Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biaxial basal tone og passiv testning af murine reproduktive system ved hjælp af en Tryk Myograph

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/60125
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Tulane University

Summary

Denne protokol udnyttede et kommercielt tilgængeligt tryk myograph-system til at udføre tryk myograph test på murine vagina og livmoderhalsen. Ved hjælp af medier med og uden calcium blev bidragene fra de glatte muskelceller (SMC) basal tone og passiv ekstracellulær matrix (ECM) isoleret for organerne underestimerede fysiologiske forhold.

Abstract

De kvindelige reproduktive organer, især vagina og livmoderhalsen, er sammensat af forskellige cellulære komponenter og en unik ekstracellulær matrix (ECM). Glatte muskelceller udviser en kontraktile funktion inden for vaginal og cervikal vægge. Afhængigt af det biokemiske miljø og den mekaniske udspiling af orgel væggene, de glatte muskelceller ændre kontraktile betingelser. Bidraget fra de glatte muskelceller under baseline fysiologiske betingelser er klassificeret som en basal tone. Mere specifikt, en basal tone er den baseline delvis konstriktion af glatte muskelceller i fravær af hormonelle og neurale stimulation. Desuden, ECM giver strukturel støtte til orgel vægge og funktioner som et reservoir for biokemiske signaler. Disse biokemiske signaler er afgørende for forskellige organfunktioner, såsom tilskyndelse til vækst og opretholdelse af homøostase. ECM af hvert organ er sammensat primært af kollagen fibre (for det meste kollagen typer I, III, og V), elastiske fibre, og glycosaminoglycans/proteoglycans. Sammensætningen og organiseringen af ECM diktere de mekaniske egenskaber af hvert organ. En ændring i ECM sammensætning kan føre til udvikling af reproduktive patologier, såsom bækkenorganprolaps eller tidlig cervikal remodeling. Endvidere, ændringer i ECM mikrostruktur og stivhed kan ændre glatte muskel celle aktivitet og fænotype, hvilket resulterer i tab af kontraktile kraft.

I dette arbejde, de rapporterede protokoller anvendes til at vurdere basal tone og passive mekaniske egenskaber af den ikke-gravide murine vagina og livmoderhalsen på 4-6 måneder i estrus. Organerne blev monteret i et kommercielt tilgængeligt tryk myograph, og både tryk-diameter og Force-længde tests blev udført. Prøve data og dataanalyse teknikker til mekanisk karakterisering af de reproduktive organer er inkluderet. Sådanne oplysninger kan være nyttige til at konstruere matematiske modeller og rationelt designe terapeutiske interventioner for kvinders sundhedsmæssige patologier.

Introduction

Den vaginale væg består af fire lag, Epitelet, lamina propria, muscularis og adventitia. Epitel består primært af epiteliale celler. Den lamina propria har en stor mængde af elastiske og fibrillar kollagen fibre. Muscularis er også sammensat af elastin og kollagen fibre, men har en øget mængde af glatte muskelceller. Adventitien består af elastin, kollagen og fibroblaster, omend i reducerede koncentrationer sammenlignet med de tidligere lag. De glatte muskelceller er af interesse for biomekorisk motiverede forskergrupper, da de spiller en rolle i den kontraktile karakter af organerne. Som sådan, kvantificere den glatte muskel celleområde fraktion og organisation er nøglen til at forstå den mekaniske funktion. Tidligere undersøgelser tyder på, at den glatte muskel indhold i den vaginale væg primært er organiseret i den omgående og længdeakse. Histologisk analyse tyder på, at den glatte muskel område fraktion er ca 35% for både proksimale og distale sektioner af væggen1.

Livmoderhalsen er en meget kollagenous struktur, der indtil for nylig, blev anset for at have minimal glat muskel celleindhold2,3. Nylige undersøgelser, dog, har antydet, at glatte muskelceller kan have en større overflod og rolle i livmoderhalsen4,5. Livmoderhalsen udviser en gradient af glatte muskelceller. Det interne operativsystem indeholder 50-60% glatte muskelceller, hvor det eksterne operativsystem kun indeholder 10%. Mus undersøgelser, dog, rapportere livmoderhalsen, der skal bestå af 10-15% glatte muskelceller og 85-90% fibrøst bindevæv uden omtale af regionale forskelle6,7,8. I betragtning af, at musemodel adskiller sig fra den hyppigt rapporterede menneskelige model, yderligere undersøgelser vedrørende mus livmoderhalsen er nødvendige.

Formålet med denne protokol var at belyse de mekaniske egenskaber af murine vagina og livmoderhalsen. Dette blev opnået ved hjælp af en Tryk myograph enhed, der muliggør vurdering af mekaniske egenskaber i de circumferentielle og aksiale retninger samtidig samtidig bevare indfødte celle-matrix interaktioner og organ geometri. Organerne blev monteret på to brugerdefinerede kanyle og sikret med silke 6-0 suturer. Prøvning af tryk diameter blev udført omkring den anslåede fysiologiske aksiale strækning for at bestemme overensstemmelsen og tangent moduli9. Der blev udført Force-length-tests for at bekræfte den anslåede aksiale strækning og for at sikre, at de mekaniske egenskaber blev kvantificeret i det fysiologiske område. Forsøgsprotokollen blev udført på den ikke-gravide murine vagina og livmoderhalsen ved 4-6 måneders alderen i estrus.

Protokollen er opdelt i to vigtigste mekaniske test sektioner: basal tone og passiv test. En basal tone er defineret som baseline partielle konstriktion af glatte muskelceller, selv i fravær af eksterne lokale, hormonelle og neurale stimulation10. Denne baseline kontraktile natur af vagina og livmoderhalsen giver karakteristisk mekanisk adfærd, som derefter måles ved tryk myograph system. De passive egenskaber vurderes ved at fjerne det intercellulære calcium, der bevarer den grundlæggende tilstand af sammentrækning, hvilket resulterer i afslapning af de glatte muskelceller. I den passive tilstand, kollagen og elastin fibre giver den dominerende bidrag til de mekaniske egenskaber af organerne.

Murine-modellen anvendes i udstrakt grad til at studere patologier i kvinders reproduktive sundhed. Musen giver flere fordele ved at kvantificere de udviklende relationer mellem ECM og mekaniske egenskaber i det reproduktive system11,12,13,14. Disse fordele omfatter korte og velkarakteriserede estrous cyklusser, relativt lave omkostninger, nem håndtering, og en relativt kort gestationstid15. Desuden er genomet af laboratorie mus godt kortlagt og genetisk modificerede mus er værdifulde værktøjer til at teste mekanistiske hypoteser16,17,18.

Kommercielt tilgængelige tryk myograph systemer anvendes i udstrakt grad til at kvantificere de mekaniske reaktioner af forskellige væv og organer. Nogle bemærkelsesværdige strukturer analyseret på trykket myograph system omfatter elastiske arterier19,20,21,22, vener og væv manipuleret vaskulære grafts23,24, spiserøret25, og de store tarme26. Tryk myograph-teknologien muliggør samtidig vurdering af egenskaber i de aksiale og circumferentielle retninger, samtidig med at de indfødte celle-ECM-interaktioner og in vivo-geometri bevares. På trods af den omfattende brug af myograph systemer i blødt væv og orgel mekanik, en protokol, der udnytter trykket myograph teknologi ikke tidligere var blevet udviklet til vagina og livmoderhalsen. Forudgående undersøgelser af de mekaniske egenskaber i vagina og livmoderhalsen blev vurderet uniaksialt27,28. Disse organer, dog oplever multiaksial lastning i kroppen29,30, således kvantificere deres biksimale mekaniske respons er vigtigt.

Desuden tyder nylige arbejde på, at glatte muskelceller kan spille en potentiel rolle i bløddels patologier5,28,31,32. Dette giver en anden attraktion ved at udnytte trykket myograph teknologi, da det bevarer den indfødte celle-matrix interaktioner, hvilket tillader afgrænsning af det bidrag, glatte muskelceller spiller i fysiologiske og patofysiologiske Betingelser. Heri, foreslår vi en protokol til at kvantificere de multiaksiale mekaniske egenskaber i vagina og livmoderhalsen under både basal tone og passive betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nulliparous 4-6 måneder kvindelige C57BL6J mus (29,4 ± 6,8 gram) hos estrus blev anvendt til dette studie. Alle procedurer blev godkendt af instituttet Animal Care og use Committee på Tulane University. Efter fødslen akklimede musene i en uge før eutanasi og blev opstaldet under standardbetingelser (12-timers lys/mørke cyklusser).

1. mus offer på estrus

  1. Fastlæg den estrøse cyklus: den estrous cyklus blev overvåget ved visuel vurdering i overensstemmelse med tidligere undersøgelser15,33,34. Den estrous cyklus består af fire etaper: proestrus, estrus, metestrus, og diestrus. Under den proestrus fase kønsorganerne er hævede, pink, fugtig, og rynket. Estrus-fasen er rynkly, men mindre opsvulmet, lyserød og fugtig. Metestrus og sig er begge rapporteret som udviser ingen hævelse og rynkning, mangler i en lyserød nuance, og tør34,35.
  2. Udfør eksperiment på estrus: alle mekaniske tests blev udført, mens musene var på estrus, da dette er den nemmeste at visualisere og giver en konsistent og gentagelig tidspunkt.
  3. For mus, som gennemgår basal tone testning, aflive via guillotine. For mus testet kun under de passive betingelser, aflive ved hjælp af kuldioxid (co2) indånding. Guillotine tjener til at bevare funktionen af glatte muskelceller i reproduktions kanalen, som co2 gas ændrer kontraktile egenskaber af de glatte muskelceller36,37,38, 39,40,41,42. Det er bydende nødvendigt at udføre dissektion inden for 30 minutter for at minimere risikoen for cellernes apoptose.

2. det reproduktive system dissektion

  1. Opsætning: Placer en absorberende pad på arbejdsstationen og fyld en Petri skål og sprøjte med 4 °C Hank's balanceret salt opløsning (HBSS) opløsning. Brug en serviet for fedtvæv bortskaffelse. Placer musen ventrale side op og tape poterne og halen. Drej mikroskop lysene på og sæt mikro-saks, saks, to par lige pincet og to par buede pincet.
  2. Brug vinklede pincet og saks, løft huden omkring maven og gøre et snit i bunden af maven, over kønsbehåring knogle. Snittet skal være lavvandet nok til ikke punktere abdominal muskel væggen. Fortsæt med at bruge saksen til at skære overlegent mod ribburet og dybt gennem mavemusklerne.
  3. Fjern overfladisk fedt ved at trække let på fedtet med de buede pincet og mikro-saks. Fedtvæv vil afspejle lys heterogene med et glitter-lignende udseende. Placer alt det fjernede fedt og væv på servietten. Identificere både uterin horn og kønsbehåring knogle.
  4. Placer lukket saks mellem vaginal væggen og kønsbehåring knogle. Forsigtigt skære midten af kønsbehåring knogle (kønsbehåring symphysis). Placer buede pincet på begge ender af den afskårne kønsbehåring knogle. Træk begge klippe ender sideværts for at give bedre adgang til de reproduktive organer.
  5. Fjern blæren og urinrøret fra vaginal væggen. Dette kan gøres ved hjælp af lige pincet og mikro-saks. Hold blæren med lige pincet til at skabe spændinger og bruge stump dissektion teknikker til at adskille det omgivende væv fra vagina. Når blæren og urinrøret er dissekeret væk, klippe basen og fjerne fra kroppen hulrum.
  6. Identificer det reproduktive system: livmoder Horns bifurcate fra livmoderhalsen. Livmoderhalsen kan identificeres fra vagina på grund af forskelle i geometri og stivhed. Den ydre diameter af livmoderhalsen er mindre end vagina. Livmoderhalsen er stivere end skeden og føles magen til en perle (figur 1).
  7. Brug blæk og kalibre til at markere 3 mm prikker langs organerne. Start under æggestokkene på livmoder rørene og Mark dots inferiorly for at nå livmoderhalsen. Brug Center livmoderhalsen dot til at starte en prik sti ned til vagina introitus.
  8. Lad blækket tørre og adskille de reproduktive organer fra omgivende fedtvæv, bindevæv, og tyktarmen. Rengør skeden så tæt på vaginal introitus som muligt. Ved hjælp af en saks, skåret omkring den vaginale introitus.
    Bemærk: det er muligt for organer at tørre ud under denne proces. Hvis dette er en bekymring, kan en sprøjte fyldt med 4 °C HBSS anvendes til at tilføre fugt til organerne.
  9. Skær livmoder hornene umiddelbart ringere end æggestokkene. Bemærk, at organerne vil trække sig tilbage fra post forklarende længde, da bindevæv fjernes, og orgel recoils. Placer de dissekterede reproduktive organer i en Petri skål fyldt med 4 °C HBSS. Denne ændring i længden kan anvendes til beregning af den anslåede in vivo-længde (punkt 5).
    Bemærk: vi har identificeret, at brug af HBSS ved denne temperatur under dissektion og kanyle ikke påvirker den glatte muskel cellelevedygtighed. Opretholdelse af en pH-værdi på 7,4, dog, er bydende nødvendigt for at opretholde levedygtigheden af de glatte muskelceller. Ved denne temperatur har HBSS et pH-niveau på 7,4.
  10. Efter en 15-minutters ækvibrationsperiode i 4 °C HBSS måles afstanden mellem prikker ved hjælp af kalibre. Optag målingerne for hver distance i et regneark. Disse værdier vil blive anvendt til at beregne in vivo-stræk forholdet (Oprindelig længde/forklarende længde).
  11. Indstil den serviet, der indeholder det kasserede væv på maveregionen med det overskydende væv mod indersiden af musen og sug servietten i 4 °C HBSS. Wrap musen og overskydende væv i folie og sted i en fryser sikker pose skal opbevares ved-20 °C. Passiv mekanisk opførsel på skeden blev ikke fundet at være signifikant anderledes efter en fryse-tø cyklus43. Alle testede organer blev anvendt umiddelbart efter eutanasi eller efter en fryse-tø-cyklus.

3. kanyle

  1. Bestem den korrekte kanylestørrelse for organ typen. I en typisk C57BL6J mus, vagina bruger kanyle, der er både 3,75 mm i diameter og nittet. Livmoderhalsen bruger en kanyle, der er 3,75 mm for den vaginal ende og en kanyle 0,75 mm i diameter for livmoder enden (figur 2) den 0,75 mm kanyle er glat.
    Bemærk: diameter størrelserne angivet ovenfor bruges til typiske nulliparøse 4-6 måneder C57BL6 mus, C57BL6 x 129SvEv og nonparous mus i alderen 7-9 måneder. Dog kan visse omstændigheder, såsom prolaps eller graviditet, kræve en større størrelse kanyle.
  2. Med hvert organ monteres den cervikale side på krafttransducer delen af kanyle anordningen. Monter den modsatte ende af orgelet (vaginal eller uterin) på mikrometer delen af enheden. Stram begge ender med suturer.
  3. På grund af forskellen i tykkelse og graden af kontraktilitet blandt vagina og livmoderhalsen, varierende teknikker kan udnyttes til at udføre den mest effektive kanyle. For vagina, Placer 2 suturer i mellem 2nd og 3Rd nitter af kanylen i en "X" mode. Ved kanyle ringen af livmoderhalsen, er kanylen ikke nittet så orgel er bedst placeret på bagsiden af kanylen med 3 horisontale suturer på livmoder enden og 4 suturer på den eksterne os. For begge organer bør den maksimale længde ikke være mere end 7 mm mellem suturerne (figur 3).

4. Tryk myograph oprettet

  1. For at opsætte trykket myograph systemet, tænde for testsystemet og fylde reservoiret flasken med 200 mL HBSS (figur 4). Drej varmen til "on" og lad HBU'ERNE i beholderen flaske til at varme op. Derefter skal du aktivere mikroskopet og åbne computer programmet. Sørg for, at billedet af det kanylerede organ, tryk grænsefladen, flowmåler aflæsninger og sequencer-funktions værktøjet alle er synlige (figur 5).

5. basal tone mekanisk prøvning

Bemærk: livmoderhalsen udstillet en phasic natur i begyndelsen stadier af testning. Men, dette faldt efter forkonditionering. Basal tone testning sker ved hjælp af krebs ringer buffer (KRB) i bassinet af DMT enhed. Bufferen er tilsat 95% O2 og 5% Co2. Efter basal tone delen er færdig, er calciumfri KRB udnyttet.

  1. At finde den ubelastede geometri: strække orgel, så væggen ikke er i spænding. For vagina, observere rillerne på den vaginale væg. For livmoderhalsen skæres umiddelbart under blækprikker, der ligger over og under det centrale livmoderhalsen-mærke. Dette afviger fra en reproducerbar metode til en livmoderhals i situ-længde på 6 mm44. Mål længden fra sutur til sutur med kalibre
  2. Find det ubelastede tryk (op): Forøg trykket fra 0 til 10 mmHg i intervaller på 1 mmHg. Bestem det tryk, som orglet ikke længere er kollapset i. Dette kan bestemmes som den største hoppe i den ydre diameter ved et givet tryk, som udstillet på program monitoren. Efter registrering af tryk og ydre diameter, Bemærk dette som det første punkt, hvor organet ikke er kollapset og nul kraften.
  3. Anslået in vivo-strækning: Beregn den anslåede in vivo-strækning ved at dividere længden målt in vivo med længden af den målte indlægs forklaring:
    Equation 1
  4. Tryk-diameter forkonditionering: Indstil trykket til 0 mmHg, længden til den estimerede in vivo længdeEquation 2og gradient til 1,5 mmHg/s. Kør en sekvens, der tager trykket fra 0 mmHg til in vivo tryk + losses (tabel 1), hold i 30 sekunder, og tag trykket til 0 mmHg med en 30 sekunders hold periode. Når du har gentaget i alt 5 cyklusser, skal du trykke på stop i computer programmet og gemme filen.
  5. At finde den eksperimentelle in vivo stretch: Justér orgel til at være på den anslåede in vivo længde, mens ved ubelastet tryk og tryk på Start. Vurder trykket vs kraftværdier for trykværdier, lige fra det ubelastede tryk til det maksimale tryk (tabel 1). Tryk på knappen stop i computer programmet, og Gem filen.
    Bemærk: den målte stræk værdi beregnes på stedet. Dette er ledsaget af begrænsningen, at det kun kan måles efter disartikulere kønsbehåring symphysis. Som et resultat, den naturlige tethering er tabt, som kan ændre længden. Den teoretiske strækning er imidlertid baseret på den tidligere indførte teori om, at organet vil opleve minimale ændringer i kraft, når de udsættes for fysiologiske belastninger for at spare energi45. I protokollen, den målte in vivo strækning vil være den stræk værdi beregnet ved hjælp af eksperimentelt identificerede længde, hvor der er minimal ændring i kraft, når de udsættes for en fysiologisk vifte af tryk.
  6. Tryk-diameter forkonditionering: Indstil trykket til 0 mmHg, længden til den eksperimentelle in vivo længde, og gradient af 1,5 mmHg/s. Kør en sekvens, der tager trykket fra 0 mmHg til det maksimale tryk + op, hold i 30 sekunder og tilbage til 0 mmHg med en annonce periode på yderligere 30 sekunder. Når du har gentaget dette i alt 5 cyklusser, skal du trykke på knappen stop i programgrænsefladen og gemme filen.
    Bemærk: 5,4 er bydende nødvendigt for at opnå en mere konsekvent aksial kraft læsning med stigende tryk. Dette trin aids i at finde den korrekte in vivo stretch, som ofte undervurderes baseret på visuelle signaler. 5,6 fungerer som et forsigtigheds skridt for at minimere hysterese og for at opnå en konsistent, gentagelig, matematisk kan fortolkes respons af organet.
  7. Kraft-længde forkonditionering: Indtast 1/3 Max Tryk + op for både indgangs-og afgangstrykket. Justér orgelet til-2% af in vivo-længden, og tryk på Start. Juster længden til + 2% in vivo længde og derefter tilbage ned til-2% ved 10 μm/s. Gentag aksial forlængelse for i alt 5 cyklusser. Tryk på stop i computer programmet, og Gem filen.
  8. Ligevægt: med orgelet ved den fastsatte in vivo-længde indstilles både indgangs-og afgangstrykket ved 1/3 af det maksimale tryk + op. Organ i 10 minutter. Bring langsomt begge tryk tilbage til 0 mmHg med gradient indstillet som 1,5 mmHg/s.
  9. Evaluer den ubelastede geometri igen: Indstil orgelet til in vivo-længden og trykket til det ubelastede tryk. Formindsk den aksiale længde mod den anslåede aflæssede længde med en hastighed på 10 μm/s, indtil der er minimal ændring i kraften. Denne tilsvarende længde er kendt som den ubelastet længde, eller hvor organet ikke er i spænding eller kompression. Før nulstilling af kraften, registrere den ubelastet længde, ydre diameter, og kraft værdi.
    Bemærk: den forudgående ubelastet geometri blev bestemt af visuelle signaler, som er rent kvalitative. En fornyet evaluering er nødvendig for en kvantitativ metode og for at højde for eventuelle ændringer i længden, der kan forekomme under forkonditioneringen. Denne geometri vil blive anvendt i afsnit 8.
  10. Ultralyd setup: Brug den generelle Imaging abdominal pakke til at visualisere organerne i test enheden. (Figur 6). Før testning, minimere artefakter fra bunden af trykket myograph metal bassin. Juster kanylen til en højde, der er den maksimale afstand fra bunden, mens vævet stadig er helt nedsænket i Testopløsningen. En brugerdefineret holder er 3D-printet for at stabilisere transduceren i lodret position under billeddannelse.
  11. Ultralyd Imaging: Identificer kanylen nær kraft transduceren og justere fase af mikroskopet til billede langs længden af vævet. Gennem hele testprocessen spores den midterste region langs længden (figur 6a, C). Efter billeddannelse, gennemgå billedet "Cine store" loop, der består af en række B-mode rammer og identificere rammen med den største ydre diameter. De foretagne tykkelses beregninger vil blive anvendt i afsnit 8.
  12. Prøvning af tryk diameter (-2% in vivo længde): Tryk på Start og justér orgelet, så det er-2% af in vivo-længden, Indstil trykket til 0 mmHg og gradient til 1,5 mmHg/s. Øg trykket fra 0 mmHg til det maksimale tryk. Tryk tilbage til 0 mmHg med en 20 sekunders hold periode. Gentag dette i 5 cyklusser.
  13. Prøvning af tryk diameter (in vivo-længde): Tryk på Start og justér orgelet, så det er på vivo-længden, Indstil trykket til 0 mmHg og gradient til 1,5 mmHg/s. Øg trykket fra 0 mmHg til det maksimale tryk. Tryk tilbage til 0 mmHg med en 20 sekunders hold periode. Gentag dette i 5 cyklusser.
  14. Prøvning af tryk diameter (+ 2% in vivo længde): Justér orgelet, så det er + 2% in vivo længde, Indstil trykket til 0 mmHg og gradient til 1,5 mmHg/s. Øg trykket fra 0 mmHg til det maksimale tryk og derefter ned til 0 mmHg med en 20 sekunders hold periode. Gentag dette i 5 cyklusser. Trykdata fra alle tre længder vil blive anvendt i afsnit 8.
  15. Prøvning af kraft længde (nominelt tryk): Indstil trykket til det ubelastede tryk og orgelet til-2% af in vivo-længden. Strække orgelet til + 2% af in vivo-længden og vende tilbage til-2% in vivo-længden med en hastighed på 10 μm/s. Gentag i alt 3 cyklusser.
  16. Test af kraft længde (1/3 maksimum Tryk + op): Indstil trykket til 1/3 af det maksimale tryk + op og justér orgelet til-2% in vivo-længden. Efter at have trykket på Start, strække orgel til + 2% in vivo længde og tilbage til-2% in vivo længde med en hastighed på 10 μm/s. Når du har gentaget i alt 3 cyklusser, skal du trykke på stop og gemme dataene.
  17. Test af kraft længde (2/3 maksimum Tryk + op): Indstil trykket til 2/3 af det maksimale tryk + op og justér orgelet til-2% in vivo-længden. Tryk på Start og stræk orgelet til + 2% in vivo-længden og tilbage til-2% in vivo-længden med en hastighed på 10 μm/s. Når du har gentaget i alt 3 cyklusser, skal du trykke på stop og gemme dataene.
  18. Test af kraft længde (maksimalt tryk + op): Indstil trykket til det maksimale tryk + op, og justér orgelet til-2% in vivo-længden. Med en hastighed på 10 μm/s strækkes orgelet til + 2% af in vivo-længden og tilbage til-2% in vivo-længden. Efter gentagelse i alt 3 cyklusser, gemme data. Alle kraft data vil blive anvendt i afsnit 8.
  19. Fjern KRB testmedier og vask med calciumfri KRB. Udskift mediet med calciumfri KRB-opløsning suppleret med 2 mM EGTA. Inkuber vævet i 30 minutter. Fjern opløsningen, og Udskift mediet med frisk calcium frit KRB.

6. passiv mekanisk prøvning

Bemærk: hvis start med passiv test starter ved trin 1. Hvis basal tone testning blev udført før passiv start ved trin 6. Hvis der startes med frosset væv, tillades en 30-minutters ækvibrationsperiode ved stuetemperatur, før organet bannulleres.

  1. At finde den ubelastede geometri: strække orgel, så væggen af organet ikke er i spænding. Måle det kanylerede organ fra sutur til sutur og registrere dette som den ubelastet længde.
  2. Sådan finder du det ubelastede tryk: Tryk på Start, Øg trykket fra 0 til 10 mmHg i intervaller på 1 mmHg. Mens du går gennem denne proces, bestemme det pres, som organet ikke er i spænding. Ved hjælp af computerprogram Monitor, kan dette bestemmes fra den største hoppe i den ydre diameter. Efter nulstilling af kraften, registrere dette tryk samt den ydre diameter og notere dette som det første punkt, hvor organet ikke er kollapset.
  3. Anslået in vivo-strækning: Beregn den anslåede in vivo-strækning ved at dividere længden målt in vivo med den målte længde post-explant.
  4. Tryk diameter forkonditionering: når du har trykket på Start, skal du indstille trykket til 0 mmHg, længden som den estimerede in vivo-længde og gradient til 1,5 mmHg/s. Begynd at køre en sekvens, der tager trykket fra 0 mmHg til det maksimale tryk og tilbage til 0 Mmhg. Gentag denne proces gennem 5 cyklusser med en 30 sekunders hold tid.
  5. Kraft-længde forkonditionering: Justér orgel til in vivo længde og manuelt indtaste ubelastet tryk i edb-program for begge tryk. Eftertryk på Start, Indstil gradient til 2 mmHg og trykket til 1/3 af maksimum. Stræk organet op til + 2% og tilbage ned til-2% stræk ved 10 μm/s. Gentag denne cyklus i alt 5 gange, og tryk på stop.
  6. At finde den eksperimentelle in vivo længde: Find og plot kraftværdier på-2% af in vivo længde, in vivo længde, og + 2% af in vivo længde. Tag kræfter med jævnt fordelt tryk, som spænder fra 0 mmHg til det maksimale tryk. Den eksperimentelle in vivo-strækning vil være den stræk værdi, der udviser en relativ flad linje over en række tryk.
  7. Gentag tryk diameteren og de aksiale forkonditionerings trin ved den nye in vivo-længde.
  8. Ligevægt: med orgelet ved den fastsatte in vivo-længde indstilles indgangs-og afgangstrykket til det ubelastede tryk. Lad organet re-ækvibrere i 15 minutter. Efter 15 minutter skal indløbs-og afgangstrykket langsomt bringes tilbage til 0 mmHg.
  9. Re-evaluere losset konfiguration: bringe orgel til den ubelastet længde og re-estimere den ubelastet længde. Optag den ubelastede længde og den udvendige diameter, mens trykket er 0 mmHg, det ubelastede tryk, og 1/3 det maksimale tryk. Nul kraften ved det ubelastede tryk. Diameteren ved det ubelastede tryk er in vivo-diameteren.
    Bemærk: det er nødvendigt at revurdere den ubelastede længde, da små plast deformationer tidligere blev observeret i blødt biologisk væv efter forkonditionering. Denne fjernede konfiguration vil være den, der anvendes i afsnit 8.
  10. Ultralyd: udføre ultralyd B-mode Imaging på ubelastet længde og tryk.
  11. Prøvning af tryk diameter: med orgelet på-2% af det eksperimentelt fastsatte in vivo-længde og trykket ved 0 mmHg trykkes på Start. Øg trykket fra 0 mmHg til det maksimale tryk og tilbage til 0 mmHg. Hold 2-0 mmHg-trinnet i 20 sekunder. Når du har gentaget i alt 5 gange, skal du trykke på knappen stop i grænsefladen og gemme filen.
    Bemærk: Gentag ved eksperimentel in vivo-længde, + 2% af den eksperimentelle in vivo-længde.
  12. Prøvning af kraft længde: Indstil trykket til nominel tryk og justér orgelet til-2% af in vivo-længden. Organet strækkes op til + 2% af in vivo-længden og tilbage til-2% af in vivo-længden med en hastighed på 10 μm/s. Gem dataene efter gentagelse i alt 3 gange. Gentag dette for 1/3 Max tryk, 2/3 Max tryk, og ved max tryk.
  13. Beregn den ubelastet tykkelse fra ultralyd billeder B-modebillede. Brug billedbehandlingssoftware til at tegne en linje, der angiver indtrængnings dybden. Indstil skalaen til længden af linjen (dvs. 2000 μm som vist i figur 6b og 6d).
  14. Vægtykkelse beregninger: ved hjælp af en computer software, spore og måle den indre og ydre diameter af orgel. Derefter skal du tegne og måle en linje mellem diametrene. Tegn i alt 25 transmural linjer. Gennemsnit alle datapunkter og Gentag i alt 3 gange.

7. Ryd op

  1. Sørg for, at trykket er 0 mmHg og slukket. Luk hoved indløbet og stikkontakten for begge tre-vejs ventiler. Sug den resterende væske ud af kanyle enhedens bassin.
  2. Fjern orgelet fra scenen og fyld reservoiret flasken med deioniseret vand. Skyl kanylen med vand ved hjælp af en sprøjte. Tilslut slangen for at omgå kanylen.
  3. Drej trykket og strømmen på, sæt indgangstrykket til 200 mmHg, afgangstrykket til 0 mmHg, gradient til 10 mmHg/s, og lad flowet køre i 5 minutter. Lad systemet køre, mens reservoiret flasken er tom og lade luften køre i 5 minutter, eller indtil linjerne er tørre.

8. data analyse

  1. For tryk diameter testning, indsamle data fra, hvor trykket begynder at stige fra den mindste værdi indtil maksimum. For Force-length test, indsamle data fra lige under den maksimale Peak i kraft, indtil kraften stoppede med at falde.
  2. Åbn datafilen for hver test med tryk diameter, og vælg fanen middel tryk. Naviger til indlæsnings området for den sidste kurve, 0 mmHg til det maksimale tryk, og slip dataene i et regneark. Vælg det samme område på den udvendige diameter, indgangstryk, udløbstryk, kraft, temperatur, pH og flow-fane, som placerer hvert element i samme dokument.
  3. Åbn dataene for hver test af kraft længde. Naviger til kurvens indlæsnings område,-2% til + 2%, og træk og slip dataene i et regneark. Vælg det samme område for de andre målte variabler, og Placer hvert element i det samme regneark.
  4. For tryk diameter og kraft længde test trække op fra alle trykværdier.
  5. Gennemsnitlige data for tryk diameter hver 1 mmHg (dvs. 0 +/-0,5, 1 +/-0,5, 2 +/-0,5).
  6. Find det ubelastede volumen af organet (V). Ligning 1 kan udnyttes til at finde V, da R02 er den ubelastede ydre radius målt ved mikroskopet, L er den ubelastede længde, og H er den ubelastet tykkelse som detekteret af ultralyd. Antagelsen om inkompressibilitet er gearede, hvilket betyder, at organet sparer volumen, mens det udsættes for deformationer.
    Bemærk: den ubelastede længde måles med kalibre fra sutur til sutur. Den ubelastede diameter måles via mikroskop, kamera og software efterfulgt af beregning af radius (figur 5) den ubelastede tykkelse beregnes ud fra ultralydbillederne (figur 6).
    Equation 3Ligning 1
  7. Brug den ubelastede lydstyrke, deformeret ydre radius (Equation 4) og længde (Equation 5) til at bestemme den deformerede indre radius Equation 6 ved hjælp af antagelsen om inkomprimerbarhed.
    Equation 7Ligning 2
  8. Brug ligninger 3, 4 og 5 til at beregne hver stress, hhv. I ligninger 3-5 er P defineret som det intraluminale tryk, og Ft er den kraft, der måles af transduceren.
    Equation 8Ligning 3
    Equation 9Ligning 4
    Equation 10Ligning 5
  9. Plot forholdet mellem tryk og diameter, Force-Pressure forhold, circumferentiel stress-circumferential stretch forhold, og den aksiale stress og circumferentielle stræk værdier (figur 7, figur 8). Stræk værdierne kan beregnes ved hjælp af midtervæggens radius. Beregninger af de circumferentielle og aksiale belastninger kan findes i henholdsvis ligninger 6 og 7.
    Equation 11Ligning 6
    Equation 12Ligning 7
  10. Beregn overholdelse i nærheden af det fysiologiske trykområde og i in vivo-stræk. Den nedre tryk grænse (LPB) er 1 standardafvigelse under det gennemsnitlige målte tryk. Det øvre tryk bundne (UPB) er 1 standardafvigelse over det gennemsnitlige målte tryk9.
    Equation 13
  11. Beregn tangent moduli for at kvantificere materialets stivhed. Identificer den beregnede circumferentielle stress, der svarer til det nedre tryk bundet og øvre bundne tryk. Monter en lineær linje til den circumferentielle stress-circumferentielle stretch kurve inden for det identificerede stress område på in vivo længde. Beregn hældningen af linjen9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En vellykket analyse af de mekaniske egenskaber af de kvindelige reproduktive organer er betinget af passende organ dissektion, kanyle og testning. Det er bydende nødvendigt at explant livmoder horn til vagina uden nogen defekter (figur 1). Afhængigt af organ typen vil kanyle størrelsen variere (figur 2). Der skal ske en kanylering, således at organet ikke kan bevæge sig under forsøget, men heller ikke beskadiger organets væg under proceduren (figur 3). Svigt af begge trin vil resultere i manglende evne til fartøjet til at holde trykket. Testprocedure standardisering er afgørende for protokollens succes med henblik på at give konsistente og gentagelige resultater.

Når orglet er dissekeret og kanylen korrekt, magt på trykket myograph system. Opsætningen af trykket myograph systemer involverer en controller enhed, flow meter, og fase (figur 4). Tryk myograph-systemet bruges til at overvåge forskellige aspekter af organet, da det gennemgår mekanisk prøvning (figur 5). Et ultralyds system, eller tilsvarende, anvendes til at måle tykkelsen af organerne i ubelastet tilstand med og uden basal tone (figur 6). Efter mekanisk prøvning kan tangent moduli beregnes for de circumferentielle og aksiale retninger (tabel 2).

Både basal tone testning og passiv testning giver de vigtigste mekaniske egenskaber i den reproduktive kanal, med og uden kontraktile bidrag af glatte muskelceller (figur 7, figur 8). Skalering mellem organerne kræver et par justeringer af protokollerne (tabel 1), som livmoderhalsen og vagina opleve forskellige belastninger in vivo46-48. Sådanne variationer kan overvåges gennem teknikker såsom tryk catherization. Tryk catherization er en metode, der tidligere anvendes til at overvåge in vivo betingelser i vagina og livmoderen49-53. Modeller i de tidligere undersøgelser spænder fra mus, kaniner og mennesker. De samme principper ville gælde i lighed med det livmoderhals-og vaginale tryk specifikt for murine-modellen. Selv om, uanset hvilket organ der testes, de samme materialer er nødvendige for protokollerne (tabel 3).

Figure 1
Figur 1: murine dissektion diagram. Musen dissektion for reproduktive organer: både uterin horn, cervix, og vagina. I figuren fjernes blæren og urinrøret fra den forreste af skeden. Tarmene og mavemusklerne blev afspejlet superiorly. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Størrelsessammenligning af de to kanyle. Størrelsessammenligning af de to kanyle, der anvendes til kanylering af forplantningsorganerne. Den større kanyle (D = 3,75 mm) anvendes til vaginal vævet (A). Den mindre kanyle (D = 0,75 mm) anvendes til kanyle af cervikal væv (B). Den cervikale kanyle er glat, mens den vaginale kanyle har to riller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kanyle metode til vagina og livmoderhalsen. På grund af den varierende geometri og tykkelse af de reproduktive organer, de er mest effektivt kanylen i særskilte manerer. For vagina, Placer to suturer i en "X" mode. Ved kanylering af livmoderhalsen, Placer 3 horisontale suturer på livmoder enden og 4 suturer på den eksterne os. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: opsætning for tryk myograph enhed. Opsætningen af DMT-enheden anvendes til både basal og passiv testning. DMT består af tre hoved hubs: scenen (A), controller enheden (B) og flowmåleren (C). I controller-enheden er der en beholder flaske og en affalds flaske. Reservoiret flasken er i første omgang fyldt med væske, der tømmer som eksperimentet udføres. Affaldsflasken, som i første omgang er tom, samler den væske, der løber gennem eksperimentet. Controller enheden bruger DMT-softwaren på computeren og styrer trykket, temperaturen og flowet. Controller enheden læser udgange fra kraft-og tryk transducerne i scenen gennem et VGA-interfacekabel. Systemets fase komponent indeholder en indgangs-og afgangs strøm af systemet. Indløbs-og udløbs strømmen har tilsvarende indgangs-og afgangstryk målt af systemet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: filopsætning på tryk myograph-programmet. Visning af computer software set-up. En boks er trukket rundt i regionen af interesse og ydre diameter af vævet er optisk spores i realtid (A). Data opnået under mekanisk prøvning registreres og vises i realtid i den udvendige diameter, indgangstrykket, afgangstrykket, MIDDEL trykket, kraft, temperatur, pH og flow-fanen (B). Inden for tryk grænseflade trykket (mmHg), gradient (mmHg/s), og flow er kontrolleret. Desuden vises den aksiale kraft (mN), der måles af den in-line krafttransducer. Strømningshastigheden (μL/min) rapporteres under fanen flowmåler (C). Tryk sekvensering vises og styres under fanen sequencer (D). Data, der registreres under mekanisk prøvning, registreres og vises i realtid i den udvendige diameter, indgangstrykket, afgangstrykket, MIDDEL trykket, kraft, temperatur, pH og fanen flow (E). En repræsentativ tryk diameter test af vagina vises viser ydre diameter som en funktion af tid på den udvendige diameter fane. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: ultralyd Imaging. Ultralyd billeddannelse af murine reproduktive organer. Alle billeder blev taget ved hjælp af ultralydssystemet på kort-akse-B-tilstand. Et repræsentativt billede af vagina ved ubelastet længde og tryk (A). Vaginal vægtykkelse blev beregnet i ImageJ. Der blev tegnet en lodret linje langs dybdeskalaen (mm) for at kalibrere antallet af pixels pr. μm. Polygonværktøjet blev brugt til at spore den indvendige og udvendige diameter. Derefter blev der trukket transmural linjer for at beregne tykkelsen og gennemsnittet (B). Dette blev udført 3 gange. Et repræsentativt billede af livmoderhalsen ved ubelastet længde og tryk (C). Vægtykkelsen blev derefter beregnet ved hjælp af billede J og polygonværktøjet på samme måde som i skeden (D). Inden for det reproduktive kompleks spores den udvendige diameter på to forskellige steder (E). Gennem billedprocessen stabiliseres transduceren af en 3-D printet holder (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: repræsentative resultater for vaginal testning. De repræsentative mekaniske testresultater af vaginal basal og passiv protokoller. Med de data, der opnås ved DMT-systemet, kan der udledes flere mekaniske forhold. A) basal tryk-diameter, B) passiv tryk-diameter, C) basal kraft-tryk, D) passiv kraft-tryk, E) basal Circumferentiel stress-circumferentiel strækning, F) passiv circumferentiel stress-circumferential stretch, G) basal aksial stress-circumferential stretch, H) passiv aksial stress-circumferentiel strækning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: repræsentative resultater for cervikal testning. De repræsentative mekaniske testresultater af de cervikale basal og passive protokoller. Med de data, der opnås ved DMT-systemet, kan der udledes flere mekaniske forhold. A) basal tryk-diameter, B) passiv tryk-diameter, C) basal kraft-tryk, D) passiv kraft-tryk, E) basal Circumferentiel stress-circumferentiel strækning, F) passiv circumferentiel stress-circumferential stretch, G) basal aksial stress-circumferential stretch, H) passiv aksial stress-circumferentiel strækning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

In vivo-tryk Maksimalt tryk 1/3 Max tryk 2/3 Max tryk Aksial strækning Kanylestørrelse Anbefalet nummer
af suturer
Vagina 7 mmHg 15 mmHg 5 mmHg 10 mmHg -2%, in vivo, + 2% 3,75 mm 2--i en "X" mode
Livmoderhalsen 10 mmHg 200 mmHg 66 mmHg 133 mmHg -2%, in vivo, + 2% 0,75 mm for livmoder ende
3,75 mm for vaginal ende		 3 horisontale suturer på
livmoder enden
4 suturer på
vaginal ekstern os

Tabel 1: Resumé af oplysninger til skalering af de mekaniske prøvningsmetoder for hvert organ. De ubelastede trykværdier blev målt ved hjælp af catherization teknikker under anæstesi (4% isofluran i 100% ilt). Et ballon kateter blev udnyttet til vaginal målinger og et 2F kateter til livmoderhalsen.

Vagina Livmoderhalsen
Basal
Omkredsen (kPa)		 127,94 188
Basal
Aksial (kPa)		 56,8 75,44
Passiv
Omkredsen (kPa)		 246,03 61,26
Passiv
Aksial (kPa)		 112,74 19,26

Tabel 2: de repræsentative resultater for tangent moduli af vagina og livmoderhalsen. Tangent moduli blev beregnet for både basale og passive forhold samt for både circumferentielle og aksiale retninger. Alle målinger er angivet i enheder af kPa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den protokol, der er fastsat i denne artikel præsenterer en metode til bestemmelse af de mekaniske egenskaber af murine vagina og livmoderhalsen. De mekaniske egenskaber, der analyseres i denne protokol, omfatter både de passive og basale tone forhold i organerne. Passive og basale tone forhold induceres ved at ændre det biokemiske miljø, hvor orglet er nedsænket. For denne protokol indeholder de medier, der er involveret i basal testning, calcium. Afprøvning af basal tone tilstand tillader isolering af den glatte muskel celle mekaniske bidrag i de kvindelige reproduktive organer54,55. Når man udfører passiv mekanisk prøvning, indeholder mediet ikke calcium. Manglen på calcium hæmmer de glatte muskelceller fra kontraktindgåelses. Dette tillader belysning af andre ECM komponenter, såsom kollagen og elastiske fibre, som i vid udstrækning diktere de passive mekaniske egenskaber. Når de kombineres med biokemisk og histologisk analyse, giver disse resultater mulighed for at belyse forholdet mellem ECM mikrostrukturel sammensætning og mekanisk funktion. Dette gør det muligt at afgrænse de strukturelle og mekaniske mekanismer for patologier, som er relevante for kvinders reproduktive sundhed.

Tidligere blev vagina og livmoderhalsen testet uniaksialt27,28. Vagina og livmoderhalsen, dog demonstrere anisotrope egenskaber og erfaring multi aksial lastning in vivo29,30 . Derfor giver tryk myograph-systemer, der anvendes heri, kvantitative oplysninger om multi aksial belastning, der kan hjælpe med at forstå ætiologier af reproduktive patologier, samt den efterfølgende udformning af potentielle behandlinger. Endvidere tillader trykmyografi vurdering af multiaksiale egenskaber, samtidig med at in vivo-organ geometrien og den oprindelige celle-matrix interaktion56 bevares. In vivo, cellerne aktivt remodel den omgivende ECM som reaktion på ændringer i biomekaniske og biokemiske signaler57,58,59. Den protokol, der anvendes heri, er fordelagtig, da den muliggør overvågning af efterfølgende ændringer i bulkorgan egenskaber under fysiologisk relevante forhold. Denne støtte i at tilvejebringe en platform til at generere systematiske datasæt af multiaksiale aktive og passive mekaniske egenskaber. Endvidere kan de data, der indsamles i disse eksperimenter, udnyttes til at formulere og validere mikrostrukturelt motiverede ikke-lineære konstitutive modeller til at beskrive og forudsige den mekaniske respons af de kvindelige kønsorganer i sunde og patologiske tilstande16,60.

En ekstra system komponent, der var fordelagtig for protokollen var brugen af ultralyd Imaging til at måle tykkelsen af orgel væggene. Tykkelsen er afgørende oplysninger til beregning af stress oplevet under test.

Med enhver eksperimentel oprettet, er der nogle begrænsninger for denne procedure. Denne protokol i øjeblikket kun betragter den elastiske respons af vagina og livmoderhalsen og ikke den viskoelastiske respons. En potentiel metode til at afbøde denne begrænsning i fremtiden er at ændre den eksisterende protokol til at omfatte krybning og stress afslapning assays61. En anden begrænsning er at antage, at organerne er incompressible. I denne undersøgelse blev tykkelsen udelukkende målt ved den ubelastede konfiguration, som motiveret af tidligere undersøgelser, der viser ikke-drægtige murine væv udviser minimale ændringer i volumen under osmotisk lastning62. Desuden har yderligere undersøgelser fungeret under samme antagelse af inkompressibilitet44,60,63. Ideelt set ville en ultralyd udføres for hele forsøget for at fjerne behovet for inkompressibilitet antagelse og for bedre at informere finite element modeller. En endelig begrænsning er manglen på kvantificeret in vivo cervikal tryk at informere lastning protokoller. Litteratur tyder på, at cervikal tryk i humane kvinder er 37 mmHg53. Mus, dog, kan udvise forskellige cervikal pres fra menneskers. Der blev påvist en forskel i vaginal tryk mellem gnaver modellerne og humane prøver64,65. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at kvantificere trykket i den ikke-gravide murine cervix. Mod dette formål, intra-uterin pres blev for nylig rapporteret i hele graviditeten49.

Det kommercielt tilgængelige tryk myograph system udnyttes i denne procedure måler kraften egenskaber af elastiske, hule organer. Denne protokol er let at tilpasse til andre forskellige organer og væv ved at ændre de kemiske tilsætningsstoffer i badet, kanylestørrelse, og sutur tykkelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Arbejdet blev finansieret af NSF CAREER Award Grant #1751050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capone, D., et al. Evaluating Residual Strain Throughout the Murine Female Reproductive System. Journal of Biomechanics. 82, 299-306 (2019).
  2. Danforth, D. The fibrous nature of the human cervix, and its relation to the isthmic segment in gravid and nongravid uteri. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 53 (4), 541-560 (1947).
  3. Hughesdon, P. The fibromuscular structure of the cervix and its changes during pregnancy and labour. Journal of Obstetrics and Gynecology of the British Commonwealth. 59, 763-776 (1952).
  4. Bryman, I., Norstrom, A., Lindblo, B. Influence of neurohypophyseal hormones on human cervical smooth muscle cell contractility in vitro. Obstetrics and Gynecology. 75 (2), 240-243 (1990).
  5. Joy, V., et al. A New Paradigm for the Role of Smooth Muscle Cells in the Human Cervix. Obstetrics. 215 (4), e471-e478 (2016).
  6. Xu, X., Akgul, Y., Mahendroo, M., Jerschow, A. Ex vivo assessment of mouse cervical remodeling through pregnancy via Na (23) MRS. NMR Biomedical. 23 (23), 907-912 (2014).
  7. Leppert, P. Anatomy and Physiology of cervical ripening. Clinical Obstetrics and Gynecology. 43 (43), 433-439 (2000).
  8. Schlembach, D., et al. Cervical ripening and insufficiency: from biochemical and molecular studies to in vivo clinical examination. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 144, S70-S79 (2000).
  9. Stoka, K., et al. Effects of Increased Arterial Stiffiness on Atherosclerotic Plaque Amounts. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
  10. Mohram, D., Heller, L. Ch. 7. Cardiovascular Physiology. , The McGraw-Hill Companies. (2006).
  11. Yoshida, K., et al. Quantitative Evaluation of Collagen Crosslinks and Corresponding Tensile Mechanical Properties in Mouse Cervical Tissue during Normal Pregnancy. PLoS One. 9, e112391 (2014).
  12. Mahendroo, M. Cervical remodeling in term and preterm birth: insight from an animal model. Society for Reproduction and Fertility. 143 (4), 429-438 (2012).
  13. Elovitz, M., Miranlini, C. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 193 (3), 1149-1155 (2005).
  14. Ripperda, C., et al. Vaginal estrogen: a dual-edged sword in postoperative healing of the vaginal wall. North American Menopause Society. 24 (7), 838-849 (2017).
  15. Nelson, J., Felicio, P., Randall, K., Sims, C., Finch, E. A Longitudinal Study of Estrous Cyclicity in Aging C57/6J Mice: Cycle, Frequency, Length, and Vaginal Cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
  16. Ferruzzi, J., Collins, M., Yeh, A., Humphrey, J. Mechanical assessment of elastin integrity in fibrillin-1-deficient carotid arteries: implications for Marfan Syndrome. Cardiovascular Research. 92 (2), 287-295 (2011).
  17. Mariko, B., et al. Fribrillin-1 genetic deficiency leads to pathological ageing of arteries in mice. The Journal of Pathology. 224 (1), 33-44 (2011).
  18. Rahn, D., Ruff, M., Brown, S., Tibbals, H., Word, R. Biomechanical Properties of The Vaginal Wall: Effect of Pregnancy, Elastic Fiber Deficiency, and Pelvic Organ Prolapse. American Urogynecological Society. 198 (5), (2009).
  19. Caulk, A., Nepiyushchikh, Z., Shaw, R., Dixon, B., Gleason, R. Quantification of the passive and active biaxial mechanical behavior and microstructural organization of rat thoracic ducts. Royal Society Interface. 12 (108), 20150280 (2015).
  20. Amin, M., Le, V., Wagenseil, J. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. Journal of Visualized Experiments. (60), e3733 (2012).
  21. Sokolis, D., Sassani, S., Kritharis, E., Tsangaris, S. Differential histomechanical response of carotid artery in relation to species and region: mathematical description accounting for elastin and collagen anisiotropy. Medical and Biological Engineering and Computing. 49 (8), 867-879 (2011).
  22. Kim, J., Baek, S. Circumferential variations of the mechanical behavior of the porcine thoracic aorta during the inflation test. Journal of Biomechanics. 44 (10), 1941-1947 (2011).
  23. Faury, G., et al. Developmental adaptation of the mouse cardiovascular system to elastin haploinsufficency. Journal of Clinical Investigation. 11 (9), 1419-1428 (2003).
  24. Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Engineering. 20, 346-355 (2014).
  25. Sommer, G., et al. Multaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
  26. Sokolis, D., Orfanidis, I., Peroulis, M. Biomechanical testing and material characterization for the rat large intestine: regional dependence of material parameters. Physiological Measurement. 32 (12), 1969-1982 (2011).
  27. Martins, P., et al. Prediction of Nonlinear Elastic Behavior of Vaginal Tissue: Experimental Results and Model Formation. Computational Methods of Biomechanics and Biomedical Engineering. 13 (3), 317-337 (2010).
  28. Feola, A., et al. Deterioration in Biomechanical Properties of the Vagina Following Implantation of a High-stiffness Prolapse Mesh. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 120 (2), 224-232 (2012).
  29. Huntington, A., Rizzuto, E., Abramowitch, S., Prete, Z., De Vita, R. Anisotropy of the Passive and Active Rat Vagina Under Biaxial Loading. Annals of Biomedical Engineering. 47, 272-281 (2018).
  30. Tokar, S., Feola, A., Moalli, P., Abramowitch, S. Characterizing the Biaxial Mechanical Properties of Vaginal Maternal Adaptations During Pregnancy. ASME 2010 Summer Bioengineering Conference, Parts A and B. , 689-690 (2010).
  31. Feloa, A., et al. Impact of Pregnancy and Vaginal Delivery on the Passive and Active Mechanics of the Rat Vagina. Annals of Biomedical Engineering. 39 (1), 549-558 (2010).
  32. Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical Analysis of the Uterosacral Ligament: Swine vs Human. Annual Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
  33. Champlin, A. Determining the Stage of the Estrous Cycle in the Mouse by the Appearance. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
  34. Byers, S., Wiles, M., Dunn, S., Taft, R. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
  35. McLean, A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. 67, e4389 (2012).
  36. Bugg, G., Riley, M., Johnston, T., Baker, P., Taggart, M. Hypoxic inhibition of human myometrial contractions in vitro: implications for the regulation of parturition. European Journal of Clinical Investigation. 36 (2), 133-140 (2006).
  37. Taggart, M., Wray, S. Hypoxia and smooth muscle function: key regulatory events during metabolic stress. Journal of Physiology. 509, 315-325 (1998).
  38. Yoo, K., et al. The effects of volatile anesthetics on spontaneous contractility of isolated human pregnant uterine muscle: a comparison among sevoflurane, desflurane, isoflurane, and halothane. Anesthesia and Analgesia. 103 (2), 443-447 (2006).
  39. de Souza, L., et al. Effects of redox disturbances on intentional contractile reactivity in rats fed with a hypercaloric diet. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 6364821 (2018).
  40. Jaue, D., Ma, Z., Lee, S. Cardiac muscarinic receptor function in rats with cirrhotic cardiomyopathy. Hepatology. 25, 1361-1365 (1997).
  41. Xu, Q., Shaffer, E. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal mode of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology. 110 (1), 251-257 (1996).
  42. Rodriguez, U., et al. Effects of blast induced Neurotrauma on pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Visualized Experimentals. (146), e58792 (2019).
  43. Rubod, C., Boukerrou, M., Brieu, M., Dubois, P., Cosson, M. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue Part 1: New Experimental Protocol. Journal of Urology. 178, 320-325 (2007).
  44. Robison, K., Conway, C., Desrosiers, L., Knoepp, L., Miller, K. Biaxial Mechanical Assessment of the Murine Vaginal Wall Using Extension-Inflation Testing. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 104504 (2017).
  45. Van loon, P. Length-Force and Volume-Pressure Relationships of Arteries. Biorheology. 14 (4), 181-201 (1977).
  46. Fernandez, M., et al. Investigating the Mechanical Function of the Cervix During Pregnancy using Finite Element Models Derived from High Resolution 3D MRI. Computational Methods Biomechanical and Biomedical Engineering. 19 (4), 404-417 (2015).
  47. House, M., Socrate, S. The Cervix as a Biomechanical Structure. Ultrasound Obstetric Gynecology. 28 (6), 745-749 (2006).
  48. Martins, P., et al. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue in Women with Pelvic Organ Prolapse. Gynecologic and Obstetrics Investigation. 75, 85-92 (2013).
  49. Rada, C., Pierce, S., Grotegut, C., England, S. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In vivo. Journal of Visualized Experiments. (98), e52541 (2015).
  50. Lumsden, M. A., Baird, D. T. Intra-uterine pressure in dysmenorrhea. Acta Obstectricia at Gynecologica Scandinavica. 64 (2), 183-186 (1985).
  51. Milsom, I., Andersch, B., Sundell, G. The Effect of Flurbiprofen and Naproxen Sodium On Intra-Uterine Pressure and Menstrual Pain in Patients With Primary Dysmennorrhea. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67 (8), 711-716 (1988).
  52. Park, K., et al. Vasculogenic female sexual dysfunction: the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. International Journal of Impotence Journal. 9 (1), 27-37 (1997).
  53. Bulletti, C., et al. Uterine Contractility During Menstrual Cycle. Human Reproduction. 15, 81-89 (2000).
  54. Kim, N. N., et al. Effects of Ovariectomy and Steroid Hormones on Vaginal Smooth Muscle Contractility. International Journal of Impotence Research. 16, 43-50 (2004).
  55. Giraldi, A., et al. Morphological and Functional Characterization of a Rat Vaginal Smooth Muscle Sphincter. International Journal of Impotence Research. 14, 271-282 (2002).
  56. Gleason, R., Gray, S. P., Wilson, E., Humphrey, J. A Multiaxial Computer-Controlled Organ Culture and Biomechanical Device for Mouse Carotid Arteries. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (6), 787-795 (2005).
  57. Swartz, M., Tscumperlin, D., Kamm, R., Drazen, J. Mechanical Stress is Communicated Between Different Cell Types to Elicit Matrix Remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (11), 6180-6185 (2001).
  58. Rachev, A. Remodeling of Arteries in Response to Changes in their Mechanical Environment. Biomechanics of Soft Tissue in Cardiovascular Systems. 441, 221-271 (2003).
  59. Lee, E. J., Holmes, J., Costa, K. Remodeling of Engineered Tissue Anisotropy in Response to Altered Loading Conditions. Annals of Biomedical Engineering. 36 (8), 1322-1334 (2008).
  60. Akintunde, A., et al. Effects of Elastase Digestion on the Murine Vaginal Wall Biaxial Mechanical Response. Journal of Biomechanical Engineering. 141 (2), 021011 (2018).
  61. Griffin, M., Premakumar, Y., Seifalian, A., Butler, P., Szarko, M. Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
  62. Myers, K., Socrate, S., Paskaleva, A., House, M. A Study of the Anisotripy and Tension/Compression Behavior of Human Cervical Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 132 (2), 021003 (2010).
  63. Murtada, S., Ferruzzi, J., Yanagisawa, H., Humphrey, J. Reduced Biaxial Contractility in the Descending Thoracic Aorta of Fibulin-5 Deficent Mice. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (5), 051008 (2016).
  64. Berkley, K., McAllister, S., Accius, B., Winnard, K. Endometriosis-induced vaginal hyperalgesia in the rat: effect of estropause, ovariectomy, and estradiol replacement. Pain. 132, s150-s159 (2007).
  65. van der Walt, I., Bø, K., Hanekom, S., Rienhardt, G. Ethnic Differences in pelvic floor muscle strength and endurance in South African women. International Urogynecology Journal. 25 (6), 799-805 (2014).

Tags

Bioengineering cervix vagina udvidelse-inflation test mekaniske egenskaber kvinders sundhed bækken gulv lidelser
Biaxial basal tone og passiv testning af murine reproduktive system ved hjælp af en Tryk Myograph
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

White, S. E., Conway, C. K., Clark,… More

White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter