Summary
该协议旨在演示如何将DNA/DOTAP混合物微注射到一天长的Xenopus laevis胚胎的眼蕾中，以及如何在中脑中图像和重建单个绿色荧光蛋白（GFP），表达光学轴向轴向。完好无损，活着的Xenopus小动物。
Abstract
水生蛙类的子群的主要视觉投影是研究调节神经元连通性发展的机制的一个很好的模型系统。在建立视网膜-tecto期间，视斧子从眼睛延伸，穿过大脑的不同区域，到达它们的目标组织，即视道。一旦光学轴突进入技术，他们精心设计终端树干，功能增加突触连接的数量，他们可以与目标内神经元在技术。在这里，我们描述了一种表达DNA编码绿色荧光蛋白（GFP）的方法，以及Xenopus胚胎中的视神经（视网膜神经结条细胞）中的增益和功能丧失基因构造。我们解释如何将联合DNA/唇裂试剂显微注入一天老胚胎的眼蕾中，以便外源基因在单个或多个视神经元中表达。通过用GFP标记基因或用GFP质粒共同注入基因，具有改变分子信号的单个光学神经元的终端轴状轴状可以直接在几天后完整、活的Xenopus小虫的大脑中成像，以及它们的形态可以量化。该协议允许确定细胞自主的分子机制，这是在体内发展光学轴向的。
Introduction
在神经系统发育过程中，前突触神经元的斧子通过大脑的不同区域导航，到达目标区域。当斧突子侵入其目标组织时，它们与午睡后目标神经元建立突触连接。在许多类型的神经元中，轴突通过阐述终端分支或轴1的网络来增加它们可以建立突触连接的数量和空间范围。水生蛙Xenopus laevis的胸腔-tec-tect-tecta是一个强大的脊椎动物模型，用于检查终端轴突化和突触连接2、3、4的原理。.单个GFP表达光学轴状轴向与正常和改变的分子信号可以直接观察到在完整，活的Xenopus小动物5，6，7，8。为了单独表达GFP，或与少量视神经中全长或截断基因一起表达基因，我们使用一种技术，将DNA微注射/脂肪插入一天长Xenopus胚胎9的眼蕾中。10.这项技术最初是为研究幼代黄鼠狼的视性斧头路径发现机制而开发的，此后我们和其他人一直应用来确定视斧头背后的细胞自主分子机制在Xenopus的植树5，6，7，8，9，10。
其他模型物种以及X.laevis中已经发展了在少数光学神经元中表达外源基因的替代技术。然而，与在异种胚胎眼蕾中微注射DNA/利普菲试剂相比，这些方法中的每一个都带来了挑战和限制。在小鼠中，转基因可用于表达少数视神经中的基因，但转基因小鼠的生成成本高昂且耗时，转基因小鼠往往存在不良的副作用11。在视神经中表达外源基因的转基因斑马鱼也可以通过将质粒注射到早期裂解阶段胚胎12中产生。然而，这个过程需要克隆一个特定的启动子来表达在斑马鱼幼虫12的视神经的马赛克模式的基因。转基因斑马鱼视神经中外源DNA的表达频率也较低（<30%）与用DNA/脂质体试剂（30~60%）进行微注射的Xenopus小黄鼠相比，12。在ovo电穿孔也被用来表达基因在少量的光学神经元在小鸡13。然而，这个程序未能完全描述建立光学投影的机制，因为光学轴向轴向化不能在完整、活的小鸡胚胎中成像。最后，几个实验室已经利用电穿孔将基因转染成少量的视神经，在Xenopus 14，15。然而，电穿孔需要优化设备和方案（刺激器、电极、波脉冲的空间和时间模式），而用于将DNA/利普菲试剂微注射到Xenopus胚胎眼蕾中。
我们和其他人以前使用微注射/脂肪技术将DNA注入到Xenopus胚胎的眼蕾中，以确定细胞自主信号机制，建立视轴向化5，6，7,8.我们最初用这种方法来剖析在异种小球5、6的视轴向化中，Cadherin和Wnt适配器蛋白β-卡泰宁的功能。在一项研究中，我们表明，β-卡腾宁结合到β-卡腾宁和PDZ分别需要启动和塑造体内的视轴非子树。在第二份报告中，我们演示了β-卡泰宁和葛兰素-3+的β-卡泰宁结合域对腹腔光学轴向6的投影模式进行了反向调节。最近，我们确定了Wnt因子，腺瘤大肠杆菌（APC）的作用，在调节在Xenopus小虫7的视轴状树的形态特征。通过共同表达APC的N-终端和中心域，在单个光神经元中与GFP一起调节β-卡泰宁稳定性和微管组织，我们确定了这些APC交互域在分支编号上的共享和不同作用，长度，和角度在光学轴向轴向在体内7。另一个实验室使用显微注射/利福菲化技术来确定BDNF受体TrkB在Xenopus 8的光学轴状轴状中发出信号的细胞自主作用。该组显示，在体内8的个体光学轴突合中，显性阴性TrkB扰动分枝和突触成熟。总体而言，Xenopus的脂质化技术已经阐明了不同基因在原生环境中视斧子分枝中的具体作用。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得加州图罗大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准（协议 # TUCA003TE01X）。
1. 获得X. 拉维斯胚胎
- 通过自然交配的雄性蛙和雌性成年青蛙的天然交配获得X.laevis胚胎，这些青蛙与人类性腺激素（HCG）结合体外受精，从用HCG充养的雌性成年青蛙中卵子受精，或直接订购（表材料）。
-
在室温下用2%半胱氨酸溶液获得的Dejelly胚胎（材料表）16。
- 在一个大的培养皿中收集50-100个胚胎。通过转移或使用塑料转移移液器去除胚胎中的溶液。在含有胚胎的盘中加入25 mL的2%半胱氨酸溶液（25 mL ddH2O，pH 至 8.0）中的0.5克半胱氨酸。
- 轻轻旋转含有半胱氨酸溶液中的胚胎的培养皿，直到胚胎的果冻涂层脱落，胚胎聚集在盘子中心的一团中（5-10分钟）。此时，缓慢而轻轻地将半胱氨酸溶液倒入废杯中。小心不要将过多的胚胎与半胱氨酸溶液一起倒入废杯中。
- 用 10% 修改的 Mark 的环状溶液 （MMR） 或其他合适的溶液（例如，改性巴特溶液 MBS）冲洗培养皿中的胚胎 6x，每次更换溶液时，都会旋转培养皿。
- 在10%MMR中培养胚胎，直到它们达到发育阶段22-2417。异种胚胎可在15~25°C的温度下孵育。胚胎的发育速度取决于它们在17岁时孵育的温度。
注：从目录中订购的Xenopus胚胎通常在发育阶段20-24到达实验室，因此可以马上进行去杰利和微注射。
2. 制备DNA质粒，制造DNA/DOTAP混合物
- 子克隆DNA表达构造成Xenopus表达载体pCS2+或pCS2_MT或其衍生物（最初由D.特纳和R.鲁普构建）5，6，7。pCS2+ 载体含有经过修饰的巨细胞病毒 （CMV） 启动子，有助于青蛙的基因表达。
- 按照标准程序，使用微型试剂盒（材料表）扩增含有GFP和/或感兴趣的基因的pCS2质粒。在微型制备协议的最后洗脱步骤中，连续将DNA排脱到ddH2O中，得出>1 μg/μL的最终浓度。
- 将所有pCS2质粒储存在-80°C，直到准备好进行显微注射/唇合实验，即当胚胎处于发育阶段22-24时。
- 解冻DNA质粒，在室温下进行唇裂。在利菲细胞发生之前，短暂离心DNA质粒。这将防止在DNA/DOTAP混合物中形成沉淀物，这种混合物可能会堵塞微毛细管移液器的尖端。
- 将DNA质粒与DOTAP脂质体转染试剂（材料表）以1：3（w/v）比率9，10。例如，将2 μg的DNA转移到1.5 mL微离心管中，加入6μL的DOTAP，或在微离心管中转移3μg的DNA，并加入9μL的DOTAP。
- 一旦DNA和DOTAP结合，轻轻轻拂微离心管混合溶液。DNA/DOTAP溶液在混合后应变得轻微不透明。
- 如果两个质粒在光学神经元中被唇化（例如，pCS2-GFP，第二个pCS2质粒含有被截断或全长版本的基因），首先将两个质粒（在短暂离心后）以1：1的比例合并，然后添加DOTAP 比率为 1：3（w/v）。例如，将 1 μg 的 pCS2-GFP 与 1 μg 的二次 pCS2 质粒结合，然后加入 6 μL 的 DOTAP。
注：研究表明，在这些发育阶段，将两个质粒注入异种胚胎眼蕾，将导致它们在个体视神经中共同表达9，10。
3. 装载带有DNA/DOTAP的显微注射针
- 用细钳（材料表）轻轻夹住拉玻璃微毛细管移液器的尖端。
- 用微滤液将玻璃微毛细管移液器回填，使微移液器的夹头出现一小滴矿物油。用矿物油半途加注微毛细管移液器。
- 将拉入现在充满矿物油的玻璃微毛细管移液器装入连接到喷油器的合适喷射支架中。如果使用喷油器（材料表），在将微毛细管移液器加载到柱塞上之前，将柱塞喷射一半。将微毛细管移液器牢固地连接到喷油器后，将柱塞完全伸出，以确认微毛细管移液器牢固地连接到喷油器上，并且不随柱塞的延伸而移动。
- 将3μL的DNA/DOTAP混合物转移到一张切割的方形（1英寸见方）石蜡纸上。
- 在立体解剖显微镜下，将玻璃微毛细管移液器的尖端移入DNA/DOTAP液滴。
- 使用注射装置上的填充选项，缓慢地将 DNA/DOTAP 滴入玻璃微毛细管移液器中。当液体被装入微毛细管移液器时，液滴会变小。由于DNA/DOTAP溶液的轻微不义，矿物油和DNA/DOTAP溶液之间的边界应在玻璃微毛管移液器中可见（图1）。如果需要，请定期停止填充微毛细管移液器，以便重新校准玻璃微毛细管移液器中的压力。
图1：微毛细管移液器的图像。图像显示注射装置上的微毛细管移液器在 （A） 和后 （B） 填充 DNA/DOTAP.开箭，微毛细管移液器中的柱塞尖端 （A，B. .闭合箭头，矿物油和DNA/DOTAP在填充微毛管移液器（B） 之间的线 。比例尺 = 1 毫米。请点击此处查看此图的较大版本。
4. 将DNA/DOTAP微注射到1天旧异种胚胎眼蕾
- 在装有0.1x MMR的10毫米培养皿中，用细钳将10个阶段20⁄24异种胚胎手动去化。抓住腰部的维特尔线信封，避免伤害胚胎。用实验者左手和右手的钳子，弹出维特尔线信封的气泡，从病毒包中释放胚胎。取出维泰林信封时，小心不要伤害胚胎。
注：从阶段20开始，Xenopus胚胎在胚胎的前半部分和后半部分之间形成缩进或"腰"。这个腰部允许在这个位置的维特尔线包络和胚胎之间形成一个缝隙。 - 使用带有切尖的塑料转移移液器将 5⁄10 去输期 22⁄24 胚胎转移到装有 1x MMR 的 10 mm 培养皿中。
注：1x MMR 中的高盐溶液有助于通过显微注射愈合穿刺伤口。 - 在立体显微镜下，抓住培养皿中一个被分割的胚胎，每只手都用钳子，排列胚胎，使其前极在视野中指向。将胚胎定向，使其横向躺着，并且其眼蕾之一（左或右）朝上。
- 在立体显微镜下，用实验者非主导手的钳子握住胚胎，用实验者占主导地位的手将玻璃微液的尖端引入眼蕾（从心室或背侧，取决于目前正在注射的胚胎），就在表皮的下方（图2）。在70~210 nL的DNA/DOTAP溶液之间注射。这可以在多个脉冲中完成，具体取决于喷油器设置为的脉冲大小（通常为 70 nL）。
注：注射的深度对于视神经的脂液注射非常重要。如果微毛细管尖端的位置正确地非常浅入眼蕾，那么在显微注射后，覆盖在眼布上的灰色表皮会膨胀。如果位置太深，灰色眼蕾不会显示任何变化，并且视觉神经元中DNA表达的频率将较低。 - 转动胚胎，在胚胎的反面对眼蕾进行相同的显微注射。
- 在每个实验中注射两个6×10（或更多）胚胎的眼蕾。
- 微注射后，将胚胎储存在含有1x MMR的培养皿中约30分钟，以促进伤口愈合。
- 30分钟后，将胚胎移植到0.1x MMR溶液中，使用0.001%漂白剂（苯乙酰胺），以减少色素沉着。培养覆盖的胚胎约五天，直到胚胎在46-4716阶段发育成小白鼠。
图2：显微注射眼蕾区域的划分。发育阶段X. laevis胚胎的图形 （A） 和显微摄影 （B） 显示应针对显微注射的眼蕾区域（红色亮点）。刻度条 = 1 mm.面板 A 已由 Zahn 等人18修改。请点击此处查看此图的较大版本。
5. GFP 表达光学轴向轴向轴的成像
注：当被脱氧核糖核酸（DNA）脂肪化达到发育阶段46-47时，它们已做好成像的准备。
- 在成像之前，必须麻醉小白鼠。在10毫米培养皿中，在ddH2 O中将唇裂的三叶草转化为0.02%的三叶草溶液。等待5~10分钟，直到小虫子变得无法移动。通过在立体解剖显微镜下观察它们跳动的心，验证它们是否还活着。
- 将一只麻醉的石柱放入玻璃幻灯片上定制的硅胶室中，并盖上盖玻片密封。小龙应稍微倾斜，以便头部的一侧（左侧或右侧）向上倾斜，并且几乎不会触及盖滑。
- 屏幕的一半背端的中脑的半头龙，在低倍率下向上倾斜，用于GFP表达光学轴向轴向。
注：宽场直立显微镜配有脱毛照明和异色物镜（材料表）可用于荧光轴的屏幕。 - 如果 tectal 半球包含一到三个 GFP 表示光学轴轴轴，则使用高对比度 40 倍的空气长工作距离目标（材料表） 捕获这些轴的 z 系列图像。对于每个轴轴轴，以 1.5 μm 的间隔捕获 10⁄20 z 系列切片。
- 为了查看中脑另一侧的轴轴，在硅室中重新加载小孔，使其向另一侧倾斜，并盖玻片密封。然后重复步骤 5.3 和 5.4。
6. 光学轴轴形态的重建与定量
- 选择包含一到三个 GFP 表示光学轴轴的映像堆栈。
- 在图形编辑软件（材料表）中使用手绘工具来跟踪每个 z 切片中可见的每个光学轴轴部分。通过每个 z 切片中明显的每个轴的片段进行跟踪，将创建轴的准确 2D 投影。不同的颜色可用于跟踪不同的 GFP 表达光学轴轴。
- 在轴轴的2D重建上进行所有形态测量，并在需要时参考原始的z系列图像7。使用 Image J 软件 （材料表），测量形态参数，如分支数（即分支尖或分支点数）、总轴分支长度、每个分支长度、轴的长度和宽度、轴的整体形状（L/W）分支的比例、圆周）和角度 7 。
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Representative Results
本文中描述的方案在一至十个视轴轴轴的树干中，将表达GFP（单独或与额外的DNA结构）的注射Xenopus胚胎的成功率为30-60%。在图3中，我们展示了从我们最近发表的研究7中，GFP表达控制和突变光学轴状的代表性共聚焦图像。在这项研究中，我们克隆了两个APC（APCNTERM和APC+-cat）的域突变体到pCS2质粒中，并将这些质粒与pCS2-GFP一起标记质粒注射到一天大的Xenopus胚胎的眼蕾中。图 4显示了我们对控件和 APC 突变轴轴轴的重建进行的几个定量测量的结果，包括分支数、总支分支长度和分支平均长度。
图3：GFP表达控制和突变光学轴向轴的代表性图像。（A） 克隆成pCS2质粒的APC N端和中央域突变体的突变体图解。（B） 代表性共聚焦图像的单GFP和GFP-APC突变光学轴状轴向在tecta完好无损，活的Xenopus小孔。（C） 重建 GFP 控制和 APC 突变光轴轴的 z 系列图像。刻度条 = 30 μm （B），40 μm （C）。这个数字已由金等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：控制重建和突变轴轴的形态的量化。分支数 （A）， 总轴分支长度 （B） 和平均分支长度 （C） 的图印确认控制与 APC 突变体之间观察到的差异， 表达轴轴的轴轴。面板 A+C 中的数据以 SEM 的控制平均值百分比显示。具有回归线的其他分支数与平均分支长度的散点图显示，这些参数在表示 APC 域（D、 E） 的光学轴轴轴轴中具有反相关性。样本编号： （A） GFP-12， APCNTERM_18 APC+-cat-25;（B） GFP-12，APCNTERM-16，APC+-cat-25;（C） GFP-11， APCNTERM-16， APC+-cat-25.这个数字已由金等人修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在本文中，我们演示了如何在单或少量光学神经元中表达外源性DNA构造，以及如何在青蛙X的完整、活的带状的带正常和改变的分子信号中成像单个GFP表达的光学轴向轴向。 .拉维斯.我们还解释了如何从体内捕获的图像中重建和量化 GFP 表达光学轴轴的树的形态。为了在少量视神经元中表达外源性DNA质粒，我们用克里斯汀·霍尔特实验室首次开发的技术，将DNA/利普菲反应试剂混合物微注射到一天旧异血胚胎的眼蕾原发性中，阿克森路径寻找在年轻的小小龙9，10，19，20，21。我们和其他人也应用了这种DNA显微注射/唇化技术来研究分子机制，以调节在较老的完好无损，活的X.laevis小龙5，6，7,8.这种廉价、简单的瞬态细胞特异性转发生程序，可以确定细胞自主基因功能，在活脊椎动物模型系统中开发视轴向轴向。
在将DNA/DOTAP微注射到Xenopus胚胎的眼蕾时，需要考虑几个重要因素作为最佳做法。首先，如其他报告所述，DNA浓度应大于1μg/μL9，10。1⁄3 μg/μL 之间的 DNA 浓度最好，但也可以使用低至 0.7 μg/μL 的 DNA 浓度。其次，将DNA显微注入22-24阶段Xenopus胚胎是实验的最佳选择，其目标是检查调节视轴向的机理。在这些发育阶段的胚胎中，眼蕾在形态上是有区别的，更容易被注射靶向。第22-24期胚胎眼蕾原发性中的大多数视神经神经元也是后线，这导致表达GFP的视神经数量减少，这反过来又允许在小矮人中成像单个GFP光学轴突轴时获得更好的分辨率。最后，以往的研究表明，外源基因在脂肪酶9后表达±8小时。因此，在22-24期胚胎的眼蕾中表达基因构造意味着基因既不会干扰视神经细胞命运的选择，也不会干扰其斧子的初始生长。第三个因素，将确保成功时，显微注射DNA到Xenopus胚胎眼蕾是DNA应该注射到眼芽9，10相对表面的区域。注射到眼蕾内或周围的更深层组织将导致含有表达外源性DNA10的光学神经元的胚胎比例降低。
在成像和重建 GFP 表达光轴状轴向在完整、活的Xenopus小树中时，还有几个问题需要注意。首先，研究人员应该只捕捉含有一到三个GFP表达光学轴轴的半球图像。如果单个图像包含三个以上 GFP 表示的光学轴轴，则树干可能具有重叠的分支，这将使得在重建过程中难以定义各个轴。需要注意的另一个问题是，光学轴轴轴轴形态的重建和定量是该协议中最耗时的步骤。我们估计，重建和量化光学轴轴轴轴形态大约需要实验总时间的 80-90%。虽然已经开发出技术来自动重建tectal神经元树突状的树干，这些计算方法还没有应用于光学轴突轴，以及22。尽管费力，但重建光学轴轴形态的过程极大地增加了研究人员对光学轴轴树形态细节的理解。反过来，这增加了这些细节，大大提高了这些研究人员能够在未来实验中捕捉的GFP表达树轴的图像的质量。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢图罗大学加州骨病医学学院对我们的研究的支持。我们感谢以前在实验室里的学生（吴先生、彭先生、金泰根、林约翰），他们在我们的实验室里帮助实施了这种显微注射技术。我们感谢克里斯蒂娜·霍尔特博士，他的实验室首次开发了Xenopus胚胎的DNA微注射/唇分技术。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
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