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Medicine

Estabelecimento de um modelo severo do olho seco usando dacryoadenectomy completo nos coelhos

doi: 10.3791/60126 Published: January 8, 2020

Summary

Uma nova abordagem é apresentada para induzir doença ocular seca crônica em coelhos, removendo cirurgicamente todas as glândulas lacrimais orbitais. Este método, distinto daqueles relatados previamente, produz um modelo estável, reproduzível do olho seco deficiente aquoso bem serido para estudar a fisiologia do rasgo e a fisiopatologia e a terapêutica ocular.

Abstract

A doença oculares seca (DED) é uma doença complexa com múltiplas etiologias e sintomas variáveis, tendo inflamação da superfície ocular como seu passo fisiopatológico chave. Apesar dos avanços em nossa compreensão do DED, as lacunas significativas de conhecimento permanecem. Os avanços são limitados em parte devido à falta de modelos animais informativos. Os autores relataram recentemente um método de DED induzido injetando todos os tecidos orbitais da glândula lacrimal (LG) com a concanavalin a lectina. Aqui, relatamos um novo modelo de DED deficiente aquoso baseado na ressecção cirúrgica de todos os tecidos orbitais LG (dacrioadenectomia). Ambos os métodos usam coelhos por causa de sua similaridade aos olhos humanos nos termos do tamanho e da estrutura da superfície ocular. Uma semana após a remoção da membrana nictitating, o LG superior orbital foi removido cirurgicamente anestesia, seguido pela remoção do LG superior palpebral, e, finalmente, a remoção do INFERIOR LG. Dacryoadenectomia induzida ded grave, evidenciado por um redução acentuada no teste de tempo de ruptura de lágrimas e no teste de lágrimas do Schirmer, e aumentou significativamente a osmolaridade de lágrimas e a coloração de bengala rosa. Dacrioadenectomy induzida DED durou pelo menos oito semanas. Não houve complicações e os animais toleraram bem o procedimento. A técnica pode ser dominada relativamente facilmente por aqueles com experiência cirúrgica adequada e apreciação da anatomia relevante do coelho. Uma vez que este modelo recapitula as características do DED aquoso-deficiente humano, é adequado para estudos de homeostase superficial ocular, DED e terapêutica candidata.

Introduction

Lágrimas são necessárias para a proteção da superfície ocular e para a manutenção das propriedades ópticas da córnea. Eles consistem em três camadas: um revestimento de mucin interior, um componente aquoso médio e uma sobreposição lipídicas1. A camada de mucin é produzida predominantemente em células cálice da conjuntiva, o componente aquoso predominantemente nas glândulas lacrimais (LGs) e a camada lipídica predominantemente nas glândulas meibomianas1,2. Os LGs orbitais são a principal fonte para o componente aquoso das lágrimas e para muitas das proteínas que protegem a superfície do ataque bacteriano3. As doenças superficiais oculares oseguem quando a produção de lágrimas aquosas é diminuída abaixo de um nível crítico, privando as superfícies epiteliais do olho do componente aquoso e constituintes cruciais do rasgo, incluindo fatores de crescimento, lisózime e lactoferrina. Nos casos de diminuição da produção de lágrimas pelos LGs, os tecidos conjuntivos e córneos passam por adaptações para compensar o ambiente alterado.

Compreender a contribuição do componente de rasgo derivado dos LGs orbitais e dos mecanismos compensatórios da superfície ocular quando isso está faltando impacta nossa apreciação da fisiologia e fisiopatologia do segmento anterior do olho e, mais amplamente, da saúde e da doença em todo o globo. A abordagem experimental para estas questões requer um modelo animal informativo. Consequentemente, vários grupos têm tentado desenvolver modelos animais em que os LGs orbitais são removidos, facilitando assim a avaliação do papel das lágrimas na saúde ocular. Um desses modelos foi recentemente relatado para o mouse4. O coelho oferece, no entanto, muitas vantagens distintas sobre modelos de roedores, incluindo estruturas anatômicas e histológicas semelhantes da LG, e talvez mais importante, tamanho semelhante e área de superfície da córnea e tecidos conjuntivos quando comparados aos seus homólogos humanos3.

A criação de doença sadia deficiente deficiente deficiente do olho seco (DED) pela ressecção cirúrgica do tecido LG em coelhos não é nova. Inúmeros relatórios descrevem a ressecção de tecidos LG com sucesso variável refletida em mudanças variáveis na produção de lágrimas medida pelo teste de lágrimas do Schirmer5,6,7,8. Uma compreensão completa da anatomia relevante do coelho e clareza sobre a terminologia anatômica são muito úteis na reprodução deste método. Uma visão geral completa de ambos é fornecida abaixo.

Anatomia das glândulas lacrimais

O coelho tem dois LGs orbitais: o LG inferior maior (ILG) e o LG superior menor (SLG; Figura 1). O ILG estende ao longo do aspecto inferior e posterior da borda orbital. Com exceção do tamanho variável, a porção anterior do ILG tem uma aparência bulbosa bastante uniforme que pode ser vista como uma protuberância na pele o globo (Figura 2). Por causa de sua aparência característica em relação ao resto da glândula, é referido como a "cabeça" do ILG. Uma parte da cabeça envolve ao redor e encontra-se na superfície externa do osso zygomatic. Isso serve como um marco útil na biomicroscopia de ultra-som para orientar injeções no ILG. O restante da cabeça reside mais medially9 na órbita.

Devido à aparência característica da parte restante do ILG, que é longo e fino, este segmento é referido como a "cauda". A cauda corre ao longo da borda orbital inferior, da cabeça do ILG à borda orbital, onde termina com anatomia variável na borda orbital inferior e posterior (Figura 3A). A cauda encontra-se profundamente (medial) ao osso zygomatic separado dos índices orbitais por uma faixa fascial para a maioria de seu curso até que alcangue a borda posterior da órbita onde estende mais uma vez para fora sobre a superfície externa do osso zygomatic. O ILG recebe seu suprimento de sangue de ramos da artéria carótida.

O SLG tem dois componentes análogos ao ser humano. Um deles é o superior palpebral LG (PSLG), que reside na pálpebra posterior superior medial para a placa de lona. Parece bulboso na natureza e tem inúmeras aberturas punctate que drenam fluido lacrimogêneo aquoso que é mais facilmente visto quando coberto com 2% de fluoresceina (Figura 3B).

A segunda é a LG superior orbital (OSLG), residente em posição medial na órbita superior (Figura 3C). Devido à sua posição perto da linha média do crânio, tem sido impossível identificá-lo com sucesso usando abordagens cirúrgicas externas da órbita temporal ou inferior. Em amostras frescas da necropsia ou em casos cirúrgicos, esta glândula pode prolapsada através do incisure posterior situado na superfície dorsal do crânio quando a pressão medial delicada é aplicada ao globo. Prolapso deste tecido glandular pode ser documentado com biomicroscopia de ultra-som.

O PSLG e o OSLG são estruturas contíguas. O OSLG é uma estrutura tubuloalveolar cuja arquitetura ductal se une no duto excretório principal. Este duto passa o cume supra-orbital e corre nos tecidos da tampa superior que terminam no PSLG. Ao longo do duto excretório, o tecido glandular consistente com as descrições originais de Davis foi identificado10 (Figura 3D).

Uma nota sobre terminologia

Excelentes e abrangentes descrições anatômicas também usam terminologia variável. A anatomia orbital clássica por Davis define apenas um LG superior e inferior10. No entanto, sua descrição da LG superior claramente detalha as porções mais especificamente definidas aqui como o PSLG e OSLG, enquanto sua descrição dos detalhes mais baixos lg as porções definidas aqui como a cabeça ea cauda do ILG. Um atlas anatômico mais recente e completo11 define esses tecidos como a glândula zigomática e o altísto de acessórios. O termo "glândula lacrimal" é usado aqui para compor o PSLG e osLG acima mencionados. Esta terminologia é mais adequada para reproduzir este método sem confusão indevida.

Protocol

Todos os estudos em animais vertebrados foram concluídos de acordo e conformidade com todas as diretrizes regulatórias e institucionais relevantes. Todos os estudos foram aprovados pelo Institutional Review Board da Stony Brook University e realizados de acordo com a declaração da Association for Research in Vision and Ofthalmology (ARVO) para o uso de animais em pesquisa oftalmológica e de visão.

1. Animais e habitação

  1. Use coelhos brancos da Nova Zelândia (NZW) pesando 2 a 3 kg.
  2. Casa coelhos individualmente em um ambiente estritamente controlado: temperatura (65 ± 5 °F), umidade (45 ± 5%) e iluminação (12 h on/off ciclo).
    NOTA: Devido a comportamentos agressivos frequentemente exibidos entre coelhos que são agrupados, manter os animais em gaiolas individuais para evitar lesões oculares inadvertidas.
  3. Dê aos coelhos acesso ilimitado à comida e água padrão do coelho.
  4. Não forneça outros enriquecimentos alimentares, de modo a evitar a suplementação inadvertida de vitamina A que pode afetar o olho seco.
  5. Acclima coelhos pelo menos duas semanas antes de gravar parâmetros de DED.

2. Remoção da membrana nictitating

NOTA: Para a simplicidade, a técnica para o olho direito é descrita abaixo. Complete este procedimento no olho esquerdo de forma idêntica.

  1. Retire a membrana nictitating bilateralmente durante o período de aclimatação (geralmente na primeira semana).
  2. Coloque o coelho em um saco de restrição de tamanho adequado.
  3. Administrar uma injeção subcutânea de acepromazine (1 mg/kg) sobre os ombros usando uma seringa de 1 cc e 26 G agulha para sedar o coelho. O ponto final para esta sedação suave é quando o animal mantém uma posição de cabeça relaxada sem movimentos normais de digitalização e suas orelhas não estão mais totalmente eretas.
  4. Usando uma micropipette, aplique 25 μL de lidocaína livre de conservantes (1%) aos olhos. Insira um espectro da tampa de arame entre as pálpebras.
  5. Agarre a membrana nictitating em seu ápice com 0.3 fórceps (ou equivalente) e puxe-a sobre a superfície córnea. Injetar 1% lidocaína com 1:100,000 adrenalina no espaço subconjuntivo da membrana nictitating usando uma agulha de 26 G. Injete aproximadamente 0,3 mL para formar um bleb de tamanho modesto sobre a membrana nictitating. Os volumes de injeção acima de 1 mL estão bem dentro de uma faixa de dose segura para coelhos (2-4 mg/kg).
  6. Retire o espectro de arame. Aguarde aproximadamente 5 min para a lidocaína e adrenalina para entrar em vigor. Durante este tempo, realize o mesmo procedimento no olho do companheiro.
  7. Substitua o espectro da tampa do fio. Agarre e estenda a membrana nictitating sobre a superfície córnea usando 0.3 fórceps. Corte a membrana em sua base com tesoura de tenotomia ou equivalente.
    NOTA: Sangramento é geralmente mínimo, mas manter uma unidade de cautery bateria de alta temperatura nas proximidades e usar conforme necessário para minimizar o sangramento. A pressão direta sobre a base de corte da membrana nictitating também pode ser usada para parar o sangramento pequeno se ocorrer.
  8. Retire o espectro da tampa do fio. Coloque pomada antibiótica tópica (neomicina, polimitalina, bacitracina e hidrocortisona) sobre a superfície da córnea.
  9. Realize um procedimento idêntico ao olho do companheiro como indicado pelo protocolo.
  10. Coloque os animais de volta em gaiolas individuais e deixe curar por pelo menos uma semana, ou até que a superfície conjuntiva tenha curado completamente do ponto de vista clínico, antes de realizar quaisquer ensaios ou intervenções adicionais.
    NOTA: A cura clínica completa é indicada pela falta de inchaço, injeção ou descarga das superfícies conjuntivais. Os animais devem manter os olhos abertos normalmente, sem a presença de ptose protetora.

3. Medição de parâmetros de olhos secos e coleta de amostras de rasgo

  1. Medir os seguintes parâmetros de DED, conforme apropriado para o protocolo experimental: osmolaridade lágrima, tempo de ruptura lágrima, teste de lágrimas de Schirmer, e coloração bengala rosa. Realizá-los como descrito anteriormente12, com uma equipe de pelo menos dois investigadores.
    NOTA: Uma equipe de pelo menos dois investigadores permite a medição eficiente de grupos maiores de animais (6 ou mais) em torno do mesmo tempo do relógio, impedindo assim possíveis variações circadianas de impactar os resultados.

4. Preparação cirúrgica e anestesia

  1. Animais levemente calmos colocados em um saco de restrição com acepromazine subcutânea como acima (1 mg/kg).
  2. Retire toda a pele no rosto e superfície dorsal do crânio para visualizar os marcos cirúrgicos.
    1. Aparar a pele com tesouras de corte deixando peles finas residuais cerca de 1 mm de comprimento (Figura 4A, à esquerda).
    2. Retire todas as peles residuais usando creme depilatório leve seguindo as instruções do fabricante(Figura 4A,à direita).
  3. Mark locais de incisão cirúrgica com uma caneta cirúrgica.
    1. Identifique o local da incisão sobre o incisure posterior aplicando a pressão medial ao globo que faz com que uma protuberância pequena se torne na pele sobre o incisure posterior do prolapso do OSLG.
    2. Faça uma marca linear de 2 cm na direção anterior/posterior na pele sobre a superfície dorsal do crânio diretamente sobre este local com uma caneta de marcação cirúrgica.
    3. Ao planejar a incisão para remoção do ILG, marque uma longa e curvilínea linha ao redor do olho (1 cm da margem inferior e temporal da tampa) que se estende desde a órbita posterior (temporal) até o canthus anterior (medial). Faça a marcação estender ao longo da órbita posterior ao nível do canthus medial ou apenas superior a este (Figura 4B). Em algumas dissecções, as incisões para remover o OSLG e o ILG serão conectadas.
      NOTA: Ao realizar cirurgia bilateral, marque ambas as órbitas neste momento.
  4. Apare um remendo da pele 2 a 3 cm de largura com tesouras sobre a superfície lateral de cada coxa para permitir a colocação de uma placa monopolar do cautery.
    1. Aplique gel de ultra-som para garantir um bom contato elétrico com a placa de cautery monopolar.
  5. Coloque um cateter intravenoso de 25 G (IV) em uma das veias marginais da orelha para administrar medicamentos ou fluidos, se necessário.
  6. Dê xilazine subcutâneo (1 mg/kg) e cetamina IV (15 mg/kg) para a indução inicial de anestesia (através do acesso IV).
    NOTA: Se o coelho é sedado de antemão com acepromazine suficiente para reter o ponto final descrito na etapa 2.3, use a sedação da máscara de gás com isoflurane como uma alternativa.
  7. Coloque uma via aérea máscara de laringe realizada no lugar usando uma faixa elástica ou corda para proteger e manter as vias aéreas.
    1. Conecte a máscara à máquina de anestesia com fluxo de oxigênio fixado em 1 L/min.
    2. Definir o isoflurano em 5% inicialmente e, em seguida, reduzir como tolerado com base no nível de sedação animal.
    3. Mantenha o isoflurane em ou acima de 2% até o fechamento final da ferida.
      NOTA: Avaliar o nível de sedação, monitorando a freqüência respiratória e os movimentos em resposta a estímulos cirúrgicos ou dolorosos. Aumentar a profundidade da anestesia se a taxa respiratória aumenta acima de 10 respirações por minuto, se o coelho começa a mastigar o mantenedor das vias aéreas, ou se quaisquer movimentos em resposta a estímulos dolorosos são observados.
  8. Monitore a oximetria do pulso, a capografia, a pressão arterial, a temperatura corporal retal e a frequência cardíaca usando um dispositivo de monitoramento de vários parâmetros ou outros dispositivos apropriados.
    1. Monitorar os sinais vitais continuamente durante o procedimento e registrar a cada 10 a 15 minutos.
  9. Posicione o coelho na mesa da sala de cirurgia (OR) sobre uma almofada de aquecimento para evitar hipotermia. Incline a tabela em uma posição reversa de Trendelenburg em aproximadamente 30° para minimizar o sangramento.
  10. Prepare a área cirúrgica com uma solução de povidone-iodo diluída em meia-força com água estéril e armar de modo a manter um campo estéril.

5. Dacrioadenectomy cirúrgica completa

NOTA: A dacrioadenectomia cirúrgica completa, como descrito aqui, foi feita usando fórceps de tecido 0,3, tesoura de tenotomia, fórceps de tecido não dentados e tesouras. Esses instrumentos podem ser trocados com instrumentos similares que executam a mesma função com base na preferência do cirurgião.

  1. Retire o OSLG primeiro.
    1. Infiltre-se nos locais de incisão (linhas de caneta de marcação cirúrgica e tampa posterior superior) com uma mistura de 50:50 de 2% de lidocaína com 1:100.000 adrenalina e 0,5% bupivacaine usando uma seringa de 5 cc com uma agulha de 30 G (Figura 5A).
      NOTA: Seringa e tamanho da agulha não são críticos.
    2. Use uma agulha de Colorado conectada a uma unidade eletrocirúrgica para fazer as incisões da pele ao longo das marcações cirúrgicas. As configurações podem variar com base na resposta clínica e normalmente estão entre 10 a 15 unidades para corte e coagulação (Figura 5B).
    3. Aplique tensão oposta em toda a incisão da pele para separar os tecidos e expor as fibras musculares frontoscutularis subjacentes.
    4. Aplique pressão medial sobre o globo para ajudar a visualização do OSLG, visto como tecido abaulamento localizado apenas medial ou profundo para as fibras musculares frontoscutularis. Se necessário, mova estas fibras musculares para o lado, a fim de expor o incisure subjacente.
    5. Com fórceps dentados (0,3) e tesoura capsulotomia, suavemente retrair e cortar a cápsula fibrosa sobrepondo o OSLG. O OSLG normalmente tem uma cor bronzeada pálida(Figura 5C).
    6. Usando fórceps dentados ou não dentados, agarrar o tecido da glândula OSLG e puxá-lo suavemente para fora através do incisure superior usando uma "mão sobre a mão" técnica. Corte pequenas bandas fibrosas usando tesoura capsulotomia para libertar a glândula de sua posição na órbita (Figura 5D).
      NOTA: À medida que o tecido da glândula OSLG é removido, ele começará a se unir em uma grande estrutura semelhante a um tubo (duto excretório principal).
    7. Quando a glândula foi removida tão completamente quanto possível, use cautery generoso com a agulha de Colorado para criar o char do tecido, truncando a glândula dentro do incisure tão profundamente como possível. Isso mais tarde servirá como um marco confirmatório durante a remoção do PSLG.
  2. Retire o PSLG.
    1. Evert a pálpebra superior usando um aplicador de ponta de algodão. A extremidade bulbosa do PSLG é geralmente facilmente visível.
      NOTA: Em algumas dissecções anatômicas, pode ser possível visualizar o duto excretório principal como uma estrutura linear pálida de cerca de 1 ou 2 mm de largura.
    2. Envolver o PSLG com fórceps dentadas (0,3) e retraiê-lo da superfície da pálpebra ao usar tesoura capsulotomia para cortar em torno de sua base separando-o do tarso subjacente (Figura 6A).
    3. Controle sangramento moderado com o cauterde monopolar.
    4. Aplique tração contínua no tecido separado para manter um plano de tecido para dissecação. Isso permitirá que o principal duto excretório do SLG seja removido também (Figura 6B).
      NOTA: À medida que a dissecação é realizada, ela normalmente avançará para a borda orbital superior, onde é possível ver as marcas cautery deixadas para trás da remoção da OSLG mais superior e medialmente localizada.
  3. Reseque o ILG.
    1. Permita que pelo menos 5 min para o anestésico local entre em vigor.
    2. Incise a pele, o músculo depressor da palpebra inferior, a parte zygomaticolabial do músculo zygomatic, e músculo orbicularis com a agulha da microdissese de Colorado e separado quanto para o OSLG na seção 5.1.
    3. Mantenha a hemostasis com o cautery monopolar.
    4. Como a incisão é levada mais profundamente através da marcação da pele, procure o brilho de um plano fascial sobre o osso zigomático ou parte superficial do músculo masseter. Neste ponto, manter o plano de tecido e levá-lo superiormente em direção à borda orbital usando a agulha Colorado para o corte (Figura 7A).
      NOTA: Com a finalidade de identificar o ILG, é mais fácil executar esta parte da dissecação sobre a cabeça do ILG que é tipicamente inferior ao limbus anterior do olho.
    5. Depois de identificar e incisar a cápsula em torno do ILG, identifique o tecido bronzeado do ILG. Apenas a parte anterior da cabeça ILG será visível(Figura 7B). No entanto, a cabeça pode ser seguida de forma mediana à medida que passa o arco zigomático e transições para a cauda (Figura 7C).
    6. Use tesoura de tenotomia para cortar o septo orbital ao longo da borda inferior expondo a parte mais posterior da cauda ILG. Uma vez que o plano de tecido é identificado, estender a dissecação posteriormente ao longo de toda a linha de incisão(Figura 7D).
      NOTA: O duto do ILG passa através dos tecidos conjuntivos fibrosos inferiores para entrar no espaço conjuntivo inferior no aspecto temporal da tampa. Na borda posterior, a cauda do ILG pode ter configurações anatômicas variadas. Às vezes termina inferior ao canthus posterior (lateral), enquanto em outras dissecções se estende mais superiormente ao redor da órbita temporal.
    7. Use o cuidado extremo para impedir dano inadvertida à fonte de sangue, que o ILG recebe das filiais da artéria carótida. O suprimento de sangue pode ser visto durante esta parte da dissecação (Figura 7E).
    8. Nos casos em que a cauda termina o canto posterior (lateral), pode ser necessário dividir a porção temporal do músculo frontoscutular para expor a cauda do ILG, que fica ao longo do osso zigomático.
    9. Depois que todo o ILG tiver sido isolado e exposto, removê-lo. Devido ao seu grande tamanho, muitas vezes é preferível cortar a glândula ao meio com uma tesoura e remover a cabeça separadamente da cauda.
    10. Proceda com muita cautela ao remover a cabeça do ILG, uma vez que se encontra imediatamente adjacente a um grande seio venoso na órbita. Embora o sangramento desta estrutura durante as ressecções cirúrgicas não tenha ocorrido, tenha amplas ajudas hemostáticas presentes para mitigar esse risco.
    11. Após a remoção de todo o tecido da glândula, feche o plano de tecido conjuntivo profundo com várias suturas de tereftalato de etileno interrompido semetileno 5-0. Feche os músculos superficiais e pele com uma corrida 6-0 poliglactina 910 sutura (Figura 7F) usando 0,3 fórceps de tecido e um motorista de agulha.

6. Cuidados pós-processuais

  1. Desarruma os animais e limpe os locais cirúrgicos com água estéril.
  2. Aplique antibiótico oftalmológico tópico e pomada de esteroides (neomicina, polimixinimina, bacitracina e hidrocortisona) às incisões. Continue esta aplicação duas vezes por dia durante 2 dias.
  3. Dê uma injeção subcutânea de 20 mL salina normal sobre as omoplatas usando uma agulha 26 G.
  4. Dê buprenorfina subcutânea 0,01 mg/kg ou cetoprofeno 3 mg/kg para controle da dor usando uma seringa de 1 cc e agulha 30 G.
    NOTA: Os animais devem retornar à sua ingestão alimentar normal e atividades dentro de 1 a 2 dias. Os coelhos devem ser avaliados pelo menos semanalmente para sinais clínicos da infecção como evidenciado pelo inchamento progressivo, pela dor, pelo eritema, pelo calor ou pela descarga purulenta sobre os locais da incisão. Os animais também devem ser observados para garantir que eles não comecem a arranhar os locais de incisão / linhas de sutura. Aparar todas as garras antes da dacrioadenectomia pode ser útil a este respeito. Se arranhar as linhas de incisão é observado, colares protetores padrão podem ser usados para evitar auto-lesões.
  5. Reverter a anestesia.
    1. Retire o mantenedor das vias aéreas depois que o animal responde a estímulos e começa a mostrar mastigação espontânea, mas antes que o mantenedor das vias aéreas pode ser danificado.
    2. Monitore os animais por aproximadamente 1 a 2 h ou até que tenham se recuperado completamente da anestesia, como evidenciado pelo movimento espontâneo em suas gaiolas.
    3. Avalie os animais para dor e trate adequadamente.
  6. Permitir que os animais se recuperem por pelo menos 1 semana após a cirurgia antes de fazer quaisquer medidas clínicas de DED.

Representative Results

O método completo da dacrioadenectomia descrito aqui foi realizado em 8 animais. Requer um grau moderado de habilidade cirúrgica. O tempo cirúrgico teve uma média de cerca de 2,2 h para cirurgia bilateral, excluindo a remoção da membrana nictitating, que foi feita separadamente e necessária <10 minutos. Não houve mortes ou complicações intraoperatórias e nenhum coelho exigiu qualquer auxílio hemostático que não seja o cauterido modesto.

Nossa aproximação cirúrgica induziu com sucesso o olho seco em todos os olhos. Isso foi confirmado por um painel de marcadores clínicos e laboratoriais do DED(Tabela 1). Durante as 8 semanas de observação, a Média TBUT foi suprimida por mais de 75% dos níveis pré-operatórios (p < 0,0001 para todos os pontos de tempo). Da mesma forma, o teste de lágrimas do Schirmer diminuiu em aproximadamente 50%, permanecendo assim para as 8 semanas de observação; não apresentou tendência de recuperação durante o período de acompanhamento. No pós-operatório, a osmolaridade de lágrimas apresentou um aumento de 10% consistente com o DED, sustentado por pelo menos 8 semanas no pós-operatório. Rose bengal coloring da córnea também aumentou e não mostrou sinais de recuperação durante as 8 semanas de acompanhamento (Figura 8). Todos os olhos submetidos à dacrioadenectomia completa mostraram redução acentuada nos números de células cálice e alterações epitelias consistentes com o olho seco (citologia de impressão conjuntiva).

Figure 1
Figura 1: Anatomia da glândula lacrimal do coelho (olho direito). A glândula lacrimal superior orbital (OSLG) é composta por uma parte orbital maior e componente palpebral menor. A maior glândula lacrimal inferior (ILG) é composta pelas porções anterior/cabeça e posterior/cauda. Os eixos de coordenação mostram a terminologia utilizada para todas as descrições de orientação utilizadas no texto. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Localização do chefe do ILG. A vista lateral da face direita após a remoção da pele. Uma protuberância no contorno da pele (indicado por setas grossas) inferior à órbita anterior indica a localização da cabeça do ILG que se encontra na superfície externa do osso zigomático neste local. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: As glândulas lacrimal orbitais. (A) A glândula lacrimal inferior direita (ILG) depois de colorir com o tintura azul de Evans mostrando a proximidade da cauda do ILG (seta vermelha) apenas medial ao osso zigomático (seta preta) e inferior ao globo. (B) Rasgar a produção da glândula lacrimal superior palpebral (PSLG). Fotos de lapso de tempo tiradas após a aplicação tópica de 2% de fluoretana. Fluido aquoso que emana do PSLG dilui o corante de fluoresceina azul ou preto inicialmente escuro transformando-o verde amarelo brilhante (semelhante ao teste seidel). (C) Posição de SLG orbital (OSLG) no crânio de coelho, deitado perto da linha média do crânio (linha pontilhada) dentro do incisure posterior (seta). O tine azul de Evans foi injetado no OSLG e na glândula lacrimal superior palpebral. (D)A seção histológica através do principal duto excretório da OSLG cercado por uma pequena quantidade de tecido glandular (seta) é vista nesta seção transversal histopatológica manchada com hematoxilina e corantes de eosina tomadas através do aspecto posterior (temporal) da pálpebra superior direita. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Preparação do local cirúrgico. (A)Painel superior esquerdo: Remoção de pele longa com tesouras. Toda a pele fina residual é posteriormente removida com um creme depilatório leve. Painel superior direito: Aparência final após a remoção completa da pele que permite a marcação cirúrgica e o ultra-som de alta qualidade do ILG a ser executado. (B) As marcas cirúrgicas apropriadas da região periorbital direita são mostradas; neste exemplo, as incisões para remover o OSLG e o ILG foram conectadas para criar uma longa incisão curvilínea. A localização da incisure posterior é indicada por uma pequena marca de haxixe na marcação do local de incisão curvilínea (seta). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: Remoção do OSLG. (A)Os locais cirúrgicos são infiltrados com anestésico usando uma combinação de 50:50 de 2% lidocaína com 1:100,000 adrenalina e 0,5% bupivacaine, que é injetada na tampa superior e ao longo das linhas de incisão para minimizar o desconforto durante o procedimento. (B) Uma agulha de microdissese colorado é usada para incisar a pele e as camadas musculares superficiais ao longo dos locais de incisão cirúrgica pré-marcados. A tração suave em toda a ferida é aplicada para ajudar a criar o plano de dissecação. As queimaduras pequenas do ponto (seta) foram feitas com a agulha de Colorado em pontos equidistantes ao longo da linha da incisão para ajudar a realinhar optimally os tecidos durante o fechamento da ferida. (C)O OSLG é exposto depois que os tecidos que sobressaem o incisure posterior foram mobilizados (seta). A cápsula da glândula foi incisada. O OSLG pode ser prolapsed aplicando a pressão medial ao globo que facilita sua remoção. (D)Fórceps são usados para envolver o OSLG e removê-lo suavemente de sua posição mais profunda dentro da órbita através do incisure posterior. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Remoção da glândula lacrimal superior palpebral (PSLG) e do duto excretório. (A)Após a eversão da pálpebra superior, a porção bulbosa do PSLG está envolvida com fórceps e dissecada do tarso usando uma tesoura. A tração aplicada ao PSLG com fórceps é fundamental para manter o plano cirúrgico. (B) A dissecação do PSLG e do principal duto lacrimal é levada superiormente em direção à borda orbital usando dissecção afiada e tração contínua na glândula e tecidos dutos para manter o plano cirúrgico apropriado. A dissecação deve prosseguir até o ponto onde o OSLG foi removido. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 7
Figura 7: Remoção do ILG. (A)A pele e o músculo superficial são incisos até que o plano fascial que sobresencontra o osso zygomatic ou a parte superficial do músculo do masseter estejam alcangados. A cabeça do ILG geralmente é claramente evidente como uma pequena protuberância localizada o membro anterior. (B) A cápsula fibrosa do ILG é incisada com tesouras expondo o ILG. Uma vez que a cápsula é incisada, as porções mais profundas da glândula podem ser facilmente removidas. (C) A parte mais externa da cabeça ILG que se encontra no osso zigomático foi exposta e refletida anteriormente mostrando o osso zigomático subjacente. (D)Incision do septo orbital ao longo da borda inferior expõe a cauda do ILG. (E)Um ramo da artéria carótida externa alimenta a cauda do ILG (seta). (F) Aparência após o fechamento de incisões da pele após dacryoadenectomy completo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 8
Figura 8: Rose Bengal mancha da superfície da córnea. Fotografia externa que mostra a mancha proeminente, a mais notável no quadrante nasal. Todos os olhos submetidos à dacrioadenectomia completa desenvolveram mudanças semelhantes que foram evidentes por 1 semana após a cirurgia e persistiu por pelo menos 6 semanas. De nota, o reflexo de luz do flash anel mostra distorção de uma superfície ocular seca demonstrando como o olho seco pode impactar negativamente a visão. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Dacrioadenectomia
média ± SEM; n = 16 olhos
Base Semana 2
Tempo de separação de lágrimas, s 60,0 ± 0,0 4,5 ± 1,2
p < 0,0001
Osmolaridade do rasgo, mOsm 291,2 ± 3,7 315,3 ± 5,5
p = 0,001 p = 0,001
Teste de lágrimas schirmer, mm 18,3 ± 1,3 10,5 ± 1,6
p = 0,0006
Bengala de Rosa, contagem modificada de NEI 0,0 ± 0,0 4,28 ± 0,6
p < 0,0001
Operado vs. linha de base: Dacryoadenectomy: TBUT, p < 0.0001; osmolaridade lágrima, p < 0,001; Teste de lágrimas schirmer, p < 0,0006); e Rose Bengal.

Tabela 1: Parâmetros de olhos secos na semana pós-operatória 2.

Discussion

Ded é classificado em dois grandes grupos com base no efeito sobre a estabilidade do filme lágrima: deficiente aquoso (diminuição da produção do componente aquoso do filme lacrimogéneo; ~ 20% do DED) e evaporativo (aumento da evaporação do filme lacrimogéneo; ~ 50% do DED). Cerca de 30% dos pacientes com DED mostram evidências de ambos (DED misto). A inflamação é o mecanismo central do DED para o qual suas diversas etiologias convergem13,14. Nosso método modela DED aquoso deficiente.

Como mencionado anteriormente, os primeiros passos importantes na reprodução de nosso método são uma apreciação dos pontos finos da anatomia das glândulas lacrimais orbitais (LGs) do coelho e evitar confusão por terminologia anatômica variada e às vezes conflitante. O atlas anatômico de Popesko et al.11 é extremamente minucioso. Para aqueles menos confortáveis com a anatomia do coelho, a dissecação de espécimes da necropsia fornece a familiaridade fácil com estas estruturas e ajuda sua remoção cirúrgica em espécimes vivos.

Conselhos críticos sobre habitação e aclimatação de animais foram dados em nossa publicação complementar12. O mesmo artigo também apresenta comentários úteis para atribuir os parâmetros do DED usados em ambos os métodos.

Em contraste com o método anterior12,este requer um maior nível de habilidade cirúrgica por causa da extensão e natureza mais invasiva das técnicas necessárias para remover os LGs. O maior risco durante essas ressecções é o sangramento catastrófico causado pela lesão de grandes vasos que estão nas proximidades dos LGs, como ramos da artéria carótida. Isso é evitado visualizando adequadamente cada LG e suas margens dentro do campo cirúrgico. Finalmente, a remoção excessivazelosa da membrana nictitating poderia levar ao prolapso da glândula Harderian, que pode interromper a avaliação do filme lágrima.

Deve ser tomado cuidado para minimizar a quantidade de perturbação conjuntiva com a remoção do PSLG, um novo aspecto do nosso método que melhora a reprodutibilidade e aumenta a gravidade do DED. É surpreendentemente fácil estabelecer o plano de dissecação e levá-lo de volta para a crista orbital superior, desde que a tração é aplicada aos tecidos. É reconfortante poder ver as marcas cautery da truncation do OSLG; eles confirmam a remoção completa do duto excretório principal da glândula.

A remoção do ILG em sua totalidade apresenta desafios também. Isolar a cabeça da glândula em primeiro lugar, pois esta é a parte mais fácil de visualizar. Toda a cabeça do tecido da glândula separa facilmente dos tecidos circundantes; no entanto, alguns cuidados devem ser usados para evitar danos ao grande seio venoso, que fica medial na cabeça do ILG. A cauda do ILG pode então ser seguida para trás enquanto passa o osso zygomatic. A maior parte da cauda é fácil de isolar. No entanto, o aspecto mais posterior da cauda pode ser mais desafiador por causa da anatomia variável e sua proximidade com um ramo de tamanho médio do carótida. Dissecção cuidadosa deve permitir que todas as margens do ILG sejam vistas claramente, facilitando sua remoção completa. O investigador deve estar preparado para levar a dissecação mais superior nos casos em que a cauda da glândula termina o canthus lateral, como explicado na discussão anterior da anatomia das glândulas lacrimal. De nota, os autores nunca foram capazes de identificar qualquer parte da OSLG ao dissecar o ILG através de uma incisão curvilínea ao longo do globo temporal e inferior. Embora isso possa ser tecnicamente possível, essa abordagem cirúrgica carrega um risco muito alto para sangramento grave. Aproximar-se do OSLG através do incisure posterior prova distante mais seguro.

O duto excretório do ILG pode ser visto penetrando através do plano fascial inferior à medida que passa para o fornix conjunctival inferior. Ocasionalmente, pequenos lóbulos do tecido de aparecendo glandular são vistos aqui também e podem ser cuidadosamente removidos.

É muito útil para manter a ordem de ressecção LG como apresentado aqui. Se o ILG for removido primeiro, o isolamento da OSLG torna-se tecnicamente muito mais difícil. A principal razão é que, após a remoção do ILG, o OSLG não pode ser facilmente prolapso e, assim, identificado.

Uma vantagem significativa do nosso modelo é que ele pode ser "modular". Em outras palavras, o grau de DED induzido pela dacrioadenectomia pode ser calibrado para atender às necessidades experimentais. Por exemplo, a ressecção de todos os LGs causaria DED máximo, mas a ressecção de apenas o SLG causaria a forma mais leve de DED e a ressecção de apenas o ILG geraria doenças de gravidade intermediária.

Nossa abordagem, que recapitula o evento pathofisiológico distinto da produção de lágrimas reduzidas oferece vantagens adicionais em comparação com métodos já relatados. Resumidamente, nenhum outro modelo cirúrgico eliminou a produção de lágrimas por todos os LGs orbitais5,6,7,15,16; incluindo a denervação parassimpática dos LGs17,e a supressão farmacológica da produção de lágrimas18,19,com os dois últimos tendo seus efeitos fora do alvo como confundidores significativos. Por fim, esse modelo minimiza o principal viés dependente do investigador, ou seja, a ressecção incompleta dos LGs, uma vez que a técnica cirúrgica oferece sua visualização completa; isto é ajudado pelo fato de que nenhuma hemostasis, à excepção do cautery, é exigida.

O investigador deve estar ciente de que a ressecção completa de todos os LGs orbitais não gera completa ausência de lágrimas e, por exemplo, os valores de teste de lágrimas de Schirmer se aproximando de zero não devem ser esperados. Isto é devido ao fato de que há sempre outras fontes de fluido lacrimogêneo, como os LGs acessórios de Wolfring e Krause e vazamento de plasma de vasos conjuntivos20,21,22. Do ponto de vista experimental, isso deve ser visto como um aspecto positivo do método, pois mantém a superfície ocular; xeroftalmia completa destruiria totalmente a córnea negando a utilidade do modelo. Além disso, em sua personificação atual, este modelo oferece uma excelente oportunidade para estudar tais mecanismos compensatórios e transporte de fluidos através desses compartimentos menores.

Em conclusão, aqui são apresentadas as especificidades de um método novo e versátil de induzir ded aquoso-deficiente que se presta ao estudo da fisiologia do rasgo, à patogênese do DED e ao estudo dos agentes terapêuticos que estão sendo desenvolvidos para esta indicação.

Disclosures

Os autores declaram que não há interesses concorrentes, exceto a BR, que tem uma posição acionária na Medicon Pharmaceuticals, Inc. e Apis Therapeutics, LLC; e LH, um funcionário da Medicon Pharmaceuticals, Inc. com uma posição acionária na Apis Therapeutics, LLC.

Acknowledgments

Reconhecemos o apoio financeiro de uma bolsa de oportunidades de pesquisa direcionada da Stony Brook University School of Medicine e uma bolsa de pesquisa da Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Agradecemos michele McTernan para o apoio editorial.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acepromazine, Aceproinj Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NDC11695-0079-8 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation
anesthesia vaporizer VetEquip, Pleasanton, CA Item # 911103 Protocol 4.8
animal restraining bag Henry Schein Animal Health, Dublin, OH Jorvet J0170 Use appropriately sized bag.
bupivacaine, 0.5% Hospira Inc, Lake Forest IL NDC: 0409-1162-02 Mixed 50:50 with 2% lidocaine with 1:100,000 epinephrine for infiltration of incision sites, protocol 5.1
buprenorphine Henry Schein Animal Health, Dublin, OH 0.01 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4
cautery unit, high-temperature, battery-powered Medline Industries Inc, Northfield, IL REF ESCT001 Keep on hand in case of bleeding, protocol 2.7
clipper, Wahl Mini Arco Henry Schein Animal Health, Dublin, OH No. 022573 Cordless shears for fur removal, protocol 4.2
Colorado needle Stryker Craniomaxillofacial, Kalamazoo, MI N103A Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3
electrosurgical unit with monopolar cautery plate Valleylab, Boulder, CO Force FXc Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3
fluorescein, Ak-Fluor 10% AKRON, Lake Forest, IL NDC17478-253 Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
foceps, curved dressing Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ Storz E1406 delicate serrated dressing forceps
forceps, 0.3 Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ ET6319 For removal of nictating membrane, protocol 2.5
forceps, Bishop Harmon Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ E1500-C Use toothed forceps for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2
hair remover lotion, Nair Widely available Softening Baby oil Dipilitory cream for sensitive skin, protocol 4.2
isoflurane Henry Schein Animal Health, Dublin, OH 29405 Possible alternative sedation, protocol 4.7
IV catheter, Terumo Surflo ETFE 24-gauge Terumo, Tokyo, Japan; available from Fisher Sci., VWR, McKesson, etc. SR-OX2419CA 25-gauge for smaller rabbits; protocol 4.6
ketamine Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NDC 11695-0701-1; NADA 200-055 15 mg/kg, protocol 4.7
ketoprofen Hospira, Inc., Lake Forest, IL 3 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4
laryngeal mask airway Docsinnovent Ltd, London, UK Vgel R3 Protocol 4.8
lid speculum, wire Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ Barraquer SUH01 For removal of nictating membrane, protocol 2.4
lidocaine 2% with epinephrine 1:100,000; 50:50 mixture Hospira Inc, Lake Forest IL NDC 0409-3182-02 Pre-treat before removal of nictating membranes, protocol 2.4
lidocaine, preservative-free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO L5647 1% in PBS for anesthesia agent, for application to eye, protocol 2.4
micropipette Eppendorf Research Plus 100 uL For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4
micropipette tips World Wide Medical Products 41071052 For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4
monitoring device, multi-parameter SurgiVet, Waukesha, WI V9201 For monitoring of vitals, protocol 4.9
needle, 26-gauge BD, Franklin Lakes, NJ REF 305115 For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5
needle, 30-gauge BD, Franklin Lakes, NJ REF 305106 For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1
osmolarity tips TearLab Corp., San Diego, CA #100003 REV R Measure tear osmolarity measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
osmometer, TearLab TearLab Corp., San Diego, CA Model#200000W REV A Measure tear osmolarity, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
povidone-iodine solution Medline Industries Inc, Northfield, IL PVP Prep Solution, NDC: 53329-939-04, REF MDS 093944 To maintain sterile field, protocol 4.11
rabbit, New Zealand White Charles River Labs, Waltham, MA (NZW) 2-3 kg Research animals
Rose bengal stain Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO NDC51801-004-40 1% in PBS, for staining the ocular surface, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
saline, normal B. Braun Medical, Irvine, CA REF R5200-01 For postprocedural care, protocol 6.1.3
Schirmer Tear Test strips Eaglevision, Katena products. Denville, NJ AX13613 Measure tear production, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
scissors, Vannas McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA Miltex 2-130 Capsulotomy scissors for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2
scissors, Westcott tenotomy McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA Miltex 18-1480 For removal of nictating membrane, protocol 2.7
sedation gas mask DRE Veterinary, Louisville, KY #1381 Possible alternative sedation, protocol 4.7
surgical marking pen Medical Action Industries, Arden, ND REF 115 Protocol 4.2
sutures, 5-0 Mersilene Ethicon US, LLC Ethylene terephthalate sutures, used for deep connective tissue closure, protocol 5.3.11
sutures, Vicryl 6-0 Ethicon US, LLC Polyglactin 910 sutures, used for superficial muscle and skin closure, protocol 5.3.11
syringe, 1 cc BD, Franklin Lakes, NJ ref 309659 For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5
syringe, 5 cc BD, Franklin Lakes, NJ REF 309603 For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1
tissue forceps, 0.8mm Graefe Roboz Surgical Store, Gaithersburg, MD RS-5150 Curved Weck forceps
topical antibiotic ointment (neomycin, polymyxin, bacitracin, and hydrocortisone) Bausch and Lomb, Tampa, FL NDC 24208-785-55 Applied after removal of nictating membrane, protocol 2.8, and for postprocedural care, protocol 6.1.2
ultrasound gel Parker Laboratories, Inc., Fairfield, NJ Aquasonic 100 To ensure electrical contact with monopolar cautery plate, protocol 4.5
xylazine Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NADA: 139-236 1 mg/kg, protocol 4.7

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References

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Estabelecimento de um modelo severo do olho seco usando dacryoadenectomy completo nos coelhos
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Honkanen, R. A., Huang, L., Huang, W., Rigas, B. Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (155), e60126, doi:10.3791/60126 (2020).More

Honkanen, R. A., Huang, L., Huang, W., Rigas, B. Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (155), e60126, doi:10.3791/60126 (2020).

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