Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biaxial basal ton och passiv testning av murina reproduktionssystemet med hjälp av en Tryckmyograph

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/60125
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Tulane University

Summary

Detta protokoll utnyttjas ett kommersiellt tillgängliga tryck myograph system för att utföra tryck myograph testning på murin slidan och livmoderhalsen. Använda Media med och utan kalcium, bidragen från den släta muskelceller (SMC) basal tonen och passiv extracellulära matrix (ECM) isolerades för organ under uppskattade fysiologiska förhållanden.

Abstract

De kvinnliga reproduktionsorganen, särskilt slidan och livmoderhalsen, består av olika cellulära komponenter och en unik extracellulär matris (ECM). Släta muskelceller uppvisar en kontraktila funktion inom vaginala och livmoderhals väggarna. Beroende på den biokemiska miljön och den mekaniska utspänd av orgel väggarna, de släta muskelcellerna förändra kontraktila villkor. Bidraget från de glatta muskelcellerna under baslinjen fysiologiska förhållanden klassificeras som en basal ton. Mer specifikt, en basala tonen är baslinjen partiell sammandragning av glattmuskelceller i avsaknad av hormonella och neurala stimulering. Dessutom ger ECM strukturellt stöd för orgel väggarna och fungerar som en reservoar för biokemiska signaler. Dessa biokemiska signaler är avgörande för olika organfunktioner, såsom anhållande tillväxt och upprätthålla homeostas. ECM av varje organ består främst av kollagenfibrer (mestadels kollagentyper I, III, och V), elastiska fibrer, och glykosaminoglykaner/proteoglykaner. Sammansättningen och organisationen av ECM diktera de mekaniska egenskaperna hos varje organ. En förändring i ECM sammansättning kan leda till utveckling av reproduktiva patologier, såsom bäcken orgel framfall eller för tidig cervikal remodeling. Vidare, förändringar i ECM mikrostruktur och stelhet kan förändra glatt muskulaturen cell aktivitet och fenotyp, vilket resulterar i förlusten av kontraktila kraft.

I detta arbete, de rapporterade protokollen används för att bedöma basala tonen och passiva mekaniska egenskaper hos den icke-gravida murina vagina och livmoderhalsen vid 4-6 månaders ålder i Estrus. Organen var monterade i en kommersiellt tillgänglig tryckmyograph och både tryck-diameter och kraft-längd tester utfördes. Exempeldata och dataanalys tekniker för mekanisk karakterisering av fortplantningsorganen ingår. Sådan information kan vara användbar för att konstruera matematiska modeller och rationellt utforma terapeutiska interventioner för kvinnors hälsorelaterade sjukdomar.

Introduction

Den vaginala väggen består av fyra skikt, epitelet, lamina propria, muscularis, och adventitia. Epitelet består främst av epitelceller. Den lamina propria har en stor mängd elastiska och fibrillar kollagenfibrer. Den muscularis hinna är också sammansatt av elastin och kollagenfibrer men har en ökad mängd glatta muskelceller. Adventitia består av elastin, kollagen, och fibroblaster, om än i reducerade koncentrationer jämfört med de tidigare lagren. De glatta muskelcellerna är av intresse för biomekaniskt motiverade forskargrupper som de spelar en roll i kontraktila karaktären av organen. Som sådan, kvantifiera smidig muskel cell Area fraktion och organisation är nyckeln till att förstå den mekaniska funktionen. Tidigare undersökningar tyder på att den släta muskel halt inom vaginalväggen är främst organiserad i omkretsriktningen och längsgående axeln. Histologisk analys tyder på att glatta muskel arean fraktion är cirka 35% för både proximala och distala delar av väggen1.

Livmoderhalsen är en mycket kollagenous struktur, som tills nyligen, ansågs ha minimal smidig muskel cellinnehåll2,3. Nyligen genomförda studier har dock föreslagit att släta muskelceller kan ha ett större överflöd och roll i livmoderhalsen4,5. Livmoderhalsen uppvisar en gradient av glatta muskelceller. Det interna operativsystemet innehåller 50-60% glatta muskelceller där det externa operativsystemet endast innehåller 10%. Mus studier, emellertid, rapportera livmoderhalsen som ska bestå av 10-15% glattmuskelceller och 85-90% fibrösa bindväv utan omnämnande av regionala skillnader6,7,8. Med tanke på att musmodellen skiljer sig från den ofta rapporterade mänskliga modellen, ytterligare undersökningar om mus livmoderhalsen behövs.

Syftet med detta protokoll var att belysa de mekaniska egenskaperna hos den murina slidan och livmoderhalsen. Detta åstadkoms med hjälp av en tryck myograph enhet som möjliggör bedömning av mekaniska egenskaper i omkretsriktningen och axiella riktningar samtidigt samtidigt som infödda cell-matris interaktioner och orgel geometri. Organen var monterade på två anpassade kanyl och säkrade med silke 6-0 suturer. Prov med tryck diameter utfördes runt den uppskattade fysiologiska axiala sträckningen för att fastställa efterlevnaden och tangent moduli9. Force-length tester utfördes för att bekräfta den uppskattade axiella sträckan och för att säkerställa att mekaniska egenskaper kvantifierades i det fysiologiska området. Den experimentella protokollet utfördes på den icke-gravida murina vagina och livmoderhalsen vid 4-6 månaders ålder i Estrus.

Protokollet är uppdelat i två huvudsakliga mekaniska provnings sektioner: basal ton och passiv testning. En basal ton definieras som baslinjen partiell sammandragning av glatta muskelceller, även i frånvaro av externa lokala, hormonella, och neurala stimulering10. Denna baslinje kontraktila karaktären av slidan och livmoderhalsen ger karakteristiska mekaniska beteenden som sedan mäts av trycket myograph systemet. De passiva egenskaperna bedöms genom att ta bort den intercellulära kalcium som upprätthåller baslinjen tillstånd av kontraktion, vilket resulterar i avslappning av glatta muskelceller. I det passiva tillståndet ger kollagen och elastin fibrer de dominerande bidragen för de mekaniska egenskaperna hos organen.

Den murina modellen används i stor utsträckning för att studera patologier i kvinnors reproduktiv hälsa. Musen erbjuder flera fördelar för att kvantifiera de föränderliga relationerna mellan ECM och mekaniska egenskaper inom reproduktionssystemet11,12,13,14. Dessa fördelar inkluderar korta och väl karaktäriserade brunst cykler, relativt låg kostnad, enkel hantering, och en relativt kort gestationstid15. Dessutom är genomet av laboratoriemöss väl kartlagda och genetiskt modifierade möss är värdefulla verktyg för att testa mekanistiska hypoteser16,17,18.

Kommersiellt tillgängliga tryck myograph system används i stor utsträckning för att kvantifiera de mekaniska svaren från olika vävnader och organ. Några anmärkningsvärda strukturer analyseras på trycket myograph systemet inkluderar elastiska artärer19,20,21,22, vener och vävnad konstruerade vaskulära ympkvistar23,24, matstrupen25, och de stora tarmarna26. Trycket myograph Technology tillåter samtidig bedömning av egenskaper i axiella och omkretsriktningen riktningar samtidigt som de infödda cell-ECM interaktioner och in vivo geometri. Trots den omfattande användningen av myograph system i mjuk vävnad och orgel mekanik, ett protokoll som utnyttjar trycket myograph Technology hade inte tidigare utvecklats för slidan och livmoderhalsen. Tidigare undersökningar av de mekaniska egenskaperna hos slidan och livmoderhalsen bedömdes uniaxially27,28. Dessa organ, dock uppleva multiaxiella lastning i kroppen29,30, vilket kvantifierar deras biaxiella mekaniska svar är viktigt.

Dessutom, nyligen arbete antyder glattmuskelceller kan spela en potentiell roll i mjuk vävnad patologier5,28,31,32. Detta ger en annan attraktion att utnyttja den tryck myograph teknik, eftersom det bevarar de infödda cell-matris interaktioner, vilket möjliggör avgränsning av bidraget att släta muskelceller spelar i fysiologiska och patofysiologiska Villkor. Häri föreslår vi ett protokoll för att kvantifiera de multiaxiella mekaniska egenskaperna hos slidan och livmoderhalsen under både basal tonen och passiva förhållanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nulliparous 4-6 månader kvinnliga C57BL6J möss (29,4 ± 6,8 gram) vid brunst användes för denna studie. Alla procedurer godkändes av Institutet för djurskötsel och användning vid Tulane University. Efter leverans, möss acklitimerad för en vecka före eutanasi och var inhysta under standardförhållanden (12-timmars ljus/mörker cykler).

1. Mouse offer på brunst

  1. Bestäm brunstcykel: den brunstcykeln övervakades genom visuell bedömning i enlighet med tidigare studier15,33,34. Den brunstcykeln består av fyra stadier: proestrus, Estrus, metestrus och diestrus. Under preöstrus fasen är könsorganen svullna, rosa, fuktiga och skrynkliga. Den brunst fasen är rynka men mindre svullna, rosa och fuktig. Metestrus och diestrus är båda rapporteras som uppvisar ingen svullnad och skrynkling, saknas i en rosa nyans, och torrt34,35.
  2. Utför experiment på Estrus: alla mekaniska tester utfördes medan möss var på Estrus, eftersom detta är det enklaste att visualisera och ger en konsekvent och upprepbar timepoint.
  3. För möss som genomgår basal ton test, euthanize via Guillotine. För möss testade endast under passiva förhållanden, euthanize med hjälp av koldioxid (CO2) inandning. Giljotinen tjänar till att bevara funktionen av släta muskelceller i reproduktionsorganen, som co2 gasen förändrar kontraktila egenskaperna hos de släta muskelcellerna36,37,38, 39,40,41,42. Det är absolut nödvändigt att utföra dissektion inom 30 minuter för att minimera risken för cell apoptos.

2. reproduktionssystemet dissektion

  1. Ställ in: placera en absorberande pad på arbetsstationen och fyll en petriskål och spruta med 4 ° c Hank balanserade salt Solution (HBSS) lösning. Använd en torka för fettvävnad bortskaffande. Placera musen ventrala Sidan upp och tejpa tassar och svans. Vrid Mikroskop lamporna på och ställ ut mikro-sax, sax, två par raka pincett, och två par böjda pincett.
  2. Med hjälp av vinklade pincetter och sax, lyfta huden runt buken och göra ett snitt vid basen av buken, ovanför blygdbenet. Snittet bör vara grunt nog att inte punktera buk muskelväggen. Fortsätt använda saxen för att skära fint mot revbenen och djupt genom magmusklerna.
  3. Ta bort ytfettet genom att dra lätt på fettet med den böjda pincetten och mikrosaxen. Fettvävnad kommer att reflektera ljus heterotivt med ett glitter-liknande utseende. Placera alla borttagna fett och vävnad på torka. Identifiera både livmoder horn och blygdbenet.
  4. Placera slutna saxar mellan vaginala väggen och blygdbenet. Försiktigt skära mitten av blygdbenet (blygd symphysis). Placera böjda pincetter på båda ändarna av snittet blygdbenet. Dra båda skära ändarna i sidled för att möjliggöra bättre tillgång till fortplantningsorganen.
  5. Ta bort urinblåsan och urinröret från vaginala väggen. Detta kan göras med hjälp av raka pincetter och mikro-sax. Håll blåsan med raka pincett för att skapa spänningar och använda trubbiga dissekeringstekniker för att separera den omgivande vävnaden från slidan. När urinblåsan och urinröret dissekeras bort, klippa basen och ta bort från kroppens hålighet.
  6. Identifiera det reproduktiva systemet: livmoder hornen dela från livmoderhalsen. Livmoderhalsen kan identifieras från slidan på grund av skillnader i geometri och stelhet. Den yttre diametern av livmoderhalsen är mindre än slidan. Livmoderhalsen är styvare än slidan och känns som liknar en pärla (figur 1).
  7. Använd bläck och bromsok för att markera 3 mm prickar längs organen. Börja under äggstockarna på livmoder rören och markera prickar inferiorly att nå livmoderhalsen. Använd Center livmoderhalsen dot för att starta en prick väg ner till slidan Introitus.
  8. Låt bläcket torka och separera fortplantningsorganen från omgivande fettvävnad, bindväv, och tjocktarmen. Rengör slidan så nära den vaginala Introitus som möjligt. Använda sax, skära runt vaginal Introitus.
    Obs: det är möjligt för organ att torka ut under denna process. Om detta är ett problem kan en spruta fylld med 4 ° c HBSS användas för att tillföra fukt till organen.
  9. Skär livmoder hornen omedelbart sämre än äggstockarna. Observera att organen kommer tillbaka från post explantat längd som bindväv avlägsnas och organet recoils. Placera dissekerade fortplantningsorganen i en petriskål fylld med 4 ° c HBSS. Denna längd förändring kan användas för att beräkna den uppskattade in vivo-längden (avsnitt 5).
    Notera: vi har identifierat att användning av HBSS vid denna temperatur under dissektion och kanylering inte påverkar den glatta muskelcellernas lönsamhet. Att upprätthålla ett pH på 7,4, dock, är absolut nödvändigt för att bibehålla livskraften i glatta muskelceller. Vid denna temperatur har HBSS en pH-nivå på 7,4.
  10. Efter en 15 minuters jämvikts period i 4 ° c Hbss, mäta utrymmet mellan prickar med hjälp av bromsok. Anteckna måtten för varje avstånd i ett kalkylblad. Dessa värden kommer att användas för att beräkna in vivo stretch ratio (ursprunglig längd/explanted längd).
  11. Ställ in den torka som innehåller den kasserade vävnaden på buk regionen med överskotts vävnaden vänd mot insidan av musen och blöt torka i 4 ° c HBSS. Linda musen och överskotts vävnad i folie och placera i en frys säker påse som ska förvaras vid-20 ° c. Passiv mekaniskt beteende på slidan konstaterades inte vara signifikant annorlunda efter en frys-Tina cykel43. Alla testade organ användes omedelbart efter eutanasi eller efter en frys-Tina cykel.

3. kanylering

  1. Bestäm rätt kanylstorlek för Organtyp. I en typisk C57BL6J mus använder slidan kanylar som är både 3,75 mm i diameter och nitad. Livmoderhalsen använder en kanyl som är 3,75 mm för vaginala änden och en kanyl 0,75 mm i diameter för livmoder änden (figur 2) den 0,75 mm kanyl är slät.
    Obs: diametern storlekar betecknas ovan används för typiska avkomma 4-6 månader C57BL6 möss, C57BL6 x 129svev, och nonparous möss i åldrarna 7-9 månader. Emellertid, vissa omständigheter, såsom framfall eller graviditet, kan kräva en större storlek kanyl.
  2. Montera den cervikala sidan på kraft givar delen av kanyleringsenheten med varje organ. Montera den motsatta änden av orgeln (vaginal eller livmoder) på mikrometerdelen av enheten. Dra åt båda ändarna med suturer.
  3. På grund av skillnaden i tjocklek och grad av kontraktilitet bland slidan och livmoderhalsen, varierande tekniker kan utnyttjas för att utföra den mest effektiva kanylering. För slidan, placera 2 suturer i mellan 2nd och 3RD nitar av kanyl i ett "X" mode. När kanylering av livmoderhalsen, kanyl är inte nitad så att orgeln är bäst placerad på bakhuvudet av kanyl med 3 horisontella suturer på livmoder slutet och 4 suturer på den externa OS. För båda organen bör maximilängden vara högst 7 mm mellan suturerna (figur 3).

4. Tryck myograph inrättas

  1. För att ställa in trycket myograph system, ström på testsystemet och fyll behållaren flaskan med 200 mL av HBSS (figur 4). Vrid värmen till "on" och låt HBSS i reservoarflaskan värma upp. Nästa, slå på mikroskopet och öppna datorprogrammet. Se till att bilden av det kanylerade organet, tryck gränssnittet, flödes mätaravläsningar och sekvenserarens Funktionsverktyg är synliga (figur 5).

5. grundläggande ton mekanisk provning

Notera: livmoderhalsen uppvisade en phasic natur under början stadier av testning. Detta minskade dock efter förkonditioneringen. Basala tonen testning görs med hjälp av Krebs ringer buffert (KRB) i bassängen av DMT enheten. Bufferten är luftad med 95% O2 och 5% Co2. Efter den basala tonen delen är klar, kalcium fri KRB utnyttjas.

  1. Hitta den lossade geometri: sträck orgeln så att väggen inte är i spänning. För slidan, Observera spåren på vaginala väggen. För livmoderhalsen, skär omedelbart under de bläck prickar som ligger ovanför och under den centrala livmoderhalsen märket. Detta utarbetar en repeterbar metod för en cervikal in situ-längd på 6 mm44. Mät längden från sutur till sutur med bromsok
  2. Att hitta det lossade trycket (upp): öka trycket från 0 till 10 mmHg i steg om 1 mmHg. Bestäm det tryck i vilket orgeln inte längre kollapsade. Detta kan bestämmas som det största hoppet i den yttre diametern vid ett givet tryck, som ställts ut på program monitorn. Efter registrering av tryck och yttre diameter, notera detta som den första punkten där orgeln inte kollapsade och noll kraften.
  3. Beräknad in vivo-stretch: beräkna den uppskattade in vivo-sträckan genom att dividera längden mätt i vivo med den uppmätta längden efter explant:
    Equation 1
  4. Förkonditionering av tryck diameter: Ställ in trycket på 0 mmHg, längden till den uppskattade in vivo-längdenEquation 2och gradienten till 1,5 mmHg/s. kör en sekvens som tar trycket från 0 mmHg till in vivo-trycket + lossat (tabell 1), håll i 30 sekunder och tryck till 0 mmHg med en 30 sekunders Hold-period. När du har repeterat totalt 5 cykler trycker du på Stop i datorprogrammet och sparar filen.
  5. Att hitta den experimentella in vivo stretch: justera orgeln för att vara på Beräknad in vivo längd medan vid det lossade trycket och tryck på Start. Bedöm tryck kontra kraftvärden för tryckvärden från det lossade trycket till det maximala trycket (tabell 1). Tryck på stopp -knappen i datorprogrammet och spara filen.
    Märk: det uppmätta sträck värdet beräknas in situ. Detta åtföljs av begränsningen att den endast kan mätas efter att ha disarticulating blygdbensymphysis. Som ett resultat, den naturliga tjudra förloras, som kan ändra längden. Den teoretiska sträckan är dock baserad på den tidigare introducerade teorin att orgeln kommer att uppleva minimala förändringar i kraft när de utsätts för fysiologiska påfrestningar för att spara energi45. I protokollet skall den uppmätta in vivo-sträckan vara det sträck värde som beräknas med hjälp av den experimentellt identifierade längden vari det finns minimal förändring i kraft när den utsätts för ett fysiologiskt spektrum av tryck.
  6. Förkonditionering av tryck diameter: Ställ in trycket på 0 mmHg, längden till den experimentella in vivo-längden och lutningen på 1,5 mmHg/s. kör en sekvens som tar trycket från 0 mmHg till maximalt tryck + upp, håll i 30 sekunder och tillbaka till 0 mmHg med en AD 30 andra kvarhållningsperiod. Efter att ha upprepat detta för totalt 5 cykler, tryck på stopp -knappen i programgränssnittet och spara filen.
    Anmärkning: 5,4 är absolut nödvändigt för att uppnå en mer konsekvent axiell kraft avläsning med ökande tryck. Detta steg hjälper till att hitta rätt in vivo stretch, som ofta underskattas baserat på visuella signaler. 5,6 fungerar som ett försiktighets steg för att minimera hysteres och för att uppnå en konsekvent, repeterbar, matematiskt interpretabel respons från orgeln.
  7. Force-length förkonditionering: Ange 1/3 Max tryck + upp för både inlopps-och utloppstrycket. Justera orgeln till-2% av in vivo-längden och tryck på Start. Justera längden till + 2% in vivo-längd och sedan tillbaka ner till-2% vid 10 μm/s. Upprepa axiell förlängning för totalt 5 cykler. Tryck på Stop i datorprogrammet och spara filen.
  8. Equilibration: med organ på den beslutsamma in vivo längden, uppsättningen både inloppet och utloppstrycket på 1/3 av maximat pressa + upp. Equilibrate orgeln i 10 minuter. Sakta föra båda Tryck tillbaka ner till 0 mmHg med gradienten inställd som 1,5 mmHg/s.
  9. Omvärdera den olastade geometrin: sätt orgeln till in vivo-längden och trycket till det olastade trycket. Minska den axiella längden mot den uppskattade lossade längden med en hastighet av 10 μm/s tills det finns minimal förändring i kraften. Denna motsvarande längd kallas den olastade längden, eller där orgeln inte är i spänning eller kompression. Innan du nollar kraften registrerar du den olastade längden, ytterdiametern och kraft värdet.
    Anmärkning: den tidigare lossade geometri bestämdes av visuella ledtrådar, som är rent kvalitativ. En ny utvärdering är nödvändig för en kvantitativ metod och för att redogöra för eventuella längdförändringar som kan inträffa under förkonditioneringen. Denna geometri kommer att användas i avsnitt 8.
  10. Ultraljud setup: Använd den allmänna Imaging buken paketet för att visualisera organ i testenheten. (Figur 6). Innan du testar, minimera artefakter från botten av trycket myograph metal Basin. Justera kanyl till en höjd som är det maximala avståndet från botten med vävnaden fortfarande helt nedsänkt i testlösningen. En anpassad hållare är 3D-tryckt för att stabilisera givaren i vertikalt läge under bildtagning.
  11. Ultraljud Imaging: identifiera kanyl nära kraft givaren och justera stadiet av mikroskopet till bild längs längden på vävnaden. Under hela testprocessen spåras mellersta regionen längs längden (figur 6a, C). Efter avbildning, granska bilden "Cine Store" loop som består av en serie B-läge ramar och identifiera ramen med den största ytterdiametern. De gjorda tjock Leks beräkningarna kommer att användas i avsnitt 8.
  12. Provning av tryck diameter (-2% in vivo längd): Tryck på Start och justera orgeln så att den är-2% av in vivo-längden, Ställ in trycket på 0 mmHg och gradient till 1,5 mmHg/s. öka trycket från 0 mmHg till det maximala trycket. Tryck tillbaka ned till 0 mmHg med en 20 sekunders Hold-period. Upprepa detta i 5 cykler.
  13. Tryck diameter provning (in vivo längd): Tryck på Start och justera orgeln så att den är på vivo längd, ställa in trycket till 0 mmHg, och lutning till 1,5 mmHg/s. öka trycket från 0 mmHg till det maximala trycket. Tryck tillbaka ned till 0 mmHg med en 20 sekunders Hold-period. Upprepa detta i 5 cykler.
  14. Provning av tryck diameter (+ 2% in vivo längd): justera orgeln så att den är + 2% in vivo längd, Ställ in trycket på 0 mmHg, och gradient till 1,5 mmHg/s. öka trycket från 0 mmHg till det maximala trycket och sedan tillbaka ner till 0 mmHg med en 20 sekunders Hold period. Upprepa detta i 5 cykler. Tryckdata från alla tre längder kommer att användas i avsnitt 8.
  15. Kraft längds provning (nominellt tryck): Ställ in trycket på det lossade trycket och orgeln till-2% av in vivo-längden. Sträck ut orgeln till + 2% av in vivo-längden och återgå till-2% in vivo-längden med en hastighet av 10 μm/s. Upprepa för totalt 3 cykler.
  16. Kraft-längd provning (1/3 maximalt tryck + upp): Ställ in trycket till 1/3 av det maximala trycket + upp och justera orgel till-2% in vivo längd. Efter att ha tryckt på Start, sträck ut orgeln till + 2% in vivo-längden och tillbaka till-2% in vivo-längden med en hastighet av 10 μm/s. När du upprepar för totalt 3 cykler, tryck på stoppa och spara data.
  17. Kraft-längd provning (2/3 maximalt tryck + upp): Ställ in trycket till 2/3 av det maximala trycket + upp och justera orgel till-2% in vivo längd. Tryck på Start och sträck ut orgeln till + 2% in vivo-längden och tillbaka till-2% in vivo-längden med en hastighet av 10 μm/s. När du upprepar för totalt 3 cykler, tryck på stoppa och spara data.
  18. Kraft längds provning (maximalt tryck + upp): Ställ in trycket på maximalt tryck + upp och justera orgeln till-2% in vivo-längden. Med en hastighet av 10 μm/s, sträck ut orgeln till + 2% av in vivo-längden och tillbaka till-2% in vivo-längden. Efter att ha upprepat för totalt 3 cykler, spara data. Alla Force data kommer att användas i avsnitt 8.
  19. Ta bort KRB-testmediet och tvätta med kalcium fritt KRB. Byt ut mediet med kalciumfri KRB-lösning kompletterad med 2 mM EGTA. Inkubera vävnaden i 30 minuter. Ta bort lösningen och ersätt mediet med färsk kalciumfri KRB.

6. passiv mekanisk provning

Obs: om du börjar med passiv testning börjar i steg 1. Om basal tons test utfördes före passiv start i steg 6. Om du börjar med fryst vävnad, låt en 30-minuters jämvikts period i rumstemperatur innan kanylera orgeln.

  1. Hitta den lossade geometri: sträck orgeln så väggen av orgeln är inte i spänning. Mät kanylerade orgeln från sutur till sutur och anteckna detta som den olastade längden.
  2. Att hitta det olastade trycket: efter att ha tryckt på Start, öka trycket från 0 till 10 mmHg i steg om 1 mmHg. Medan du går igenom denna process, bestämma det tryck i vilket organet inte är i spänning. Med hjälp av datorprogram Monitor, kan detta bestämmas från det största hoppet i den yttre diametern. Efter nollning av kraft, registrera detta tryck samt den yttre diametern och notera detta som den första punkten där orgeln inte kollapsade.
  3. Beräknad in vivo-stretch: beräkna den uppskattade in vivo-sträckan genom att dividera längden mätt i vivo med den uppmätta längden efter explant.
  4. Förkonditionering av tryck diameter: efter att ha tryckt på Start, Ställ in trycket inställt på 0 mmHg, längden som beräknad in vivo längd, och gradient till 1,5 mmHg/s. börja köra en sekvens som tar trycket från 0 mmHg till det maximala trycket och tillbaka till 0 Mmhg. Upprepa denna process genom 5 cykler med en 30 sekunders Hold tid.
  5. Force-längd preconditioning: justera orgeln till in vivo längd och manuellt in det lossade trycket i datorprogrammet för båda tryck. Efter att ha tryckt på Start, Ställ in lutningen på 2 mmHg och trycket till 1/3 av den maximala. Sträck ut orgeln upp till + 2% och tillbaka ner till-2% stretch vid 10 μm/s. Upprepa denna cykel för totalt 5 gånger och tryck på Stop.
  6. Att hitta den experimentella in vivo-längden: hitta och rita kraftvärden vid-2% av in vivo-längden, in vivo-längden och + 2% av in vivo-längden. Ta krafter vid jämnt fördelade tryck från 0 mmHg till maximalt tryck. Den experimentella in vivo stretch kommer att vara stretch värde som uppvisar en relativt platt linje över en rad tryck.
  7. Upprepa tryck diametern och de axiella förkonditioneringsstegen vid den nya in vivo-längden.
  8. Jämvikt: med orgel vid fastställd in vivo längd, Ställ in inlopps-och utloppstrycket till det lossade trycket. Låt orgeln re-equilibrate i 15 minuter. Efter 15 minuter, långsamt föra in inlopps-och utloppstrycket tillbaka ner till 0 mmHg.
  9. Omvärdera oladdad konfiguration: ta orgeln till den olastade längden och omvärdera den olastade längden. Anteckna den olastade längden och den yttre diametern medan trycket är 0 mmHg, det lossade trycket, och 1/3 det maximala trycket. Nollan kraften vid det lossade trycket. Diametern vid det lossade trycket är in vivo-diametern.
    Anmärkning: omberäkning av den olastade längden är nödvändig eftersom små plastiska deformationer observerades tidigare i mjuka biologiska vävnader efter prekonditionering. Denna lossade konfiguration kommer att vara den som utnyttjas i avsnitt 8.
  10. Ultraljud: utför ultraljud B-läge avbildning vid den lossas längd och tryck.
  11. Provning med tryck diameter: med orgel på-2% av experimentellt bestämd in vivo längd och trycket vid 0 mmHg, tryck på Start. Öka trycket från 0 mmHg till det maximala trycket och tillbaka till 0 mmHg. Håll 2-0 mmHg-steget i 20 sekunder. Efter att ha repeterat för totalt 5 gånger, tryck på stopp -knappen i gränssnittet och spara filen.
    Anmärkning: Upprepa vid den experimentella in vivo-längden, + 2% av den experimentella in vivo-längden.
  12. Kraft längds test: Ställ in trycket på nominellt tryck och justera orgeln till-2% av in vivo-längden. Sträck ut orgeln upp till + 2% av in vivo-längden och tillbaka till-2% av in vivo-längden med en hastighet av 10 μm/s. Efter att ha repeterat för totalt 3 gånger, spara data. Upprepa detta för 1/3 Max tryck, 2/3 Max tryck, och vid Max tryck.
  13. Beräkna den olastade tjockleken från ultraljud bilder B-läge bild. Med hjälp av bildprogram, rita en linje för att beteckna penetrationsdjupet. Ställ in skalan på linjens längd (dvs. 2000 μm som visas i figur 6b och 6d).
  14. Väggtjocklek beräkningar: med hjälp av en datorprogramvara, spåra och mäta den inre och yttre diametern på orgeln. Dra sedan och mät en linje mellan diametrarna. Rita totalt 25 transmural linjer. Genomsnittlig alla datapunkter och upprepa för totalt 3 gånger.

7. städa upp

  1. Kontrollera att trycket är 0 mmHg och avstängt. Stäng av huvud öppningen och uttaget för båda trevägsventilerna. Aspirera resterande vätska från bassängen på kanyleringsanordningen.
  2. Ta bort orgeln från scenen och fyll behållaren flaska med avjoniserat vatten. Skölj kanylen med vatten med hjälp av en spruta. Anslut slangen för att kringgå kanyl.
  3. Vrid trycket och flödet på, Ställ in inloppstrycket till 200 mmHg, utloppstrycket till 0 mmHg, gradient till 10 mmHg/s, och låt flödet löpa i 5 minuter. Låt systemet köras medan reservoarflaskan är tom och låt luften köra i 5 minuter eller tills linjerna är torra.

8. analys av data

  1. För provning med tryck diameter, samla in data varifrån trycket börjar öka från minimivärdet till maximalt. För Force-length testning, samla in data från strax under den maximala topp som är i kraft tills kraften slutat minska.
  2. Öppna datafilen för varje test med tryck diameter och välj fliken medel tryck. Navigera till lastningsområdet för den sista kurvan, 0 mmHg till det maximala trycket, och släpp data i ett kalkylblad. Välj samma region på fliken yttre diameter, inloppstryck, utloppstryck, kraft, temperatur, pH och flöde och placera varje objekt i samma dokument.
  3. Öppna data för varje kraft längds test. Navigera till inläsnings området för kurvan,-2% till + 2%, och dra och släpp data i ett kalkylblad. Välj samma region för de andra uppmätta variablerna och placera varje objekt i samma kalkylblad.
  4. För tryck diameter och kraft längd test subtrahera upp från alla tryckvärden.
  5. Genomsnittlig data för tryck diametern var 1 mmHg (dvs. 0 +/-0,5, 1 +/-0,5, 2 +/-0,5).
  6. Hitta den lossade volymen av orgeln (V). Ekvation 1 kan utnyttjas för att hitta V, med tanke på att R02 är den lossas yttre radie mätt med mikroskopet, L är den olastade längden, och H är den lossade tjocklek som upptäcks av ultraljud. Antagandet om inkompressibiliteten är lånefinansierade, vilket innebär att organet bevarar volymen samtidigt utsätts för deformationer.
    Obs: den olastade längden mäts med bromsok från sutur till sutur. Den lossade diametern mäts via Mikroskop, kamera och programvara följt av beräkning av radien (figur 5) den olastade tjockleken beräknas utifrån ultraljudsbilderna (figur 6).
    Equation 3Ekvation 1
  7. Använda antagandet om inkompressibilitet, Använd den olastade volymen, deformerade yttre radieEquation 4(), och längdEquation 5() för att bestämma deformerade inre Equation 6 radie.
    Equation 7Ekvation 2
  8. Använd ekvationer 3, 4 och 5 för att beräkna varje stress, respektive. I ekvationer 3-5 definieras P som det svalgmanometri trycket och Ft är den kraft som mäts av givaren.
    Equation 8Ekvation 3
    Equation 9Ekvation 4
    Equation 10Ekvation 5
  9. Plotta relationen mellan tryck och diameter, Force-Pressure-relation, Omcirklerande stress-circumferentiell stretch-relation och den axiella stressen och circumferentiella stretch-värdena (figur 7, figur 8). Sträck värden kan beräknas med hjälp av mellanväggsradie. Beräkningar av de perifera och axiella påfrestningarna återfinns i ekvationerna 6 respektive 7.
    Equation 11Ekvation 6
    Equation 12Ekvation 7
  10. Beräkna efterlevnaden nära det fysiologiska tryckområdet och i in vivo stretch. Den undre tryck gränsen (LPB) är 1 standardavvikelse under det genomsnittliga uppmätta trycket. Den övre tryck bundna (UPB) är 1 standardavvikelse över medelvärdet uppmätt tryck9.
    Equation 13
  11. Beräkna tangenten moduli att kvantifiera materialets styvhet. Identifiera den beräknade circumferentiella stressen som motsvarar det undre tryck bundna och övre gräns trycket. Passa in en linjär linje till den omkretsriktningen stress-circumferentiella stretch kurvan inom det identifierade stress området i invivo längd. Beräkna lutningen på linjen9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Framgångsrik analys av de mekaniska egenskaperna hos de kvinnliga reproduktionsorganen är beroende av lämpliga organ dissektion, kanylering, och testning. Det är absolut nödvändigt att explantat livmoder hornen till slidan utan några defekter (figur 1). Beroende på Organtyp kommer kanylstorleken att variera (figur 2). Kanylering skall ske så att orgeln inte kan röra sig under experimentet men inte heller skadar orgeln under ingreppet (figur 3). Underlåtenhet av något steg kommer att resultera i oförmåga hos fartyget att hålla tryck. Provningsförfarande standardisering är avgörande för protokollets framgång för att ge konsekventa och repeterbara resultat.

När orgeln är dissekeras och kanylerade ordentligt, makt på trycket myograph systemet. Inställningen av de tryck myograph system innebär en styrenhet enhet, flödesmätare, och skede (figur 4). Det tryck myograph systemet används för att övervaka olika aspekter av organet som det genomgår mekanisk provning (figur 5). Ett ultraljudssystem, eller motsvarande, används för att mäta tjockleken på organen i det lossade tillståndet med och utan basal ton (figur 6). Efter mekanisk provning kan tangenten moduli beräknas för de omkretsriktningen och axiella riktningarna (tabell 2).

Både bas tonen testning och passiv testning avkastning viktiga mekaniska egenskaper i reproduktionsorganen, med och utan kontraktila bidrag av släta muskelceller (figur 7, figur 8). Skalning mellan organen kräver några justeringar av protokollen (tabell 1), som livmoderhalsen och slidan uppleva olika laster in vivo46-48. Sådana variationer kan övervakas genom tekniker som tryckkaterisering. Tryckkaterisering är en metod som tidigare använts för att övervaka in vivo-förhållandena inom slidan och livmodern49-53. Modellerna i de tidigare studierna spänner från möss, kaniner och människor. Samma principer skulle gälla på samma sätt som det cervikala och vaginala trycket specifikt för murin-modellen. Oavsett vilket organ som testas behövs dock samma material för protokollen (tabell 3).

Figure 1
Figur 1: murina dissekera diagram. Musen dissektion för fortplantningsorganen: både livmoder horn, livmoderhalsen, och slidan. I figuren, urinblåsan och urinröret avlägsnas från den främre av slidan. Tarmarna och magmusklerna reflekterades fint. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Storleksjämförelse av de två kanylen. Storleksjämförelse av de två kanylor som används för kanylering av fortplantningsorganen. Den större kanyl (D = 3,75 mm) används för vaginal vävnad (A). Den mindre kanyl (D = 0,75 mm) används för kanylerande livmoderhals vävnad (B). Livmoderhalsen kanyl är slät medan vaginal kanyl har två spår. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Kanyleringsmetod för vagina och cervix. På grund av den varierande geometri och tjocklek av fortplantningsorganen, de är mest effektivt kanylerade i distinkta seder. För slidan, placera två suturer i ett "X" mode. När kanylering av livmoderhalsen, placera 3 horisontella suturer på livmoder slutet och 4 suturer på den externa OS. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: inställning för tryck myograph Device. Installationen av DMT-enheten utnyttjas för både basal och passiv testning. DMT består av tre huvud knutpunkter: Stage (a), styrenhet Unit (B) och flödesmätare (C). Inom styrenheten finns en behållare flaska och en avfallsflaska. Behållaren flaskan är initialt fylld med vätska som tömmer när experimentet utförs. Avfallsflaskan, som initialt är tom, samlar in den vätska som rinner genom experimentet. Styrenheten enheten gränssnitt med DMT programvara på datorn och styrtryck, temperatur och flöde. Styrenhets enheten läser av utgångarna från kraft-och tryckgivarna inom scenen genom en VGA-gränssnittskabel. Systemets scen komponent innehåller ett inlopps-och utlopps flöde för systemet. Inlopps-och utlopps flödet har motsvarande inlopps-och utloppstryck mätt med systemet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: filinställningar på programmet tryck myograph. Visning av datorprogramvara set-up. En låda ritas runt regionen av intresse och yttre diameter av vävnaden är optiskt spåras i realtid (a). Data som erhålls under mekanisk provning registreras och visas i realtid i ytterdiametern, inloppstrycket, utloppstrycket, medel trycket, kraft, temperatur, pH och flödesfliken (B). Inom tryck gränssnitts trycket (mmHg), gradienten (mmHg/s) och flödet kontrolleras. Vidare visas den axiella kraften (mN) mätt med in-line Force-givaren. Flödeshastighet (μL/min) rapporteras i fliken flödesmätare (C). Tryck sekvensering visas och styrs i Sequencer-fliken (D). Data som registrerats under mekanisk provning registreras och visas i realtid i den yttre diametern, inloppstryck, utloppstryck, medel tryck, kraft, temperatur, pH och flöde Tab (E). En representativ tryck diameter test av slidan visas visar yttre diameter som en funktion av tiden på den yttre diametern fliken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: ultraljudsundersökning. Ultraljud avbildning av murina fortplantningsorganen. Alla bilder togs med ultraljudssystemet på Short-Axis-B-läget. En representativ bild av slidan vid den olastade längden och trycket (a). Vaginala väggtjockleken beräknades i ImageJ. En vertikal linje drogs längs djupskalan (mm) för att kalibrera antalet pixlar per μm. Polygonverktyget användes för att spåra den inre och yttre diametern. Sedan ritas transmural linjer för att beräkna tjocklek och medelvärde (B). Detta utfördes 3 gånger. En representativ bild av livmoderhalsen vid den lossade längden och trycket (C). Väggtjockleken beräknades sedan med hjälp av bild J och polygonverktyget på ett liknande sätt som i slidan (D). Inom reproduktions komplexet spåras ytterdiametern på två olika platser (E). Under hela avbildningsprocessen stabiliseras givaren av en 3-D tryckt hållare (F). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: representativa resultat för vaginal testning. Representativa mekaniska testresultat av de vaginala basala och passiva protokollen. Med de data som erhålls genom DMT-systemet kan flera mekaniska relationer härledas. A) basala tryck-diameter, B) passiv tryck diameter, C) basala kraft-tryck, D) passiv kraft-tryck, E) basal omkretsriktningen stress-omkretsriktningen stretch, F) passiv omkretsriktningen stress-omkretsriktningen stretch, G) basal axiell stress-omkretsriktningen stretch, H) passiv axiell stress-omkretsriktningen stretch. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: representativa resultat för cervikal testning. Representativa mekaniska testresultat av de cervikala basala och passiva protokollen. Med de data som erhålls genom DMT-systemet kan flera mekaniska relationer härledas. A) basala tryck-diameter, B) passiv tryck diameter, C) basala kraft-tryck, D) passiv kraft-tryck, E) basal omkretsriktningen stress-omkretsriktningen stretch, F) passiv omkretsriktningen stress-omkretsriktningen stretch, G) basal axiell stress-omkretsriktningen stretch, H) passiv axiell stress-omkretsriktningen stretch. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

In vivo-tryck Maximalt tryck 1/3 Max tryck 2/3 Max tryck Axiell stretch Cannula storlek Rekommenderat antal
av suturer
Slidan 7 mmHg 15 mmHg 5 mmHg 10 mmHg -2%, in vivo, + 2% 3,75 mm 2--i ett "X" mode
Livmoderhalsen 10 mmHg 200 mmHg 66 mmHg 133 mmHg -2%, in vivo, + 2% 0,75 mm för livmoder änden
3,75 mm för vaginaländen		 3 horisontella suturer på
livmoder änden
4 suturer på
vaginal yttre OS

Tabell 1: Sammanfattning av information för skalning av mekaniska provningsmetoder för varje organ. De lossade tryck värdena mättes med hjälp av kateriseringstekniker under anestesi (4% isofluran i 100% syre). En ballongkateter utnyttjades för vaginal mätningar och en 2F-kateter för livmoderhalsen.

Slidan Livmoderhalsen
Basala
Circumferential (kPa)		 127,94 188
Basala
Axiellt (kPa)		 56,8 75,44
Passiv
Circumferential (kPa)		 246,03 61,26
Passiv
Axiellt (kPa)		 112,74 19,26

Tabell 2: representativa resultat för tangenten moduli i slidan och livmoderhalsen. Tangenten moduli beräknades för både basal och passiv förhållanden samt för både omkretsriktningen och axiella riktningar. Alla mätningar finns i enheter av kPa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det protokoll som föreskrivs i denna artikel presenterar en metod för att bestämma de mekaniska egenskaperna hos murin slidan och livmoderhalsen. De mekaniska egenskaperna som analyseras i detta protokoll omfattar både de passiva och basala ton förhållandena i organen. Passiva och basala ton förhållanden induceras genom att förändra den biokemiska miljö där orgeln är nedsänkt. För detta protokoll innehåller media som deltar i basal testning kalcium. Testning av basal tonen tillstånd tillåter isolering av glatt muskel cell mekaniskt bidrag inom de kvinnliga reproduktionsorganen54,55. När passiv mekanisk provning utförs innehåller mediet inte kalcium. Bristen på kalcium hämmar glatta muskelceller från upphandlande. Detta möjliggör klargörande av andra ECM-komponenter, såsom kollagen och elastiska fibrer, som i stor utsträckning dikterar de passiva mekaniska egenskaperna. I kombination med biokemiska och histologisk analys, dessa resultat medger klargörande av sambandet mellan ECM mikrostrukturell sammansättning och mekanisk funktion. Detta gör det möjligt att avgränsa de strukturella och mekaniska mekanismerna för patologier som är relevanta för kvinnors reproduktiva hälsa.

Tidigare testades slidan och livmoderhalsen uniaxially27,28. Slidan och livmoderhalsen, dock, Visa anisotropisk egenskaper och uppleva multiaxiella lastning in vivo29,30 . Därför, tryck myograph system som används häri ger kvantitativ information om multiaxiella lastning som kan hjälpa till att förstå etiologier av reproduktiv patologier, samt den efterföljande utformningen av potentiella behandlingar. Ytterligare, tryck myography tillstånd bedömning av multiaxiella egenskaper samtidigt bevara in vivo orgel geometri och den infödda cell-Matrix interaktion56 . In vivo, cellerna aktivt omforma den omgivande ECM som svar på förändringar i biomekaniska och biokemiska signaler57,58,59. Det protokoll som används häri är fördelaktigt eftersom det medger övervakning av senare förändringar i bulkorganegenskaper under fysiologiskt relevanta förhållanden. Detta hjälper till att tillhandahålla en plattform för att generera systematiska dataset av multiaxiella aktiva och passiva mekaniska egenskaper. Dessutom kan de data som samlas in i dessa experiment utnyttjas för att formulera och validera mikrostrukturmotiverade ickelinjära konstitutiva modeller för att beskriva och förutsäga det mekaniska svaret hos de kvinnliga reproduktionsorganen i friska och patologiska tillstånd16,60.

En ytterligare system komponent som var fördelaktigt för protokollet var användningen av ultraljud avbildning för att mäta tjockleken på orgel väggarna. Tjockleken är avgörande information för att beräkna stress erfarna medan genomgår testning.

Med alla experimentella inrättas, det finns vissa begränsningar för denna procedur. Detta protokoll anser för närvarande endast elastisk respons i slidan och livmoderhalsen och inte viskoelastiska svar. En potentiell metod för att mildra denna begränsning i framtiden är att ändra det befintliga protokollet för att inkludera krypning och stress avslappnings analyser61. En andra begränsning förutsätter att organen är incompressible. Inom denna studie, tjocklek var enbart mätt vid den lossas konfiguration, som motiveras av tidigare studier som visar nongravid murina vävnad uppvisar minimala förändringar i volym under osmotiska lastning62. Dessutom har ytterligare studier fungerat under samma antagande av incompressibility44,60,63. Helst skulle ett ultraljud utföras för hela experimentet för att undanröja behovet av incompressibility antagande och att bättre informera finita element modeller. En slutlig begränsning är avsaknaden av kvantifierad in vivo livmoderhalscancer tryck för att informera laddnings protokollen. Litteraturen tyder på att livmoderhalsen trycket hos mänskliga kvinnor är 37 mmHg53. Möss, dock, kan uppvisa olika livmoderhalscancer tryck från den hos människor. En skillnad i vaginalt tryck visades mellan gnagare modeller och humana prover64,65. Ytterligare studier behövs för att kvantifiera trycket i den icke-gravida murin cervix. Mot denna punkt, intrauterin trycket rapporterades nyligen under graviditeten49.

Det kommersiellt tillgängliga trycket myograph system som används i denna procedur mäter kraft egenskaperna hos elastiska, ihåliga organ. Detta protokoll är lätt att anpassa till andra olika organ och vävnader genom att modifiera de kemiska tillsatser i badet, kanyl storlek, och sutur tjocklek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Arbetet finansierades av NSF CAREER Award Grant #1751050.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2F catheter Millar SPR-320 catheter to measure cervical pressure
6-0 Suture Fine Science Tools 18020-60 larger suture ties
CaCl2 (anhydrous) VWR 97062-590 HBSS concentration: 140 mg/ mL
CaCl2-2H20 Fischer chemical BDH9224-1KG
KRB concentration: 3.68 g/L
Dextrose (D-glucose) VWR 101172-434 HBSS concentration: 1000 mg/mL
KRB concentration: 19.8 g/L
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 curved forceps
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11203-25 straight forceps
Eclipse Nikon E200 microscope used for imaging
Flow meter Danish MyoTechnologies 161FM flow meter within the testing apparatus
Force Transducer - 110P Danish MyoTechnologies 100079 force transducer
ImageJ SciJava ImageJ1 used to measure volume
Instrument Cases Fine Science Tools 20830-00 casing to hold dissection tools
KCl Fisher Chemical 97061-566 HBSS concentration: 400 mg/ mL
KRB concentration: 3.5 g/L
KH2PO4 G-Biosciences 71003-454 HBSS concentration: 60 mg/ mL
MgCl2 VWR 97064-150
KRB concentration: 1.14 g/L
MgCl2-6H2O VWR BDH9244-500G HBSS concentration: 100 mg/ mL
MgSO4-7H20 VWR 97062-134 HBSS concentration: 48 mg/ mL
Mircosoft excel Microsoft 6278402 program used for spreadsheet
Na2HPO4 (dibasic anhydrous) VWR 97061-588 HBSS concentration: 48 mg/mL
KRB concentration: 1.44 g/L
NaCl VWR 97061-274 HBSS concentration: 8000 mg/mL
KRB concentration: 70.1 g/L
NaHCO3 VWR 97062-460 HBSS concentration: 350 mg/ mL
KRB concentration: 21.0 g/L
Pressure myograph systems Danish MyoTechnologies 110P and 120CP Pressure myograph system:
prorgram, cannulation device,
and controller unit
Pressure Transducer Danish MyoTechnologies 100106 pressure transducer
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 straight forceps
Student Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 91500-09 micro-scissors
Tissue dye Bradley Products 1101-3 ink to measure in vivo stretch
Ultrasound transducer FujiFilm Visual Sonics LZ-550 ultrasound transducer used; 256 elements, 40 MHz center frequency
VEVO2100 FujiFilm Visual Sonics VS-20035 ultrasound used for imaging
Wagner Scissors Fine Science Tools 14069-12 larger scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Capone, D., et al. Evaluating Residual Strain Throughout the Murine Female Reproductive System. Journal of Biomechanics. 82, 299-306 (2019).
  2. Danforth, D. The fibrous nature of the human cervix, and its relation to the isthmic segment in gravid and nongravid uteri. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 53 (4), 541-560 (1947).
  3. Hughesdon, P. The fibromuscular structure of the cervix and its changes during pregnancy and labour. Journal of Obstetrics and Gynecology of the British Commonwealth. 59, 763-776 (1952).
  4. Bryman, I., Norstrom, A., Lindblo, B. Influence of neurohypophyseal hormones on human cervical smooth muscle cell contractility in vitro. Obstetrics and Gynecology. 75 (2), 240-243 (1990).
  5. Joy, V., et al. A New Paradigm for the Role of Smooth Muscle Cells in the Human Cervix. Obstetrics. 215 (4), e471-e478 (2016).
  6. Xu, X., Akgul, Y., Mahendroo, M., Jerschow, A. Ex vivo assessment of mouse cervical remodeling through pregnancy via Na (23) MRS. NMR Biomedical. 23 (23), 907-912 (2014).
  7. Leppert, P. Anatomy and Physiology of cervical ripening. Clinical Obstetrics and Gynecology. 43 (43), 433-439 (2000).
  8. Schlembach, D., et al. Cervical ripening and insufficiency: from biochemical and molecular studies to in vivo clinical examination. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 144, S70-S79 (2000).
  9. Stoka, K., et al. Effects of Increased Arterial Stiffiness on Atherosclerotic Plaque Amounts. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (5), (2018).
  10. Mohram, D., Heller, L. Ch. 7. Cardiovascular Physiology. , The McGraw-Hill Companies. (2006).
  11. Yoshida, K., et al. Quantitative Evaluation of Collagen Crosslinks and Corresponding Tensile Mechanical Properties in Mouse Cervical Tissue during Normal Pregnancy. PLoS One. 9, e112391 (2014).
  12. Mahendroo, M. Cervical remodeling in term and preterm birth: insight from an animal model. Society for Reproduction and Fertility. 143 (4), 429-438 (2012).
  13. Elovitz, M., Miranlini, C. Can medroxyprogesterone acetate alter Toll-like receptor expression in a mouse model of intrauterine inflammation? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 193 (3), 1149-1155 (2005).
  14. Ripperda, C., et al. Vaginal estrogen: a dual-edged sword in postoperative healing of the vaginal wall. North American Menopause Society. 24 (7), 838-849 (2017).
  15. Nelson, J., Felicio, P., Randall, K., Sims, C., Finch, E. A Longitudinal Study of Estrous Cyclicity in Aging C57/6J Mice: Cycle, Frequency, Length, and Vaginal Cytology. Biology of Reproduction. 27 (2), 327-339 (1982).
  16. Ferruzzi, J., Collins, M., Yeh, A., Humphrey, J. Mechanical assessment of elastin integrity in fibrillin-1-deficient carotid arteries: implications for Marfan Syndrome. Cardiovascular Research. 92 (2), 287-295 (2011).
  17. Mariko, B., et al. Fribrillin-1 genetic deficiency leads to pathological ageing of arteries in mice. The Journal of Pathology. 224 (1), 33-44 (2011).
  18. Rahn, D., Ruff, M., Brown, S., Tibbals, H., Word, R. Biomechanical Properties of The Vaginal Wall: Effect of Pregnancy, Elastic Fiber Deficiency, and Pelvic Organ Prolapse. American Urogynecological Society. 198 (5), (2009).
  19. Caulk, A., Nepiyushchikh, Z., Shaw, R., Dixon, B., Gleason, R. Quantification of the passive and active biaxial mechanical behavior and microstructural organization of rat thoracic ducts. Royal Society Interface. 12 (108), 20150280 (2015).
  20. Amin, M., Le, V., Wagenseil, J. Mechanical Testing of Mouse Carotid Arteries: from Newborn to Adult. Journal of Visualized Experiments. (60), e3733 (2012).
  21. Sokolis, D., Sassani, S., Kritharis, E., Tsangaris, S. Differential histomechanical response of carotid artery in relation to species and region: mathematical description accounting for elastin and collagen anisiotropy. Medical and Biological Engineering and Computing. 49 (8), 867-879 (2011).
  22. Kim, J., Baek, S. Circumferential variations of the mechanical behavior of the porcine thoracic aorta during the inflation test. Journal of Biomechanics. 44 (10), 1941-1947 (2011).
  23. Faury, G., et al. Developmental adaptation of the mouse cardiovascular system to elastin haploinsufficency. Journal of Clinical Investigation. 11 (9), 1419-1428 (2003).
  24. Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue-Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Engineering. 20, 346-355 (2014).
  25. Sommer, G., et al. Multaxial mechanical response and constitutive modeling of esophageal tissues: Impact on esophageal tissue engineering. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9379-9391 (2013).
  26. Sokolis, D., Orfanidis, I., Peroulis, M. Biomechanical testing and material characterization for the rat large intestine: regional dependence of material parameters. Physiological Measurement. 32 (12), 1969-1982 (2011).
  27. Martins, P., et al. Prediction of Nonlinear Elastic Behavior of Vaginal Tissue: Experimental Results and Model Formation. Computational Methods of Biomechanics and Biomedical Engineering. 13 (3), 317-337 (2010).
  28. Feola, A., et al. Deterioration in Biomechanical Properties of the Vagina Following Implantation of a High-stiffness Prolapse Mesh. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 120 (2), 224-232 (2012).
  29. Huntington, A., Rizzuto, E., Abramowitch, S., Prete, Z., De Vita, R. Anisotropy of the Passive and Active Rat Vagina Under Biaxial Loading. Annals of Biomedical Engineering. 47, 272-281 (2018).
  30. Tokar, S., Feola, A., Moalli, P., Abramowitch, S. Characterizing the Biaxial Mechanical Properties of Vaginal Maternal Adaptations During Pregnancy. ASME 2010 Summer Bioengineering Conference, Parts A and B. , 689-690 (2010).
  31. Feloa, A., et al. Impact of Pregnancy and Vaginal Delivery on the Passive and Active Mechanics of the Rat Vagina. Annals of Biomedical Engineering. 39 (1), 549-558 (2010).
  32. Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical Analysis of the Uterosacral Ligament: Swine vs Human. Annual Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
  33. Champlin, A. Determining the Stage of the Estrous Cycle in the Mouse by the Appearance. Biology of Reproduction. 8 (4), 491-494 (1973).
  34. Byers, S., Wiles, M., Dunn, S., Taft, R. Mouse Estrous Cycle Identification Tool and Images. PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).
  35. McLean, A. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. 67, e4389 (2012).
  36. Bugg, G., Riley, M., Johnston, T., Baker, P., Taggart, M. Hypoxic inhibition of human myometrial contractions in vitro: implications for the regulation of parturition. European Journal of Clinical Investigation. 36 (2), 133-140 (2006).
  37. Taggart, M., Wray, S. Hypoxia and smooth muscle function: key regulatory events during metabolic stress. Journal of Physiology. 509, 315-325 (1998).
  38. Yoo, K., et al. The effects of volatile anesthetics on spontaneous contractility of isolated human pregnant uterine muscle: a comparison among sevoflurane, desflurane, isoflurane, and halothane. Anesthesia and Analgesia. 103 (2), 443-447 (2006).
  39. de Souza, L., et al. Effects of redox disturbances on intentional contractile reactivity in rats fed with a hypercaloric diet. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 6364821 (2018).
  40. Jaue, D., Ma, Z., Lee, S. Cardiac muscarinic receptor function in rats with cirrhotic cardiomyopathy. Hepatology. 25, 1361-1365 (1997).
  41. Xu, Q., Shaffer, E. The potential site of impaired gallbladder contractility in an animal mode of cholesterol gallstone disease. Gastroenterology. 110 (1), 251-257 (1996).
  42. Rodriguez, U., et al. Effects of blast induced Neurotrauma on pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Visualized Experimentals. (146), e58792 (2019).
  43. Rubod, C., Boukerrou, M., Brieu, M., Dubois, P., Cosson, M. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue Part 1: New Experimental Protocol. Journal of Urology. 178, 320-325 (2007).
  44. Robison, K., Conway, C., Desrosiers, L., Knoepp, L., Miller, K. Biaxial Mechanical Assessment of the Murine Vaginal Wall Using Extension-Inflation Testing. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 104504 (2017).
  45. Van loon, P. Length-Force and Volume-Pressure Relationships of Arteries. Biorheology. 14 (4), 181-201 (1977).
  46. Fernandez, M., et al. Investigating the Mechanical Function of the Cervix During Pregnancy using Finite Element Models Derived from High Resolution 3D MRI. Computational Methods Biomechanical and Biomedical Engineering. 19 (4), 404-417 (2015).
  47. House, M., Socrate, S. The Cervix as a Biomechanical Structure. Ultrasound Obstetric Gynecology. 28 (6), 745-749 (2006).
  48. Martins, P., et al. Biomechanical Properties of Vaginal Tissue in Women with Pelvic Organ Prolapse. Gynecologic and Obstetrics Investigation. 75, 85-92 (2013).
  49. Rada, C., Pierce, S., Grotegut, C., England, S. Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In vivo. Journal of Visualized Experiments. (98), e52541 (2015).
  50. Lumsden, M. A., Baird, D. T. Intra-uterine pressure in dysmenorrhea. Acta Obstectricia at Gynecologica Scandinavica. 64 (2), 183-186 (1985).
  51. Milsom, I., Andersch, B., Sundell, G. The Effect of Flurbiprofen and Naproxen Sodium On Intra-Uterine Pressure and Menstrual Pain in Patients With Primary Dysmennorrhea. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 67 (8), 711-716 (1988).
  52. Park, K., et al. Vasculogenic female sexual dysfunction: the hemodynamic basis for vaginal engorgement insufficiency and clitoral erectile insufficiency. International Journal of Impotence Journal. 9 (1), 27-37 (1997).
  53. Bulletti, C., et al. Uterine Contractility During Menstrual Cycle. Human Reproduction. 15, 81-89 (2000).
  54. Kim, N. N., et al. Effects of Ovariectomy and Steroid Hormones on Vaginal Smooth Muscle Contractility. International Journal of Impotence Research. 16, 43-50 (2004).
  55. Giraldi, A., et al. Morphological and Functional Characterization of a Rat Vaginal Smooth Muscle Sphincter. International Journal of Impotence Research. 14, 271-282 (2002).
  56. Gleason, R., Gray, S. P., Wilson, E., Humphrey, J. A Multiaxial Computer-Controlled Organ Culture and Biomechanical Device for Mouse Carotid Arteries. Journal of Biomechanical Engineering. 126 (6), 787-795 (2005).
  57. Swartz, M., Tscumperlin, D., Kamm, R., Drazen, J. Mechanical Stress is Communicated Between Different Cell Types to Elicit Matrix Remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (11), 6180-6185 (2001).
  58. Rachev, A. Remodeling of Arteries in Response to Changes in their Mechanical Environment. Biomechanics of Soft Tissue in Cardiovascular Systems. 441, 221-271 (2003).
  59. Lee, E. J., Holmes, J., Costa, K. Remodeling of Engineered Tissue Anisotropy in Response to Altered Loading Conditions. Annals of Biomedical Engineering. 36 (8), 1322-1334 (2008).
  60. Akintunde, A., et al. Effects of Elastase Digestion on the Murine Vaginal Wall Biaxial Mechanical Response. Journal of Biomechanical Engineering. 141 (2), 021011 (2018).
  61. Griffin, M., Premakumar, Y., Seifalian, A., Butler, P., Szarko, M. Biomechanical Characterization of Human Soft Tissues Using Indentation and Tensile Testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
  62. Myers, K., Socrate, S., Paskaleva, A., House, M. A Study of the Anisotripy and Tension/Compression Behavior of Human Cervical Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 132 (2), 021003 (2010).
  63. Murtada, S., Ferruzzi, J., Yanagisawa, H., Humphrey, J. Reduced Biaxial Contractility in the Descending Thoracic Aorta of Fibulin-5 Deficent Mice. Journal of Biomechanical Engineering. 138 (5), 051008 (2016).
  64. Berkley, K., McAllister, S., Accius, B., Winnard, K. Endometriosis-induced vaginal hyperalgesia in the rat: effect of estropause, ovariectomy, and estradiol replacement. Pain. 132, s150-s159 (2007).
  65. van der Walt, I., Bø, K., Hanekom, S., Rienhardt, G. Ethnic Differences in pelvic floor muscle strength and endurance in South African women. International Urogynecology Journal. 25 (6), 799-805 (2014).

Tags

Bioteknik livmoderhalsen Vagina förlängning-inflations test mekaniska egenskaper kvinnors hälsa bäckenbotten sjukdomar
Biaxial basal ton och passiv testning av murina reproduktionssystemet med hjälp av en Tryckmyograph
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

White, S. E., Conway, C. K., Clark,… More

White, S. E., Conway, C. K., Clark, G. L., Lawrence, D. J., Bayer, C. L., Miller, K. S. Biaxial Basal Tone and Passive Testing of the Murine Reproductive System Using a Pressure Myograph. J. Vis. Exp. (150), e60125, doi:10.3791/60125 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter