Summary
Dieses Protokoll soll zeigen, wie man ein DNA/DOTAP-Gemisch in Augenknospen von eintägigen Xenopus laevis Embryonen mikroinjiziert und wie man einzelne grüne fluoreszierende Proteine (GFP) abbilden und rekonstruieren kann, die optische axonale Lauben in tektalen Midhirnen von intakte, lebende Xenopus Kaulquappen.
Abstract
Die primäre visuelle Projektion von Kaulquappen des Wasserfrosches Xenopus laevis dient als ausgezeichnetes Modellsystem zur Untersuchung von Mechanismen, die die Entwicklung neuronaler Konnektivität regulieren. Bei der Etablierung der retino-tektalen Projektion erstrecken sich optische Axone vom Auge aus und navigieren durch verschiedene Regionen des Gehirns, um ihr Zielgewebe, das optische Tectum, zu erreichen. Sobald optische Axone in das Tectum eindringen, erarbeiten sie Klemmenlaube, die die Anzahl der synaptischen Verbindungen erhöhen, die sie mit Zielinterneuronen im Tectum herstellen können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Exodierung von DNA-Kodierung von grünem fluoreszierendem Protein (GFP) und Gain- und Verlust-von-Funktions-Genkonstrukte in optischen Neuronen (retinalen Ganglienzellen) in Xenopus-Embryonen. Wir erklären, wie man ein kombiniertes DNA/Lipofection-Reagenz in Augenknospen von eintägigen Embryonen mikroinjiziert, so dass exogene Gene in einer oder einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen exprimiert werden. Durch Taggen mit GFP oder Co-Injektion mit einem GFP-Plasmid können terminale axonale Arbors einzelner optischer Neuronen mit veränderter molekularer Signalisierung direkt in Gehirnen intakter, lebender Xenopus-Kaulquappen einige Tage später und deren Morphologie abgebildet werden. quantifiziert werden kann. Dieses Protokoll ermöglicht die Bestimmung zellautonomer molekularer Mechanismen, die der Entwicklung der optischen Axonarborisation in vivo zugrunde liegen.
Introduction
Während der Entwicklung des Nervensystems navigieren Axone von präsynaptischen Neuronen durch verschiedene Regionen des Gehirns, um ihre Zielbereiche zu erreichen. Wenn Axone in ihr Zielgewebe eindringen, stellen sie synaptische Verbindungen mit postsynaptischen Zielneuronen her. In vielen Arten von Neuronen erhöhen Axone die Anzahl und räumliche Ausdehnung der synaptischen Verbindungen, diesie durch die Ausarbeitung von Netzwerken von Terminalzweigen oder Lauben 1 herstellen können. Die retinotektale Projektion von Kaulquappen des Wasserfrosches Xenopus laevis ist ein leistungsfähiges Wirbeltiermodell zur Untersuchung von Mechanismen, die der terminalen Axonarborisation und synaptischen Konnektivität zugrunde liegen2,3,4 . Individuelle GFP-Exzessionen mit optischen axonalen Lauben mit normaler und veränderter molekularer Signalisierung können direkt in intakten, lebenden Xenopus-Kaulquappen 5,6,7,8beobachtet werden. Um GFP allein oder zusammen mit in voller Länge oder abgeschnittenen Versionen von Genen in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen auszudrücken, verwenden wir eine Technik, bei der die Mikroinjektion/Lipofection von DNA in Augenknospen von eintägigen Xenopus-Embryonen 9, 10. Diese Technik wurde ursprünglich entwickelt, um Mechanismen der optischen Axon-Pfadfindung in jungen Xenopus-Kaulquappen zu untersuchen, und wurde seitdem von uns und anderen angewendet, um zellautonome molekulare Mechanismen zu bestimmen, die dem optischen Axon zugrunde liegen. Arborisation in Xenopus Kaulquappen5,6,7,8,9,10.
Alternative Techniken zur Exjegung exogener Gene in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen wurden in anderen Modellarten sowie in X. laevisentwickelt. Jeder dieser Ansätze stellt jedoch Herausforderungen und Einschränkungen dar, wenn man sie mit der Mikroinjektion von DNA/Lipofektionsreagenz in Augenknospen von Xenopus-Embryonen vergleicht. Bei Mäusen kann die Transgenese verwendet werden, um Gene in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen auszudrücken, aber die Erzeugung von transgenen Mäusen ist teuer und zeitaufwändig und transgene Mäuse sind oft mit unerwünschten Nebenwirkungen vorhanden11. Transgene Zebrafische, die exogene Gene in optischen Neuronen ausdrücken, können auch durch Injektion von Plasmiden in Embryonen im frühen Spaltungsstadium12entstehen. Dieser Prozess erfordert jedoch das Klonen eines bestimmten Promotors, um Gene in einem Mosaikmuster in optischen Neuronen in Zebrafischlarvenauszudrücken 12. Die Expressionshäufigkeit exogener DNA in optischen Neuronen bei transgenen Zebrafischen ist ebenfalls etwas geringer (<30%) im Vergleich zu Xenopus-Kaulquappen, die mit DNA/liposomalem Reagenz mikroinjiziert wurden (30 bis 60%)12. In ovo Elektroporation wurde auch verwendet, um Gene in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen in Kükenauszudrücken 13. Dieses Verfahren hat jedoch nicht die Mechanismen vollständig charakterisiert, die optische Projektionen herstellen, da die optische Axonarborisation nicht in intakten, lebenden Kükenembryonen abgebildet werden kann. Schließlich haben mehrere Laboratorien Elektroporation verwendet, um Gene in eine kleine Anzahl von optischen Neuronen in Xenopus Kaulquappen14,15zu transfekieren. Dennoch erfordert die Elektroporation eine Optimierung der Ausrüstung und Protokolle (Stimulator, Elektroden, räumliche und zeitliche Muster von Wellenimpulsen) über die für die Mikroinjektion von DNA/Lipofektionreagenz in Augenknospen von Xenopus-Embryonen verwendeten Daten.
Wir und andere haben zuvor die Technik der Mikroinjektion/Lipofektion von DNA in Augenknospen von Xenopus-Embryonen verwendet, um zellautonome Signalmechanismen zu bestimmen, die eine optische Axonarborisation 5,6, 7 , 8. Diesen Ansatz haben wir zunächst verwendet, um die Funktionen des Cadherin- und Wnt-Adapterproteins in der optischen axonalen Arborisierung in Xenopus-Kaulquappen 5,6zu sezieren. In einer Studie zeigten wir, dass die Bindung von '-Catenin an '-Catenin bzw. an PDZ für die Initiierung und Formgebung optischer axonaler Lauben in vivo5erforderlich ist. In einem zweiten Bericht haben wir gezeigt, dass die Bindungsdomänen für die A-Catenin- und GSK-3-Bindungsmuster von ventralen optischen axonalen Arbors6. In jüngerer Zeit haben wir Rollen für den Wnt-Faktor, adenomatous poliposis coli (APC), bei der Regulierung morphologischer Merkmale von optischen axonalen Lauben in Xenopus Kaulquappen7identifiziert. Durch die Ko-Exjekierung der N-Terminal und zentrale Domänen von APC, die die Organisation von A-Catenin-Stabilität und Mikrotubuli zusammen mit GFP in einzelnen optischen Neuronen modulieren, haben wir gemeinsame und unterschiedliche Rollen für diese APC-Interaktionsdomänen auf Zweignummer bestimmt. Länge und Winkel in optischen axonalen Lauben in vivo7. Ein anderes Labor verwendete die Mikroinjektions-/Lipofektionstechnik, um zellautonome Rollen für die Signalisierung durch den BDNF-Rezeptor TrkB in optischen axonalen Lauben in Xenopus Kaulquappen8zu bestimmen. Diese Gruppe zeigte, dass die Expression einer dominant-negativen TrkB gestörtverzweigte Verzweigung und synaptische Reifung in einzelnen optischen Axon-Arbors in vivo8. Insgesamt hat die Lipofektionstechnik in Xenopus bereits die spezifischen Rollen verschiedener Gene bei der optischen Axonverzweigung in der nativen Umgebung beleuchtet.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Touro University California (Protokoll TUCA003TE01X) genehmigt.
1. Beschaffung von X. laevis Embryonen
- Erhalten Sie X. laevis Embryonen durch natürliche Paar ungerührter männlicher und weiblicher erwachsener Frösche, die mit humanem Choriongonadotropin (HCG) grundiert sind, durch In-vitro-Fertilisation von Eiern, die von weiblichen erwachsenen Fröschen, die mit HCG grundiert sind, vergossen wurden, oder durch direkte Bestellung (Tabelle Materialien).
-
Entgelee-Embryonen, die mit einer 2% Cysteinlösung bei Raumtemperatur (Materialtabelle) erhalten werden16.
- Sammeln Sie 50 bis 100 Embryonen in einer großen Petrischale. Entfernen Sie die Lösung, in der sich die Embryonen befinden, indem Sie eine Kunststoff-Transferpipette dekantieren oder verwenden. 25 ml 2% Cysteinlösung (0,5 g Cystein in 25 ml ddH2O, pH bis 8,0) in die Schale geben, die die Embryonen enthält.
- Die Petrischale, die die Embryonen in der Cysteinlösung enthält, sanft zu wirbeln, bis die Geleemäntel der Embryonen abfallen und sich die Embryonen in einem Klumpen in der Mitte der Schale sammeln (5 x 10 min). An dieser Stelle, langsam und sanft gießen Sie die Cystein-Lösung in ein Abfallbecher. Achten Sie darauf, nicht zu viele der Embryonen in das Abfallbecher glasiert zusammen mit der Cystein-Lösung zu gießen.
- Spülen Sie die Embryonen in der Petrischale 6x mit 10% modifizierter Mark es Ringer-Lösung (MMR) oder einer anderen geeigneten Lösung (z.B. modifizierte Barth-Lösung, MBS), die die Schale jedes Mal verwirbelt, wenn die Lösung ersetzt wird.
- Kultur die Embryonen in 10% MMR, bis sie Entwicklungsstadien erreichen 22-2417. Xenopus-Embryonen können bei Temperaturen zwischen 15 und 25 °C inkubiert werden. Die Entwicklungsrate der Embryonen hängt von der Temperatur ab, die sie bei17inkubiert.
HINWEIS: Xenopus-Embryonen, die aus einem Katalog bestellt wurden, kommen in der Regel in der Entwicklungsphase 20-24 im Labor an, so dass sie sofort entjelziert und mikroinjiziert werden können.
2. Vorbereitung von DNA-Plasmiden und Herstellung einer DNA/DOTAP-Mischung
- Subklon-DNA-Expression konstruktiert in Xenopus Expressionsvektoren pCS2+ oder pCS2+MT oder Derivate davon (ursprünglich konstruiert von D. Turner und R. Rupp)5,6,7. pCS2+-Vektoren enthalten einen modifizierten Cytomegalievirus-Promotor (CMV), der die Genexpression bei Fröschen erleichtert.
- Amplify pCS2 Plasmide, die GFP und/oder Gene von Interesse mit Miniprep-Kits (Tabelle der Materialien) nach dem Standardverfahren enthalten. Führen Sie im letzten Elutionsschritt des Miniprep-Protokolls eine sequenzielle Elution der DNA in ddH2O durch, um eine Endkonzentration von >1 g/l zu ergeben.
- Speichern Sie alle pCS2-Plasmide bei -80 °C, bis sie bereit sind, ein Mikroinjektions-/Lipofektionsexperiment durchzuführen, d. h. wenn sich Embryonen in der Entwicklungsphase von 22 bis 24 befinden.
- Tauen SIE DNA-Plasmide, die bei Raumtemperatur lipofiert werden. Unmittelbar vor der Lipofektion kurz Zentrifugieren DNA Plasmide. Dadurch wird verhindert, dass sich ausgefällt in der DNA/DOTAP-Mischung gebildet wird, die die Spitze der Mikrokapillarpipette verstopfen könnte.
- Kombinieren Sie DNA-Plasmide mit dem LIPOsomalen Transfektionsreagenz DOTAP (Materialtabelle) mit einem Verhältnis von 1:3 (w/v)9,10. Übertragen Sie z. B. 2 g DNA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, und fügen Sie 6 l DOTAP hinzu, oder übertragen Sie 3 g DNA in ein Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie 9 l DOTAP hinzu.
- Sobald DNA und DOTAP kombiniert sind, streichen Sie vorsichtig das Mikrozentrifugenrohr, um die Lösung zu mischen. Die DNA/DOTAP-Lösung sollte nach dem Mischen leicht undurchsichtig werden.
- Sollen zwei Plasmide (z. B. pCS2-GFP mit einem zweiten pCS2-Plasmid, das eine abgeschnittene oder vollwertige Version eines Gens enthält) in optischen Neuronen lipofectiert werden, kombinieren Sie zunächst die beiden Plasmide (nach kurzzeitiger Zentrifugierung beider) im Verhältnis 1:1 und DOTAP im Verhältnis 1:3 (w/v). Kombinieren Sie z. B. 1 g pCS2-GFP mit 1 g eines zweiten pCS2-Plasmids, und fügen Sie dann 6 l DOTAP hinzu.
HINWEIS: Studien haben gezeigt, dass die Lipofektion von zwei Plasmiden in Augenknospen von Xenopus-Embryonen in diesen Entwicklungsstadien zu ihrer Ko-Expression in einzelnen optischen Neuronen9,10führen wird.
3. Laden einer Mikroinjektionsnadel mit DNA/DOTAP
- Schneiden Sie vorsichtig die Spitze einer gezogenen Glasmikrokapillarpipette mit feinen Zangen (Tisch der Materialien).
- Füllen Sie die Mikrokapillarpipeette aus Glas mit Mineralöl mit einem Mikrofil, so dass an der abgeschnittenen Spitze der Mikropipette ein winziger Tropfen Mineralöl erscheint. Füllen Sie die mikrokapillare Pipette auf halbem Weg mit Mineralöl.
- Laden Sie die mit Mineralöl gefüllte Mikrokapillarpipette aus gezogenem Glas in einen geeigneten Injektionshalter, der mit einem Injektor verbunden ist. Wenn Sie einen Injektor (Materialtabelle)verwenden, werfen Sie den Kolben auf halbem Weg aus, bevor Sie die Mikrokapillarpipette darauf laden. Sobald die Mikrokapillarpipetette sicher am Injektor befestigt ist, verlängern Sie den Kolben in vollem Umfang, um zu bestätigen, dass die Mikrokapillarpipette stark am Injektor befestigt ist und sich nicht mit der Verlängerung des Kolbens bewegt.
- Übertragen Sie einen 3-L-Tropfen des DNA/DOTAP-Gemischs auf ein geschnittenes quadratisches (1 Zoll quadratisches) Blatt Paraffinpapier.
- Bewegen Sie unter einem Stereo-Sezierendes Mikroskop die Spitze der Mikrokapillarpipetten aus Glas in den DNA/DOTAP-Tropfen.
- Saugen Sie den DNA/DOTAP-Tropfen langsam in die Mikrokapillarpipetten aus Glas mit der Fülloption am Injektionsapparat. Wenn die Flüssigkeit in die Mikrokapillarpipette geladen wird, wird der Tropfen kleiner. Aufgrund der geringen Opazität der DNA/DOTAP-Lösung sollte die Grenze zwischen dem Mineralöl und der DNA/DOTAP-Lösung in der Mikrokapillarpipette aus Glas sichtbar sein (Abbildung 1). Beenden Sie bei Bedarf die regelmäßige Füllung der Mikrokapillarpipette, damit der Druck in der Mikrokapillarpipeette aus Glas neu kalibriert werden kann.
Abbildung 1: Bilder der Mikrokapillarpipette. Die Bilder zeigen eine mikrokapillare Pipette auf dem Injektionsapparat, vor (A) und nach (B) Füllung mit DNA/DOTAP. Offene Pfeile, Kolbenspitze in der Mikrokapillarpipette (A,B). Geschlossener Pfeil, Linie zwischen Mineralöl und DNA/DOTAP in der gefüllten Mikrokapillarpipette (B). Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
4. Mikroinjizieren von DNA/DOTAP in Augenknospen von 1 Tag alten Xenopus-Embryonen
- Leiten Sie zehn Stufe 20-24 Xenopus-Embryonen mit feiner Zange in einer 10 mm Petrischale, die mit 0,1x MMR gefüllt ist, manuell ab. Greifen Sie die Vitelline-Hülle an der Taille, um die Embryonen nicht zu verletzen. Mit Zangen in den linken und rechten Händen des Experimentators, pop die Blase der Vitelline-Hülle und lassen Sie den Embryo aus der Vitelline-Hülle. Achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu verletzen, wenn Sie die Vitelline-Hülle entfernen.
HINWEIS: Ab Stadium 20 entwickeln Xenopus-Embryonen eine Einrückung oder "Taille" zwischen der vorderen und der hinteren Hälfte des Embryos. Diese Taille ermöglicht eine Lücke zwischen der Vitelline-Hülle und dem Embryo an dieser Position zu bilden. - Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit einer geschnittenen Spitze, um 5-10 abwertende Stage 22-24-Embryonen auf eine 10 mm Petrischale zu übertragen, die mit 1x MMR gefüllt ist.
HINWEIS: Die höhere Salzlösung in 1x MMR erleichtert die Heilung von Stichwunden, die sich aus der Mikroinjektion ergeben. - Greifen Sie unter dem Stereomikroskop einen der abwertenden Embryonen in der Petrischale mit Zangen in jeder Hand und ordnen Sie den Embryo so an, dass sein vorderer Pol im Sichtfeld nach oben zeigt. Richten Sie den Embryo so aus, dass er seitlich liegt und eine seiner Augenknospen (links oder rechts) nach oben zeigt.
- Halten Sie den Embryo unter dem Stereomikroskop mit der Zange in der nicht-dominanten Hand des Experimentators und führen Sie mit der dominanten Hand des Experimentators die Spitze der Glasmikropipette in die Augenknospe ein (von der ventralen oder dorsalen Seite, je nach der Hälfte der embryo, der derzeit injiziert wird), direkt unter der Epidermis (Abbildung 2). Injizieren Sie zwischen 70-210 nL der DNA/DOTAP-Lösung. Dies kann in mehreren Impulsen erfolgen, abhängig von der Größe des Impulses, auf den der Injektor eingestellt ist (normalerweise 70 nL).
HINWEIS: Die Tiefe der Injektion ist sehr wichtig für Lipofection in optische Neuronen. Wenn die Position der Spitze der Mikrokapillare sehr oberflächlich sehr oberflächlich in die Augenknospe eingeführt wird, dann schwillt nach der Mikroinjektion die graue Epidermis, die die Augenknospe überlagert, an. Wenn die Position zu tief ist, zeigt die graue Augenknospe keine Veränderungen, und die Häufigkeit der Expression von DNA in optischen Neuronen wird niedriger sein. - Drehen Sie den Embryo um und führen Sie die gleiche Mikroinjektion in die Augenknospe auf der kontralateralen Seite des Embryos durch.
- Injizieren Sie beide Augenknospen von 6-10 (oder mehr) Embryonen in jedem Experiment.
- Nach der Mikroinjektion Embryonen in einer Petrischale mit 1x MMR ca. 30 min lagern, um die Wundheilung zu erleichtern.
- Nach 30 min übertragen Sie injizierte Embryonen in eine 0,1x MMR-Lösung mit 0,001% Bleichmittel (Phenylthiocarbamid), um die Pigmentierung zu reduzieren. Kultur die Embryonen bedeckt für etwa fünf Tage, bis die Embryonen haben sich zu Kaulquappen in den Stadien 46-4716entwickelt.
Abbildung 2: Abgrenzung der Augenknospenregion für die Mikroinjektion. Schematische (A) und Photomikroskopie (B) des X. laevis Embryos in den Entwicklungsstadien 22/23 zeigen augenknospenediere, die für die Mikroinjektion ins Visier genommen werden sollten (rote Highlights). Maßstabsleiste = 1 mm. Panel A wurde von Zahn et al.18modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
5. Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Tadpoles
HINWEIS: Wenn Kaulquappen, die mit DNA lipofected wurden, Entwicklungsstadien erreichen 46-47, sind sie bereit für die Bildgebung.
- Vor der Bildgebung müssen Kaulquappen anästhetisiert werden. Um Kaulquappen zu anästhesieren, die lipofected Kaulquappen in eine 0,02% Tricainlösung in ddH2O in einer 10 mm Petrischale übertragen. Warten Sie 5 bis 10 min, bis Diekaulen unbeweglich werden. Vergewissern Sie sich, dass Kaulquappen noch am Leben sind, indem Sie ihre schlagenden Herzen unter einem Stereo-Sezierendes Mikroskop beobachten.
- Legen Sie eine anästhesierte Kaulquappe in eine maßgeschneiderte Silikonkammer auf eine Glasrutsche und versiegeln Sie sie mit einem Deckel. Die Kaulquappe sollte leicht geneigt werden, so dass eine Seite (links oder rechts) ihres Kopfes nach oben geneigt ist und den Deckelschlupf nur knapp berührt.
- Sieb die Hälfte des dorsalen tektalen Mittelhirns der Kaulquappe, die bei geringer Vergrößerung nach oben geneigt ist, um die optischeaxonale Laube zu exdrücken.
HINWEIS: Ein Aufrechtemikroskop mit Epilfuoreszenzbeleuchtung und einer apochromatischen Objektivlinse (Materialtabelle) kann zum Abschirmen von fluoreszierenden Lauben verwendet werden. - Wenn die tektale Hemisphäre zwischen ein bis drei GFP exektiert optische axonale Lauben enthält, erfassen Sie eine Z-Serie von Bildern dieser Lauben mit einem hohen Kontrast 40x Luft lange Arbeitsstrecke Objektiv (Tabelle der Materialien). Erfassen Sie für jede axonale Laube 10 bis 20 Z-Serienscheiben in Intervallen von 1,5 m.
- Um Axon-Arboren auf der anderen Seite des tektalen Mittelhirns zu betrachten, laden Sie die Kaulquappe in die Siliziumkammer neu, so dass sie auf die andere Seite kippt und mit einem Deckelschlupf versiegelt wird. Wiederholen Sie dann die Schritte 5.3 und 5.4.
6. Rekonstruktion und Quantifizierung der optischen Axonal Arbor Morphologie
- Wählen Sie einen Bildstapel aus, der zwischen einem und drei GFP-ausdrückenden optischen axonalen Lauben enthält.
- Verwenden Sie das Freihand-Zeichnungswerkzeug in der Grafikbearbeitungssoftware (Tabelle der Materialien), um den Teil jeder optischen axonalen Laube zu verfolgen, die in jedem Z-Slice sichtbar ist. Die Verfolgung der Stücke jeder Laube, die in jedem Z-Slice sichtbar ist, erzeugt eine genaue 2D-Projektion der Laube. Verschiedene Farben können verwendet werden, um unterschiedliche GFP-ausdrückende optische axonale Lauben zu verfolgen.
- Machen Sie alle morphometrischen Messungen an 2D-Rekonstruktionen der axonalen Lauben, in Bezug auf die ursprüngliche Z-Serie von Bildern, wenn nötig7. Mit Bild J-Software (Materialtabelle), messen Sie morphologische Parameter wie die Anzahl der Zweige (d. h. Anzahl der Zweigspitzen oder Zweigpunkte), die Gesamtlänge des Laubenzweigs, die Länge pro Ast, die Länge und die Breite der Laube, die Gesamtform der Laube (L/W Verhältnis, Zirkularität) und Winkel der Zweige7.
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Representative Results
Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll ergibt eine Erfolgsrate von 30 bis 60% der injizierten Xenopus-Embryonen, die GFP (allein oder zusammen mit einem zusätzlichen DNA-Konstrukt) in ein bis zehn optischen axonalen Lauben exzieren. In Abbildung 3zeigen wir repräsentative konfokale Bilder von GFP, die Kontrolle und mutierte optische axonale Lauben in intakten Xenopus Kaulquappen aus unserer kürzlich veröffentlichten Studie7ausdrücken. Für diese Studie haben wir zwei Domänenmutanten von APC (APCNTERM und APC-cat) in pCS2-Plasmide geklont und diese Plasmide zusammen mit einem pCS2-GFP-Kennzeichnungsplasmid in Augenknospen von eintägigen Xenopus-Embryonen injiziert. Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse mehrerer quantitativer Messungen, die wir an Rekonstruktionen der Kontroll- und APC-mutierten axonalen Lauben durchgeführt haben, einschließlich der Anzahl der Zweige, der Gesamtlänge des Laubenzweigs und der mittleren Länge der Zweige.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von GFP, die Kontrolle und mutierte optische axonale Lauben ausdrücken. (A) Schematische Mutanten von APC N-terminal enden und zentralen Domänenmutanten, die in pCS2-Plasmide geklont wurden. (B) Repräsentative konfokale Bilder einzelner GFP- und GFP-APC-mutierter optischer axonaler Lauben in tecta intakter, lebender Xenopus-Kaulquappen. (C) Rekonstruktionen von Bildern der Z-Serie der GFP-Steuerung und APC-mutierten optischen axonalen Lauben. Skalenstäbe = 30 m (B), 40 m (C). Diese Zahl wurde von Jin et al.7geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Quantifizierung von Morphologien von Rekonstruktionen von Kontroll- und mutierten axonalen Lauben. Plots der Anzahl der Zweige (A), gesamtarben Zweiglänge (B), und mittlere Zweiglänge (C) bestätigen beobachtete Unterschiede zwischen Kontrolle und APC Mutanten, die axonale Lauben ausdrücken. Die Daten in den Bedienfeldern A-C werden als Prozent des Steuermittels mit SEM angezeigt. *über Datenbalken oder -zeile zeigt p < 0,05 an. Zusätzliche Streudiagramme mit einer Anzahl von Zweigen im Vergleich zur mittleren Verzweigungslänge mit Regressionslinien zeigen eine inverse Korrelation zwischen diesen Parametern in optischen axonalen Lauben, die APC-Domänen (D, E )exdrücken. Beispielnummern: (A) GFP-12, APCNTERM–18 APC-cat-25; (B) GFP-12, APCNTERM-16, APC-cat-25; (C) GFP-11, APCNTERM-16, APC-cat-25. Diese Zahl wurde von Jin et al.7geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In diesem Artikel zeigen wir, wie man exogene DNA-Konstrukte in einer oder einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen ausdrückt und wie man einzelne GFP-Ausdrücke von optischen axonalen Lauben mit normaler und veränderter molekularer Signalisierung in intakten, lebenden Kaulquappen des Frosches X . laevis. Wir erklären auch, wie die Morphologie des GFP zu rekonstruieren und zu quantifizieren, die optische axonale Lauben aus Bildern ausdrückt, die in vivo aufgenommen wurden. Um exogene DNA-Plasmide in einer kleinen Anzahl von optischen Neuronen auszudrücken, injizieren wir ein DNA/Lipofection Reagenz-Gemisch in die Augenknospenprimordie von eintägigen Xenopus-Embryonen, mit einer Technik, die zuerst im Labor von Christine Holt entwickelt wurde, um Axon Pathfinding in jungen Kaulquappen9,10,19,20,21. Wir und andere haben auch diese DNA-Mikroinjektion/Lipofection-Technik angewendet, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die die optische Axonarborisierung in älteren intakten, lebenden X. laevis Kaulquappen5,6, regulieren. 7 , 8. Dieses kostengünstige, einfache Verfahren zur transienten, zellspezifischen Transgenese ermöglicht die Bestimmung der zellautonomen Genfunktion bei der Entwicklung optischer axonaler Lauben in einem lebenden Wirbeltiermodellsystem.
Es gibt mehrere wichtige Faktoren, die für Best Practices bei der Mikroinjektion von DNA/DOTAP in Augenknospen von Xenopus-Embryonen zu berücksichtigen sind. Erstens sollte, wie in anderen Berichten erwähnt, die DNA-Konzentration größer als 1g/l 9,10sein. Am besten sind DNA-Konzentrationen zwischen 1,3 g und l, aber es können auch DNA-Konzentrationen von bis zu 0,7 g/l verwendet werden. Zweitens ist die Mikroinjektion von DNA in die Xenopus-Embryonen der Stufe 22 bis 24 optimal für Experimente, bei denen das Ziel darin besteht, Mechanismen zu untersuchen, die die optische axonale Arborisierung regulieren. In Embryonen in diesen Entwicklungsstadien sind Augenknospen morphologisch differenziert und können leichter für die Injektion14gezielt werden. Die meisten optischen Neuronen in der Augenknospenprimordia der 22-24-Embryonen im Stadium sind ebenfalls postmitotisch, was zu einer geringeren Anzahl von optischen Neuronen führt, die GFP exprimieren, was wiederum eine bessere Auflösung bei der Abbildung einzelner GFP-optischer axonaler Lauben in Kaulquappen ermöglicht. Schließlich haben frühere Studien gezeigt, dass exogene Gene nach Lipofektion98 h exprimiert werden. Daher bedeutet die Extierung von Genkonstrukten in Augenknospen von Embryon des Stadiums 22-24, dass die Gene weder die Zellschicksalsauswahl von optischen Neuronen noch das anfängliche Auswachsen ihrer Axone stören werden. Ein dritter Faktor, der den Erfolg bei der Mikroinjektion von DNA in Xenopus Embryo-Augenknospen sicherstellen wird, ist, dass die DNA in eine relativ oberflächliche Region der Augenknospe9,10injiziert werden sollte. Die Injektion in tiefere Gewebe in oder um die Augenknospe führt zu einem geringeren Prozentsatz an Embryonen, die optische Neuronen enthalten, die die exogene DNA10exdrücken.
Es gibt auch mehrere Probleme zu beachten, wenn Bildgebung und Rekonstruktion GFP ausdrücken optische axonale Lauben in intakten, lebenden Xenopus Kaulquappen. Erstens sollten Forscher nur Bilder von tektalen Hemisphären erfassen, die zwischen ein bis drei GFP enthalten, die optische axonale Lauben exdrücken. Wenn ein einzelnes Bild mehr als drei GFP-ausdrückende optische axonale Lauben enthält, haben die Lauben wahrscheinlich überlappende Zweige, was es schwierig macht, die einzelnen Lauben während des Rekonstruktionsprozesses zu definieren. Ein weiteres Problem, das man sich bewusst sein sollte, ist, dass die Rekonstruktion und Quantifizierung der optischen axonalen Baumbormorphologie die zeitaufwändigsten Schritte in diesem Protokoll sind. Wir schätzen, dass die Rekonstruktion und Quantifizierung der optischen axonalen Arbormorphologie etwa 80 bis 90 % der Gesamtzeit des Experiments erfordern. Obwohl Techniken entwickelt wurden, um die Rekonstruktion von tektalen neuronen dendritischen Lauben zu automatisieren, wurden diese Rechenmethoden noch nicht auf optische axonale Lauben sowie22angewendet. Obwohl mühsam, erhöht der Prozess der Rekonstruktion der optischen Laubenmorphologie dramatisch das Verständnis der Forscher für die Details der optischen axonalen Laubenmorphologie. Dieses zusätzliche Detail wiederum verbessert die Qualität der Bilder von GFP-ausdrückenden Lauben, die diese Forscher in zukünftigen Experimenten erfassen können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken dem Touro University California College of Osteopathic Medicine für die Unterstützung unserer Forschung. Wir würdigen frühere Studenten im Labor (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim), die bei der Implementierung dieser Mikroinjektionstechnik in unserem Labor geholfen haben. Wir danken Dr. Christine Holt, in deren Labor diese DNA-Mikroinjektions-/Lipofektionstechnik in Xenopus-Embryonen zum ersten Mal entwickelt wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
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- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
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