。同样,认为将分数F8_F20分组以浓缩残余囊泡,并在必要时通过针对EV标记HSP90的西方斑点分析检查其存在更为明智。有趣的是,在分数2F-EV+中检测到HSP90的阳性信号,在细胞裂附器中也作为正控制,但在1F-EV-和3F-EV-样本中未检测到(图2E和补充图S1为对照)。此分析仅确认 2F-EV+ 的兴趣以及以前 SEC 分数的正确管理。为了确认EV隔离,使用电子显微镜进行的附加实验仅分析2F-EV+样品,并允许对具有典型形态和大小异质性在100至400nm之间的EV进行观测(图2F,G)。
验证的另一个关键步骤是蛋白组分析(图3)。我们开发了具有多个目标的整个质谱分析:(i) 通过检测 2F-EV+ 中的大量 EV 标记来确认 EV 的分离,(ii) 最终识别 EV 阴性样品(1F-EV-和 3F-EV-)中的污染物蛋白质,以及 (iii) 描述支持其生物活动的电动汽车的蛋白质含量。
图3:EV阳性和EV阴性样品的蛋白质分析。(A) 经过三次从类似微胶质细胞制剂中分离的分离,样品1F-EV-、2F-EV+和3F-EV-被加载为硫酸钠磺酸酰聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并迁移至堆叠凝胶浓缩蛋白质,以实现其凝胶内消化。然后,通过液相色谱串联质谱仪(LC-MS/MS)分析所得肽,以识别相应的蛋白质。(B) 样本 1F-EV-和 2F-EV+ 之间的已识别蛋白质比较,显示在 2F-EV+ 分数 (522) 中专门检测到的两个分数 (19) 中的常见蛋白质。热图显示2F-EV-和2F-EV+三联各样值(红色)中所有常见蛋白质的相对表示。(C) 比较分数 2F-EV+ 和 3F-EV- 之间的已识别蛋白质,显示三联蛋白 (113) 和专门代表的蛋白质之间的常见蛋白质(2F-EV+ 中的 428 和 3F-EV--中的 11)。热图显示两个群集中的相对表示形式。一(A组)在3F-EV-样本中呈现5个过度代表的蛋白质,第二个(组B)在2F-EV+中呈现108个过度代表的蛋白质。请点击此处查看此图形的较大版本。
从电池条件介质中,UC 和 SEC 程序导致三个样本 1F-EV-、2F-EV+ 和 3F-EV-。相应的蛋白质由硫酸钠多丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)提取和浓缩。在堆叠凝胶中短暂迁移后,样品通过带切开采集,在不同的管中转移,以在凝胶内消化。产品通过在线反向相色谱直接耦合到质谱仪进行分析(图3A)。
以下结果,作为整个过程的一个示例,从48h培养后从微胶质培养介质中获得。原始数据被提交到大鼠蛋白数据库。鉴定的蛋白质在样品1F-EV-和2F-EV+(图3B)和样品2F-EV+和3F-EV-(图3C)之间进行了比较。在第一个比较中,Venn 图显示了在 2F-EV+ 分数中专门检测到的 19 种常见蛋白质和 522 种蛋白质。使用定量蛋白质组学软件进行的分析允许识别常见蛋白质的相对表示。结果显示了热图,其中1F-EV-和2F-EV+三联之间的所有常见蛋白质在2F-EV+样本中代表过多(红色)。在分数2F-EV+和3F-EV-之间的第二次比较中,在三叶合一之间确定了113种常见蛋白质。此外,在2F-EV+中专门检测到428种蛋白质,在3F-EV-中独家发现11种蛋白质。定量分析后,113种常见蛋白质的热图表示突出显示了两个簇,其中A簇在3F-EV-样本中呈现了5个过度代表的蛋白质,而簇B在2F-EV+中呈现了108个过度代表的蛋白质。
428种蛋白质专门代表,2F-EV+中代表过度的108种蛋白质被提交到Exocarta开放访问数据库,以检测EV相关分子。Exocarta 中前 100 个 EV 标记的分析突出显示了 2F-EV+ 中 86 个 EV 相关蛋白质的存在(图 4A)。
图4:2F-EV+样品中蛋白质分析。(A) 向Exocarta数据库提交了536种蛋白质(428种专用蛋白质和108种过度代表的蛋白质)池,以检测EV相关分子。Exocarta 数据库中在前 100 个 EV 标记中检测到的 86 个 EV 相关蛋白质的分子符号。(B) 蛋白质相互作用及其与选定生物过程的关联预测显示2F-EV+样本中的免疫和神经保护途径。请点击此处查看此图形的较大版本。
有趣的是,对簇A中的5种常见蛋白质和3F-EV-中专门代表的11种蛋白质的分析与任何EV标记(未显示的数据)无关。最后,蛋白质相互作用及其与选定生物过程的关联预测显示,免疫中介剂的2F-EV+部分(21%)存在有时参与控制炎症反应 (4.1%)(图4B)。2F-EV+中的EV含量也与神经元发育(16.8%)、神经元分化(5%)相关和控制神经元死亡(3.8%)这是符合以下中性增生测定。
因此,我们选择的策略使访问所有数据成为可能,并允许在然后我们进行的生物测定之前预测EV介导功能(图5)。
图 5:EV 相关 f 解调法。评估了微胶质衍生的EV对神经外生长(上框)的影响,并评估了巨噬细胞衍生的EV对胶质瘤细胞入侵(下帧)的影响。(A, B)在PC-12细胞(A组经许可后从拉沃-罗梅罗等人16号修改)或大鼠原神经元(B)上测量了神经内粒的长度。结果显示,与控制 (Ctrl) 相比,EV (+ EV) 项下的生长显著增加。在大鼠原发性巨噬细胞衍生的EV(C6 + EV)或车辆(C6控制)的存在下,缩放杆 = 20 μm(C, D) C6胶质瘤球菌进入胶原蛋白的时间过程。C6球体3D侵入胶原蛋白被监测和量化长达6天。肿瘤细胞入侵的定量在1、2、3或6天(C)显示,在代表性图像(D)上观察到。刻度柱 = 500 μm。对于中性增生测定,意义通过未配对的学生t-测试(= p < 0.05, = p < 0.01 和 = p < 0.001) 计算。对于入侵测定,其意义是通过单向ANOVA计算的,然后是图基的后临时测试。误差条表示三个独立实验的相对标准误差。请点击此处查看此图形的较大版本。
通过这种方式,在PC-12细胞系和大鼠原神经元上研究了微胶质衍生的EV的神经营养功能。结果表明,对中微子的生长有积极的影响(图5A,B)。与对照条件相比,PC-12和主神经元中中神经网络的长度和/或数量分别增加了约6倍和1.5倍。在另一个背景下,我们还研究了巨噬菌体衍生的EV对脑肿瘤入侵的影响(图5C,D)。它使用嵌入在胶原蛋白矩阵中的3D肿瘤球体进行评估。用C6大鼠胶质瘤细胞生成的球体在胶原蛋白基质中培养6天,含有(或不含)从大鼠巨噬细胞培养培养基中纯化的EV。胶原蛋白基质提供了一种结构,肿瘤细胞可以侵入并扩散出球体。巨噬细胞衍生的EV影响胶质瘤球菌的生长和入侵。经过6天的培养后,与对照相比,EV处理的球体减少了50%。结果表明,巨噬细胞能产生具有抗肿瘤和/或抗侵入性因子的EV,影响胶质瘤的生长。
补充图S1:用于西吹试验的膜图像。(A)图 2E(针对 HSP90 EV 标记)的西方污点的原始图像。(B) 同一膜的庞索染色图像显示 1F-EV-、2F-EV+ 和 3F-EV-样品中蛋白质提取物的正确加载。请点击此处下载此图。
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Discussion
中枢神经系统(CNS)是一个复杂的组织,细胞到细胞的通信调节平衡所需的正常神经元功能30。EV现已被广泛研究,并被描述为细胞到细胞通信的重要分子货物31。他们特别向受体细胞提供一种调子鸡尾酒,从而影响其在健康和病理条件下的功能32。最近的研究表明,EV在中枢神经系统24、33、3433,34中起着至关重要的作用,尤其是那些来自大脑免疫细胞24的35、36。36亲炎免疫反应和抗炎免疫反应之间的平衡至关重要,允许在突触发育和整个生命神经元活动期间保持大脑完整性。本研究讨论了两种截然不同的免疫反应情况:微胶质和神经元之间的关系(i)和(ii)渗透巨噬细胞和胶质瘤细胞之间的关系。首先,微胶质是脑组织中的常驻巨噬细胞,它们在管理微环境变化中起着关键的免疫作用,以确保神经元活动。但过度的亲炎机制可以支持过度激活的微胶质,并导致神经退行性疾病37,38。37,相反,高级胶质瘤需要抗炎特征,并涉及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在肿瘤部位招募。骨髓衍生巨噬细胞(BMDMs)代表与胶质瘤细胞关系密切的大量这些TAM。在肿瘤的影响下,BMDM在体内表现出抗炎和亲肿瘤的轮廓39。这些BMDM如何控制体外肿瘤细胞入侵是本报告的一个关键问题。这就是为什么,巨噬细胞衍生的EV单独用于胶质瘤球菌入侵测定。胶质瘤细胞在共同培养中共同作用,会影响巨噬细胞,从而产生具有抗炎特征的其他EV种群。直接使用免疫EV可以更好作为抗肿瘤剂。因此,免疫细胞维持细胞到细胞之间的交流在特定微环境中,其中炎症平衡受到外部信号40,41,41的强烈影响。对EV介导免疫反应的理解是限制许多疾病的发病机制的巨大挑战。生物活性EV含量的鉴定是了解调节炎过程和提出新的治疗策略的关键42,43。,43
在这项研究中,我们提出了一种由差分超离心过程组成的方法,作为消除细胞碎片、凋亡体和可溶性分子的第一步,结合大小排除色谱,将EV与分子聚合物分离出来。当在生物测定中评估EV种群时,区分EV含量与其他共隔离材料至关重要。这就是为什么我们改进了隔离,以便将 EV- 与非 EV 相关化合物分离。通过在提交给 SEC 程序的控制样本中添加标准蛋白质,我们随后能够通过 MALDI-TOF 将其洗脱分数本地化。由于标准是自由分子,因此它们在全球范围内与与非EV材料相关的样品相关分子聚合体共同进行。因此,实验样品的EV分数在可靠的分离过程中得到验证。此外,我们还开发了双蛋白酶分析策略。除了使用抗HSP90抗体作为EV标记的初步检测外,我们决定通过非靶向检测EV相关蛋白特征来验证正确的EV分馏。事实上,由于某些抗体的特异性和敏感性不足,目前的方法并非故意侧重于检测多种已知的EV标记。在隔离过程中,EV亚群表面某些EV标记的变异性和丰度仍然存在争议。此外,由于缺乏商业抗体,基于抗体的方法可能代表大量生物体的局限性,而EV研究现在是生物学中的热门话题。这种非目标分析允许识别数量较多的分子,这些分子已经被描述为EV标记(Exocarta数据库中前100个EV标记中的86个蛋白质)。最后,这种方法对于验证EV与描述不当的生物体的分离非常有用,前提是检测到的蛋白质能够对已知的EV标记物产生显著的同源性。正如最近描述的,大规模的蛋白酶分析可以替代只使用几个任意标记43。这将改善EV+分数在生物测定中使用前对EV+分数的歧视及其活性成分的识别。
事实上,有必要将EV内容物的特性与生物测定中观察到的效果联系起来。事实上,EV对受体细胞的生物影响表明,需要参与车辆中介或效应器。同样,同样的非靶向分析允许识别生物活性分子。此分析中可能的优化涉及可以识别的分子类型。我们的策略基于对蛋白质特征的大规模分析,并导致了与免疫反应和神经元生存相关的预测性生物通路。必须考虑其他分子家族,例如脂质、mRNA和微RNA。我们目前的研究将这些额外的识别与蛋白质特征联系起来,以便获得这种与EV相关的通信的全球知识。
今后几年将设想采用许多治疗方法。鉴于EV能够轻松跨越血脑屏障并到达病理组织,这些分子货物可以以不同的方式使用。虽然这项研究没有突出EV表面分子,它们的身份仍然是必要的,以便更好地了解对目标细胞和组织的处理过程。我们方法中的蛋白组分析允许访问这些数据。否则,在本报告中,我们将EV的体外生产作为有益的鸡尾酒。我们没有优化最佳条件,以充灭或激活免疫细胞事先。这一点至关重要,因为在组织中,微环境对免疫细胞有直接影响,并最终有助于塑造其EV的生物生成。例如,在胶质细胞瘤的情况下,人们发现癌细胞产生自己的EV,从而有助于将邻近的TAM定向到抗炎配置文件及其局部免疫抑制44,45。44,这就是为什么胶质瘤环境中的巨噬细胞衍生EV不同于单个巨噬细胞培养体中产生的。因此,我们直接使用从单个巨噬细胞培养中单独产生的巨噬细胞源EV来控制胶质瘤球菌入侵,因为巨噬细胞-胶质瘤共同培养对肿瘤的生长没有控制作用。进一步的治疗策略可以通过使用从活化巨噬细胞体体外产生的亲炎和抗肿瘤EV来防止体内免疫抑制。类似的策略可用于神经退行性疾病,通过使用从微胶质衍生的EV,产生有利于神经元生存的神经保护和抗炎反应。总之,对免疫细胞与体内微环境之间EV介导通信的研究是更好地了解发病机制和设计创新治疗方法的关键。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
提交的作品得到了全国教育促进中心、全国教育与教育协会的支持。我们感谢BICeL-校园科学城设施获得仪器和技术建议。我们感谢让-帕斯卡尔·吉梅诺、苏莱曼·阿布卢亚德和伊莎贝尔·富尼耶为大众测量学援助。我们感谢塔尼娜·阿拉伯人、克里斯特尔·范坎普、弗朗索瓦丝·勒马雷克-克罗克、雅科波·维齐奥利和皮埃尔-埃里克·萨乌蒂埃对科学和技术发展所作的重大贡献。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-rad | 4561045EDU | |
Acetonitrile | Fisher Chemicals | A955-1 | |
Amicon 50 kDa centrifugal filter | Merck | UFC505024 | |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
HSP90 α/β antibody (RRID: AB_675659) | Santa-cruz | sc-13119 | |
B27 Plus supplement | Gibco | A3582801 | |
BenchMixer V2 Vortex Mixer | Benchmark Scientific | BV1003 | |
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bradford) | Bio-Rad | 5000006 | |
C18 ZipTips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
C6 rat glioma cell | ATCC | ATCC CCL-107 | |
Canonical tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804000010 | |
CO2 Incubator | ThermoFisher | ||
Confocal microscope LSM880 | Carl Zeiss | LSM880 | |
Cover glass | Marienfeld | 111580 | |
Culture Dish (60 mm) | Sarstedt | 82.1473 | |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | |
EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph | ThermoFisher | ||
Electron microscope JEM-2100 | JEOL | ||
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03777-10G | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
Exo-FBS | Ozyme | EXO-FBS-50A-1 | Exosome depleted FBS |
ExoCarta database (top 100 proteins of Evs) | http://www.exocarta.org/ | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | |
Fetal Horse Serum | Biowest | S0960-500 | |
Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
Fisherbrand Q500 Sonicator with Probe | Fisherbrand | 12893543 | |
FlexAnalysis | Brucker | ||
Fluorescence mounting medium | Agilent | S3023 | |
Formic Acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
Formvar-carbon coated copper grids | Agar scientific Ltd | AGS162-3 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 340855 | |
Hoechst 33342 | Euromedex | 17535-AAT | |
Idoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
InstantBlue Coomassie Protein Stain | Expedeon | ISB1L | |
Invert light microscope CKX53 | Olympus | ||
L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
LabTek II 8 wells | Nunc | 154534 | |
Laemmli 2x | Bio-Rad | 1610737 | |
Laminin | Corning | 354232 | |
MaxQuant software (proteins identification software) | https://maxquant.net/maxquant/ | ||
MBT Polish stell | Brucker | 8268711 | |
MEM 10x | Gibco | 21090-022 | |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M6385-100G | |
MiliQ water | Merck Millipore | ||
Milk | Regilait | REGILAIT300 | |
Mini PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | |
MonoP FPLC column | GE Healthcare | no longer available | |
Nanosight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | |
NanoSight NTA software v3.2 | Malvern Panalytical | ||
NanoSight syringe pump | Malvern Panalytical | ||
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
Nonidet P-40 | Fluka | 56741 | |
Nunc multidish 24 wells | ThermoFisher | 82.1473 | |
Paraformaldehyde | Electro microscopy Science | 15713 | |
PC-12 cell line | ATCC | ATCC CRL-1721 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Peptide calibration mix | LaserBio Labs | C101 | |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
Perseus software (Processing of identified proteins) | https://maxquant.net/perseus/ | ||
Phalloidin-tetramethylrhodamine conjugate | Santa-cruz | sc-362065 | |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 14190094 | no calcium, no magnesium |
pluriStrainer M/ 60 µm | pluriSelect | 43-50060 | |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | |
Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | 355651 | |
Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830-20TAB | |
PureCol | Cell Systems | 5005 | |
Q-Exactive mass spectrometer | ThermoFisher | ||
rapifleX mass spectrometer | Brucker | ||
Rat cortical neurons | Cell Applications | R882N-20 | Cell origin : Derived from cerebral cortices of day 18 embryonic Sprague Dawley rat brains |
Rat Macrophage & Microglia Culture Medium | Cell Applications | R620K-100 | Cell orgin : Normal healthy Rat bone marrow |
Rat primary macrophages | Cell Applications | R8818-10a | |
Rat primary microglia | Lonza | RG535 | |
Sepharose CL-2B | GE Healthcare | 17014001 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Slide | Dustsher | 100204 | |
Sodium Chloride | Scharlau | SO0227 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | S7920-100G | |
Sodium hydroxide | Scharlab | SO0420005P | |
Sodium pyrophosphate | Sigma-Aldrich | S6422-100G | |
SpeedVac Vacuum Concentrator | ThermoFisher | ||
String software (functional protein association networks) | https://string-db.org/ | ||
SuperSignal West Dura extended Duration Substrate | ThermoFisher | 34075 | |
Syringe 1.0 mL | Terumo | 8SS01H1 | |
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris | Interchim | UP031657 | |
Tris-Glycine | Euromedex | EU0550 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Ultracentrifuge Rotor 70.1 Ti | Beckman Coulter | 342184 | |
Uranyl acetate | Agar Scientific Ltd | AGR1260A | |
Whatman filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10347510 | |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C2020-25G |
References
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