Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Undersøgelse af den transkriptionelle rolle af en RUNX1 intronic LYDDÆMPER af crispr/Cas9 ribonucleoprotein i akutte myeloid leukæmiceller

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/60130
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Blood Cancer Cytogenetics and Genomics Laboratory, Department of Anatomical and Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory in Oncology in South China, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Direkte levering af præmonterede Cas9/guide RNA ribonucleoprotein komplekser er et hurtigt og effektivt middel til genomredigering i hæmatopoietiske celler. Her bruger vi denne tilgang til at slette en RUNX1 intronic lyddæmper og undersøge de transkriptionelle svar i OCI-AML3 leukæmiceller.

Abstract

Hovedparten af det humane genom (~ 98%) består af ikke-kodnings sekvenser. CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-kodning af DNA-sekvenser, der indeholder bindingssteder for transkriptionelle regulatorer til at moduere genekspression. Ændringer af CREs har været impliceret i forskellige sygdomme, herunder kræft. Mens initiativtagere og smagsforstærkere har været den primære CREs for at studere genforordning, er meget lidt kendt om rollen som lyddæmper, som er en anden type af CRE, der formidler gen undertrykkelse. Crispr/Cas9, der oprindeligt blev identificeret som et adaptivt Immunitets system i prokaryoter, er blevet udnyttet til at være et effektivt værktøj til eukaryote genomredigering. Her præsenterer vi brugen af denne teknik til at slette en intronic lyddæmper i human RUNX1 genet og undersøge virkningerne på genekspression i OCI-AML3 leukæmiceller. Vores tilgang er afhængig af elektroporation-medieret levering af to præmonterede Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) komplekser til at skabe to dobbelt-streng pauser (DSBs), der flankerer lyddæmperen. Sletninger kan let screenes ved fragment analyse. Udtryks analyser af forskellige mRNAs transskriberet fra alternative promotorer hjælper med at evaluere promotor-afhængige effekter. Denne strategi kan bruges til at studere andre CREs og er særligt velegnet til hæmatopoietiske celler, som ofte er svære at transficere med plasmid-baserede metoder. Brugen af en plasmid-og virusfri strategi giver mulighed for enkle og hurtige vurderinger af genregulerings funktioner.

Introduction

CIS-regulatoriske elementer (CREs) er ikke-kodning af DNA-sekvenser, der indeholder bindingssteder for transkriptionelle regulatorer til kontrol af genekspression1,2. Disse elementer er typisk 100 til 1.000 basepar (BP) Long. Promotorer og smagsforstærkere er de to mest karakteriserede typer af CREs. Initiativtagerne er til stede i umiddelbar nærhed af transskription start sites og udgør den grundlæggende enhed af transskription. Mange gener har mere end én promotor, og deres alternative anvendelse bidrager til transkriptomer mangfoldighed og vævs specificitet3,4. På den anden side, smagsforstærkere aktivere transskription og kan være placeret opstrøms, downstream eller inden for introns af målgener. Smagsforstærkere kan handle fra langt afstand (over en megabase) og uafhængig af orientering1,2. CREs omfatter også lyddæmpere og isolatorer5,6. Førstnævnte handlinger er i modsætning til at frem mere til at hæmme genekspression ved binding til transkriptionelle repressorer, mens sidstnævnte partitioner genomet i diskrete topologisk domæner til at isolere gener fra andre CREs fra tilstødende domæner. Disse elementer handler i samspil med hinanden gennem kort-og/eller langtrækkende kromatin interaktioner og er organiseret i regulatoriske hubs til direkte korrekt spatiotemporale gen udtryk. Nylige fremskridt i sekvensering af High gennemløb har accelereret identifikationen og den funktionelle Annotation af mange CREs, der i høj grad har lettet vores forståelse af de transkriptionelle netværk, der dikterer Lineage-specifikke gen udtryk i forskellige celle-og vævstyper7,8,9,10,11,12.

I betragtning af CREs ' grundlæggende rolle i reguleringen af transkriptionen kan deres ændringer føre til afvigende genekspression. Det har vist sig, at CREs ofte forstyrres af genetiske og epigenetiske forandringer i forskellige typer af kræft i mennesker, hvilket bidrager til tumor initiering, progression og aggressivitet13,14. Desuden er CRE-binding faktorer ofte muteret og/eller misexpresses i forskellige kræfttyper, yderligere at fremhæve betydningen af CRE-deregulering i oncogenesis15. CREs kan også påvirkes af strukturelle afvigelser, som eksemplificeret ved hyppige kromosomale rekonstruktioner af immunglobulin Heavy (IgH) gene forstærker, der resulterer i unormal aktivering af de tilstødende onkogener i B-celle-lymfomer16. I akut myeloid leukæmi (AML), repositionering af en enkelt forstærker ved kromosom 3Q rearrangementerne forårsager samtidig GATA2 downregulation og EVI1 aktivering, som potentielt kan målrettes af bet hæmning af forstærker funktioner 17. for nylig karakteriserede vi en ny kromosomal translokation, der involverer forstyrrelse af en RUNX1 intronic lyddæmper, som kan bidrage til AML-progression i en pædiatrisk patient18. Således, decifrere den ikke-kodning kræft genomet giver frugtbare muligheder for at belyse sygdoms patogenese, biomarkør opdagelse og terapeutiske interventioner, som i sidste ende forbedre patientens resultater.

Crispr/Cas9 nuclease pathway, der oprindeligt blev identificeret som et adaptivt immunsystem i prokaryotiske celler, er blevet udnyttet som et hurtigt og omkostningseffektivt middel til websteds specifik genomredigering i levende celler og organismer19,20 ,21,22. CRISPR/Cas9-systemet involverer to hovedkomponenter: gRNA og Streptococcus pyogenes-afledt Cas9 nuclease. GRNA indeholder en specifik sekvens kaldet protospacer, der genkender målområdet og dirigerer Cas9 til redigering. GRNA består af to dele: CRISPR RNA (crRNA), typisk en 20-Mer nukleotidsekvens, der supplerer måldna, og en Trans-aktivering af crRNA (tracrRNA), som fungerer som en bindende stilladset for nukleasen. En protospacer tilstødende motiv (PAM) (5 '-NGG) umiddelbart støder op til målet site er påkrævet for Cas9 spaltning og kavaler plads er placeret 3 nucleotider opstrøms for PAM. CRISPR/Cas9-medieret genredigering udføres almindeligvis ved transfficerende celler med en plasmid, der koder Cas9 og den klonede gRNA23. Men denne fremgangsmåde er udfordrende for hæmatopoietiske celler, som ofte er svære at transficere og kræver langvarige virus-baserede transduktionsmetoder. En alternativ tilgang er direkte cellulær levering af præmonterede Cas9/gRNA RNP komplekser24. En fælles metode til RNP levering er elektro poration, som genererer midlertidige porer i cellemembranen, således at indrejse af RNP komplekser i cellerne25,26. Fordelene ved denne tilgang omfatter brugervenlighed, reduceret off-Target effekter og stabilitet af RNP komplekser. Her beskriver vi en protokol for at bruge RNP-leveringsmetoden til at undersøge den transkriptionelle rolle af en RUNX1 intronic lyddæmper i OCI-AML3 leukæmi Cell line18, som blev etableret fra det perifere blod af en AML-patient diagnosticeret med den fransk-amerikanske-britiske M4 under type27. Protokollen omfatter design af crRNA, forberedelse af RNP komplekser, elektroporation samt screening og efterfølgende karakterisering af de ønskede kloner.

Protocol

1. design af crRNA

  1. Design to crrnas, en 5 ' og de andre 3 ' af målet CRE ved hjælp af en web-baseret crispr design værktøj28,29,30,31. Sørg for, at en PAM af NGG er placeret umiddelbart efter målsekvensen for Cas9 genkendelse. Udformningen af de to crRNAs (crRNA-1 og crRNA-2) til sletning af RUNX1 lyddæmper18 er vist i figur 1.
    Bemærk: Et crRNA indeholder typisk en 20-Mer protospacer, der supplerer målsekvensen.
  2. Kontroller tilstedeværelsen af enkelt nucleotid polymorfier (SNPs)/indels i målet og tilstødende Pam sekvenser ved at indtaste de genomiske steder af sekvenser i søgefeltet i en online genom browser (f. eks NCBI 1000 genomer eller UCSC genom browser).
    Bemærk: Fælles SNPs/indels har en mindre allel frekvens på mindst 1% i den almindelige befolkning.
  3. Indsend de valgte crRNA-sekvenser til syntese med en kommerciel leverandør. Også købe tracrRNA for gRNA duplex dannelse.

2. design af sletning screening Primers

  1. Design et par primere, der flankerer det tilsigtede sletnings område. Sørg for, at primere er mindst 50 BP fra Cas9-spaltnings stederne, så PCR-forstærkning er minimalt påvirket af indels dannet på kavaler stederne.
  2. Sørg for, at amplikonen er mindre end 1.200 BP (helst mindre end 600 BP for bedre størrelses opløsning). Du bør også mærke en af primere med et fluorescerende farvestof (f. eks. 6-carboxyfluoresccein (6-FAM)) ved 5 '-enden for påvisning. De primere, der anvendes til screening af RUNX1 lyddæmper sletning18 er vist i figur 1.

3. klargøring af Cas9/gRNA RNP komplekser

  1. Resuspension af crRNAs og tracrRNA i 1x TE buffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) til en endelig koncentration på 200 μM.
  2. For hvert crRNA blandes 2,2 μL 200 μM crRNA, 2,2 μL af 200 μM tracrRNA og 5,6 μL 1x TE buffer (totalt 10 μL) i et 0,2 mL rør for at opnå en endelig duplex-koncentration på 44 μM.
  3. Der inkubates ved 95 °C i 5 minutter i en termo cycler. Lad rørene køle af til stuetemperatur for gRNA kompleksdannelse.
  4. 10,4 μL af 62 μM rekombinant Cas9 nuclease fortyndes med 7,6 μL 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at opnå en endelig nukleasekoncentration på 36 μM.
    Bemærk: Dette beløb er tilstrækkeligt til fremstilling af to Cas9/gRNA komplekser.
  5. Bland lige store mængder (8,5 μL) af den fortyndede nuklease med hver af de gRNA-duplexer, som er opnået fra trin 3,3.
  6. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter for at tillade RNP-kompleksdannelse. Opbevar blandingerne på is indtil elektroporation.

4. elektroporation af RNP-komplekser i OCI-AML3-celler

  1. Culture OCI-AML3 celler i RPMI 1640 medium suppleret med 10% varme inaktiveret føtal kvægserum (FBS), 1x GlutaMAX, 100 enheder/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin (i det følgende benævnt komplet RPMI 1640 medium) ved 37 °C med 5% CO2.
  2. Tæl celler ved hjælp af trypan og et blå farvning. Sørg for, at cellens levedygtighed på tidspunktet for elektro portering er over 90%.
  3. Der centrifugeres 2,5 x 106 celler i et 1,5 ml rør ved 500 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og cellerne vaskes med 1 mL 1x PBS. Drej cellerne igen, og fjern alle rester af supernatanten.
  4. Cellerne opslæmmes i 163 μL RPMI 1640 medium uden phenolrød.  Tilsæt 16,7 μL af hvert RNP-kompleks (fra trin 3,6) og 3,6 μL 100 μM elektroporation forstærker til cellerne (total volumen = 200 μL). Bland forsigtigt ved pipettering.
    Bemærk: Den Electroporation Enhancer er en bærer DNA for at øge redigeringen effektivitet.
  5. Overfør blandingen til en 0,2 cm-Gap elektroporation cuvette uden bobler. Udfør elektroporation med et elektro porationsystem (mode: eksponentiel; Spænding =: 150 V; Kapacitans = 700 μF; Modstand = 50 Ω).
  6. Cellerne overføres til en T-25 vævskultur kolbe, der indeholder 6 mL komplet RPMI 1640-medium og inkubater ved 37 °C med 5% CO2.

5. screening og udvælgelse af celle kloner med Bialleliske sletninger

  1. Cellerne fortyndes til 5 x 103/ml i komplet rpmi 1640-medium én dag efter elektroporation. Tilsæt 100 μL af den fortyndede cellesuspension i hver brønd af 96-brønd vævskultur plader og lad cellerne vokse i 7-14 dage.
  2. Uddrag genomisk DNA fra cellerne ved hjælp af et højt gennemløb rensningssystem.
  3. Der tilsættes 100 μL plade binding og lyse buffer til hver brønd på en 96-brønd ekstraktions plade. Tilsæt 5 x 104 celler ophængt i 10 ΜL 1x PBS til bufferen og bland dem ved pipettering.
  4. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter for at tillade binding af genomisk DNA til brøndene.
  5. Sug opløsningen ud af brøndene uden at skrabere brønd fladerne. Vask brøndene med 120 μL vaskebuffer.
  6. Lufttørre brøndene, der indeholder det bundne DNA.
  7. Klargør 20 μL PCR mix (2 μL 10x high fidelity buffer, 0,8 μL 50 mM MgSO4, 0,4 μl af 10 mm dNTPs, 0,4 μl af 10 μm Fam-mærket Forward primer (trin 2,2), 0,4 μl af 10 μm ikke-mærket omvendt primer og 0,4 U af Taq -DNA-Polymerase for hver prøve).
    Bemærk: Forbered en Master Mix for at sikre tilsætning af standardiserede mængder af reagenser i hver prøve.
  8. Tilsæt PCR-blandingen til hver brønd på ekstraktions pladen, og Kør reaktionerne i en termo cycler (betingelser: Initial 94 °C i 2 min, efterfulgt af 35 cyklusser af 94 °C i 15 s, 56 °C i 30 s og 68 °C i 1 min).
  9. Beregn mængden af produkterne ved at måle deres koncentrationer i et udvalgt antal prøver ved hjælp af et fluorometer. Alle prøver fortyndes med nuklease-fri H2O til 0,5 ng/μl.
  10. 1 μL af de fortyndede PCR-produkter blandes med 8,5 μL deioniseret formamid og 0,5 μL fluorescerende farvestof-mærket størrelses standard i en 96-brønd plade, der er kompatibel med den genetiske analysator.
    Bemærk: Forbered en masterblanding, der indeholder deioniseret formamid og størrelses standarden.
  11. Dæk pladen med en septa plade og denaturere prøverne ved 95 °C i 3 minutter i en termo cycler. Luk ikke låget på maskinen.
  12. Udfør kapillær gel elektroforese for at adskille de mærkede PCR-produkter som tidligere beskrevet32.
  13. Efter elektroforese, åbne analyse software til at analysere resultaterne.
  14. Klik på nyt projekt , og vælg mikrosatellit. Klik derefter på OK.
  15. Klik på Føj eksempler til projekt , og vælg resultatfilerne (indeholder. FSA-udvidelsen). Klik derefter på Føj til liste for at importere filerne.
  16. Vælg standard for Mikrosatellit i kolonnen analysemetode i den tabel, der viser de valgte resultatfiler. Vælg også den størrelses standard, der bruges i standard kolonnen størrelse . Klik derefter på ikonet Analysér , Angiv eksperimentnavnet, og Gem eksperimentet.
  17. Klik på Vis plot for at få vist resultaterne, og vælg fragment analyse i afbildnings indstillingen.
  18. Vælg de relevante farvede kanaler til analyse. Kontroller det orange ikon for at se de mærkede fragmenter i størrelses standarden for at vurdere kvaliteten af Opkalds størrelsen.
  19. Kontroller det blå ikon for at se de mærkede PCR-produkter. Identificer de toppe, der svarer til vildtype og mutant (dvs. forsynet med de forventede sletninger) produkter. Beregn det mutante niveau i hver prøve ved at dividere arealet under mutant peak med summen af arealet under Wild-type og mutant Peaks.
  20. Vælg flere celle puljer med høje niveauer af de forventede sletninger for yderligere serielle fortyndinger.
  21. Gentag DNA-ekstraktion, fluorescerende PCR og kapillar elektroforese trin. Vælg celle kloner med mutant niveauer > 95%, der repræsenterer bialleliske sletninger til efterfølgende analyser.
  22. Kontroller identiteten af sletninger i de markerede kloner ved sanger sekvensering.

6. funktionelle analyser af lyddæmperen sletning ved kvantitativ RT-PCR-analyse i realtid

  1. Uddrag total RNA fra de udvalgte kloner og udføre komplementære DNA (cDNA) syntese.
  2. 1 μg RNA blandes med 1 μL 50 μM oligo (dT)20 primer og 1 μl 10 mm dntp-blanding i et samlet volumen på 10 μl. Inkuber ved 65 °c i 5 min og derefter på is i mindst 1 min.
  3. Der tilsættes 10 μL cDNA-syntese blanding med 2 μL 10x RT-buffer, 4 μL 25 mM MgCl2, 2 μl 0,1 M DTT, 1 μl rnasehæmmer (40 U/μl) og 1 μl revers transkriptase (200 u/μl). Der inkubates ved 50 °C i 50 min og derefter 85 °C i 5 minutter i en termo cycler.
    Bemærk: Forbered en Master Mix for den omvendte transskription.
  4. Chill prøverne på is. Tilsæt 1 μL RNase H og Inkubér ved 37 °C i 20 min. Opbevar cDNA ved-20 °C.
  5. Design primere og TaqMan-sonder, som specifikt genkender individuelle transskriptions varianter genereret fra alternative promotorer.
    Bemærk: Pre-designede transkriptspecifikke primer/Probe sæt er kommercielt tilgængelige.
  6. Klon DNA-fragmenter, der indeholder de specifikke transskription sekvenser i plasmid DNA. Forbered en 10-fold fortyndings serie (106 til 10 kopier) af de rekombinante plasmider som standardkurver for transkriptionen.
  7. Forbered 20 μL PCR mix (0,5 μL DNA-skabelon, 1 μL 20x præ-designet TaqMan Probe/primer assay og 10 μL 2x TaqMan PCR Master Mix) for hver prøve (både cDNA og plasmid standarder). Mål hver prøve i tre eksemplarer.
    Bemærk: Forbered en Master Mix for real-time PCR.
  8. Kør reaktionerne i en real-time PCR maskine (betingelser: Initial 50 °C i 2 min og 95 °C i 10 min, efterfulgt af 40 cyklusser af 94 °C for 15 s og 60 °C i 1 min).
  9. Efter amplificeringen, klik på Analysér ikonet i softwaren for at analysere dataene. Kontroller hældningen og korrelationskoefficienten for standard kurverne for at evaluere effektiviteten og lineariteten af reaktionerne. Sørg for, at skråningerne er mellem-3,1 og-3,6, og korrelationskoefficienterne er større end 0,99.
  10. Normaliser kopi nummeret for måludskriften i hver prøve med et husholdnings-gen (f. eks. Gapdh).

Representative Results

Formålet med forsøget er at slette en intronic-lyddæmper i RUNX1 -genet og undersøge indvirkningen på RUNX1 TRANSSKRIPTION i OCI-AML3-celler. Lyddæmperen blev identificeret ved en kombinatorisk molekyl tilgang og fandtes at indeholde et 209 BP Core element18. For at muliggøre en mere nøjagtig evaluering af dette kerneelement i kontrollen af RUNX1 -ekspression blev crRNAs (crrna-1 og crrna-2) designet til at være tæt på dette område18 (figur 1). De forudsagte Cas9 spaltninger, der blev anlagt af crRNA-1 og crRNA-2, var 29 BP og 35 BP fra kerneelementet henholdsvis (figur 1). Det skal bemærkes, at mens PAM sites af de to crRNAs bor på modsatte strenge, DSBs vil ske uafhængigt af PAM sekvens placering. Således forventes den samtidige introduktion af to Cas9/gRNA RNP-komplekser styret af crRNA-1 og crRNA-2 at sætte punkt på lyddæmper elementet fra RUNX1 locus.

For at screene for de ønskede sletninger i et stort antal prøver, en 96-Well format af genomisk DNA ekstraktion kit blev brugt til høj gennemløb rensning. Også, DNA bundet på brøndene af ekstraktions pladerne kan underkastes direkte forstærkning, hvilket minimerer fejl eller kontaminering på grund af gentagen prøveoverførsel. De primere, der anvendes til screening af sletninger18 , er vist i figur 1. Den forventede størrelse af Wild-type PCR produkt er omkring 500 BP. Da den tilsigtede sletning spænder over 273 BP, forventes det mutante produkt at være ca. 230 BP. Dette størrelsesområde muliggør enkel og hurtig fragment analyse af kapillær gelelektroforese. I alt 160 Initial celle puljer blev screenet, og 14 blev fundet til at bære de forventede sletninger med mutant niveauer på mindst 70%. Fem puljer blev derefter udvalgt til yderligere serielle fortyndinger for at identificere kloner, der bærer bialleliske sletninger. Repræsentative elektro pherogrammer fra celle kloner med forskellige niveauer af mutant produkter er vist i figur 2A. Identiteten af sletninger blev verificeret af sanger sekvensering (figur 2B). Som forventet blev indels dannet af ikke-homologe med reparation af DSBs33 observeret på de forudsagte kavaler steder i sletnings klonerne. Disse resulterede i forstærkning af mutante produkter af varierende størrelse, som også kunne påvises ved kapillar elektroforese (figur 2A).

RUNX1 -genet indeholder to promotorer, nemlig distale P1 og proksimale P2, som adskilles af en stor intron-husly af lyddæmper elementet34. Tre store mRNA-udskrifter fremstilles af disse initiativtagere: RUNX1c af P1 og RUNX1a og RUNX1b af P234. Nukleotidsekvensen af RUNX1c og RUNX1b er identiske, bortset fra at førstnævnte har en unik N-endestation, hvorfra en specifik taqman-genekspressions analyse kan designes (figur 3a). For at måle RUNX1bblev der anvendt en TaqMan-analyse, som anerkender både RUNX1b og RUNX1c (figur 3a). RUNX1b niveauer blev derefter bestemt ved at fratrække total RUNX1b/RUNX1c fra RUNX1c. RUNX1a er en markant kortere isoform på grund af alternativ splejning og en specifik TaqMan assay er tilgængelig for denne variant (figur 3a). Aktiviteten af P1-og P2-initiativtagerne kan således bestemmes individuelt. Kvantitativ RT-PCR i realtid viste, at sletningen af lyddæmperen væsentligt upregulated ekspressions niveauerne for både P1-og P2-afledte udskrifter (figur 3B).

Figure 1
Figur 1 : Strategi for at slette RUNX1 intronic lyddæmper. Lyddæmperen (den røde boks) er placeret i den første intron af RUNX1 genet, der adskiller de to promotorer P1 og P2 (hg19 koordinater er vist). To crrnas (crrna-1 og crrna-2) var designet til at introducere DSBs ledsage lyddæmperen element. De forudsagte Cas9-spaltningen er angivet med lodrette røde streger, og PAM-stederne (NGG) er i lilla. De to primere, der bruges til screening af sletninger, repræsenteres af åbne pile. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Identifikation af sletnings klonerne. A) repræsentative elektropherogrammer af celle kloner,derviser forskellige niveauer af mutant PCR-produkter (MUT). Størrelsen af de mutante produkter varierer blandt klonerne på grund af indels dannet på kavaler stederne. WT = vildtype. B) kontrol af sletninger fra repræsentative kloner ved sanger sekvensering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Funktionelle konsekvenser af lyddæmperen sletning. A) de tre vigtigste RUNX1 isoformer (RUNX1a, RUNX1b og RUNX1c) er vist. Disse varianter indeholder den samme runt DNA binding domæne, men forskellige N-(orange) eller C-Terminus (blå). Placeringen af TaqMan Probe/primer-par er angivet med røde streger. Tal indikerer aminosyrerester. B) kvantitativ RT-PCR-analyse i realtid af RUNX1 P1-og P2-afledte transskriptioner i cellepopulationer med (del) eller uden (WT) de bialleliske sletninger18. Gapdh blev brugt til normalisering. * og * * angiver p < 0,05 og p < 0,01, henholdsvis af Mann-Whitney-testen. Dette tal er blevet ændret fra Cheng et al.18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Crispr/Cas9-systemet er blevet anvendt i en lang række genomredigerings applikationer såsom gen knockout og Knock-in Studies35,36, transkriptional regulation37,38, genteknologi af forskellige modelorganismer39,40,41,42,43,44 og genterapi45,46. Her demonstrerer vi brugen af CRISPR/Cas9 for at undersøge de funktionelle konsekvenser af at slette en intronic lyddæmper på RUNX1 genet. Leveringen af CRISPR-komponenterne i vores tilgang var ikke afhængig af plasmid-DNA, kloning af gRNA eller virus, men elektroporation af præmonterede Cas9/gRNA RNP-komplekser. Det er blevet påvist, at anvendelsen af eksogen DNA kan forbindes med uønsket integration af fremmede vektor sekvenser i værts genomet, øget toksicitet og lav virkningsgrad25,47,48, hvorimod virus transduktionsmetoder er tidskrævende. Desuden, langvarig ekspression af Cas9 fra plasmid DNA kan forøge off-Target effekter48. Tværtimod er den direkte RNP-baserede leveringsmetode blevet etableret som den foretrukne metode, da den er hurtig og ligetil med forbedret redigerings effektivitet, selektivitet og cellelevedygtighed. Faktisk, en række forskellige metoder såsom lipofection49,50, elektro poration25,51, nanopartikler52, celle-penetratering peptider53, iTop54 og triamf 55 er udviklet til effektiv crispr/Cas9-levering i forskellige celletyper samt dyre-og plantearter24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63. da ikke-kodning DNA-sekvenser er hotspots af genetiske variationer64, kontrollere tilstedeværelsen af fælles SNPs/indels i målet og tilstødende Pam sekvenser er særlig relevant, når designe grna, der er rettet mod regulerende Elementer.

En flaskehals i CRISPR/Cas9 genomredigering involverer screening af ønskede mutante kloner i et stort antal prøver. Vi beskæftigede fluorescerende PCR kombineret med kapillar gel elektroforese til screening som målet mutation er en lille genomisk sletning af omkring 300 BP. Denne metode er hurtig og følsom og kan udføres i en høj gennemløb mode. Denne metode giver også mulighed for nøjagtig estimering af mutant niveauer og sletnings størrelser samtidigt. Desuden understøttes multiplex-analyse af PCR-fragmenter, der er mærket med forskellige fluorescerende farvestoffer. Vi har rutinemæssigt brugt denne teknik til genotype små indsættelser/sletninger i myeloid neoplasmer65,66. I vores erfaring kan vi konsekvent opdage fragment størrelser, der er forskellige med 4 BP med høj præcision og mutant byrde ned til ~ 3%. Det skal dog bemærkes, at denne metode har en fragment størrelsesgrænse på 1.200 BP, og det er derfor ikke egnet til screening af store sletninger. Der kan heller ikke påvises base erstatninger (hvilket resulterer i uændret fragment størrelse) og potentielle hændelser uden for målgruppen i andre genomiske områder. For sidstnævnte, den kostbare hele genomsekvensering er forpligtet til at gennemgribende profilere globale uønskede ændringer i målet kloner. Til at vedtage vores nuværende tilgang til undersøgelse af store ikke-kodning lovgivningsmæssige sekvenser (> 1000 bp), en detaljeret sletning og mutagenese analyser af formodede transkriptionsfaktor bindingssteder ved hjælp in vitro reporter gen assays kan udføres på forhånd for at afgrænse det minimale funktionelle område for CRISPR/Cas9-redigering18.

Da mange gener indeholder mere end én projektledere3,4, er det vigtigt at være opmærksom på eksistensen af alternative promotorer i målgenlocus, da manipulerende reguleringselementer kan påvirke initiativtagerne differentieret. Transskriptions varianter fra forskellige initiativtagere skal derfor måles individuelt for at evaluere eventuelle promotor-specifikke svar. Brugen af TaqMan sonde-baserede assays foretrækkes frem for SYBR grøn på grund af bedre specificitet og reproducerbarhed. Hvis det mere avancerede digitale PCR-system er tilgængeligt, kan transskription kvantificeres mere præcist uden brug af standardkurve konstruktion.

En vigtig overvejelse i at udføre crispr/Cas9 eksperimenter i Cancer cellelinjer er Ploidi og Target gen kopi nummer i cellerne, der anvendes som stort set alle kræft cellelinjer Harbor genetiske ændringer, herunder strukturelle og kopiantal variationer. I vores tilfælde har OCI-AML3 en hyperdiploid karyotype med 45 til 50 kromosomer. Også, celle linjen blev fundet at bære en normal RUNX1 kopi nummer som afsløret fra Cancer Cell line Encyclopedia67 og fluorescens in situ hybridisering undersøgelser18. Når du målretter mod et gen med kopi nummer gevinst, skal leveringsmetoden muligvis optimeres for at give et tilstrækkeligt niveau af CRISPR-komponenterne til redigeringen. Også, flere kloner kan være nødvendigt at screenes for at identificere de komplette knockouts. Det er vigtigt, at det er blevet påvist, at målretning mod forstærkede genomregioner, især dem, der forårsages af strukturelle omordninger, kan udløse genuafhængige antiproliferativ reaktioner i cancerceller, hvilket fører til falsk positive resultater i gen funktionelle undersøgelser68,69,70. I denne forbindelse bør der anvendes alternative tilgange som RNA-interferens (RNAi)-Knockdown og/eller cDNA-overekspression til at verificere CRISPR-resultaterne. Der bør også bruges flere cellelinjer for at undgå fejlfortolkning af cellelinje specifikke, men genuafhængige CRISPR-redigerings effekter.

CRISPR/Cas9-systemet har revolutioneret grundlæggende og Translationel forskning ved at give et enkelt og effektivt middel til genomredigering. Her viser vi, hvor let det er at bruge CRISPR/Cas9 til at forstyrre en intronic lyddæmper til transkriptionelle studier i en Cancer cellelinje. Denne teknik giver mulighed for studiet af CREs på DNA-niveau og giver mulighed for at undersøge CRE funktioner i den endogene kontekst i stedet for de traditionelle heterolog reporter gener. For nylig er et CRISPR-baseret RNA redigeringssystem også blevet identificeret71 og kan tjene som et nyt værktøj til at studere CREs ved at målrette RNA transskriberet fra de lovgivningsmæssige elementer. Ved at kombinere med kromosom konstellation Capture teknikker, CRISPR/Cas9 vil helt sikkert hjælpe dechifrere involvering af CREs i ændret genomorganisation og genekspression forbundet med forskellige helbredsproblemer.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Prof. M.D. Minden (Princess Margaret Cancer centre, University Health Network, Toronto, Canada) for at give OCI-AML3 Cell line. Også, forfatterne vil gerne takke de centrale værker af Cancer Genomics og Patogenbiologi (det kinesiske universitet i Hong Kong) for at levere de faciliteter og bistand til støtte for denne forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 cm gap electroporation cuvette Bio-Rad 1652086
1×TE buffer, pH 7.5 Integrated DNA Technologies 11-01-02-02
10 mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific 18427013
3500 Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405673
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer Thermo Fisher Scientific None
7300 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific None
7300 System SDS Software Thermo Fisher Scientific None Version 1.3.1
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system Bio-Rad 1652660
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well Thermo Fisher Scientific CS11205
crRNA-1 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
crRNA-2 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
Deionized formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
Electroporation Enhancer Integrated DNA Technologies 1075915
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270098
Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32857
GeneMapper Software 5 Thermo Fisher Scientific 4475073
GeneScan 600 LIZ Size Standard Thermo Fisher Scientific 4408399
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
PBS, 10x Solution, pH 7.4 Affymetrix 75889
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher Scientific 11304029
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease Integrated DNA Technologies 1081058 Components of the Cas9/gRNA complex
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 31800-022
RPMI 1640 medium without phenol red Thermo Fisher Scientific 11835030
RUNX1a TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs04186042_m1
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs00231079_m1
RUNX1c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs01021966_m1
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher Scientific 18080051
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4304437
tracrRNA Integrated DNA Technologies 1072533 Components of the Cas9/gRNA complex
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Unlabeled PCR reverse primer Thermo Fisher Scientific None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maston, G. A., Evans, S. K., Green, M. R. Transcriptional regulatory elements in the human genome. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 29-59 (2006).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nature Reviews Genetics. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Research. 16 (1), 55-65 (2006).
  4. Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends in Genetics. 19 (11), 640-648 (2003).
  5. West, A. G., Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: many functions, many mechanisms. Genes & Development. 16 (3), 271-288 (2002).
  6. Riethoven, J. J. Regulatory regions in DNA: promoters, enhancers, silencers, and insulators. Methods in Molecular Biology. 674, 33-42 (2010).
  7. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  8. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  9. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  10. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  11. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  12. Bernstein, B. E., et al. The NIH roadmap epigenomics mapping consortium. Nature Biotechnology. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  13. Zhou, S., Treloar, A. E., Lupien, M. Emergence of the Noncoding Cancer Genome: A Target of Genetic and Epigenetic Alterations. Cancer Discovery. 6 (11), 1215-1229 (2016).
  14. Khurana, E., et al. Role of non-coding sequence variants in cancer. Nature Reviews Genetics. 17 (2), 93-108 (2016).
  15. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Molecular Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  16. Willis, T. G., Dyer, M. J. The role of immunoglobulin translocations in the pathogenesis of B-cell malignancies. Blood. 96 (3), 808-822 (2000).
  17. Gröschel, S., et al. A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in leukemia. Cell. 157 (2), 369-381 (2014).
  18. Cheng, C. K., et al. RUNX1 upregulation via disruption of long-range transcriptional control by a novel t(5;21)(q13;q22) translocation in acute myeloid leukemia. Molecular Cancer. 17 (1), 133 (2018).
  19. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  20. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual Review of Genetics. 45, 273-297 (2011).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  23. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  24. Cho, S. W., Lee, J., Carroll, D., Kim, J. S., Lee, J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genetics. 195 (3), 1177-1180 (2013).
  25. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  26. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, 04766 (2014).
  27. Quentmeier, H., et al. Cell line OCI/AML3 bears exon-12 NPM gene mutation-A and cytoplasmic expression of nucleophosmin. Leukemia. 19 (10), 1760-1767 (2005).
  28. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  29. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  30. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  31. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  32. Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. Journal of Visualized Experiments. (122), e55586 (2017).
  33. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  34. Sood, R., Kamikubo, Y., Liu, P. Role of RUNX1 in hematological malignancies. Blood. 129 (15), 2070-2082 (2017).
  35. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  36. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  37. Wright, J. B., Sanjana, N. E. CRISPR Screens to Discover Functional Noncoding Elements. Trends in Genetics. 32 (9), 526-529 (2016).
  38. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  39. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  40. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  41. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  42. Chen, C., Fenk, L. A., de Bono, M. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans by CRISPR-targeted homologous recombination. Nucleic Acids Research. 41 (20), 193 (2013).
  43. Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, 16 (2015).
  44. Svitashev, S., et al. Targeted Mutagenesis, Precise Gene Editing, and Site-Specific Gene Insertion in Maize Using Cas9 and Guide RNA. Plant Physiology. 169 (2), 931-945 (2015).
  45. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  46. Ye, L., et al. Genome editing using CRISPR-Cas9 to create the HPFH genotype in HSPCs: An approach for treating sickle cell disease and β-thalassemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10661-10665 (2016).
  47. Gabriel, R. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nature Biotechnology. 29 (9), 816-823 (2011).
  48. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nature Methods. 9 (8), 805-807 (2012).
  49. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  50. Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (11), 2868-2873 (2016).
  51. Gundry, M. C., et al. Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9. Cell Reports. 17 (5), 1453-1461 (2016).
  52. Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
  53. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  54. D'Astolfo, D. S., et al. Efficient intracellular delivery of native proteins. Cell. 161 (3), 674-690 (2015).
  55. Yen, J., et al. TRIAMF: A New Method for Delivery of Cas9 Ribonucleoprotein Complex to Human Hematopoietic Stem Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16304 (2018).
  56. Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  57. Martin, A., et al. CRISPR/Cas9 mutagenesis reveals versatile roles of Hox genes in crustacean limb specification and evolution. Current Biology. 26 (1), 14-26 (2016).
  58. Menoret, S., et al. Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineered proteins. Scientific Reports. 5, 14410 (2015).
  59. Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
  60. Malnoy, M., et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Frontiers in Plant Science. 7, 1904 (2016).
  61. Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
  62. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 7, 13274 (2016).
  63. Shin, S. E., et al. CRISPR/Cas9-induced knockout and knock-in mutations in Chlamydomonas reinhardtii. Scientific Reports. 6, 27810 (2016).
  64. 1000 Genomes Project Consortium et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  65. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. The New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  66. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations fro an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  67. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  68. Aguirre, A. J., et al. Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting. Cancer Discovery. 6 (8), 914-929 (2016).
  69. Munoz, D. M., et al. CRISPR Screens Provide a Comprehensive Assessment of Cancer Vulnerabilities but Generate False-Positive Hits for Highly Amplified Genomic Regions. Cancer Discovery. 6 (8), 900-913 (2016).
  70. Gonçalves, E., et al. Structural rearrangements generate cell-specific, gene-independent CRISPR-Cas9 loss of fitness effects. Genome Biology. 20 (1), 27 (2019).
  71. Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).

Tags

Genetik CRISPR/CAS9 ribonucleoprotein elektro poration CIS-regulerende element lyddæmper Transkriptional kontrol leukæmi
Undersøgelse af den transkriptionelle rolle af en <em>RUNX1</em> intronic LYDDÆMPER af crispr/Cas9 ribonucleoprotein i akutte myeloid leukæmiceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. K., Wong, T. H. Y., Yung,… More

Cheng, C. K., Wong, T. H. Y., Yung, Y. L., Chan, N. C. N., Ng, M. H. L. Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (151), e60130, doi:10.3791/60130 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter