Summary
Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come microiniettare una miscela DNA/DOTAP in boccioli di occhiali di embrioni di Xenopus laevis di un giorno, e come immaginare e ricostruire singole proteine fluorescenti verdi (GFP) che esprimono arbori assonali ottici nei midbrain intatti, vivono girini Xenopus.
Abstract
La proiezione visiva primaria dei girini della rana acquatica Xenopus laevis serve come un eccellente sistema modello per studiare i meccanismi che regolano lo sviluppo della connettività neuronale. Durante la creazione della proiezione retino-tectale, gli assoni ottici si estendono dall'occhio e navigano attraverso regioni distinte del cervello per raggiungere il loro tessuto bersaglio, il tectum ottico. Una volta che gli assoni ottici entrano nel tectum, elaborano arbori terminali che funzionano per aumentare il numero di connessioni sinaptiche che possono fare con interneuroni bersaglio nel tectum. Qui, descriviamo un metodo per esprimere il DNA che codifica la proteina fluorescente verde (GFP), e i costrutti genici di guadagno e perdita di funzione, nei neuroni ottici (cellule gangliari retiniche) negli embrioni di Xenopo. Spieghiamo come microinietare un reagente combinato DNA/lipofection in bulbi oculari di embrioni vecchi di un giorno in modo tale che i geni esogeni siano espressi in un numero singolo o piccolo di neuroni ottici. Etichettando i geni con GFP o co-iniettando con un plasmide GFP, gli arbori assonali terminali di singoli neuroni ottici con segnalazione molecolare alterata possono essere immagine direttamente nel cervello di girini Dello Xenopo intatti diversi diversi diversi diversi giorni dopo, e la loro morfologia può essere quantificato. Questo protocollo consente la determinazione di meccanismi molecolari auto-autonomi alla base dello sviluppo dell'arborizzazione ottica degli assoni in vivo.
Introduction
Durante lo sviluppo del sistema nervoso, assoni di neuroni pressinaptici navigare attraverso diverse regioni del cervello per raggiungere le loro aree di destinazione. Quando gli assoni invadono i loro tessuti bersaglio, stabiliscono connessioni sinaptiche con neuroni bersaglio postsinaptici. In molti tipi di neuroni, gli assoni aumentano il numero e l'estensione spaziale delle connessioni sinaptiche che possono effettuare elaborando reti di rami terminali o arbori1. La proiezione retino-tectale dei girini della rana acquatica Xenopus laevis è un potente modello vertebrato per esaminare i meccanismi alla base dell'arborizzazione degli assoni terminali e della connettività sinaptica2,3,4 . I singoli pergolato assonali ottici che esprimono pergolato ottico con segnalazione molecolare normale e alterata possono essere osservati direttamente in giri di Xenopus intatti, viventi 5,6,7,8. Per esprimere gFP da solo o insieme a versioni a lunghezza intera o troncate di geni in un piccolo numero di neuroni ottici, utilizziamo una tecnica che coinvolge microiniezione / lipofezione di DNA in boccioli di un giorno vecchi embrioni Xenopi 9, 10. Questa tecnica è stata originariamente sviluppata per studiare i meccanismi di ricerca del percorso degli assoni ottici nei giovani girini Xenopus, e da allora è stata applicata da noi e da altri per determinare i meccanismi molecolari autonomi delle cellule alla base dell'assone ottico arborizzazione in girini Dienopus 5,6,7,8,9,10.
Tecniche alternative per esprimere geni esogeni in un piccolo numero di neuroni ottici sono stati sviluppati in altre specie modello, così come in X. laevis. Tuttavia, ognuno di questi approcci presenta sfide e limitazioni rispetto alla microiniezione di DNA/lipofection reagente in eyebuds di embrioni Xenopus. Nei topi, la transgenesi può essere utilizzata per esprimere geni in un piccolo numero di neuroni ottici, ma la generazione di topi transgenici è costosa e richiede tempo e topi transgenici spesso presentano effetti collaterali indesiderati11. Il pesce zebra transgenico che esprime geni esogeni nei neuroni ottici può anche essere creato iniettando plasmidi negli embrioni dello stadio di scissione precoce12. Tuttavia, questo processo richiede la clonazione di un promotore specifico per esprimere i geni in un modello a mosaico nei neuroni ottici nelle larve del pesce zebra12. Anche la frequenza di espressione del DNA esogeno nei neuroni ottici nei pesci zebra transgenici è leggermente inferiore (<30%) rispetto ai girini di Xenopus che sono stati microiniettati con reagente di DNA/liposomal (30-60%)12. Nell'elettroporazione ovocale è stato utilizzato anche per esprimere i geni in un piccolo numero di neuroni ottici nei pulcini13. Tuttavia, questa procedura non è riuscita a caratterizzare completamente i meccanismi che stabiliscono proiezioni ottiche perché l'arborizzazione ottica degli assoni non può essere immagine in embrioni di pulcino vivi e intatti. Infine, diversi laboratori hanno utilizzato l'elettroporazione per trasfecare i geni in un piccolo numero di neuroni ottici nei girini di Xenopus 14,15. Tuttavia, l'elettroporazione richiede l'ottimizzazione di apparecchiature e protocolli (stimolatore, elettrodi, modelli spaziali e temporali di impulsi d'onda) oltre a quello utilizzato per la microiniezione di DNA/lipofezione in boccioli di embrioni Xenopi.
Noi e altri in precedenza abbiamo usato la tecnica di microiniezione/lipofezione del DNA in orbite di embrioni di Xenopus per determinare i meccanismi di segnalazione autonoma cellulare che stabiliscono l'arborizzazione ottica assonale5,6, 7 (in questo stato , 8. Inizialmente abbiamo utilizzato questo approccio per sezionare le funzioni della proteina-catenina dell'adattatore Cadherin e Wnt nella arborizzazione assonale ottica nei girini di Xenopus 5,6. In uno studio, abbiamo mostrato che è richiesto il legame di catenina a z-catenina e pd, rispettivamente, per l'iniazione e la forma di arbori assonali ottici in vivo5. In un secondo rapporto, abbiamo dimostrato che i domini vincolanti di catenina z per la f-catenina e GSK-3 - modulano in modo opposto i modelli di proiezione degli arbori assonali ottici ventrali6. Più recentemente, abbiamo identificato ruoli per il fattore Wnt, adenomatous poliposis coli (APC), nella regolazione delle caratteristiche morfologiche degli arbori assonali ottici nei giri loschi xenopi 7. Esprimendo il N-terminale e i domini centrali di APC che modulano la stabilità della catenina e l'organizzazione dei microtubuli insieme a GFP nei singoli neuroni ottici, abbiamo determinato ruoli condivisi e distinti per questi domini di interazione APC sul numero di filiale, lunghezza e angolo in pergolato assonale ottico in vivo7. Un altro laboratorio ha utilizzato la tecnica di microiniezione/lipofection per determinare i ruoli autonomi delle cellule per la segnalazione da parte del recettore BDNF, TrkB, in perimeri assonali ottici nei giri xenopi 8. Questo gruppo ha mostrato che l'espressione di una maturazione perturbato TrkB dominante-negativo e maturazione sinaptica nei singoli arbori ottici in vivo8. Nel complesso, la tecnica di lipofezione in Xenopus ha già illuminato i ruoli specifici di diversi geni nella ramificazione ottica degli assoni nell'ambiente nativo.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Touro University California (Protocollo - TUCA003TE01X).
1. Ottenere X. laevis Embrioni
- Ottenere gli embrioni X. laevis mediante accoppiamento naturale di coppie di rane adulte maschili e femminili innescate con gonadotropina corionica umana (HCG), con la fecondazione in vitro degli ovuli versati da rane adulte, innescate con HCG, o ordinando direttamente (Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta ( Tabella di ordinazione diretta (Tabella di ordinazione di Materiali).
-
Embrioni di degella ottenuti con una soluzione di cisteina del 2% a temperatura ambiente (Tabella dei materiali)16.
- Raccogli 50-100 embrioni in un grande piatto Petri. Rimuovere la soluzione in cui si trovano gli embrioni decantando o utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica. Aggiungere 25 mL di soluzione di cisteina del 2% (0,5 g di cisteina in 25 mL ddH2O, pH a 8,0) al piatto contenente gli embrioni.
- Girare delicatamente il piatto Petri contenente gli embrioni nella soluzione cisteina fino a quando i cappotti gelatinosi degli embrioni cadono e gli embrioni raccolti in una macchia al centro del piatto (5,10 min). A questo punto, versare lentamente e delicatamente la soluzione cisteina in un becher di scarto. Fare attenzione a non versare troppi degli embrioni nel becher di scarico insieme alla soluzione cisteina.
- Sciacquare gli embrioni nel piatto 6x di Petri con il 10% modificato soluzione Mark's Ringer (MMR) o un'altra soluzione adatta (ad esempio, modificata Barth's Solution, MBS), ruotando il piatto ogni volta che la soluzione viene sostituita.
- Cultura gli embrioni in 10% MMR fino a raggiungere gli stadi di sviluppo 22-2417. Gli embrioni di Xenopo possono essere incubati a temperature comprese tra i 15 e i 25 gradi centigradi. Il tasso di sviluppo degli embrioni dipende dalla temperatura in cui sono incubati a17anni.
NOT: Gli embrioni di Xenopo ordinati da un catalogo di solito arrivano in laboratorio alle fasi dello sviluppo 20-24, in modo che possano essere dejellied e microiniettati subito.
2. Preparazione del DNA Plasmidi e realizzazione di una miscela DNA/DOTAP
- L'espressione del DNA del subclone costruisce in vettori di espressione Xenopus pCS2 o pCS2 o derivati (originariamente costruiti da D. Turner e R. Rupp)5,6,7. I vettori di pCS2 contengono un promotore di citomegalovirus modificato (CMV) che facilita l'espressione genica nelle rane.
- Amplifica i plasmidi pCS2 contenenti GFP e/o geni di interesse con kit di miniprep (Tabella dei materiali) seguendo la procedura standard. Nella fase finale di eluizione del protocollo miniprep, eseguire un'eluizione sequenziale del DNA in ddH2O per produrre una concentrazione finale di >1 g/l.
- Conservare tutti i plasmidi di pCS2 a -80 gradi centigradi fino a quando non è pronto per eseguire un esperimento di microiniezione/lipofezione, cioè quando gli embrioni sono agli stadi dello sviluppo 22-24.
- Scongelare i plasmidi di DNA da lipofonizzare a temperatura ambiente. Immediatamente prima della lipofezione, centrifugare brevemente i plasmidi del DNA. Ciò impedirà la formazione di precipitati nella miscela DNA/DOTAP che potrebbe intasare la punta della pipetta microcapillare.
- Combinare plasmidi di DNA con il reagente di trasfezione liposomica DOTAP (Tabella dei materiali) a un rapporto 1:3 (w/v)9,10. Per esempio, trasferire 2 g di DNA in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungere 6 o luna di DOTAP, oppure trasferire 3 g di DNA in un tubo di microcentrismo e aggiungere 9 l di DOTAP.
- Una volta combinati il DNA e il DOTAP, far scorrere delicatamente il tubo di microcentrismo per mescolare la soluzione. La soluzione DNA/DOTAP dovrebbe diventare leggermente opaca dopo la miscelazione.
- Se due plasmidi devono essere lipofonici insieme (ad esempio, pCS2-GFP con un secondo pCS2 plasmid e contenente una versione troncata o completa di un gene) nei neuroni ottici, prima combinare i due plasmidi (dopo brevemente entrambi) con un rapporto 1:1, quindi aggiungere DOTAP a un rapporto 1:3 (w/v). Ad esempio, unire 1 g di pCS2-GFP con 1 g di secondo pCS2 plasmide, quindi aggiungere 6 L di DOTAP.
NOT: Gli studi hanno dimostrato che la lipofezione di due plasmidi in bulbi oculari di embrioni Dienopus in queste fasi di sviluppo comporterà la loro co-espressione nei singoli neuroni ottici9,10.
3. Caricamento di un ago di microiniezione con DNA/DOTAP
- Agganciare delicatamente la punta di una pipetta microcapillare in vetro tirato con pinze sottili (Tabella dei materiali).
- Riempire la pipetta a microcapillare di vetro con olio minerale utilizzando un microfil in modo tale che una piccola goccia di olio minerale appaia sulla punta tagliata della micropipetta. Riempire la pipetta microcapillare a metà con olio minerale.
- Caricare la pipetta microcapillare di vetro tirato che ora è riempito con olio minerale in un supporto di iniezione adatto collegato ad un iniettore. Se si utilizza un iniettore (Tabella dei materiali), espellere lo stantuffo a metà strada prima di caricarlo sulla pipetta microcapillare. Una volta che la pipetta microcapillare è fissata saldamente all'iniettore, estendere lo stantuffo fino a garantire che la pipetta microcapillare sia fortemente attaccata all'iniettore e non si muova con l'estensione dello stantuffo.
- Trasferire una goccia di 3 -L della miscela DNA/DOTAP su un foglio quadrato tagliato (quadrato da 1 pollice quadrato) di carta paraffina.
- Sotto un microscopio stereo di sezionato, spostare la punta della pipetta microcapillare di vetro nella goccia DNA/DOTAP.
- Aspirare lentamente la goccia DNA/DOTAP nel pipetta microcapillare di vetro utilizzando l'opzione di riempimento sull'apparato di iniezione. Come il liquido viene caricato nella pipetta microcapillare, la goccia diventerà più piccola. A causa della leggera opacità della soluzione DNA/DOTAP, il confine tra l'olio minerale e la soluzione DNA/DOTAP dovrebbe essere visibile nel tubo microcapillare in vetro (Figura 1). Se necessario, smettere di riempire periodicamente la pipetta microcapillare per consentire alla pressione nella pipetta microcapillare di vetro di ricalibrare.
Figura 1: Immagini di pipetta microcapillare. Le immagini mostrano una pipetta microcapillare sull'apparato di iniezione, prima (A) e dopo (B) riempimento con DNA/DOTAP. Frecce aperte, punta dello stantuffo nella pipetta microcapillare (A,B). Freccia chiusa, linea tra olio minerale e DNA/DOTAP nella pipetta microcapillare riempita (B). Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Microiniettamento DNA/DOTAP in Boccioli di 1 giorno vecchi Xenopus Embrioni
- Devitellinizzare manualmente dieci anni 20-24 embrioni di Xenopo con pinze sottili in un piatto Petri da 10 mm riempito con 0,1 x MMR. Afferrare l'involucro vitelline in vita per evitare di ferire gli embrioni. Con le pinze nelle mani sinistra e destra dello sperimentatore, fai scoppiare la bolla della busta vitelline e rilascia l'embrione dalla busta vitelline. Fare attenzione a non ferire gli embrioni quando si rimuove la busta vitelline.
NOT: A partire dalla fase 20, gli embrioni di Xenopo sviluppano un'indentazione o una "vita" tra le metà anteriore e posteriore dell'embrione. Questa vita permette una formazione di uno spazio tra l'involucro vitelline e l'embrione in questa posizione. - Usa una pipetta di trasferimento di plastica con una punta di taglio per trasferire uno stadio devitellinizzato di 5-10 embrioni in un piatto Petri da 10 mm riempito con 1x MMR.
NOT: La soluzione di sale più alta in 1x MMR facilita la guarigione delle ferite da puntura che risulteranno dalla microiniezione. - Sotto lo stereoscopio, afferrare uno degli embrioni devitellinizzati nel piatto Petri con pinze in ogni mano, e disporre l'embrione in modo che il suo polo anteriore è puntato verso l'alto nel campo visivo. Orientare l'embrione in modo che si trova lateralmente e uno dei suoi bulbi oculari (sinistra o destra) sia rivolto verso l'alto.
- Sotto lo stereoscopio, tenere l'embrione con le pinze nella mano non dominante dello sperimentatore, e con la mano dominante dello sperimentatore introdurre la punta della micropipetta di vetro nell'eyebud (dal lato ventrale o dorsale, a seconda della metà l'embrione attualmente iniettato), appena sotto l'epidermide (Figura 2). Iniettare tra 70-210 nL della soluzione DNA/DOTAP. Questo può essere fatto in diversi impulsi, a seconda delle dimensioni dell'impulso che l'iniettore è impostato su (di solito 70 nL).
NOT: La profondità dell'iniezione è molto importante per la lipofezione nei neuroni ottici. Se la posizione della punta del microcapillare è correttamente inserita molto superficialmente nel boglio degli occhi, quindi dopo la microiniezione, l'epidermide grigia sovrastante l'occhio sarà gonfiare. Se la posizione è troppo profonda, l'occhio-occhio grigio non mostrerà alcun cambiamento e la frequenza di espressione del DNA nei neuroni ottici sarà inferiore. - Girare l'embrione ed eseguire la stessa microiniezione nell'occhiale sul lato contralaterale dell'embrione.
- In ogni esperimento inietta entrambe le bocche per gli occhi di 6-10 embrioni (o più).
- Dopo la microiniezione, conservare gli embrioni in una parabola di Petri con 1x MMR per circa 30 min per facilitare la guarigione della ferita.
- Dopo 30 min, trasferire gli embrioni iniettati in una soluzione MMR 0,1x con 0,001% agente sbiancante (fenylthiocarbamide) per ridurre la pigmentazione. Cultura gli embrioni coperti per circa cinque giorni, fino a quando gli embrioni si sono sviluppati in girini agli stadi 46-4716.
Figura 2: Demarcazione della regione del bocciolo per la microiniezione. Lo schema (A) e la fotomicrografia (B) dell'embrione X. laevis nelle fasi dello sviluppo 22/23 mostrano la regione degli occhi che dovrebbe essere mirata per la microiniezione (evidenziazioni rosse). Barra di scala - 1 mm. Il pannello A è stato modificato da .ahn etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
5. Imaging di GFP Expressing Ottico Assonal Arbors in Tattili Intatti e Viventi
NOT: Quando i girini che sono stati lipofettati con il DNA raggiungono gli stadi di sviluppo 46-47, sono pronti per l'imaging.
- Prima dell'imaging, i girini devono essere anestesizzati. Per anestesizzare i girini, trasferire i girini lipofettati in una soluzione di tricaina allo 0,02% in ddH2O in una piastra Petri da 10 mm. Attendere 5/10 min fino a quando i girini diventano immobili. Verificare che i girini siano ancora vivi osservando i loro cuori che battono sotto un microscopio stereo dissettante.
- Mettere un girino anetizzato in una camera in silicone su misura su uno scivolo di vetro e sigillare con una coverslip. Il girino dovrebbe inclinarsi leggermente in modo che un lato (sinistra o destra) della testa sia inclinato verso l'alto e tocchi appena lo slittamento del coperchio.
- Schermo la metà del midbrain dorsale tectal del girino che è inclinato verso l'alto a basso ingrandimento per GFP esprimendo arbori assali ottici.
NOT: Un microscopio a terra eretto ad ampio campo dotato di illuminazione a epilfuorescenza e di una lente obiettivo apocromatico (Table of Materials) può essere utilizzato per lo screening degli arbori fluorescenti. - Se l'emisfero tectale contiene da uno a tre GFP che esprimono pergolato assonale ottici, catturare una serie z di immagini di questi arbori utilizzando un obiettivo di lunga distanza ad alto contrasto 40x air (Tabella dei materiali). Per ogni pergolato assone, cattura 10-20 fette di z a intervalli di 1,5 m.
- Per visualizzare gli arbori assone dall'altro lato del midbrain tectale, ricaricare il girino nella camera di silicio in modo che si inclina verso l'altro lato e sigillare con uno slittamento di copertura. Ripetere quindi i passaggi 5.3 e 5.4.
6. Ricostruzione e quantificazione della morfologia ottica assonale dell'arbor
- Selezionare una pila di immagini che contiene da uno a tre pergolato assonali Ottici.
- Utilizzare lo strumento di disegno a mano libera nel software di modifica grafica (Tabella dei materiali) per tracciare la porzione di ogni pergolato assale ottico visibile in ogni z-slice. Tracciando attraverso i pezzi di ogni pergolato evidente in ogni z-slice creerà una proiezione 2D accurata del pergolato. Diversi colori possono essere utilizzati per tracciare distinti GFP esprimendo perrie assonali ottici.
- Effettuare tutte le misurazioni morfometriche sulle ricostruzioni 2D dei perile assonali, con riferimento alla serie z originale di immagini quando necessario7. Utilizzando il software Image J (Tabella dei materiali), misurai i parametri morfologici come il numero di rami (ad esempio, il numero di punte di diramazione o di rami, la lunghezza totale del ramo del pergolato, la lunghezza per ramo, la lunghezza e la larghezza del pergolato, la forma complessiva del pergolato (L/W rapporto, circolarità) e l'angolo dei rami7.
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Representative Results
Il protocollo descritto in questo articolo produce un tasso di successo del 30-60% degli embrioni di Xenopo iniettati che esprimono GFP (da solo o insieme a costrutti di DNA aggiuntivi) in uno o dieci arbori assonali ottici. Nella Figura 3, mostriamo immagini confocali rappresentative di GFP esprimendo controllo e artifungi assonali ottici mutanti in tattili Xenopus intatti Xenopus giri dal nostro studio recentemente pubblicato7. Per questo studio, abbiamo clonato due mutanti di dominio di APC (APCNTERM e APC-cat) in plasmidi pCS2, e abbiamo co-iniettato questi plasmidi insieme a un plasmide etichettante pCS2-GFP negli ombretti degli embrioni Xenopo di un giorno. La figura 4 mostra i risultati di diverse misurazioni quantitative effettuate sulle ricostruzioni dei perime assonali mutanti di controllo e APC, tra cui il numero di rami, la lunghezza totale del ramo del pergolato e la lunghezza media dei rami.
Figura 3: Immagini rappresentative del GFP che esprimono il controllo e gli arbori assonali ottici mutanti. (A) Schematico dei mutanti di mutanti APC N-terminal e di dominio centrale che sono stati clonati in plasmidi pCS2. (B) Immagini confocali rappresentative di singoli artifici GFP e arbori assonali ottici mutanti GFP-APC in tecta di girini Xenopus intatti e viventi. (C) Ricostruzioni di immagini in serie z di controllo GFP e arbori assonali ottici mutanti APC. Barre di scala : 30 m (B), 40 m (C). Questa cifra è stata modificata da Jin et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione delle morfologie delle ricostruzioni di controllo e arbori assonali mutanti. I grafici del numero di rami (A), la lunghezza totale del ramo del pergolato (B) e la lunghezza media del ramo (C) confermano le differenze osservate tra il controllo e il mutante APC che esprime gli arbori assonali. I dati nei pannelli A-C vengono visualizzati come percentuale di media di controllo con SEM. I grafici a dispersione aggiuntivi di numero di rami rispetto alla lunghezza media dei rami con linee di regressione mostrano una correlazione inversa tra questi parametri negli arbori assonali ottici che esprimono domini APC (D, E). Numeri di esempio: (A) GFP-12, APCNTERM–18 APC-cat-25; (B) GFP-12, APCNTERM-16, APC-cat-25; (C) GFP-11, APCNTERM-16, APC-cat-25. Questa cifra è stata modificata da Jin et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo articolo, dimostriamo come esprimere costrutti di DNA esogeni in singoli o piccoli tipi di neuroni ottici e come immaginare singoli arbori assonali ottici che esprimono arbori assonali ottici con segnalazioni molecolari normali e alterate in tapole intatte e viventi della rana X . lave. Spieghiamo anche come ricostruire e quantificare la morfologia di GFP esprimendo arbori assonali ottici da immagini catturate in vivo. Per esprimere plasmidi di DNA esogeno in piccoli numeri di neuroni ottici, microiniettamo una miscela reagente DNA/lipofection in primirdia del bulbo oculare di un giorno vecchi embrioni Xenopus, utilizzando una tecnica sviluppata per la prima volta nel laboratorio di Christine Holt per studiare l'ottica percorso assonatotrovando nei giovani girini9,10,19,20,21. Noi e altri abbiamo anche applicato questa tecnica di microiniezione/lipofezione del DNA per studiare i meccanismi molecolari che regolano l'arborizzazione ottica degli assoni in vecchi girini X. laevis 5,6, 7 (in questo stato , 8. Questa procedura semplice e economica per la transgenesi transitoria e cellulare consente di determinare la funzione genica cellulare-autonoma nello sviluppo di arbori assonali ottici in un sistema di modello vertebrale vivente.
Ci sono diversi fattori importanti da considerare per le migliori pratiche quando microinieta DNA/DOTAP in boccioli di embrioni Dienopi. In primo luogo, come indicato in altri rapporti, la concentrazione di DNA deve essere maggiore di 1 g /L 9,10. Le concentrazioni di DNA tra i 1o/3 g/L sono le migliori, ma è possibile utilizzare anche concentrazioni di DNA a partire da 0,7 g/L. In secondo luogo, il microinieta DNA negli embrioni Xenopi allo stadio 22-24 è ottimale per esperimenti in cui l'obiettivo è esaminare i meccanismi che regolano l'arborizzazione assonale ottica. Negli embrioni in queste fasi di sviluppo, gli occhibocci sono morfologicamente differenziati e possono essere più facilmente mirati per l'iniezione14. La maggior parte dei neuroni ottici nella primardia del bocciolo oculare degli embrioni dello stadio 22-24 sono anche post-mitotici, il che si traduce in un numero minore di neuroni ottici che esprimono GFP, il che a sua volta consente una migliore risoluzione quando si immaginano singoli arbori assonali ottici GFP nei girini. Infine, studi precedenti hanno dimostrato che i geni esogeni sono espressi 8 h dopo la lipofezione9. Pertanto, esprimere i costrutti genici negli occhibosi degli embrioni dello stadio 22-24 significa che i geni non perturberanno né la selezione del destino cellulare dei neuroni ottici né la conseguenza iniziale dei loro assoni. Un terzo fattore che garantirà il successo durante la microiniezione di DNA negli occhi dell'embrione di Xenopus è che il DNA deve essere iniettato in una regione relativamente superficiale dell'occhiobo9,10. L'iniezione in tessuti più profondi all'ingresso o intorno al bocciolo si tradurrà in una minore percentuale di embrioni che contengono neuroni ottici che esprimono il DNA esogeno10.
Ci sono anche diversi problemi di cui essere a conoscenza quando si immagina e si ricostruisce GFP che esprimono arbori assonali ottici in tapoli Xenopus viventi intatti. In primo luogo, i ricercatori dovrebbero catturare solo immagini di emisferi tectali che contengono da uno a tre arbori assonali ottici. Se una singola immagine contiene più di tre periri assonali ottici GFP che esprimono pergolato assonali ottici, è probabile che gli arbori abbiano rami sovrapposti, il che renderà difficile definire i singoli arbori durante il processo di ricostruzione. Un altro problema da tenere presente è che la ricostruzione e la quantificazione della morfologia ottica assonale dell'arbore sono le fasi più dispendiose in termini di tempo in questo protocollo. Stimiamo che la ricostruzione e la quantificazione della morfologia ottica dell'arbore assonale richiedano circa l'80-90% del tempo totale dell'esperimento. Anche se sono state sviluppate tecniche per automatizzare la ricostruzione degli arbori dendritici dei neuroni tectali, questi metodi computazionali non sono ancora stati applicati agli arbori assonali ottici e22. Anche se laborioso, il processo di ricostruzione della morfologia ottica dell'arboro aumenta drasticamente la comprensione da parte dei ricercatori dei dettagli della morfologia ottica assonale dell'arbore. Questo dettaglio aggiunto, a sua volta, migliora significativamente la qualità delle immagini di GFP che esprimono arbori che questi ricercatori sono in grado di catturare in esperimenti futuri.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo touro University California College of Osteopathic Medicine per aver sostenuto la nostra ricerca. Riconosciamo gli studenti precedenti in laboratorio (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) che hanno contribuito a implementare questa tecnica di microiniezione nel nostro laboratorio. Siamo grati alla dott.ssa Christine Holt, nel cui laboratorio è stata sviluppata per la prima volta questa tecnica di microiniezione/lipofezione del DNA negli embrioni di Xenopus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
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