Summary

Tom basal biaxial e teste passivo do sistema reprodutivo murino usando um Miografo de pressão

Published: August 13, 2019
doi:

Summary

Este protocolo utilizou um sistema de miografo de pressão disponível comercialmente para realizar testes miográficos de pressão na vagina e colo do útero murino. Utilizando meios com e sem cálcio, as contribuições do tom básico das pilhas de músculo liso (SMC) e da matriz extracelular passiva (ECM) foram isoladas para os órgãos circunstâncias physiological estimadas.

Abstract

Os órgãos reprodutivos femininos, especificamente a vagina e o colo do útero, são compostos por vários componentes celulares e uma matriz extracelular única (ECM). Células musculares lisas exibem uma função contrátil dentro das paredes vaginal e cervical. Dependendo do ambiente bioquímico e da distensão mecânica das paredes dos órgãos, as células musculares lisas alteram as condições contráctil. A contribuição das células musculares lisas em condições fisiológicas iniciais é classificada como um tom basal. Mais especificamente, um tom basal é a constrição parcial basal das células musculares lisas na ausência de estimulação hormonal e neural. Além disso, o ECM fornece o apoio estrutural para as paredes e as funções do órgão como um reservatório para pistas bioquímicas. Essas pistas bioquímicas são vitais para várias funções de órgãos, como incitar o crescimento e manter a homeostase. A ECM de cada órgão é composta principalmente de fibras colágenas (principalmente colágeno tipos I, III e V), fibras elásticas e glicosaminoglicanos/proteoglicanos. A composição e organização do ECM determinam as propriedades mecânicas de cada órgão. Uma mudança na composição do ECM pode conduzir ao desenvolvimento de patologias reprodutivas, tais como o prolapso pélvico do órgão ou o remodelamento cervical prematuro. Além disso, as alterações na microestrutura e rigidez da ECM podem alterar a atividade e o fenótipo da célula muscular lisa, resultando na perda da força contrátil.

Neste trabalho, os protocolos relatados são usados para avaliar o Tom basal e as propriedades mecânicas passivas da vagina e da cerviz murino nonpregnant em 4-6 meses da idade no estro. Os órgãos foram montados em um miógrafo de pressão comercialmente disponível e os testes do pressão-diâmetro e da força-comprimento foram executados. São incluídos dados de amostra e técnicas de análise de dados para a caracterização mecânica dos órgãos reprodutivos. Essas informações podem ser úteis para a construção de modelos matemáticos e racionalmente projetar intervenções terapêuticas para as patologias de saúde das mulheres.

Introduction

A parede vaginal é composta de quatro camadas, o epitélio, o propria do lamina, os muscularis, e o adventitia. O epitélio é composto principalmente de células epiteliais. O própria do lamina tem uma grande quantidade de fibras elásticas e fibrilar do colagénio. Os muscularis também são compostos de fibras de elastina e colágeno, mas tem uma quantidade aumentada de células musculares lisas. A adventícia é composta por elastina, colágeno e fibroblastos, embora em concentrações reduzidas em comparação com as camadas anteriores. As células musculares lisas são de interesse para grupos de pesquisa biomecânica motivados como desempenham um papel na natureza contrátil dos órgãos. Como tal, quantificar a fração da área da célula muscular lisa e a organização é fundamental para a compreensão da função mecânica. As investigações precedentes sugerem que o índice liso do músculo dentro da parede vaginal esteja organizado primeiramente no eixo circunferencial e longitudinal. A análise histológica sugere que a fração da área do músculo liso é de aproximadamente 35% para as secções proximal e distal da parede1.

O colo do útero é uma estrutura altamente colagenosa, que até recentemente, foi pensado para ter o conteúdo mínimodecélulas musculares lisas 2,3. Estudos recentes, no entanto, sugeriram que as células musculares lisas podem ter uma maior abundância e papel no colo do útero4,5. O colo do útero exibe um gradiente de células musculares lisas. O sistema operacional interno contém 50-60% de células musculares lisas, onde o sistema operacional externo contém apenas 10%. Os estudos do rato, entretanto, relatam o cerviz para ser compor de 10-15% pilhas de músculo liso e 85-90% tecido conexivo fibroso sem menção de diferenças regionais6,7,8. Dado que o modelo do rato difere do modelo humano freqüentemente relatado, umas investigações mais adicionais a respeito da cerviz do rato são precisadas.

O objetivo deste protocolo foi elucidar as propriedades mecânicas da vagina e colo uterino murino. Isto foi conseguido usando um dispositivo do miógrafo da pressão que permita a avaliação de propriedades mecânicas nas direções circunferenciais e axiais simultaneamente ao manter interações nativas da pilha-matriz e a geometria do órgão. Os órgãos foram montados em duas cânulas personalizadas e fixadas com seda 6-0 suturas. Os testes de pressão-diâmetro foram realizados em torno do estiramento axial fisiológico estimado para determinar a complacência e a moduli tangente9. Testes de força-comprimento foram conduzidos para confirmar o estiramento axial estimado e para garantir que as propriedades mecânicas fossem quantificadas na faixa fisiológica. O protocolo experimental foi realizado na vagina Murina não-grávida e no colo do útero aos 4-6 meses de idade em estro.

O protocolo é dividido em duas seções principais do teste mecânico: tom básico e teste passivo. Um tom basal é definido como a constrição parcial basal das células musculares lisas, mesmo nas ausências de estimulação local, hormonal e neural externa10. Esta natureza contrátil basal da vagina e colo do útero produz comportamentos mecânicos característicos que são então medidos pelo sistema de miografia de pressão. As propriedades passivas são avaliadas pela remoção do cálcio intercelular que mantém o estado basal de contração, resultando no relaxamento das células musculares lisas. No estado passivo, as fibras de colágeno e elastina fornecem as contribuições dominantes para as características mecânicas dos órgãos.

O modelo murino é usado extensivamente para estudar patologias na saúde reprodutiva das mulheres. O mouse oferece várias vantagens para quantificar as relações evolutivas entre ECM e propriedades mecânicas dentro do sistema reprodutivo11,12,13,14. Estas vantagens incluem ciclos estral curtos e bem caracterizados, custo relativamente baixo, facilidade de manuseio e um tempo gestacional relativamente curto15. Além disso, o genoma de camundongos laboratoriais é bem mapeado e os camundongos geneticamente modificados são ferramentas valiosas para testar hipóteses mecanísticas16,17,18.

Os sistemas de miografia de pressão disponíveis comercialmente são amplamente utilizados para quantificar as respostas mecânicas de vários tecidos e órgãos. Algumas estruturas notáveis analisadas no sistema de miografo de pressão incluem as artérias elásticas19,20,21,22, veias e enxertos vasculares de engenharia tecidual23,24, o esôfago25, e os grandes intestinos26. A tecnologia do miógrafo da pressão permite a avaliação simultânea das propriedades nas direções axiais e circunferenciais ao manter as interações nativas do Cell-ECM e na geometria in vivo. Apesar do uso extensivo de sistemas do miógrafo na mecânica macia do tecido e do órgão, um protocolo que utiliza a tecnologia do miógrafo da pressão não tinha sido desenvolvido previamente para o vagina e a cerviz. Investigações anteriores sobre as propriedades mecânicas da vagina e do colo do útero foram avaliadas uniaxialmente27,28. Estes órgãos, entretanto, experimentam o carregamento multiaxial dentro do corpo29,30, assim quantificando sua resposta mecânica biaxial é importante.

Além disso, o trabalho recente sugere que as células musculares lisas podem desempenhar um papel potencial nas patologias dos tecidos moles5,28,31,32. Isto fornece uma outra atração de utilizar a tecnologia do miógrafo da pressão, porque preserva as interações nativas da pilha-matriz, assim permitindo o delineamento da contribuição que as pilhas de músculo lisas jogam em fisiológico e fisiopatológico Condições. Nisto, nós propor um protocolo para quantificar as propriedades mecânicas multiaxial do vagina e da cerviz o tom básico e as circunstâncias passivas.

Protocol

Nulíparas 4-6 meses fêmeas C57BL6J camundongos (29,4 ± 6,8 gramas) no estro foram utilizados para este estudo. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais do Instituto na Universidade de Tulane. Após a entrega, os camundongos aclimatados durante uma semana antes da eutanásia e foram alojados em condições padrão (ciclos de luz/escuro de 12 horas). 1. sacrifício do rato no estro Determinar o ciclo estral: o ciclo estral foi monitorado por a…

Representative Results

A análise bem sucedida das propriedades mecânicas dos órgãos reprodutivos femininos depende da dissecção, canulação e teste de órgãos apropriados. É imperativo explante os chifres uterinos para a vagina sem quaisquer defeitos (Figura 1). Dependendo do tipo de órgão, o tamanho da cânula variará (Figura 2). A canulação deve ser feita para que o órgão não se mova durante o experimento, mas também não danifique a parede do órgão durante o procedimento…

Discussion

O protocolo fornecido neste artigo apresenta um método para determinar as propriedades mecânicas da vagina Murina e colo do útero. As propriedades mecânicas analisadas neste protocolo incluem as condições de Tom passivo e basal dos órgãos. As condições de Tom passivo e basal são induzidas alterando o ambiente bioquímico em que o órgão está submerso. Para este protocolo, a mídia envolvida no teste basal contém cálcio. Testar a condição basal do Tom permite a isolação da contribuição mecânica da pi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho foi financiado pela concessão do prêmio da carreira de NSF #1751050.

Materials

2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer – 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

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White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

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