Summary
يهدف هذا البروتوكول إلى توضيح كيفية حقن خليط الحمض النووي/DOTAP بالميكروين في عيون الأجنة القديمة من Xenopus laevis في يوم من الأيام، وكيفية تصوير وإعادة بناء البروتين الفلورسنت الأخضر الفردي (GFP) الذي يعبر عن الأربور اللافسونية البصرية في العقول المتوسطة التكتال سليمة ، والذين يعيشون Xenopus الضفادع.
Abstract
الإسقاط البصري الأساسي من الضفادع المائية Xenopus laevis بمثابة نظام نموذج ممتاز لدراسة الآليات التي تنظم تطوير الاتصال العصبية. أثناء إنشاء الإسقاط الريتينو تيكتال، تمتد المحاور البصرية من العين وتنتقل عبر مناطق متميزة من الدماغ للوصول إلى الأنسجة المستهدفة، وtectum البصرية. مرة واحدة axons البصرية تدخل tectum، فإنها تضع الأشجار الطرفية التي تعمل على زيادة عدد الاتصالات متشابك أنها يمكن أن تجعل مع الخلايا العصبية المستهدفة في tectum. هنا، ونحن نصف طريقة للتعبير عن الحمض النووي ترميز البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)، واكتساب وفقدان وظيفة الجينات المنشآت، في الخلايا العصبية البصرية (خلايا العقدة الشبكية) في أجنة Xenopus. نحن نشرح كيفية حقن الحمض النووي مجتمعة / lipofection الكاشف في براعم العين من الأجنة القديمة يوم واحد مثل أن يتم التعبير عن الجينات الخارجية في عدد واحد أو صغير من الخلايا العصبية البصرية. عن طريق وضع علامات على الجينات مع GFP أو الحقن المشترك مع بلازميد GFP، يمكن تصوير الأشجار axonal الطرفية من الخلايا العصبية البصرية الفردية مع الإشارات الجزيئية المتغيرة مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تصور مباشرة في العقول سليمة، وحيا Xenopus الضفادع عدة أيام في وقت لاحق، ومورفولوجيا بهم يمكن أن تكون صورة مباشرة في العقول يمكن قياسها كمياً. يسمح هذا البروتوكول بتحديد الآليات الجزيئية المستقلة للخلايا التي تكمن وراء تطوير مشتل أكسون بصري في الجسم الحي.
Introduction
أثناء تطور الجهاز العصبي، تتنقل محاور الخلايا العصبية المتبصرة عبر مناطق مختلفة من الدماغ للوصول إلى المناطق المستهدفة. عندما تغزو المحاور الأنسجة المستهدفة، فإنها تنشئ اتصالات متشابكة مع الخلايا العصبية المستهدفة postsynaptic. في العديد من أنواع الخلايا العصبية، والمحاور زيادة عدد والمدى المكاني للاتصالات متشابك أنها يمكن أن تجعل من خلال وضع شبكات من فروع المحطة الطرفية أو الأشجار1. الإسقاط الريتينو تيكتال من الضفادع المائية Xenopus laevis هو نموذج الفقاريات قوية لفحص الآليات الكامنة وراء مشتل محور أكسون المحطة الطرفية والاتصال متشابك2،3،4 . يمكن ملاحظة GFP الفردية التي تعبر عن الأشجار axonal البصرية مع الإشارات الجزيئية العادية والمتغيرة مباشرة في سليمة، وحيا Xenopus الضفادع 5،6،7،8. للتعبير عن GFP وحدها أو جنبا إلى جنب مع كامل طول أو الإصدارات المقتطعة من الجينات في عدد قليل من الخلايا العصبية البصرية، ونحن نستخدم تقنية تنطوي على الحقن المجهري / lipofection من الحمض النووي في براعم العين من يوم واحد القديمة Xenopus الأجنة9، 10.وقد وضعت هذه التقنية في الأصل لدراسة آليات pathfinding axon البصرية في الضفادع Xenopus الشباب، ومنذ ذلك الحين تم تطبيقها من قبلنا والآخرين لتحديد الخلايا المستقلة الآليات الجزيئية الكامنة وراء axon البصرية التشتل في Xenopus الضفادع5،6،7،8،9،10.
وقد وضعت تقنيات بديلة للتعبير عن الجينات الخارجية في عدد قليل من الخلايا العصبية البصرية في الأنواع النموذجية الأخرى، وكذلك في X. laevis. ومع ذلك، فإن كل من هذه النهج يطرح تحديات وقيود بالمقارنة مع الحقن المجهري للحمض النووي/الكاشف في براعم العين من أجنة Xenopus. في الفئران، يمكن استخدام الجينات للتعبير عن الجينات في عدد صغير من الخلايا العصبية البصرية، ولكن توليد الفئران المعدلة وراثيا مكلفة وتستغرق وقتا طويلا والفئران المعدلة وراثيا غالبا ما تكون موجودة مع الآثار الجانبية غير المرغوب فيها11. كما يمكن إنشاء أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا التي تعبر عن الجينات الخارجية في الخلايا العصبية البصرية عن طريق حقن بلازميدات في الأجنة مرحلة الانقسام في وقت مبكر12. ومع ذلك، تتطلب هذه العملية استنساخ المروج محددة للتعبير عن الجينات في نمط الفسيفساء في الخلايا العصبية البصرية في يرقات حمار وحشي12. كما أن تواتر التعبير عن الحمض النووي الخارجي في الخلايا العصبية البصرية في أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثياً أقل إلى حد ما (<30%) بالمقارنة مع ضفادع Xenopus التي تم حقنها بالحمض النووي/ الكاشف الليبوسومي (30−60%)12 . في ovo الكهروبورة كما استخدمت للتعبير عن الجينات في أعداد صغيرة من الخلايا العصبية البصرية في الفراخ13. ومع ذلك، فشل هذا الإجراء في توصيف كامل الآليات التي تضع الإسقاطات البصرية لأن مشتل أكسون بصري لا يمكن أن يصور في الأجنة الفرخ الحية سليمة. وأخيرا، استخدمت عدة مختبرات الكهربائي لنقل الجينات إلى عدد صغير من الخلايا العصبية البصرية في الضفادع Xenopus 14،15. ومع ذلك، يتطلب الكهربة الاستفادة المثلى من المعدات والبروتوكولات (محفز، والأقطاب الكهربائية، والأنماط المكانية والزمنية لنبضات الأمواج) بما يتجاوز تلك المستخدمة للحقن المجهري لكاشف الحمض النووي/lipofection في براعم العيون لأجنة Xenopus.
نحن وآخرون استخدمنا سابقا تقنية الحقن المجهري / lipofection من الحمض النووي في براعم العين من أجنة Xenopus لتحديد الخلايا المستقلة آليات الإشارات التي تنشئ مشتل axonالبصرية 5،6، 7 , 8.استخدمنا في البداية هذا النهج لتشريح وظائف الكادرين وWnt محول البروتين β-catenin في مشتل axonal البصرية في xenopus الضفادع5،6. في دراسة واحدة، أظهرنا أن بيتا-الكاتينين ملزمة لα-catenin وPDZ مطلوب، على التوالي، لبدء وتشكيل الأشجار axonal البصرية في الجسم الحي5. في تقرير ثان، أظهرنا أن المجالات الملزمة بيتا-الكاتينين لα-catenin و GSK-3β عكس أنماط الإسقاط تحوير من الأشجار الأنبية البطينيةaxonal 6. في الآونة الأخيرة، حددنا الأدوار لعامل Wnt، الورم الحميد بوليبوسيس القولونية (APC)، في تنظيم السمات المورفولوجية من الأشجار السمعية في Xenopus الضفادع7. من خلال المشاركة في التعبير عن N-الطرفية والمجالات المركزية من APC أن تعدل بيتا-catenin الاستقرار وتنظيم microtubule جنبا إلى جنب مع GFP في الخلايا العصبية البصرية الفردية، حددنا الأدوار المشتركة والمتميزة لهذه المجالات التفاعل APC على رقم الفرع، طول، وزاوية في الأشجار axonal البصرية في الجسم الحي7. واستخدم مختبر آخر تقنية الحقن المجهري/الشفة لتحديد الأدوار المستقلة للخلايا للإشارة بواسطة مستقبلات BDNF، TrkB، في أرل axonal البصرية في الضفادع Xenopus 8. وأظهرت هذه المجموعة أن التعبير عن TrkB المهيمنة السلبية المتفرعة المضطربة والنضج متشابك في الأشجار أكسون البصرية الفردية في الجسم الحي8. بشكل عام، فإن تقنية lipofection في Xenopus قد أضاءت بالفعل الأدوار المحددة للجينات المختلفة في المتفرعة من axon البصرية في البيئة الأصلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة تورو كاليفورنيا (بروتوكول # TUCA003TE01X).
1. الحصول على X. laevis الأجنة
- الحصول على X. laevis الأجنة عن طريق التزاوج الطبيعي من أزواج من الذكور والإناث الضفادع الكبار تستعد مع gonadotropin chorionic الإنسان (قوات حرس السواحل الهايتية)، عن طريق الإخصاب في المختبر من البيض تسليط من الضفادع البالغة الإناث تستعد مع قوات حرس السواحل الهايتية، أو عن طريق طلب مباشرة(جدول المواد).
-
ديجيلي الأجنة التي تم الحصول عليها مع محلول السيستين 2٪ في درجة حرارة الغرفة (جدول المواد)16.
- جمع 50-100 جنين في طبق بيتري كبير. إزالة الحل الأجنة في عن طريق decanting أو باستخدام ماصة نقل البلاستيك. إضافة 25 مل من محلول السيستين 2٪ (0.5 غرام سيستين في 25 مل ddH2O، والحموضة إلى 8.0) إلى الطبق الذي يحتوي على الأجنة.
- تدور بلطف طبق بيتري الذي يحتوي على الأجنة في محلول السيستين حتى تسقط معاطف هلام الأجنة وتجمع الأجنة في كتلة في وسط الطبق (5-10 دقائق). عند هذه النقطة، صب ببطء وبلطف قبالة محلول السيستين في كوب النفايات. الحرص على عدم صب الكثير من الأجنة في الكأس النفايات جنبا إلى جنب مع محلول السيستين.
- شطف الأجنة في طبق بيتري 6X مع 10٪ تعديل مارك الرينجر الحل (MMR) أو غيرها من الحلول المناسبة (على سبيل المثال، تعديل حل بارث، MBS)، دوامة الطبق في كل مرة يتم استبدال الحل.
- زراعة الأجنة في 10٪ MMR حتى تصل إلى مراحل النمو 22-2417. يمكن احتضان أجنة Xenopus في درجات حرارة تتراوح بين 15-25 درجة مئوية. معدل تطور الأجنة يعتمد على درجة حرارة يتم احتضانها في17.
ملاحظة: عادة ما تصل أجنة Xenopus المطلوبة من كتالوج إلى المختبر في مراحل النمو 20-24، بحيث يمكن أن يتم dejellied وحقنها بالدقيقة على الفور.
2. إعداد بلازميدات الحمض النووي وصنع خليط الحمض النووي / DOTAP
- Subclone الحمض النووي التعبير يبني في ناقلات التعبير Xenopus pCS2 + أو pCS2 + MT أو مشتقاتها (شيدت أصلا من قبل D. تيرنر وR. روب)5،6،7. تحتوي متجهات pCS2+ على مروج معدل للفيروس المضخم للخلايا (CMV) يسهل التعبير الجيني في الضفادع.
- تضخيم pCS2 بلازميدات تحتوي على GFP و / أو الجينات ذات الأهمية مع مجموعات miniprep(جدول المواد)بعد الإجراء القياسي. في الخطوة الأخيرة من بروتوكول الإلتوائي، قم بإجراء عملية تشعب تسلسلية للحمض النووي إلى ddH2O لتحقيق تركيز نهائي قدره >1 ميكروغرام/ميكرولتر.
- تخزين جميع بلازميدات pCS2 عند -80 درجة مئوية حتى تكون جاهزة لإجراء تجربة حقن دقيق/lipofection، أي عندما تكون الأجنة في مراحل النمو 22-24.
- إذابة بلازميدات الحمض النووي لتكون lipofected في درجة حرارة الغرفة. مباشرة قبل lipofection، لفترة وجيزة بلازميدات الحمض النووي الطرد المركزي. وهذا سيمنع التعجيل من تشكيل في خليط الحمض النووي /DOTAP التي يمكن أن تسد غيض من ماصة microcapillary.
- الجمع بين بلازميدات الحمض النووي مع كاشف الانف الشحم ية DOTAP(جدول المواد)بنسبة 1:3 (ث / الخامس)9،10. على سبيل المثال، نقل 2 ميكروغرام من الحمض النووي إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل وإضافة 6 ميكرولتر من DOTAP، أو نقل 3 ميكروغرام من الحمض النووي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإضافة 9 ميكرولتر من DOTAP.
- مرة واحدة يتم الجمع بين الحمض النووي وDOTAP، نفض الغبار بلطف أنبوب microcentrifuge لخلط الحل. يجب أن يصبح حل الحمض النووي/DOTAP غير شفاف قليلاً بعد الخلط.
- إذا كان اثنين من بلازميدات أن تكون lipofected معا (على سبيل المثال، pCS2-GFP مع بلازميد pCS2 الثاني الذي يحتوي على نسخة مقتطعة أو كاملة الطول من الجينات) في الخلايا العصبية البصرية، أولا الجمع بين اثنين من بلازميدات (بعد تسنتر لفترة وجيزة كل منهما) في نسبة 1:1، ومن ثم إضافة DOTAP بنسبة 1:3 (ث / v). على سبيل المثال، الجمع بين 1 ميكروغرام من pCS2-GFP مع 1 ميكروغرام من بلازميد pCS2 الثانية ثم إضافة 6 ميكرولتر من DOTAP.
ملاحظة: وقد أظهرت الدراسات أن lipofection من اثنين من بلازميدات في براعم العين من أجنة Xenopus في هذه المراحل التنموية سوف يؤدي إلى التعبير المشترك في الخلايا العصبية البصرية الفردية9،10.
3. تحميل إبرة الحقن المجهري مع الحمض النووي / DOTAP
- مقطع بلطف غيض من ماصة الزجاج سحبت microcapillary مع ملقط غرامة(جدول المواد).
- الردم الماصة الزجاجية microcapillary مع الزيوت المعدنية باستخدام ميكروفيل بحيث يظهر قطرة صغيرة من الزيوت المعدنية في طرف مقطع من micropipette. ملء ماصة microcapillary في منتصف الطريق مع الزيوت المعدنية.
- قم بتحميل الماصة الزجاجية الممتلئة الآن بالزيت المعدني في حامل حقن مناسب متصل بحاقن. إذا كنت تستخدم حاقن(جدول المواد)،وإخراج الغطاس في منتصف الطريق قبل تحميل ماصة microcapillary على ذلك. مرة واحدة يتم إرفاق ماصة microcapillary بشكل آمن إلى حاقن، وتوسيع الغطاس إلى أقصى حد للتأكد من أن ماصة microcapillary تعلق بقوة على حاقن ولا تتحرك مع تمديد الغطاس.
- نقل قطرة 3 ميكرولتر من خليط الحمض النووي /DOTAP إلى مربع قطع (1 بوصة مربع) ورقة من ورقة البارافين.
- تحت مجهر تشريح ستيريو، نقل غيض من ماصة microcapillary الزجاج في انخفاض الحمض النووي / DOTAP.
- تمتص ببطء انخفاض الحمض النووي / DOTAP في ماصة الزجاج microcapillary باستخدام خيار التعبئة على جهاز الحقن. كما يتم تحميل السائل في ماصة microcapillary، فإن انخفاض الحصول على أصغر. بسبب التعتيم الطفيف من محلول الحمض النووي / DOTAP، يجب أن تكون الحدود بين الزيوت المعدنية والحل DNA / DOTAP مرئية في ماصة الشعيرات المجهرية الزجاج(الشكل 1). إذا لزم الأمر، التوقف عن ملء ماصة microcapillary بشكل دوري للسماح للضغط في ماصة الشعيرات المجهرية الزجاج لإعادة معايرة.
الشكل 1: صور من الماصة المجهرية. تظهر الصور ماصة microcapillary على جهاز الحقن، قبل(أ)،وبعد(B)ملء مع الحمض النووي / DOTAP. السهام المفتوحة، غيض من الغطاس في ماصة microcapillary(A، B). سهم مغلق، خط بين الزيوت المعدنية والحمض النووي / DOTAP في ماصة microcapillary شغلها(B). شريط مقياس = 1 ملم.
4. حقن الحمض النووي /DOTAP في براعم العيون من 1 يوم القديمة Xenopus الأجنة
- يُخْفَدُ تَخَيّنُ يدوياً عشرة أجنة من المرحلة 20-24 Xenopus مع ملقط ناعم في طبق بيتري 10 مم مملوء بـ 0.1x MMR. فهم المغلف vitelline في الخصر لتجنب إصابة الأجنة. مع ملقط في كل من الأيدي اليسرى واليمنى للمجرّب، قم بفرقعة مغلف فيتيلين وحرر الجنين من مغلف فيتيلين. الحرص على عدم إصابة الأجنة عند إزالة المغلف vitelline.
ملاحظة: ابتداء من المرحلة 20، تطور أجنة Xenopus مسافة بادئة أو "خصر" بين النصفين الأمامي والخلفي للجنين. هذا الخصر يسمح بفجوة لتشكيل بين المغلف vitelline والجنين في هذا الموقف. - استخدم ماصة نقل بلاستيكية مع طرف قطع لنقل 5-10 أجنة من المرحلة 22-24 إلى طبق بيتري عيار 10 مم مملوء بـ 1x MMR.
ملاحظة: حل الملح العالي في 1X MMR يسهل الشفاء من الجروح ثقب التي سوف تنتج عن الحقن المجهري. - تحت المجهر المجسم، فهم واحد من الأجنة المنحرفة في طبق بيتري مع ملقط في كل يد، وترتيب الجنين بحيث يتم توجيه القطب الأمامي حتى في مجال الرؤية. توجيه الجنين بحيث يكون الكذب أفقيا واحد من براعم العين (اليسار أو اليمين) يواجه صعودا.
- تحت المجهر المجسم، عقد الجنين مع ملقط في يد غير المهيمنة التجرب، ومع اليد المهيمنة للمجرّب إدخال غيض من micropipette الزجاج في العين (من الجانب البطني أو الردور، اعتمادا على نصف الجنين الذي يجري حقنه حاليا)، فقط تحت البشرة(الشكل 2). حقن ما بين 70-210 نمل من محلول الحمض النووي/DOTAP. ويمكن القيام بذلك في عدة نبضات، اعتمادا على حجم النبض يتم تعيين حاقن إلى (عادة 70 نمل).
ملاحظة: عمق الحقن مهم جدا ً للlipofection في الخلايا العصبية البصرية. إذا تم إدخال موضع طرف الشعيرات الدقيقة بشكل صحيح بشكل سطحي جدا في العين ، ثم بعد الحقن المجهري ، فإن البشرة الرمادية التي تقع فوق العين تنتفخ. إذا كان الموقف عميق جدا، فإن العين الرمادية لا تظهر أي تغييرات، وتواتر التعبير عن الحمض النووي في الخلايا العصبية البصرية سوف تكون أقل. - تحويل الجنين حولها وإجراء نفس الحقن المجهري في العين على الجانب المقابل للجنين.
- حقن كل من براعم العين من 6-10 (أو أكثر) الأجنة في كل تجربة.
- بعد الحقن المجهري، تخزين الأجنة في طبق بيتري مع 1X MMR لمدة 30 دقيقة تقريبا لتسهيل التئام الجروح.
- بعد 30 دقيقة، نقل الأجنة المحقونة إلى حل MMR 0.1x مع عامل تبييض 0.001٪ (فينيلثيوكارباميد) للحد من التصبغ. زراعة الأجنة المغطاة لمدة خمسة أيام تقريباً، حتى تطورت الأجنة إلى ضفادع في المراحل 46-4716.
الشكل 2: ترسيم حدود منطقة العيون للحقن المجهري. المخطط(A)وphotomicrograph(B)من X. laevis الجنين في مراحل النمو 22/23 تظهر منطقة العين التي ينبغي أن تستهدف للحقن المجهري (يسلط الضوء الأحمر). شريط المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. تصوير GFP التعبير عن الأشجار البصرية Axonal في سليمة، الضفادع الحية
ملاحظة: عندما تصل الضفادع التي تم غليها بالحمض النووي إلى مراحل النمو 46-47، فإنها جاهزة للتصوير.
- قبل التصوير، يجب أن يتم التخدير الضفادع. لالتخدير الضفادع، نقل الضفادع lipofected إلى محلول ثلاثي الكوكايين 0.02٪ في ddH2O في طبق بيتري 10 ملم. انتظر 5-10 دقائق حتى تصبح الضفادع غير متحركة. تحقق من أن الضفادع لا تزال على قيد الحياة من خلال مراقبة قلوبهم الضرب تحت مجهر تشريح ستيريو.
- ضع عمود امن واحد في غرفة سيليكون مصنوعة حسب الطلب على شريحة زجاجية وختم مع غطاء. يجب أن يميل التادبول قليلا بحيث يكون جانب واحد (يسار أو يمين) من رأسه زاوية صعودا وبالكاد يمس زلة الغطاء.
- فحص نصف الدماغ الأوسط التكتال الظهري من التادبول الذي يميل صعودا في التكبير منخفضة لGFP التعبير عن الأشجار axonal البصرية.
ملاحظة: يمكن استخدام مجهر مستقيم واسع النطاق مجهز بإضاءة قابلة للإزالة وعدسة موضوعية أبوكرومية(جدول المواد)لفحص الأشجار الفلورية. - إذا كان نصف الكرة الأرضية tectal يحتوي على ما بين واحد إلى ثلاثة GFP التعبير عن الأشجار axonal البصرية، والتقاط z-سلسلة من الصور من هذه الأشجار باستخدام تباين عال 40X الهواء هدف مسافة العمل الطويلة(جدول المواد). لكل شجرة محورية، التقط 10-20 شريحة من الفئة z على فترات 1.5 ميكرومتر.
- من أجل عرض أشجار أكسون على الجانب الآخر من الدماغ الأوسط tectal، إعادة تحميل تادبول في غرفة السيليكون بحيث يميل إلى الجانب الآخر وختم مع زلة غطاء. ثم كرر الخطوتين 5.3 و 5.4.
6. إعادة بناء والقياس الكمي لمورفولوجيا الشجرة الأكسونالية البصرية
- حدد مكدس الصور الذي يحتوي على ما بين واحد إلى ثلاثة GFP التعبير عن الأشجار axonal البصرية.
- استخدم أداة الرسم الحر في برنامج تحرير الرسوم البيانية(جدول المواد)لتتبع الجزء من كل شجرة بصرية axonal مرئية في كل شريحة z. تتبع من خلال قطع من كل شجرة واضحة في كل شريحة z سوف تخلق إسقاط 2D دقيقة من الشجرة. ويمكن استخدام ألوان مختلفة لتتبع GFP متميزة التعبير عن الأشجار axonal البصرية.
- جعل جميع القياسات مورفومترية على إعادة الإعمار 2D من الأشجار axonal، مع الإشارة إلى z-سلسلة الأصلي من الصور عند الحاجة7. باستخدام برنامج الصورة J(جدول المواد)،قياس المعلمات المورفولوجية مثل عدد الفروع (أي عدد نصائح الفروع أو نقاط الفرع)، إجمالي طول فرع الشجرة، طول الفرع، طول الشجرة، طول وعرض الشجرة، الشكل العام للشجرة (L/W) نسبة، التعميم)، وزاوية الفروع7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينتج عن البروتوكول الموصوف في هذه المقالة معدل نجاح 30-60% من أجنة Xenopus المحقونة التي تعبر عن GFP (بمفردها أو مع بنيات الحمض النووي الإضافية) في شجرة واحدة إلى عشرة أشجار بصرية ذات محور. في الشكل 3، نعرض الصور التمثيلية البؤرية لـ GFP التي تعبر عن السيطرة والأشجار البصرية المُصاقة في أعمدة Xenopus سليمة من دراستنا التي نشرت مؤخرًا7. لهذه الدراسة، قمنا باستنساخ اثنين من المسوخ المجال من APC (APCNTERM وAPCβ-cat) في بلازميدات pCS2، وشارك في حقن هذه البلازميدات جنبا إلى جنب مع pCS2-GFP وضع العلامات بلازميد في براعم العيون من الأجنة Xenopus القديمة يوم واحد. ويبين الشكل 4 نتائج العديد من القياسات الكمية التي قمنا بها بشأن عمليات إعادة بناء الرقابة والأشجار ذات الفأس المتحولة من نوع APC، بما في ذلك عدد الفروع، وطول فرع الشجرة الإجمالي، ومتوسط طول الفروع.
الشكل 3: الصور التمثيلية لـ GFP التي تعبر عن السيطرة والأشجار البصرية المُسخَّنة. (أ)مخطط من المتحولين من APC N-الطرفية ومسوخ المجال المركزي التي تم استنساخها في بلازميدات pCS2. (B)الصور التمثيلية المتّسة من GFP واحد وGFP-APC متحولة الأشجار البصرية axonal في tecta من سليمة، يعيش Xenopus الضفادع. (C)إعادة بناء الصور z-سلسلة من السيطرة GFP وAPC مسوخ الأشجار axonal البصرية. قضبان المقياس = 30 ميكرومتر (B)، 40 ميكرومتر (C). تم تعديل هذا الرقم من جين وآخرون7. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التحديد الكمي لمورفولوجيا تُعيد بناء الأربور الفأسية المتحولة. قطع من عدد من الفروع(أ)،إجمالي طول فرع الشجرة(B)،ومتوسط طول الفرع(ج)تؤكد الاختلافات الملحوظة بين السيطرة وAPC متحولة التعبير عن الأشجار axonal. تظهر البيانات الموجودة في اللوحات A−C كنسبة مئوية من متوسط عنصر التحكم مع SEM. * يشير شريط البيانات أو السطر أعلاه إلى p < 0.05. تظهر قطع إضافية مبعثرة لعدد من الفروع مقابل متوسط طول الفرع مع خطوط الانحدار ارتباط عكسي بين هذه المعلمات في الأربور الإبطية البصرية التي تعبر عن مجالات APC(D, E). أرقام العينة:(أ)GFP-12، APCNTERM-18 APCβ-cat-25؛ (ب)GFP-12, APCNTERM-16, APCβ-cat-25; (C)GFP-11, APCNTERM-16, APCβ-cat-25. تم تعديل هذا الرقم من جين وآخرون7. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، نبين كيفية التعبير عن بنيات الحمض النووي الخارجية في أعداد واحدة أو صغيرة من الخلايا العصبية البصرية وكيفية صورة GFP الفردية التي تعبر عن الأشجار axonal البصرية مع الإشارات الجزيئية العادية والمتغيرة في سليمة، وأعمدة المعيشة من الضفدع X . محمد محمد كما نشرح كيفية إعادة بناء وتحديد شكل GFP التعبير عن الأشجار axonal البصرية من الصور التي تم التقاطها في الجسم الحي. للتعبير عن بلازميدات الحمض النووي الخارجية في عدد صغير من الخلايا العصبية البصرية، ونحن microinject خليط الحمض النووي / lipofection الكاشف في primordia العين من يوم واحد من الأجنة Xenopus القديمة، وذلك باستخدام تقنية وضعت لأول مرة في مختبر كريستين هولت لدراسة البصرية axon pathfinding في الضفادع الشباب9،10،19،20،21. نحن وآخرون قد طبقت أيضا هذا الحمض النووي microinjection / lipofection تقنية لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم مشتل أكسون البصرية في كبار السن سليمة، الذين يعيشون X. laevis الضفادع5،6، 7 , 8.هذا الإجراء غير مكلفة وبسيطة لعابر, خلية محددة transgenesis يسمح تحديد وظيفة الجينات الخلية المستقلة في تطوير الأشجار axonal البصرية في نظام نموذج الفقاريات الحية.
هناك العديد من العوامل الهامة التي يجب مراعاتها لأفضل الممارسات عند حقن الحمض النووي/DOTAP في براعم العين من أجنة Xenopus. أولاً، كما لوحظ في تقارير أخرى، ينبغي أن يكون تركيز الحمض النووي أكبر من 1 ميكروغرام/ميكرولتر9،10. تركيزات الحمض النووي بين 1-3 ميكروغرام/ ميكرولتر هي الأفضل، ولكن تركيزات الحمض النووي منخفضة مثل 0.7 ميكروغرام/ميكرولتر يمكن استخدامها أيضاً. ثانياً، إن حقن الحمض النووي الدقيق في المرحلة 22-24 من أجنة Xenopus هو الأمثل للتجارب التي يكون الهدف منها هو فحص الآليات التي تنظم التشتل البصري الإبطي. في الأجنة في هذه المراحل التنموية ، يتم تمييز براعم العين من الناحية الشكلية ويمكن استهدافها بسهولة أكبر للحقن14. معظم الخلايا العصبية البصرية في الأوعية الأولية للمرحلة 22-24 هي أيضا ً ما بعد المنقمة، مما يؤدي إلى عدد أقل من الخلايا العصبية البصرية التي تعبر عن GFP، والتي بدورها تسمح بدقة أفضل عند تصوير الأشجار البصرية الفردية GFP في أعمدة الضفادع. وأخيرا، أظهرت الدراسات السابقة أن يتم التعبير عن الجينات الخارجية ~ 8 ح بعد lipofection9. ولذلك، فإن التعبير عن البنى الجينية في براعم العين للأجنة المرحلة 22-24 يعني أن الجينات لن تعكر صفو مصير الخلايا اختيار الخلايا العصبية البصرية ولا النمو الأولي لمحاورها. والعامل الثالث الذي من شأنه أن يضمن النجاح عند حقن الحمض النووي في براعم العين الجنين Xenopus هو أن الحمض النووي ينبغي حقنها في منطقة سطحية نسبيا من العين9،10. الحقن في أنسجة أكثر عمقا في أو حول العين سيؤدي إلى انخفاض نسبة الأجنة التي تحتوي على الخلايا العصبية البصرية التي تعبر عن الحمض النووي الخارجي10.
وهناك أيضا العديد من القضايا التي يجب أن تكون على بينة من عند التصوير وإعادة بناء GFP التعبير عن الأشجار axonal البصرية في سليمة، وحيا Xenopus الضفادع. أولا، يجب على الباحثين التقاط صور فقط من نصف الكرة الأرضية التي تحتوي على ما بين واحد إلى ثلاثة GFP التعبير عن الأشجار axonal البصرية. إذا كانت صورة واحدة تحتوي على أكثر من ثلاثة GFP التعبير عن الأشجار axonal البصرية، والأشجار من المرجح أن يكون لها فروع متداخلة، مما سيجعل من الصعب تحديد الأشجار الفردية خلال عملية إعادة الإعمار. وثمة مسألة أخرى يجب إدراكها وهي أن إعادة بناء وتقدير المورفولوجيا البصرية لشُلِّر الأربور هي أكثر الخطوات استهلاكاً للوقت في هذا البروتوكول. ونقدر أن إعادة بناء والتحديد الكمي لمورفولوجيا الأشجار الإبطية البصرية يتطلبان ما يقرب من 80-90% من إجمالي وقت التجربة. على الرغم من أنه تم تطوير تقنيات لأتمتة إعادة بناء الأشجار التقشرية العصبية tectal، لم يتم تطبيق هذه الأساليب الحسابية حتى الآن على الأشجار axonal البصرية وكذلك22. على الرغم من أن شاقة، فإن عملية إعادة بناء مورفولوجيا الشجرة البصرية يزيد بشكل كبير من فهم الباحثين لتفاصيل مورفولوجيا الشجرة الإبطية البصرية. هذه التفاصيل المضافة، بدورها، يحسن بشكل كبير من نوعية الصور من GFP التعبير عن الأشجار هؤلاء الباحثين قادرون على التقاط في التجارب المستقبلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر جامعة تورو كلية كاليفورنيا للطب العظام لدعم أبحاثنا. ونحن نعترف الطلاب السابقين في المختبر (إستر وو، غريغوري بنغ، تايغون جين، جون ليم) الذين ساعدوا في تنفيذ هذه التقنية الحقن المجهري في مختبرنا. ونحن ممتنون للدكتورة كريستين هولت، التي تم تطوير تقنية الحقن المجهري/الشفة في أجنة Xenopus لأول مرة في مختبرها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
