Summary
Denne protokol har til formål at demonstrere, hvordan man mikroinjicere en DNA/dotap blanding i eyebuds af en dag gamle xenopus laevis embryoner, og hvordan man billede og rekonstruere individuelle grønne fluorescerende protein (gfp) udtrykker optiske axonal Dorne i tectal midhjerner af intakt, levende Xenopus Tadpoles.
Abstract
Den primære visuelle projektion af haletudser af vand frøen xenopus laevis fungerer som et glimrende model system til at studere mekanismer, der regulerer udviklingen af neuronal konnektivitet. Under etableringen af Retino-tectal projektion, optiske axoner strækker sig fra øjet og navigere gennem forskellige regioner i hjernen til at nå deres mål væv, optisk tectum. Når optiske axoner ind i tectum, de udførlige Terminal Dorne at funktion til at øge antallet af synaptisk forbindelser, de kan gøre med Target interneuroner i tectum. Her beskriver vi en metode til at udtrykke DNA-kodning grøn fluorescerende protein (GFP), og gevinst-og tab-af-funktion gen konstruktioner, i optiske neuroner (retinal ganglion celler) i Xenopus embryoner. Vi forklarer, hvordan man microinjicere et kombineret DNA/lipofection reagens i øjen knopper af en dag gamle embryoner, således at eksogene gener udtrykkes i enkelt eller lille antal optiske neuroner. Ved at tagge gener med gfp eller co-indsprøjtning med en gfp plasmid, kan Terminal axonal Dorne af individuelle optiske neuroner med ændret Molekylær signalering imælges direkte i hjerner af intakt, levende xenopus haletudser flere dage senere, og deres morfologi kan kvantificeres. Denne protokol giver mulighed for bestemmelse af celle-autonome molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af optisk Axon arborization in vivo.
Introduction
Under udviklingen af nervesystemet, axoner af præsynaptiske neuroner navigere gennem forskellige regioner i hjernen til at nå deres mål områder. Når axoner invaderer deres målvæv, de etablerer synaptiske forbindelser med postsynaptiske Target neuroner. I mange typer af neuroner øger axoner antallet og den rumlige udstrækning af synaptiske forbindelser, de kan gøre ved at udarbejde netværk af Terminal grene eller Dorne1. Retino-tectal projektion af tadpoler af vand frøen xenopus laevis er en stærk hvirveldyr model for undersøgelse af mekanismer underliggende Terminal Axon arborization og synaptisk tilslutningsmuligheder2,3,4 . Individuelle gfp udtrykker optiske axonal Dorne med normal og ændret Molekylær signalering kan observeres direkte i intakt, levende xenopus haletudser5,6,7,8. For at udtrykke GFP alene eller sammen med fuld længde eller trunkerede versioner af gener i et lille antal optiske neuroner, bruger vi en teknik, der involverer mikroinjektion/lipofection af DNA i eyebuds af en dag gamle Xenopus embryoner9, 10. denne teknik blev oprindeligt udviklet til at studere mekanismer af optisk Axon pathfinding i unge xenopus Tadpoles, og er siden blevet anvendt af os og andre til at bestemme celle-autonome molekylære mekanismer underliggende optisk Axon arborisering i xenopus haletudser5,6,7,8,9,10.
Alternative teknikker til at udtrykke eksogene gener i et lille antal optiske neuroner er blevet udviklet i andre model arter, samt i X. laevis. Men hver af disse tilgange præsenterer udfordringer og begrænsninger i forhold til mikroinjektion af DNA/lipofection reagens i øjen knopper af Xenopus embryoner. I mus kan transgenese bruges til at udtrykke gener i et lille antal optiske neuroner, men genereringen af Transgene mus er bekostelig og tidskrævende og Transgene mus ofte til stede med uønskede bivirkninger11. Transgene zebra, der udtrykker eksogene gener i optiske neuroner kan også skabes ved at injicere plasmider i tidlige kavaler stadiet embryoner12. Denne proces kræver imidlertid kloning af en specifik promotor for at udtrykke gener i et mosaik mønster i optiske neuroner i Zebra larver12. Hyppigheden af ekspression af eksogen DNA i optiske neuroner i transgene Zebra er også noget lavere (< 30%) sammenlignet med xenopus haletudser, der blev mikroinjiceret med DNA/liposomal reagens (30 − 60%)12. I ovo elektroporation er også blevet brugt til at udtrykke gener i et lille antal optiske neuroner i kyllinger13. Men denne procedure har undladt fuldt ud at karakterisere mekanismer, der etablerer optiske fremskrivninger, fordi optisk Axon arborization ikke kan afbildet i intakt, levende chick embryoner. Endelig har flere laboratorier brugt elektroporation til transficere gener i et lille antal optiske neuroner i xenopus haletudser14,15. Men elektro poration kræver optimering af udstyr og protokoller (stimulator, elektroder, rumlige og tidsmæssige mønstre af bølge impulser) ud over, der anvendes til mikroinjektion af DNA/lipofection reagens i øjen knopper af Xenopus embryoner.
Vi og andre tidligere brugte teknikken med mikroinjektion/lipofection af DNA i øjen knopper af xenopus embryoner til at bestemme celle autonome signalerings mekanismer, der etablerer optisk Axon arborization5,6, 7 , 8. vi brugte oprindeligt denne fremgangsmåde til at dissekere funktionerne i cadherin og WNT adapter protein β-køreledning i optisk axonal arborisering i xenopus haletudser5,6. I en undersøgelse viste vi, at β-køreledning i binding til α-køreledning i og til PDZ er påkrævet for henholdsvis at initiere og forme optiske axonal Dorne in vivo5. I en anden rapport demonstrerede vi, at β-køreledningen i bindende domæner for α-køreledning i og GSK-3β i modsætning hertil modulerede projektions mønstre af ventrale optiske axonal Dorne6. For nylig, vi identificerede roller for WNT faktor, adenomatøs poliposis coli (APC), i reguleringen morfologiske funktioner af optiske axonal Dorne i xenopus haletudser7. Ved at co-udtrykke N-terminalen og centrale domæner i APC, at moduere β-køreledning i stabilitet og mikrotubulus organisation sammen med gfp i individuelle optiske neuroner, vi fastsatte delte og særskilte roller for disse APC interaktion domæner på filial nummer, længde, og vinkel i optiske axonal Dorne in vivo7. Et andet laboratorium anvendte mikroinjektion/lipofection teknik til at bestemme celle autonome roller for signalering af BDNF receptor, TrkB, i optiske axonal Dorne i xenopus haletudser8. Denne gruppe viste, at udtryk for en dominerende-negativ TrkB rystet forgrening og synaptisk modning i individuelle optiske Axon Dorne in vivo8. Samlet set har lipofection-teknikken i Xenopus allerede belyst de specifikke roller for forskellige gener i optisk Axon-forgrenings forgrening i det indfødte miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Udvalget for institutionel dyrepasning og-anvendelse (IACUC) i Touro University California (protokol # TUCA003TE01X).
1. opnåelse af X. laevis embryoner
- Opnå X. laevis embryoner ved naturlig parring af par af mandlige og kvindelige voksne frøer primet med humant choriongonadotropin (HCG), ved in vitro befrugtning af æg udgydt fra kvindelige voksne frøer PRIMET med HCG, eller ved at bestille direkte (tabel over Materialer).
-
Dejelly embryoner opnået med en 2% cystein opløsning ved stuetemperatur (tabel over materialer)16.
- Saml 50 − 100 embryoner i en stor Petri skål. Fjern opløsningen embryonerne er i ved at deantere eller bruge en plastik overførings pipette. Der tilsættes 25 mL 2% cystein opløsning (0,5 g cystein i 25 mL ddH2O, pH til 8,0) til den skål, der indeholder embryonerne.
- Hvirvl forsigtigt den Petri skål, der indeholder embryonerne i cystein-opløsningen, indtil de gelé frakker af embryonerne falder af, og embryonerne samles i en klump i midten af skålen (5 − 10 min). På dette tidspunkt, langsomt og forsigtigt hælde off cystein opløsning i en affalds bæger. Pas på ikke at hælde for mange af embryonerne i affalds bægerglasset sammen med cystein opløsningen.
- Skyl embryonerne i Petri skålen 6x med 10% modificeret Mark's ringe opløsning (MMR) eller en anden egnet opløsning (f. eks. modificeret Barthélemy-opløsning, MBS), hvirvlende skålen, hver gang opløsningen udskiftes.
- Kultur embryonerne i 10% MMR, indtil de når udviklingsstadiet 22 − 2417. Xenopus embryoner kan inkuberet ved temperaturer mellem 15 − 25 °c. Udviklings raten for embryonerne afhænger af den temperatur, de inkuberet ved17.
Bemærk: Xenopus embryoner bestilt fra et katalog ankommer normalt i laboratoriet på udviklingsmæssige stadier 20 − 24, så de kan være dejellied og microinjiceres med det samme.
2. klargøring af DNA-plasmider og fremstilling af en DNA/DOTAP-blanding
- Subclone DNA-udtryks konstruktioner til xenopus Expression vektorer pCS2 + eller pCS2 + MT eller derivater deraf (oprindeligt konstrueret af D. Turner og R. Rupp)5,6,7. pCS2 + vektorer indeholder en modificeret Cytomegalovirus (CMV)-promotor, der letter genekspression i frøer.
- Amplify pCS2 plasmider indeholdende GFP og/eller gener af interesse med miniprep kits (tabel over materialer) efter standardproceduren. I det sidste elueringstrin i miniprep-protokollen skal du udføre en sekventiel eluering af DNA'ET i ddH2O for at give en slutkoncentration på > 1 μg/μl.
- Opbevar alle pCS2 plasmider ved-80 °C, indtil de er klar til at udføre et mikroindsprøjtnings-/lipofection-eksperiment, dvs.
- Tø DNA-plasmider til at blive lipofected ved stuetemperatur. Umiddelbart før lipofection centrifugeres kortvarigt DNA-Plasmids. Dette vil forhindre bundfald i dannelsen af DNA/DOTAP-blandingen, der kan tilstoppe spidsen af mikrokapillar pipetten.
- Kombiner DNA-plasmider med dotap liposomal transfektering reagens (tabel over materialer) ved et 1:3 (w/v) ratio9,10. For eksempel overføres 2 μg DNA til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, og der tilsættes 6 μL DOTAP eller overføres 3 μg DNA i et mikrocentrifuge glas, og der tilsættes 9 μL DOTAP.
- Når DNA og DOTAP kombineres, skal du forsigtigt svippe mikrocentrifuge røret for at blande opløsningen. DNA/DOTAP opløsningen skal blive lidt uigennemsigtig efter blanding.
- Hvis to plasmider skal lipofected sammen (f. eks. pCS2-GFP med en anden pCS2 plasmid indeholdende en afkortet eller fuld-længde version af et gen) i optiske neuroner, først kombinere de to plasmider (efter kort centrifugering begge) på en 1:1 ratio, og derefter tilføje DOTAP ved et forhold på 1:3 (w/v). For eksempel, kombinere 1 μg pCS2-GFP med 1 μg af en anden pCS2 plasmid og derefter tilsættes 6 μL DOTAP.
Bemærk: Undersøgelser har vist, at lipofection af to plasmider i øjen knopper af xenopus embryoner på disse udviklingsmæssige stadier vil resultere i deres Co-udtryk i individuelle optiske neuroner9,10.
3. Ilægning af en Mikroinjektionsnål med DNA/DOTAP
- Klip forsigtigt spidsen af en trukket glas mikrokapillar pipette med fine pincet (tabel over materialer).
- Fyld glas mikrokapillar pipetten med mineralolie ved hjælp af en mikrofil, så der kommer en lille dråbe mineralolie på den klippede spids af mikropipetten. Fyld mikrokapillar pipetten halvvejs med mineralolie.
- Ilægning af den trukket glas mikrokapillær pipette, som nu er fyldt med mineralolie, ind i en egnet injektions holder, der er sluttet til en injektor. Hvis du bruger en injektor (tabel over materialer), skal du skubbe stemplet ud på midten, før du lægger mikrokapillær pipetten på den. Når mikrokapillar pipetten er forsvarligt fastgjort til injektoren, skal stemplet forlænges i fuldt omfang for at bekræfte, at mikrokapillar pipetten er stærkt fastgjort til injektoren og ikke bevæger sig med forlængelsen af stemplet.
- Overfør en 3 μL dråbe DNA/DOTAP-blandingen på en skåret firkant (1 tommer firkantet) ark paraffin papir.
- Under en stereo dissekere mikroskop, flytte spidsen af glasset mikrokapillar pipette i DNA/dotap dråbe.
- Sug langsomt DNA/DOTAP-faldet ind i glas mikrokapillar pipetten ved hjælp af udfyldnings muligheden på injektions apparatet. Da væsken er indlæst i mikrokapillar pipetten, vil faldet blive mindre. På grund af den lille uigennemsigtighed af DNA/DOTAP-opløsningen bør grænsen mellem mineralolien og DNA/DOTAP-opløsningen være synlig i glas mikrokapillær pipetten (figur 1). Hvis det er nødvendigt, skal du holde op med at fylde mikrokapillar pipetten med jævne mellemrum, så trykket i glas mikrokapillar pipetten kalibrerer.
Figur 1: billeder af mikrokapillær pipette. Billeder viser en mikrokapillær pipette på injektions apparatet, før (a), og efter (B) påfyldning med DNA/dotap. Åbne pile, spidsen af stemplet i mikrokapillar pipetten (A, B). Lukket pil, linje mellem mineralolie og DNA/DOTAP i den fyldte mikrokapillar pipette (B). Scale bar = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. mikroindsprøjtning af DNA/DOTAP i øjen knopper af 1-daggamle Xenopus -embryoner
- Manuelt devitellinize ti Stage 20 − 24 Xenopus embryoner med fine Tang i en 10 mm Petri skål fyldt med 0,1 x MMR. Tag fat i vitelline-konvolutten i taljen for at undgå at beskadige embryonerne. Med tang i både de venstre og højre hænder, pop boblen af vitelline kuvert og frigive embryonet fra vitelline kuvert. Pas på ikke at skade embryonerne, når du fjerner vitelline konvolutten.
Bemærk: Fra og med stadie 20 udvikler Xenopus embryonerne en indrykning eller ' talje ' mellem fostrets forreste og bageste halvdele. Denne talje giver et hul til at danne mellem vitelline konvolut og embryo på denne position. - Brug en plastik overførings pipette med et snit spids til at overføre 5 − 10 devitellinized stadie 22 − 24 embryoner til en 10 mm Petri skål fyldt med 1x MMR.
Bemærk: Den højere saltopløsning i 1x MMR letter heling af punkterings sår, der vil følge af mikroindsprøjtningen. - Under stereomikroskopet, tag fat i en af de devitellinized embryoner i Petri skålen med pincet i hver hånd, og Arranger fosteret, så dets forreste Pol er fremhævet i synsfeltet. Drej embryonet, så det ligger sideværts, og et af dets øjen knopper (venstre eller højre) vender opad.
- Under stereomikroskopet skal du holde embryoet med pincet i eksperimentet's ikke-dominerende hånd, og med eksperimentet's dominerende hånd introducere spidsen af glasmikropipetten i øjeæblerne (fra ventrale eller Rygsiden, afhængigt af halvdelen af det embryon, der i øjeblikket injiceres), lige under epidermis (figur 2). Injicer mellem 70 − 210 nL af DNA/DOTAP-opløsningen. Dette kan gøres i flere impulser, afhængigt af størrelsen af puls injektoren er indstillet til (normalt 70 nL).
Bemærk: Den dybere injektion er meget vigtigt for lipofection i optiske neuroner. Hvis positionen af spidsen af mikrokapillar er korrekt indsat meget overfladisk i øjenbryn, derefter efter mikroinjektion, den grå epidermis overliggende øjenbryn vil svulme. Hvis positionen er for dyb, vil den grå øjen prop ikke vise nogen ændringer, og hyppigheden af ekspression af DNA i optiske neuroner vil være lavere. - Vend embryonet rundt og udfør den samme mikroinjektion i øjenbryn på den kontralaterale side af embryonet.
- Injicér begge øjen knopper på 6 − 10 (eller flere) embryoner i hvert forsøg.
- Efter mikroinjektion skal embryoner opbevares i en Petri skål med 1x MMR i ca. 30 minutter for at lette sårheling.
- Efter 30 min. overføres injicerede embryoner til en 0,1 x MMR-opløsning med 0,001% blegemiddel (phenylthiocarbamid) for at reducere pigmentering. Kultur embryonerne dækkes i ca. fem dage, indtil embryonerne har udviklet sig til haletudser i trin 46 − 4716.
Figur 2: afgrænsning af eyebud-regionen til mikroinjektion. Skematisk (A) og photomicrograph (B) af X. laevis embryo på udviklingsmæssige stadier 22/23 Vis eyebud region, der skal målrettes til mikroinjektion (røde højdepunkter). Scale bar = 1 mm. panel A er blevet modificeret fra Zahn et al.18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
5. Imaging af GFP udtrykker optiske Axonal Arbors i intakt, levende Tadpoles
Bemærk: Når tadpoler, der var lipofected med DNA nå udviklingsmæssige stadier 46 − 47, de er klar til billeddannelse.
- Før billeddannelse skal haletudser bedøses. For at bedøve haletudser, overføre de lipofected tadpoler til en 0,02% tricain opløsning i DDH2O i en 10 mm Petri skål. Vent 5 − 10 minutter, indtil haletudser bliver immobile. Bekræft, at haletudser stadig er i live ved at observere deres bankende hjerter under en stereo dissekere mikroskop.
- Placer en bedøvet Tadpole i et specialfremstillet silikone kammer på en glas rutsjebane og tætning med en dækseddel. Den Tadpole skal vippe lidt, så den ene side (venstre eller højre) af hovedet er vinklet opad og bare knap rører dækslet slip.
- Screen halvdelen af den dorsale tectal hjernen af Tadpole, der er vippes opad ved lav forstørrelse for gfp udtrykker optiske axonal Arbors.
Bemærk: En widefield opretstående mikroskop udstyret med en epilfuorescens belysning og en apochromatic objektiv linse (tabel over materialer) kan bruges til at screene for fluorescerende Arbors. - Hvis den tectal halvkugle indeholder mellem en til tre gfp udtrykker optiske axonal dorne, fange en z-serie af billeder af disse Dorne ved hjælp af en høj kontrast 40x luft lang arbejdsafstand mål (tabel over materialer). For hver axonal Arbor, Capture 10 − 20 z-serien skiver med 1,5 μm intervaller.
- For at se Axon Dorne på den anden side af tectal midbrain, Genindlæs Tadpole i silikone kammeret, så det hælder til den anden side og forsegler med en dækseddel. Gentag derefter trin 5,3 og 5,4.
6. rekonstruktion og kvantificering af optisk Axonal Arbor morfologi
- Vælg en billedstak, der indeholder mellem en til tre GFP udtrykker optiske axonal Arbors.
- Brug frihåndstegning værktøj i grafisk redigering software (tabel af materialer) til at spore den del af hver optisk axonal Arbor synlige i hver z-skive. Sporing gennem brikkerne i hver Arbor tydeligt i hver z-skive vil skabe en nøjagtig 2D projektion af lysthus. Forskellige farver kan bruges til at spore forskellige GFP udtrykker optiske axonal Arbors.
- Foretag alle morphometriske målinger på 2D rekonstruktioner af de axonal Arbors, med henvisning til den oprindelige z-serie af billeder, når det er nødvendigt7. Brug af image J software (tabel over materialer), måle morfologiske parametre såsom antallet af filialer (dvs. antallet af gren tips eller gren point), total Arbor gren længde, længde pr gren, længde og bredde af Arbor, overordnede form af Arbor (L/W cirkularitet) og vinklen på grenene7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den protokol, der er beskrevet i denne artikel, giver en succesrate på 30 − 60% af de injicerede Xenopus -embryoner, der udtrykker gfp (alene eller sammen med yderligere DNA-konstruktioner) i en til ti optiske axonal Arbors. I figur 3viser vi repræsentative konfokale billeder af gfp udtrykke kontrol og mutant optiske axonal Dorne i intakt xenopus haletudser fra vores nyligt offentliggjorte studie7. Til denne undersøgelse klonede vi to domæne mutanter af APC (APCNTERM og APCβ-cat) i pCS2 plasmider, og co-injiceres disse plasmider sammen med en pCS2-GFP mærkning plasmid i eyebuds af en dag gamle Xenopus embryoner. Figur 4 viser resultaterne af flere kvantitative målinger vi lavede på rekonstruktioner af kontrol og APC mutant axonal Arbors, herunder antallet af grene, total Arbor gren længde, og gennemsnitlig længde af grene.
Figur 3: repræsentative billeder af GFP udtrykker kontrol og mutant optiske axonal Arbors. (A) skematisk af MUTANTER af APC N-terminal og centrale domæne mutanter, der blev klonet i pCS2 Plasmids. (B) repræsentative konfokale billeder af Single gfp og gfp-APC mutant optiske axonal Dorne i tecta af intakt, levende xenopus Tadpoles. (C) rekonstruktioner af z-seriens billeder af gfp Control og APC mutant optiske axonal Arbors. Skala stænger = 30 μm (B), 40 μm (C). Dette tal er blevet ændret fra Jin et al.7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: kvantificering af morfologier af rekonstruktioner af kontrol og mutant axonal Arbors. Parceller af antal grene (A), total Arbor gren længde (B), og gennemsnitlig gren længde (C) Bekræft observerede forskelle mellem kontrol og APC mutant udtrykker axonal Arbors. Data i paneler A − C vises som procent af kontrol gennemsnit med SEM. * over data bjælke eller linje indikerer p < 0,05. Yderligere scatter plot af antal grene versus gennemsnitlig gren længde med regressions linjer viser omvendt korrelation mellem disse parametre i optiske axonal dorne, som udtrykker APC-domæner (D, E). Prøve numre: (A) gfp-12, APCNTERM – 18 APCβ-Cat-25; B) gfp-12, APCNTERM-16, APCβ-Cat-25; (C) gfp-11, APCNTERM-16, APCβ-Cat-25. Dette tal er blevet ændret fra Jin et al.7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel demonstrerer vi, hvordan man udtrykker eksogene DNA-konstruktioner i enkelt eller lille antal optiske neuroner, og hvordan man billede individuelle gfp udtrykker optiske axonal Dorne med normal og ændret Molekylær signalering i intakte, levende tadpoler af frøen X . laevis. Vi forklarer også, hvordan man rekonstruere og kvantificere morfologien af gfp udtrykker optiske axonal Dorne fra billeder fanget in vivo. For at udtrykke eksogene DNA-plasmider i et lille antal optiske neuroner, mikroinjicere vi en DNA/lipofection reagens blanding i eyebud primordia af en dag gamle Xenopus embryoner, ved hjælp af en teknik først udviklet i laboratoriet af Christine Holt at studere optik Axon pathfinding i unge haletudser9,10,19,20,21. Vi og andre har også anvendt denne DNA mikroinjektion/lipofection teknik til at studere molekylære mekanismer, der regulerer optisk Axon arborization i ældre intakt, levende X. laevis haletudser5,6, 7 , 8. denne billige, enkle procedure for forbigående, celle specifik transgenese giver bestemmelse af celle-autonome gen funktion i udviklingen af optiske axonal Dorne i et levende hvirveldyr model system.
Der er flere vigtige faktorer at overveje for bedste praksis, når mikroindsprøjtning DNA/DOTAP i øjen knopper af Xenopus embryoner. For det første bør DNA-koncentrationen, som anført i andre rapporter, være større end 1 μg/μl9,10. DNA-koncentrationer mellem 1 − 3 μg/μL er bedst, men DNA-koncentrationer så lavt som 0,7 μg/μL kan også anvendes. For det andet er mikroindsprøjtning af DNA i stadie 22 − 24 Xenopus -embryoner optimalt til eksperimenter, hvor målet er at undersøge mekanismer, der regulerer optisk axonal arborisering. I embryoner på disse udviklingsmæssige stadier, er eyebuds morfologisk differentieret og kan lettere målrettes injektion14. De fleste optiske neuroner i øjenbryn primordia af fase 22 − 24 embryoner er også post-mitotisk, hvilket resulterer i et mindre antal optiske neuroner udtrykker gfp, som igen giver mulighed for bedre opløsning, når Imaging individuelle gfp optiske axonal Dorne i Tadpoles. Endelig har tidligere undersøgelser vist, at eksogene gener udtrykkes ~ 8 timer efter lipofection9. Derfor udtrykker genkonstruktioner i eyebuds af stadie 22 − 24 embryoner betyder, at gener vil forstyrrer hverken celle skæbne udvælgelse af optiske neuroner eller den oprindelige udvækst af deres axons. En tredje faktor, der vil sikre succes, når mikroindsprøjtning DNA i xenopus embryo øjenbryn er, at DNA skal injiceres i en relativt overfladisk region af øjeæblens9,10. Indsprøjtning i mere dybe væv i eller omkring øjet vil resultere i en lavere procentdel af embryoner, der indeholder optiske neuroner udtrykker eksogene DNA10.
Der er også flere spørgsmål at være opmærksom på, når billeddannelse og rekonstruere gfp udtrykker optiske axonal Dorne i intakt, levende xenopus Tadpoles. For det første bør forskerne kun fange billeder af tectal halvkugler, der indeholder mellem en til tre GFP udtrykker optiske axonal Arbors. Hvis et enkelt billede indeholder mere end tre gfp udtrykker optiske axonal dorne, de Dorne er tilbøjelige til at have overlappende grene, som vil gøre det vanskeligt at definere de enkelte Dorne under genopbygningsprocessen. Et andet spørgsmål at være opmærksom på, er, at genopbygningen og kvantificering af optisk axonal Arbor morfologi er de mest tidskrævende trin i denne protokol. Vi anslår, at rekonstruere og kvantificere optisk axonal Arbor morfologi kræver ca. 80 − 90% af den samlede tid af eksperimentet. Selv om der er udviklet teknikker til at automatisere genopbygningen af tectal neuron dendritiske dorne, disse beregningsmæssige metoder er endnu ikke blevet anvendt til optiske axonal Dorne samt22. Selvom omstændelig, processen med at rekonstruere optisk Arbor morfologi dramatisk øger forskernes forståelse af detaljerne i optisk axonal Arbor morfologi. Denne ekstra detalje, til gengæld betydeligt forbedrer kvaliteten af billeder af gfp udtrykker Dorne disse forskere er i stand til at fange i fremtidige eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Touro University California College for osteopatisk medicin for at støtte vores forskning. Vi anerkender tidligere studerende i laboratoriet (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John lim), der hjalp med at implementere denne mikroinjektionsteknik i vores laboratorium. Vi er taknemmelig for Dr. Christine Holt, i hvis laboratorium denne DNA mikroinjektion/lipofection teknik i Xenopus embryoner blev først udviklet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
