Summary
Este protocolo tiene como objetivo demostrar cómo microinyectar una mezcla de ADN/DOTAP en los auriculares de embriones Xenopus laevis de un día de edad, y cómo imagen y reconstrucción de proteínafluorescentes verdes individuales (GFP) expresando árboles axonales ópticos en intactos, los renacuajos vivos de Xenopus.
Abstract
La proyección visual primaria de renacuajos de la rana acuática Xenopus laevis sirve como un excelente sistema modelo para el estudio de mecanismos que regulan el desarrollo de la conectividad neuronal. Durante el establecimiento de la proyección retino-tectal, los axónicos ópticos se extienden desde el ojo y navegan a través de regiones distintas del cerebro para llegar a su tejido objetivo, el tectum óptico. Una vez que los axons ópticos entran en el tectum, elaboran árboles terminales que funcionan para aumentar el número de conexiones sinápticas que pueden hacer con las interneuronas objetivo en el tectum. Aquí, describimos un método para expresar la codificación del ADN de la proteína fluorescente verde (GFP), y construcciones genéticas de ganancia y pérdida de función, en neuronas ópticas (células ganglionares retinianas) en embriones de Xenopus. Explicamos cómo microinyectar un reactivo combinado de ADN/lipofección en los eyebudsdes de un día de edad, de modo que los genes exógenos se expresan en un solo o pequeño número de neuronas ópticas. Mediante el etiquetado de genes con GFP o co-inyección con un plásmido GFP, los árboles axonales terminales de neuronas ópticas individuales con señalización molecular alterada se pueden imaginar directamente en cerebros de renacuajos de Xenopus intactos y vivos varios días más tarde, y su morfología se puede cuantificar. Este protocolo permite la determinación de mecanismos moleculares autónomos celulares que subyacen al desarrollo de la arborización de axón óptico in vivo.
Introduction
Durante el desarrollo del sistema nervioso, axons de neuronas presinápticas navegan a través de diversas regiones del cerebro para llegar a sus áreas objetivo. Cuando los axons invaden sus tejidos diana, establecen conexiones sinápticas con las neuronas diana postsinápticas. En muchos tipos de neuronas, los axons aumentan el número y la extensión espacial de las conexiones sinápticas que pueden hacer mediante la elaboración de redes de ramas terminales o arbores1. La proyección retino-tectal de renacuajos de la rana acuática Xenopus laevis es un potente modelo de vertebrado para examinar los mecanismos subyacentes a la arborización terminal de axón y conectividad sináptica2,3,4 . Los árboles axonales ópticos individuales de expresión de GFP con señalización molecular normal y alterada se pueden observar directamente en renacuajos de Xenopus vivos5,6,7,8. Para expresar GFP solo o junto con versiones completas o truncadas de genes en un pequeño número de neuronas ópticas, utilizamos una técnica que implica microinyección/lipofección de ADN en los oculares de un día de edad Xenopus embriones9, 10. Esta técnica fue desarrollada originalmente para estudiar los mecanismos de búsqueda de trayectoria de axón óptico en los renacuajos del Xenopus jóvenes, y desde entonces ha sido aplicada por nosotros y otros para determinar los mecanismos moleculares autónomos de la célula subyacentes a la axón óptico arborización en renacuajos Xenopus 5,6,7,8,9,10.
Se han desarrollado técnicas alternativas para expresar genes exógenos en un pequeño número de neuronas ópticas en otras especies modelo, así como en X. laevis. Sin embargo, cada uno de estos enfoques presenta desafíos y limitaciones en comparación con la microinyección de REactivo de ADN/lipofección en los auriculares de embriones de Xenopus. En ratones, la transgénesis se puede utilizar para expresar genes en un pequeño número de neuronas ópticas, pero la generación de ratones transgénicos es costosa y consume mucho tiempo y ratones transgénicos a menudo presentan efectos secundarios indeseables11. El pez cebra transgénico que expresa genes exógenos en las neuronas ópticas también se puede crear inyectando plásmidos en embriones de etapa de escisión temprana12. Sin embargo, este proceso requiere la clonación de un promotor específico para expresar genes en un patrón de mosaico en neuronas ópticas en larvas de pez cebra12. La frecuencia de expresión del ADN exógeno en las neuronas ópticas en el pez cebra transgénico también es algo menor (<30%) en comparación con los renacuajos Xenopus que fueron microinyectados con ADN/reactivo liposomal (30-60%)12. En ovo electroporation también se ha utilizado para expresar genes en pequeños números de neuronas ópticas en polluelos13. Sin embargo, este procedimiento no ha caracterizado completamente los mecanismos que establecen proyecciones ópticas porque la arborización del axón óptico no se puede imaginar en embriones de polluelos vivos intactos. Por último, varios laboratorios han utilizado la electroporación para transfectar genes en un pequeño número de neuronas ópticas en Xenopus tadpoles14,15. Sin embargo, la electroporación requiere la optimización de equipos y protocolos (estimulador, electrodos, patrones espaciales y temporales de pulsos de onda) más allá de la utilizada para la microinyección de ADN/lipofección reactivo en los oculares de embriones Xenopus.
Nosotros y otros utilizamos anteriormente la técnica de microinyección/lipofección de ADN en los oculares de embriones Xenopus para determinar los mecanismos de señalización autónoma celular que establecen la arborización del axón óptico5,6, 7 , 8. Inicialmente utilizamos este enfoque para diseccionar las funciones de la proteína adaptadora de Cadherin y Wnt en la arborización óptica axonal en Xenopus tadpoles5,6. En un estudio, mostramos que se requiere la unión de la catenina a la catenina y a la PDZ, respectivamente, para iniciar y dar forma a los árboles axonales ópticos in vivo5. En un segundo informe, demostramos que los dominios de unión de catenina para la catenina y gSK-3o modulan de forma opuesta los patrones de proyección de los árboles axonales ventrales ópticos6. Más recientemente, identificamos roles para el factor Wnt, adenomatous poliposis coli (APC), en la regulación de las características morfológicas de los árboles axonales ópticos en Xenopus tadpoles7. Al co-expresar los dominios N-terminal y central de APC que modulan la estabilidad de la catenina y la organización del microtúbulos junto con la GFP en neuronas ópticas individuales, determinamos roles compartidos y distintos para estos dominios de interacción de APC en el número de rama, longitud, y el ángulo en los árboles axonales ópticos in vivo7. Otro laboratorio utilizó la técnica de microinyección/lipofección para determinar los roles autónomos celulares para la señalización por el receptor BDNF, TrkB, en los árboles axonales ópticos en xenopus renacuajos8. Este grupo mostró que la expresión de una ramificación dominante-negativa TrkB perturbado y maduración sináptica en los árboles de axón óptico individuales in vivo8. En general, la técnica de lipofección en Xenopus ya ha iluminado los roles específicos de diferentes genes en la ramificación de axón óptico en el entorno nativo.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Touro de California (Protocolo n.o TUCA003TE01X).
1. Obtención de embriones X. laevis
- Obtener embriones X. laevis mediante el apareamiento natural de pares de ranas adultas masculinas y femeninas preparadas con gonadotropina coriónica humana (HCG), mediante la fertilización in vitro de óvulos derramados de ranas hembra adultas preparadas con HCG, o ordenando directamente(Tabla de Materiales).
-
Embriones Dejelly obtenidos con una solución de cisteína al 2% a temperatura ambiente (Tabla de Materiales)16.
- Recoger 50-100 embriones en un plato grande de Petri. Retire la solución en la que se encuentran los embriones decantando o utilizando una pipeta de transferencia de plástico. Añadir 25 ml de 2% de solución de cisteína (0,5 g de cisteína en 25 ml de ddH2O, pH a 8,0) al plato que contiene los embriones.
- Revuelva suavemente la placa Petri que contiene los embriones en la solución de cisteína hasta que las capas de gelatina de los embriones se caigan y los embriones se acusen en un grupo en el centro del plato (5-10 min). En este punto, lentamente y suavemente verter la solución de cisteína en un vaso de precipitados de desecho. Tenga cuidado de no verter demasiados embriones en el vaso de precipitados de desecho junto con la solución de cisteína.
- Enjuague los embriones en la placa Petri 6x con una solución Mark's Ringer (MMR) modificada al 10% u otra solución adecuada (por ejemplo, modificada de la solución de Barth, MBS), arremolinando el plato cada vez que se reemplaza la solución.
- Cultivar los embriones en 10% MMR hasta que lleguen a las etapas de desarrollo 22-2417. Los embriones de Xenopus pueden incubarse a temperaturas entre 15 y 25 oC. La tasa de desarrollo de los embriones depende de la temperatura en la que se incuban a17.
NOTA: Los embriones de Xenopus ordenados de un catálogo suelen llegar al laboratorio en las etapas de desarrollo 20-24, por lo que pueden ser dejellied y microinyectados de inmediato.
2. Preparación de Plásmidos de ADN y Fabricación de una mezcla de ADN/DOTAP
- Subclone DNA expression construye en Xenopus expression vectors pCS2+ o pCS2+MT o derivados de los mismos (originalmente construidos por D. Turner y R. Rupp)5,6,7. Los vectores pCS2+ contienen un promotor modificado del citomegalovirus (CMV) que facilita la expresión génica en ranas.
- Amplifique los plásmidos pCS2 que contengan GFP y/o genes de interés con kits miniprep(Tabla de materiales)siguiendo el procedimiento estándar. En el paso de elución final del protocolo miniprep, realice una elución secuencial del ADN en ddH2O para producir una concentración final de >1 g/L.
- Almacene todos los plásmidos pCS2 a -80 oC hasta que estén listos para realizar un experimento de microinyección/lipofección, es decir, cuando los embriones se encuentren en etapas de desarrollo 22-24.
- Descongelar los plásmidos de ADN para ser lipoinfectados a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de la lipofección, centrifugar brevemente los plásmidos de ADN. Esto evitará que se formen precipitados en la mezcla ADN/DOTAP que podría obstruir la punta de la pipeta microcapilar.
- Combine los plásmidos de ADN con el reactivo de transfección liposomal DOTAP(Tabla de Materiales)en una proporción de 1:3 (p/v)9,10. Por ejemplo, transfiera 2 g de ADN a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añada 6 l de DOTAP, o transfiera 3 g de ADN en un tubo de microcentrífuga y agregue 9 ml de DOTAP.
- Una vez que el ADN y el DOTAP se combinan, mueva suavemente el tubo de microcentrífuga para mezclar la solución. La solución DNA/DOTAP debe volverse ligeramente opaca después de la mezcla.
- Si dos plásmidos van a ser lipoinfectados juntos (por ejemplo, pCS2-GFP con un segundo plásmido pCS2 que contiene una versión truncada o de longitud completa de un gen) en las neuronas ópticas, primero combine los dos plásmidos (después de centrifugar brevemente ambos) en una proporción de 1:1, y luego agregue primero DOTAP en una relación 1:3 (w/v). Por ejemplo, combine 1 g de pCS2-GFP con 1 g de un segundo plásmido pCS2 y, a continuación, agregue 6 s de DOTAP.
NOTA: Los estudios han demostrado que la lipofección de dos plásmidos en los eyebudss de Xenopus embriones en estas etapas del desarrollo dará lugar a su coexpresión en neuronas ópticas individuales9,10.
3. Carga de una aguja de microinyección con ADN/DOTAP
- Sujete suavemente la punta de una pipeta microcapilar de vidrio tirado con fórceps finos(Tabla de materiales).
- Rellene la pipeta microcapilar de vidrio con aceite mineral utilizando un microfil de tal forma que aparezca una pequeña gota de aceite mineral en la punta recortada de la micropipeta. Llene la pipeta microcapilar hasta la mitad con aceite mineral.
- Cargue la pipeta microcapilar de vidrio tirado que ahora está llena de aceite mineral en un soporte de inyección adecuado conectado a un inyector. Si utiliza un inyector(Tabla de materiales),expulse el émbolo hasta la mitad antes de cargar la pipeta microcapilar sobre él. Una vez que la pipeta microcapilar esté firmemente unida al inyector, extienda el émbolo hasta el punto máximo para confirmar que la pipeta microcapilar está fuertemente unida al inyector y no se mueve con la extensión del émbolo.
- Transfiera una gota de 3 l de la mezcla de ADN/DOTAP a una hoja cuadrada cortada (1 pulgada cuadrada) de papel de parafina.
- Bajo un microscopio de disección estéreo, mueva la punta de la pipeta microcapilar de vidrio a la gota de ADN/DOTAP.
- Succionar lentamente la gota de ADN/DOTAP en la pipeta microcapilar de vidrio utilizando la opción de llenado en el aparato de inyección. A medida que el líquido se carga en la pipeta microcapilar, la gota se hará más pequeña. Debido a la ligera opacidad de la solución DNA/DOTAP, el límite entre el aceite mineral y la solución DNA/DOTAP debe ser visible en la pipeta microcapilar de vidrio(Figura 1). Si es necesario, deje de llenar la pipeta microcapilar periódicamente para permitir que la presión en la pipeta microcapilar de vidrio se vuelva a calibrar.
Figura 1: Imágenes de pipeta microcapilar. Las imágenes muestran una pipeta microcapilar en el aparato de inyección, antes de (A), y después(B) llenando con ADN/DOTAP. Flechas abiertas, punta del émbolo en la pipeta microcapilar (A,B). Flecha cerrada, línea entre aceite mineral y DNA/DOTAP en la pipeta microcapilar rellena (B). Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Microinyectar ADN/DOTAP en los eyes de 1 día de edad Xenopus Embryos
- Devitellinizar manualmente diez etapas 20-24 Xenopus embriones con fórceps finos en una placa Petri de 10 mm llena de 0,1x MMR. Sujete el sobre de viellina en la cintura para evitar dañar los embriones. Con fórceps en las manos izquierda y derecha del experimentador, haz estallar la burbuja del sobre de viellina y libera el embrión del sobre de viellina. Tenga cuidado de no dañar los embriones al retirar el sobre de vilines.
NOTA: A partir de la etapa 20, los embriones de Xenopus desarrollan una sangría o 'cintura' entre las mitades anterior y posterior del embrión. Esta cintura permite que se forme un hueco entre el sobre de viellina y el embrión en esta posición. - Utilice una pipeta de transferencia de plástico con una punta cortada para transferir 5 x 10 embriones desvitellinizados en etapa 22 x 24 a una placa Petri de 10 mm llena de 1 x MMR.
NOTA: La solución salina más alta en 1x MMR facilita la curación de heridas punzantes que resultarán de la microinyección. - Bajo el estereomicroscopio, agarre uno de los embriones desvitellinizados en la placa Petri con fórceps en cada mano, y coloque el embrión para que su polo anterior se apunte hacia arriba en el campo de visión. Orientar el embrión de modo que se acueste lateralmente y uno de sus auriculares (izquierda o derecha) está mirando hacia arriba.
- Bajo el estereomicroscopio, sostenga el embrión con los fórceps en la mano no dominante del experimentador, y con la mano dominante del experimentador introduzca la punta del micropipeta de vidrio en el eyebud (desde el lado ventral o dorsal, dependiendo de la mitad de el embrión que se está inyectando actualmente), justo debajo de la epidermis(Figura 2). Inyecte entre 70 y 210 nL de la solución DNA/DOTAP. Esto se puede hacer en varios pulsos, dependiendo del tamaño del pulso que el inyector se establece en (generalmente 70 nL).
NOTA: La profundidad de la inyección es muy importante para la lipofección en las neuronas ópticas. Si la posición de la punta del microcapilar se inserta correctamente muy superficialmente en el eyebud, luego después de la microinyección, la epidermis gris que cubre el eyebud se hinchará. Si la posición es demasiado profunda, el eyebud gris no mostrará ningún cambio, y la frecuencia de expresión del ADN en las neuronas ópticas será menor. - Gire el embrión y realice la misma microinyección en el eyebud en el lado contralateral del embrión.
- Inyectar ambos auriculares de 6 a 10 (o más) embriones en cada experimento.
- Después de la microinyección, almacenar embriones en una placa de Petri con 1x MMR durante aproximadamente 30 minutos para facilitar la cicatrización de heridas.
- Después de 30 min, transfiera los embriones inyectados a una solución de MMR de 0,1x con un agente blanqueador del 0,001% (feniltiocarbamida) para reducir la pigmentación. Cultivo de los embriones cubiertos durante aproximadamente cinco días, hasta que los embriones se hayan convertido en renacuajos en las etapas 46-4716.
Figura 2: Demarcación de la región del eyebud para microinyección. El esquema (A) y el fotomicrografía (B) del embrión X. laevis en las etapas de desarrollo 22/23 muestran la región de los emalos oculares que debe ser blanco de la microinyección (puntos destacados rojos). La barra de escala 1 mm. Panel A ha sido modificada de Zahn et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
5. Imagen de GFP Expressing Optic Axonal Arbors en Intact, Living Tadpoles
NOTA: Cuando los renacuajos que fueron lipoinfectados con ADN alcanzan las etapas de desarrollo 46-47, están listos para la toma de imágenes.
- Antes de la toma de imágenes, los renacuajos deben anestesiarse. Para anestesiar renacuajos, transfiera los renacuajos lipoinfectados a una solución de tricaína al 0,02% en ddH2O en un plato Petri de 10 mm. Espere de 5 a 10 minutos hasta que los renacuajos se vuelvan inmóviles. Verifique que los renacuajos sigan vivos observando sus corazones latiendo bajo un microscopio de disección estéreo.
- Coloque un renacuajo anestesiado en una cámara de silicona hecha a medida sobre un portaobjetos de vidrio y selle con un cubreobjetos. El renacuajo debe inclinarse ligeramente para que un lado (izquierda o derecha) de su cabeza esté inclinado hacia arriba y apenas toque el deslizamiento de la cubierta.
- Examina la mitad del cerebro medio tectal dorsal del renacuajo que se inclina hacia arriba con bajo aumento para GFP que expresa los árboles axonales ópticos.
NOTA: Un microscopio vertical de campo ancho equipado con una iluminación de epilfuorescencia y una lente objetivo apocromática (Tabla de Materiales) se puede utilizar para la detección de árboles fluorescentes. - Si el hemisferio tectal contiene entre uno a tres arbenes axonales ópticos que expresan GFP, capture una serie z de imágenes de estos árboles utilizando un objetivo de alta contraste de 40x aire de larga distancia de trabajo(Tabla de materiales). Para cada eje axonal, capture 10 x 20 rodajas de la serie z a intervalos de 1,5 m.
- Para ver los árboles de axón en el otro lado del cerebro medio tectal, recargue el renacuajo en la cámara de silicio para que se incline hacia el otro lado y selle con un resbalón de la cubierta. A continuación, repita los pasos 5.3 y 5.4.
6. Reconstrucción y cuantificación de la morfología del cenador axonal óptico
- Seleccione una pila de imágenes que contenga entre uno y tres arbóreos axonales ópticos que expresan La pGLI.
- Utilice la herramienta de dibujo a mano alzada en el software de edición gráfica(Tabla de materiales)para trazar la parte de cada eje axonal óptico visible en cada corte z. El trazado a través de las piezas de cada árbol evidente en cada corte z creará una proyección 2D precisa del árbol. Se pueden utilizar diferentes colores para trazar distintos árboles axonales de expresión de GFP.
- Realice todas las mediciones morfométricas en reconstrucciones 2D de los árboles axonales, con referencia a la serie z original de imágenes cuando sea necesario7. Utilizando el software Image J(Tabla de materiales),medir parámetros morfológicos como el número de ramas (es decir, el número de puntas de rama o puntos de bifurcación), la longitud total de la rama del árbol, la longitud por rama, la longitud y la anchura del árbol, la forma general del eje (L/W circularidad) y el ángulo de las ramas7.
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Representative Results
El protocolo descrito en este artículo produce una tasa de éxito de 30-60% de embriones xenopus inyectados que expresan GFP (solo o junto con construcciones de ADN adicionales) en uno a diez árboles axonales ópticos. En la Figura 3,mostramos imágenes confocales representativas de GFP expresando el control y los árboles axonales ópticos mutantes en renacuajos Xenopus intactos de nuestro estudio publicado recientemente7. Para este estudio, clonamos dos mutantes de dominio de APC (APCNTERM y APC-cat) en plásmidos pCS2, y co-inyectamos estos plásmidos junto con un plásmido de etiquetado pCS2-GFP en los eyebudss de un día de edad Xenopus embriones. La Figura 4 muestra los resultados de varias mediciones cuantitativas que hicimos en las reconstrucciones del control y los árboles axonales mutantes de La APC, incluyendo el número de ramas, la longitud total de la rama del árbol y la longitud media de las ramas.
Figura 3: Imágenes representativas de GFP que expresan el control y los árboles axonales ópticos mutantes. (A) Esquema de mutantes de APC N-terminal y mutantes de dominio central que fueron clonados en plásmidos pCS2. (B) Imágenes confocales representativas de los árboles axonales axonales ópticos mutantes de GFP y GFP-APC en tecta de renacuajos de Xenopus intactos y vivos. (C) Reconstrucciones de imágenes de la serie z de control GFP y árboles axonales ópticos mutantes APC. Barras de escala a 30 m (B), 40 m (C). Esta cifra ha sido modificada de Jin et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación de morfologías de reconstrucciones de control y árboles axonales mutantes. Las gráficas del número de ramas (A), la longitud total de la rama del árbol (B), y la longitud media de la rama(C) confirman las diferencias observadas entre el control y el mutante APC que expresa los árboles axonales. Los datos de los paneles A-C se muestran como porcentaje de la media de control con SEM. *por encima de la barra de datos o línea indica p < 0.05. Las gráficas de dispersión adicionales del número de ramas frente a la longitud media de la rama con líneas de regresión muestran una correlación inversa entre estos parámetros en los árboles axonales ópticos que expresan dominios APC (D, E). Números de muestra: (A) GFP-12, APCNTERM–18 APC-cat-25; (B) GFP-12, APCNTERM-16, APC-cat-25; (C) GFP-11, APCNTERM-16, APC-cat-25. Esta cifra ha sido modificada de Jin et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este artículo, demostramos cómo expresar construcciones de ADN exógeno en un solo o pequeño número de neuronas ópticas y cómo crear imágenes individuales de GFP que expresan árboles axonales ópticos con señalización molecular normal y alterada en renacuajos vivos intactos de la rana X . laevis. También explicamos cómo reconstruir y cuantificar la morfología de GFP expresando árboles axonales ópticos a partir de imágenes capturadas in vivo. Para expresar plásmidos de ADN exógenos en un pequeño número de neuronas ópticas, microinyectamos una mezcla de reactivo de ADN/lipofección en primordia de bisfemo de embriones Xenopus de un día de edad, utilizando una técnica desarrollada por primera vez en el laboratorio de Christine Holt para estudiar óptica axon pathfinding en renacuajos9,10,19,20,21. Nosotros y otros también hemos aplicado esta técnica de microinyección/lipofección de ADN para estudiar los mecanismos molecularesque regulan la arborización del axón óptico en los renacuajos vivos de xala 5,6, 7 , 8. Este procedimiento sencillo y económico para la transgénesis transitoria y específica de las células permite determinar la función génica autónoma de las células en el desarrollo de árboles axonales ópticos en un sistema modelo de vertebrados vivos.
Hay varios factores importantes a tener en cuenta para las mejores prácticas al microinyectar ADN/DOTAP en los auriculares de embriones de Xenopus. En primer lugar, como se ha señalado en otros informes, la concentración de ADN debe ser superior a 1 g/L9,10. Las concentraciones de ADN entre 1 y 3 g/l son las mejores, pero también se pueden utilizar concentraciones de ADN tan bajas como 0,7 g/L. En segundo lugar, la microinyección de ADN en la etapa 22-24 xenopus embriones es óptima para experimentos en los que el objetivo es examinar los mecanismos que regulan la arborización axonal óptica. En embriones en estas etapas de desarrollo, los auriculares se diferencian morfológicamente y se pueden orientar más fácilmente para la inyección14. La mayoría de las neuronas ópticas en la primordia de los bispolones de la etapa 22-24 también son post-mitóticas, lo que resulta en un número menor de neuronas ópticas que expresan GFP, lo que a su vez permite una mejor resolución al tomar imágenes de árboles axonales ópticos GFP individuales en renacuajos. Por último, estudios previos han demostrado que los genes exógenos se expresan a 8 h después de la lipofección9. Por lo tanto, expresar construcciones genéticas en los cogollos oculares de los embriones de la etapa 22-24 significa que los genes no perturbarán ni la selección del destino celular de las neuronas ópticas ni el crecimiento inicial de sus axones. Un tercer factor que asegurará el éxito al microinyectar ADN en los auriculares embrionarios de Xenopus es que el ADN debe ser inyectado en una región relativamente superficial del emadeánocular 9,10. Inyectar en tejidos más profundos dentro o alrededor del eyebud resultará en un menor porcentaje de embriones que contienen neuronas ópticas que expresan el ADN exógeno10.
También hay varios problemas a tener en cuenta al tomar imágenes y reconstruir GFP expresando árboles axonales ópticos en renacuajos de Xenopus intactos y vivos. En primer lugar, los investigadores sólo deben capturar imágenes de hemisferios tectales que contengan entre uno y tres arbóreos axonales ópticos que expresan la pMI. Si una sola imagen contiene más de tres arbóreos axonales ópticos de caños, es probable que los árboles tengan ramas superpuestas, lo que dificultará la definición de los árboles individuales durante el proceso de reconstrucción. Otro problema a tener en cuenta es que la reconstrucción y cuantificación de la morfología del arbor axonal óptico son los pasos que consumen más tiempo en este protocolo. Estimamos que la reconstrucción y cuantificación de la morfología del eje axonal óptico requiere aproximadamente el 80-90% del tiempo total del experimento. Aunque se han desarrollado técnicas para automatizar la reconstrucción de los árboles dendríticos de neuronas tectales, estos métodos computacionales aún no se han aplicado a los árboles axonales ópticos, asícomo 22. Aunque laborioso, el proceso de reconstrucción de la morfología del eje óptico aumenta dramáticamente la comprensión de los investigadores de los detalles de la morfología del árbol axonal óptico. Este detalle añadido, a su vez, mejora significativamente la calidad de las imágenes de GFP expresando arbores que estos investigadores son capaces de capturar en futuros experimentos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Touro University California College of Osteopathic Medicine por apoyar nuestra investigación. Reconocemos a estudiantes anteriores en el laboratorio (Esther Wu, Gregory Peng, Taegun Jin, John Lim) que ayudaron a implementar esta técnica de microinyección en nuestro laboratorio. Agradecemos a la Dra. Christine Holt, en cuyo laboratorio se desarrolló por primera vez esta técnica de microinyección/lipofección de ADN en embriones de Xenopus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5" Micropipettes | Drummond Scientific | 3-000-203 - G/X | |
| μ-manager software (Version 1.4) | Vale Lab | www.micro-manager.org | |
| CCD camera | Scion Corporation | CFW-1312 M | |
| Chorulon (Human Chorionic Gonadotropin) | AtoZ Vet Supply | N/A | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 168149-100G | |
| DOTAP | Sigma-Aldrich | 11202375001 | |
| Dumont Forceps #5 | Fine Science Tools | 11250-10 | |
| Eclipse E800 epifluoresence microscope | Nikon | Objectives: Nikon Plan Apo 20x/0.75, Nikon Plan Fluor 40/0.75 | |
| GNU Image Manipulation Program (Version 2.10.10) | GIMP | ||
| Illustrator (2017 Creative Cloud) | Adobe | ||
| ImageJ (Version 1.46r) | NIH | ||
| Microfil | World Precision Instruments | MF 34G-5 | |
| Micromanipulator with universal adaptor and support base | Drummond Scientific | 3-000-024-R | |
| 3-000-025-SB | |||
| 3-000-024-A | |||
| Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-30 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| Motorized z-stage | Applied Scientific Instrumentation | MFC-2000 | |
| Nanoject II injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Powerpoint (Version 15.31) | Microsoft | ||
| Xenopus laevis embryos | Nasco | LM00490 |
References
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