Summary
Этот протокол призван продемонстрировать, как микровимизм ДНК / DOTAP смесь в глазные будни одного дня старый Xenopus laevis эмбрионов, и как изображение и реконструировать отдельные зеленые флуоресцентные белки (GFP), выражая оптические аксональные арборы в тектальных средних мозгов нетронутыми, живые головастики Xenopus.
Abstract
Первичная визуальная проекция головастиков водной лягушки Xenopus laevis служит отличной модельной системой для изучения механизмов, регулирующих развитие нейронной связи. Во время создания ретино-текальной проекции, оптические аксоны простираются от глаза и перемещаться по различным областям мозга, чтобы достичь своей целевой ткани, оптического тектума. Как только оптические аксоны попадают в тектум, они разрабатывают терминальные беседки, которые функционируют, чтобы увеличить количество синапических соединений, которые они могут сделать с целевыми интернейронами в тектуме. Здесь мы описываем метод выражения ДНК, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (GFP), и усиление и потеря функции гена конструкций, в оптических нейронов (клетки ганглия) в эмбрионах Ксенопуса. Мы объясняем, как микровимировать комбинированный реагент ДНК/липотекции в глазные рецепторы однодневных эмбрионов, так что экзогенные гены выражаются в одном или небольшом количестве оптических нейронов. Пометки генов с GFP или совместного введения с плазмид GFP, терминал аксональных беседок отдельных оптических нейронов с измененной молекулярной сигнализации могут быть изображены непосредственно в мозге нетронутыми, живые головастики Xenopus несколько дней спустя, и их морфологии может быть количественно. Этот протокол позволяет определить клеточные молекулярные механизмы, лежащие в основе развития оптического аксона arborization in vivo.
Introduction
Во время развития нервной системы аксоны пресинаптических нейронов проходят через различные области мозга, чтобы достичь своих целевых областей. Когда аксоны вторгаются в их ткани-мишени, они устанавливают синаптические связи с постсинаптические нейроны-мишени. Во многих типах нейронов аксоны увеличивают количество и пространственную степень синапических связей, которые они могут сделать, разрабатывая сети терминальных ветвей или беседок1. Ретино-тектальная проекция головастиков водной лягушки Xenopus laevis является мощной позвоночной моделью для изучения механизмов, лежащих в основе аксонизации терминала и синаптической связи2,3,4 . Индивидуальный GFP, выражающий оптические аксональные беседки с нормальной и измененной молекулярной сигнализацией, можно наблюдать непосредственно в нетронутых, живых головастях Ксенопуса 5,6,7,8. Чтобы выразить GFP в одиночку или вместе с полнометражными или усеченными версиями генов в небольшом количестве оптических нейронов, мы используем технику, включающую микроинъекцию/липофекацию ДНК в глазные будки однодневных эмбрионов Ксенопуса 9, 10. Этот метод был первоначально разработан для изучения механизмов оптического аксона поиска путей в молодых головастиков Xenopus, и с тех пор применяется нами и другими для определения клеточных автономных молекулярных механизмов, лежащих в основе оптического аксона беседка в Ксенопус головастики5,6,7,8,9,10.
Альтернативные методы экспрессирования экзогенных генов в небольшом количестве оптических нейронов были разработаны в других видах моделей, а также в X. laevis. Тем не менее, каждый из этих подходов представляет проблемы и ограничения по сравнению с микроинъекцией ДНК / липотекции реагента в глазных рецепторах эмбрионов Ксенопуса. У мышей трансгенез может быть использован для выражения генов в небольшом количестве оптических нейронов, но генерация трансгенных мышей является дорогостоящим и трудоемким и трансгенных мышей часто присутствует с нежелательными побочными эффектами11. Трансгенные зебры, которые выражают экзогенные гены в оптических нейронов также могут быть созданы путем введения плазмиды в ранней стадии декольте эмбрионов12. Тем не менее, этот процесс требует клонирования конкретного промоутера, чтобы выразить гены в мозаичном рисунке в оптических нейронов в личинки зебры12. Частота экспрессии экзогенной ДНК в оптических нейронах у трансгенных зебры также несколько ниже (Злт;30%) по сравнению с Ксенопус головастики, которые были микровведены с ДНК / липосомальный реагент (30-60%)12. В ово электропорации также используется для выражения генов в небольших количествах оптических нейронов у птенцов13. Тем не менее, эта процедура не смогла полностью охарактеризовать механизмы, которые устанавливают оптические проекции, потому что оптический аксон беседки не могут быть изображены в нетронутых, живых эмбрионов цыпленка. Наконец, несколько лабораторий использовали электропорации для трансфекта генов в небольшое количество оптических нейронов в Ксенопус головастики14,15. Тем не менее, электропорация требует оптимизации оборудования и протоколов (стимулятор, электроды, пространственные и временные модели волновых импульсов) за то, что используется для микроинъекции ДНК / липотекции реагента в глазные рецепторы эмбрионов Ксенопуса.
Мы и другие ранее использовали метод микроинъекции / липотекации ДНК в глазные рецепторы эмбрионов Ксенопуса для определения клеточных автономных механизмов сигнализации, которые устанавливают оптический аксон беседы5,6, 7 (г. , 8. Мы первоначально использовали этот подход, чтобы вскрыть функции Cadherin и Wnt адаптер белка -катенин в оптической аксональной арборизации в Ксенопус головастики5,6. В одном исследовании мы показали, что связывание к катенину и PD, соответственно, требуется для иначины и формирования оптических аксональных беседок in vivo5. Во втором отчете мы продемонстрировали, что связывающие домены для кятенина и ГСК-3 противоположники модулируют проекционные модели брюшной оптической аксональной арборы6. Совсем недавно мы определили роли для фактора Wnt, аденоматозной полипозной палочки (APC), в регулировании морфологических особенностей оптических аксональных беседок в Головаки Xenopus 7. Совместно выражая N-терминал и центральные домены APC, которые модулируют стабильность и микротубулы вместе с GFP в отдельных оптических нейронах, мы определили общие и различные роли для этих доменов взаимодействия APC на номере филиала, длина и угол в оптических аксональных беседок in vivo7. Другая лаборатория использовала метод микроинъекции/липофектирования для определения клеточных автономных ролей для сигнализации рецептором BDNF, TrkB, в оптических аксональных беседках в головастях Ксенопуса 8. Эта группа показала, что выражение доминирующей отрицательной TrkB возмущенвной ветвления и синаптической созревания в отдельных оптических аксонов беседки in vivo8. В целом, метод липотекации в Ксенопууже уже освещает специфические роли различных генов в ветвящейся оптический аксон в родной среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Туро в Калифорнии (Протокол TUCA003TE01X).
1. Получение X. laevis Эмбрионы
- Получить X. laevis эмбрионов путем естественного спаривания пар мужчин и женщин взрослых лягушек загрунтованные с человеческим хорионическим гонадотропин (HCG), путем экстракорпорального оплодотворения яйцеклеток сарай из женских взрослых лягушек загрунтованные с HCG, или заказать непосредственно (Таблица Материалы).
-
Эмбрионы Деджузы, полученные с 2% цистеином при комнатной температуре (Таблица материалов)16.
- Соберите 50–100 эмбрионов в большой чашке Петри. Удалите раствор, в который находятся эмбрионы, декантируя или используя пластиковую передачу пипетки. Добавьте 25 мл 2% цистеина (0,5 г цистеина в 25 мл ddH2O, рН до 8,0) в блюдо, содержащее эмбрионы.
- Аккуратно закружайте чашку Петри, содержащую эмбрионы в растворе цистеина, пока желе пальто эмбрионов не упадут и эмбрионы не соберутся в комке в центре блюда (5–10 мин). В этот момент медленно и осторожно сливайте раствор цистеина в мусорный стакан. Позаботьтесь, чтобы не залить слишком много эмбрионов в стакан отходов вместе с цистеином раствора.
- Промыть эмбрионы в чашке Петри 6x с 10% модифицированным решением Ringer Марка (MMR) или другим подходящим решением (например, модифицированным решением Барта, MBS), закрученным блюдом каждый раз, когда решение заменяется.
- Культура эмбрионов в 10% MMR, пока они не достигнут стадии развития 22-2417. Эмбрионы ксенопуса могут инкубироваться при температуре от 15 до 25 градусов по Цельсию. Скорость развития эмбрионов зависит от температуры, в которой они инкубируются при17.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы ксенопусов, заказанные из каталога, обычно поступают в лабораторию на стадиях развития 20–24, поэтому их можно сразу же дежелизировать и микровисировать.
2. Подготовка ДНК плазмиды и создание ДНК / DOTAP Mixture
- Экспрессия субклона ДНК конструируется в векторвыражения экспрессии Xenopus pCS2 или pCS2'MT или производных из них (первоначально построенных Д. Тернером и Р. Руппом)5,6,7. векторы pCS2' содержат модифицированный цитомегаловирус (CMV), который облегчает экспрессию генов у лягушек.
- Усилите плазмиды pCS2, содержащие GFP и/или гены, представляющие интерес, с наборами miniprep(Таблица материалов) в соответствии со стандартной процедурой. В заключительном шаге elution протокола мини-prep, выполнить последовательное elution ДНК в ddH2O, чтобы дать окончательную концентрацию йgt;1 мкг / Л.
- Храните все плазмиды pCS2 при -80 градусов по Цельсию до готовности к проведению эксперимента по микроинъекциям/липофеке, т.е. когда эмбрионы находятся на стадии развития 22–24.
- Оттепель ДНК плазмиды для липоинфицированных при комнатной температуре. Непосредственно перед липофакцией кратко центрифуги ДНК плазмиды. Это предотвратит образование осадка в смеси ДНК/ДОТАП, которая может засорить кончик микрокапиллярной пипетки.
- Объедините плазмиды ДНК с липосомальным реагентом DOTAP(Таблица материалов)в соотношении 1:3 (w/v)9,10. Например, перенесите 2 мкг ДНК в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл и добавьте 6 л ДОТАП, или перенесите 3 мкг ДНК в микроцентрифугую трубку и добавьте 9 л ДОТАП.
- После того, как ДНК и DOTAP объединены, осторожно Флик микроцентрифуги трубки, чтобы смешать раствор. После смешивания раствор ДНК/DOTAP должен стать слегка непрозрачным.
- Если две плазмиды должны быть липофицированы вместе (например, pCS2-GFP со второй плазмидной pCS2, содержащей усеченную или полноформатную версию гена) в оптических нейронах, сначала объединить две плазмиды (после краткого центрифуги обоих) в соотношении 1:1, а затем добавить DOTAP в соотношении 1:3 (w/v). Например, объединить 1 мг pCS2-GFP с 1 мкг второй плазмиды pCS2, а затем добавить 6 зл и глота.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исследования показали, что липотекция двух плазмидов в глазные рецепторы эмбрионов Ксенопуса на этих стадиях развития приведет к их со-выражению в отдельных оптических нейронов9,10.
3. Загрузка иглы микроинъекций с помощью ДНК/ДОТАП
- Аккуратно обрезать кончик вытащил стекла микрокапиллярной пипетки с мелкими щипцами (Таблица материалов).
- Заполните стеклянный микрокапиллярный пипетка минеральным маслом с помощью микрофила таким образом, что крошечная капля минерального масла появляется на обрезанной кончике микропипетты. Заполните микрокапиллярную пипетку на полпути минеральным маслом.
- Загрузите вытянутую стеклянную микрокапиллярную пипетку, которая теперь заполнена минеральным маслом, в подходящий держатель для инъекций, подключенный к инжектору. При использовании инжектора(Таблица материалов),выбрасывать поршень на полпути перед загрузкой микрокапиллярной пипетки на него. После того, как микрокапиллярный пипетка надежно прикреплен к инжектору, расширьте поршень в полной мере, чтобы подтвердить, что микрокапиллярная пипетка сильно прикреплена к инжектору и не перемещается с расширением поршеня.
- Передача 3 капли днк / DOTAP смеси на вырезать квадратный (1 дюйм квадратный) лист парафина бумаги.
- Под стерео рассекающим микроскопом переместите кончик стеклянной микрокапиллярной пипетки в падение ДНК/ДОТАП.
- Медленно сосать ДНК / DOTAP падение в стекло микрокапиллярной пипетки, используя возможность заполнения на аппарате инъекций. Как жидкость загружается в микрокапиллярный пипетка, падение будет получать меньше. Из-за небольшой непрозрачности раствора ДНК/DOTAP граница между минеральным маслом и раствором ДНК/DOTAP должна быть видна в стеклянной микрокапиллярной пипетке(рисунок 1). При необходимости прекратите периодически заполнять микрокапиллярную пипетку, чтобы давление в стеклянной микрокапиллярной пипетке перекалибровалось.
Рисунок 1: Изображения микрокапиллярной пипетки. Изображения показывают микрокапиллярный пипетка на аппарате инъекций, до (A), и после (B) заполнения с ДНК / DOTAP. Открытые стрелки, кончик поршеня в микрокапиллярной пипетке(A,B). Закрытая стрелка, линия между минеральным маслом и ДНК/ДОТАП в заполненной микрокапиллярной пипетке(B). Шкала бар 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
4. Микроинъекционная ДНК/ДОТАП в глазные будники 1-го дня Старые эмбрионы ксенопуса
- Вручную девителлинизируют десять стадий 20'24 Ксенопус эмбрионов с тонкими щипцы в 10 мм Петри блюдо заполнено 0,1x MMR. Возьмитесь за вительлин конверт на талии, чтобы избежать травмирования эмбрионов. С щиптеми в левой и правой руках экспериментатора, поп пузырь вителлин конверт и освободить эмбрион из конверта вителлин. Позаботьтесь, чтобы не травмировать эмбрионы при удалении вителлина конверт.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с 20-го этапа, эмбрионы ксенопуса развивают отступ или «талию» между передней и задней половинками эмбриона. Эта талия позволяет образовывать зазор между вительлиновым оболочкой и эмбрионом в этом положении. - Используйте пластиковую передачу пипетки с разрезом наконечник для передачи 5'10 девителлизированной стадии 22'24 эмбрионов в 10 мм Петри блюдо заполнено 1x MMR.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокий солевой раствор в 1x MMR облегчает заживление проколотых ран, которые будут возникать в результате микроинъекции. - Под стереомикроскопом, схватить один из девителлино эмбрионов в чашке Петри с щипками в каждой руке, и организовать эмбрион так, что его передний полюс указывается в поле зрения. Ориентируйте эмбрион так, чтобы он лежал боковои и один из его глазных бутонов (слева или справа) обращен вверх.
- Под стереомикроскопом держите эмбрион с щиптом в недоминирующей руке экспериментатора, а доминирующей рукой экспериментатора вводят кончик стеклянного микропайпета в глазной будки (с брюшной или содвистой стороны, в зависимости от половины эмбриона, который в настоящее время вводят), как раз под эпидермис(Рисунок 2). Вводят между 70-210 nL раствора ДНК/DOTAP. Это может быть сделано в нескольких импульсов, в зависимости от размера импульса инжектор установлен на (обычно 70 nL).
ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина инъекции очень важна для липотекции в оптические нейроны. Если положение кончика микрокапилляра правильно вставляется очень поверхностно в глазной бутон, то после микроинъекции серый эпидермис, наводненный глазом, набухнет. Если положение слишком глубокое, серый глазнец не будет показывать никаких изменений, а частота экспрессии ДНК в оптических нейронах будет ниже. - Поверните эмбрион вокруг и выполнить же микроинъекции в глазна на контралатеральной стороне эмбриона.
- Вводят оба глазных рецептора эмбрионов, насыгивающих 6–10 (или более) эмбрионов в каждом эксперименте.
- После микроинъекции, хранить эмбрионы в чашке Петри с 1x MMR в течение примерно 30 минут, чтобы облегчить заживление ран.
- После 30 мин, перенесите инъекционные эмбрионы в раствор 0,1x MMR с 0,001% отбеливающим агентом (фенилтиокарбамид) для уменьшения пигментации. Культура эмбрионов охватывает сярискусства в течение примерно пяти дней, пока эмбрионы не превратились в головастиков на стадиях 46-4716.
Рисунок 2: Демаркация области глазного бутона для микроинъекции. Схематичный(A) и фотомикрограф (B) x. laevis эмбриона на стадиях развития 22/23 показать глазной области, которые должны быть направлены на микроинъекцию (красные блики). Шкала бар No 1 мм. Панель А была изменена из Зан и др.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
5. Изображение GFP Выражая оптические аксональные arbors в Intact, living Tadpoles
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда головастики, которые были липофицины с ДНК достичь стадии развития 46-47, они готовы к визуализации.
- Перед визуализацией головастики должны быть обезглавлины. Для обеззараживать головастиков, перенесите липоинфицированных головастиков в раствор трикаина 0,02% в ddH2O в 10 мм чашке Петри. Подождите 5–10 минут, пока головастики не станут неподвижными. Убедитесь, что головастики все еще живы, наблюдая за их бьющимися сердцами под стерео рассекающим микроскопом.
- Поместите одного обезглавленного головастика в специально сделанную силиконовую камеру на стеклянной горке и уплотнение с крышкой. Головасток должен слегка наклоняться так, чтобы одна сторона (левая или правая) его головы наклонена вверх и едва касалась скольжения крышки.
- Экран половины дорсал тектал среднего мозга головастика, который наклонен вверх при низком увеличении для GFP, выражая оптические аксональные беседки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Широкоугольный вертикальномикроскоп, оснащенный освещением эпилюфорисценции и апохроматической объективной линзой(Таблица материалов),может быть использован для скрининга для флуоресцентных беседок. - Если тектального полушария содержит от одного до трех GFP, выражающих оптические аксональные беседки, захватывать z-серию изображений этих беседок с использованием высокой контрастной 40-й цели большого рабочего расстояния воздуха(Таблица материалов). Для каждой аксональной беседки захватывай срезы серии 10–20 z с интервалом 1,5 мкм.
- Для того, чтобы просмотреть аксон беседки на другой стороне тектал среднего мозга, перезагрузить головастик в кремниевой камере так, чтобы он наклоняется на другую сторону и печать с крышкой скольжения. Затем повторите шаги 5.3 и 5.4.
6. Реконструкция и количественная оценка оптической аксональной арборной морфологии
- Выберите стек изображений, содержащий от одного до трех GFP, выражающих оптические аксональные беседки.
- Используйте инструмент рисования от руки в графическом программном обеспечении для редактирования(Таблица материалов),чтобы проследить часть каждой оптической аксональной беседки, видимой в каждом z-ломтике. Отслеживание через куски каждой беседки, очевидной в каждом z-ломтике, создаст точную 2D проекцию беседки. Различные цвета могут быть использованы для отслеживания различных GFP, выражающих оптические аксональные беседки.
- Сделайте все морфометрические измерения на 2D реконструкциях аксональных беседок, со ссылкой на оригинальные z-серии изображений, когда это необходимо7. Использование программного обеспечения Image J(Таблица материалов),измерять морфологические параметры, такие как количество ветвей (т.е. количество ветвей или точек ветви), общая длина ветви, длина на ветку, длина и ширина беседки, общая форма беседки (L/W соотношение, круговость) и угол ветвей7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол, описанный в этой статье, дает показатель успеха 30-60% инъекционных эмбрионов Ксенопуса, выражающих GFP (в одиночку или вместе с дополнительными конструкциями ДНК) в одной-десяти оптических аксональных беседок. На рисунке 3, мы показываем представитель конфокальные изображения GFP выражая контроль и мутант оптических аксональных беседок в нетронутых головастиков Xenopus из нашего недавно опубликованного исследования7. Для этого исследования мы клонировали двух доменных мутантов APC (APCNTERM и APC-cat) в плазмиды pCS2 и совместно вводили эти плазмиды вместе с плазмидной маркировкой pCS2-GFP в глазные будни однодневного эмбриона Xenopus. На рисунке 4 показаны результаты нескольких количественных измерений, которые мы провели по реконструкциям контрольно-мутантных аксонных беседок, включая количество ветвей, общую длину ветки и средняя длина ветвей.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения GFP, выражающие контроль и мутантные оптические аксональные беседки. (A) Схема мутантов APC N-терминала и центрального домена мутантов, которые были клонированы в pCS2 плазмиды. (B) Представитель confocal изображения одного GFP и GFP-APC мутант оптических аксональных беседок в текта нетронутыми, живые головастики Xenopus. (C) Реконструкция z-серии изображений управления GFP и APC мутант оптических аксональных беседок. Шкала баров 30 мкм (B), 40 мкм (C). Эта цифра была изменена с Jin et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Количественная оценка морфологии реконструкций контрольных и мутантных аксональных беседок. Участки количества ветвей(A),общая длина ветви беседки (B), и средняя длина ветви (C) подтверждают наблюдаемые различия между контролем и APC мутант, выражающий аксональные беседки. Данные в панелях A'C отображается как процент контрольного среднего значения с SEM. Дополнительные участки рассеяния числа ветвей по сравнению со средней длиной ветви с регрессионными линиями показывают обратную корреляцию между этими параметрами в оптических аксональных беседках, выражающих домены APC(D, E). Примеры номеров: (A) GFP-12, APCNTERM-18 APC-cat-25; (B) GFP-12, APCNTERM-16, APC-cat-25; (C) GFP-11, APCNTERM-16, APC-cat-25. Эта цифра была изменена с Jin et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы демонстрируем, как выразить экзогенные конструкции ДНК в одном или малом количестве оптических нейронов и как изображение отдельных GFP, выражающих оптические аксональные беседки с нормальными и измененными молекулярными сигнализациями в нетронутых, живых головастях лягушки X . laevis. Мы также объясняем, как реконструировать и количественно морфологии GFP, выражающих оптические аксональные беседки из изображений, снятых in vivo. Чтобы выразить экзогенные плазмиды ДНК в небольшом количестве оптических нейронов, мы микроинъекционные ДНК / липотекции реагента смеси в примордии одного дня старых эмбрионов Xenopus, используя технику, впервые разработанную в лаборатории Кристин Холт для изучения оптических Аксон поиск пути в молодых головастиков9,10,19,20,21. Мы и другие также применили этот метод микроинъекции/ липофеки ДНК для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют оптический аксонов в старых нетронутыми, живых X. laevis головастики5,6, 7 (г. , 8. Эта недорогая, простая процедура для преходящих, клеточных специфических трансгенеза позволяет определить функцию клеток-автономного гена в развитии оптических аксональных беседок в живой системе модели позвоночных.
Есть несколько важных факторов, чтобы рассмотреть для наилучшей практики, когда микроинъекционные ДНК / DOTAP в глазные рецепторы эмбрионов Ксенопуса. Во-первых, как отмечалось в других докладах, концентрация ДНК должна быть больше, чем 1 мкг /ЗЛ9,10. Концентрации ДНК между 1 х 3 мкг/Л являются лучшими, но концентрации ДНК как низко как 0,7 мкг / Зл также могут быть использованы. Во-вторых, микроинъекция ДНК в стадию 22–24 ксенопусных эмбрионов является оптимальной для экспериментов, в которых цель состоит в изучении механизмов, регулирующих оптическую аксональную беседу. В эмбрионах на этих стадиях развития, глазные бутоны морфологически дифференцированы и могут быть более легко ориентированы на инъекцию14. Большинство оптических нейронов в прибежище глаз нойши 22–24 эмбрионов также являются постмитотиками, что приводит к меньшему количеству оптических нейронов, выражающих GFP, что, в свою очередь, позволяет лучше разослать при визуализации отдельных gFP оптических аксонных арборов в головастях. Наконец, предыдущие исследования показали, что экзогенные гены выражаются в 8 ч после липотекты9. Таким образом, выражение генных конструкций в глазных рецепторах эмбрионов стадии 22–24 означает, что гены не будут возмущать ни выбор клеточной судьбы оптических нейронов, ни первоначальный рост их аксонов. Третий фактор, который обеспечит успех при микроинъекционных ДНК в Xenopus эмбриона eyebuds является то, что ДНК должна быть введена в относительно поверхностной области глазного бутона9,10. Инъекции в более глубокие ткани в или вокруг глазного бутона приведет к более низкому проценту эмбрионов, которые содержат оптические нейроны, выражающие экзогенную ДНК10.
Есть также несколько вопросов, чтобы быть в курсе, когда изображение и реконструкция GFP выражая оптические аксональные беседки в нетронутой, живые головастики Xenopus. Во-первых, исследователи должны только захватить изображения тектальных полушарий, которые содержат от одного до трех GFP, выражающих оптические аксональные беседки. Если одно изображение содержит более трех GFP, выражающих оптические аксональные беседки, беседки, скорее всего, имеют перекрывающиеся ветви, что затруднит определение отдельных беседок в процессе реконструкции. Другой вопрос, который следует знать, заключается в том, что реконструкция и количественная оценка оптической аксональной морфологии беседки являются наиболее трудоемкими шагами в этом протоколе. По нашим оценкам, для реконструкции и количественной оценки оптической аксональной морфологии беседки требуется примерно 80–90% от общего времени эксперимента. Хотя методы были разработаны для автоматизации реконструкции тектал нейрон дендритных беседки, эти вычислительные методы еще не были применены к оптической аксональных беседок, а22. Несмотря на трудоемкий характер, процесс реконструкции оптической морфологии беседки резко повышает понимание исследователями деталей оптической аксональной морфологии беседки. Эта дополнительная деталь, в свою очередь, значительно улучшает качество изображений GFP, выражающих беседки, которые эти исследователи могут запечатлеть в будущих экспериментах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Университет Туро Калифорнийский колледж остеопатической медицины за поддержку наших исследований. Мы признаем предыдущих студентов в лаборатории (Эстер Ву, Грегори Пэн, Тэгун Джин, Джон Лим), которые помогли реализовать эту технику микроинъекций в нашей лаборатории. Мы благодарны доктору Кристинхол, в чьей лаборатории была впервые разработана эта методика микроинъекций/липотекции ДНК в эмбрионах Ксенопуса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
- Gibson, D. A., Ma, L. Developmental regulation of axon branching in the vertebrate nervous system. Development. 138 (2), 183-195 (2011).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nature Neuroscience. 4 (11), 1093-1101 (2001).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K. Map formation in the developing Xenopus retinotectal system: an examination of ganglion cell terminal arborizations. Journal of Neuroscience. 5 (12), 3228-3245 (1985).
- Elul, T. M., Kimes, N. E., Kohwi, M., Reichardt, L. F. N-and C-terminal domains of β-catenin, respectively, are required to initiate and shape axon arbors of retinal ganglion cells in vivo. Journal of Neuroscience. 23 (16), 6567-6575 (2003).
- Wiley, A., et al. GSK-3β and α-catenin binding regions of β-catenin exert opposing effects on the terminal ventral optic axonal projection. Developmental Dynamics. 237 (5), 1434-1441 (2008).
- Jin, T., Peng, G., Wu, E., Mendiratta, S., Elul, T. N-terminal and central domains of APC function to regulate branch number, length and angle in developing optic axonal arbors in vivo. Brain research. 1697, 34-44 (2018).
- Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. Journal of Neuroscience. 27 (10), 2444-2456 (2007).
- Holt, C. E., Garlick, N., Cornel, E. Lipofection of cDNAs in the Embryonic Vertebrate Central Nervous System. Neuron. 4 (2), 203-214 (1990).
- Ohnuma, S. I., Mann, F., Boy, S., Perron, M., Harris, W. A. Lipofection strategy for the study of Xenopus retinal development. Methods. 28 (4), 411-419 (2002).
- Joesch, M., Meister, M. A neuronal circuit for colour vision based on rod-cone opponency. Nature. 532 (7598), 236-239 (2016).
- Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. Journal of Neuroscience. 26 (13), 3604-3614 (2006).
- Li, X., Monckton, E. A., Godbout, R. Ectopic expression of transcription factor AP-2δ in developing retina: effect on PSA-NCAM and axon routing. Journal of Neurochemistry. 129 (1), 72-84 (2014).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo-from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Developmental Biology. 7, 107 (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). , North Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Zahn, N., Levin, M., Adams, D. S. The Zahn drawings: new illustrations of Xenopus embryo and tadpole stages for studies of craniofacial development. Development. 144 (15), 2708-2713 (2017).
- Piper, M., Dwivedy, A., Leung, L., Bradley, R. S., Holt, C. E. NF-protocadherin and TAF1 regulate retinal axon initiation and elongation in vivo. Journal of Neuroscience. 28 (1), 100-105 (2008).
- Dwivedy, A., Gertler, F. B., Miller, J., Holt, C. E., Lebrand, C. Ena/VASP function in retinal axons is required for terminal arborization but not pathway navigation. Development. 134 (11), 2137-2146 (2007).
- Leung, L. C., Harris, W. A., Holt, C. E., Piper, M. NF-Protocadherin Regulates Retinal Ganglion Cell Axon Behaviour in the Developing Visual System. PLOS One. 10 (10), e0141290 (2015).
- Lee, P. C., He, H. Y., Lin, C. Y., Ching, Y. T., Cline, H. T. Computer aided alignment and quantitative 4D structural plasticity analysis of neurons. Neuroinformatics. 11 (2), 249-257 (2013).
