Summary
Directe levering van voorgemonteerde Cas9/gids RNA RiboNucleoProteïne-complexen is een snel en efficiënt middel voor genoom bewerking in hematopoietische cellen. Hier gebruiken we deze aanpak om een RUNX1 intronic geluiddemper te verwijderen en de transcriptionele responsen in OCI-AML3 leukemische cellen te onderzoeken.
Abstract
Het grootste deel van het menselijk genoom (~ 98%) bestaat uit niet-Codeer sequenties. CIS-regelgevende elementen (CREs) zijn niet-CODEER bare DNA-sequenties die bindende plaatsen bevatten voor transcriptionele regulatoren om genexpressie te moduleren. Veranderingen van CREs zijn betrokken bij verschillende ziekten, waaronder kanker. Terwijl promotors en versterkers de primaire CREs voor het bestuderen van genregulering zijn geweest, is er weinig bekend over de rol van geluiddemper, wat een ander type CRE is dat genonderdrukking bemiddelt. CRISPR/Cas9, oorspronkelijk geïdentificeerd als een adaptief immuniteitssysteem in prokaryoten, is uitgebuit als een krachtig hulpmiddel voor eukaryotische genoom bewerking. Hier presenteren we het gebruik van deze techniek om een intronic-demper in het menselijk RUNX1 gen te verwijderen en de effecten op genexpressie in OCI-AML3 leukemische cellen te onderzoeken. Onze aanpak is gebaseerd op elektroporation-gemedieerde levering van twee voorgemonteerde Cas9/gids RNA (grna) RiboNucleoProteïne (RNP) complexen om twee dubbele strand Breaks (dsb's) te creëren die de geluiddemper flankeren. Verwijderingen kunnen gemakkelijk worden gescreend door fragment analyse. Expressie analyses van verschillende Mrna's die zijn getranscribeerd door alternatieve organisatoren helpen de Promoter afhankelijke effecten te evalueren. Deze strategie kan worden gebruikt om andere CREs te bestuderen en is vooral geschikt voor hematopoietische cellen, die vaak moeilijk te transfect zijn met plasmide gebaseerde methoden. Het gebruik van een plasmide-en virusvrije strategie maakt eenvoudige en snelle evaluaties van genregulerende functies mogelijk.
Introduction
CIS-regelgevende elementen (CREs) zijn niet-CODEER bare DNA-sequenties die bindende plaatsen bevatten voor transcriptionele regulatoren om genexpressie1,2tebeheersen. Deze elementen zijn meestal 100 tot 1.000 baseparen (BP) lang. Promotors en versterkers zijn de twee meest gekenmerkte types van CREs. Promotors zijn aanwezig in de nabijheid van de transcriptie start sites en vormen de basiseenheid van transcriptie. Veel genen hebben meer dan één promotor en hun alternatieve gebruik draagt bij aan transcriptome diversiteit en weefsel specificiteit3,4. Aan de andere kant, versterkers activeren transcriptie en kan worden gevestigd stroomopwaarts, downstream of binnen intron van de doel genen. Versterkers kunnen optreden van verre afstand (over een megabyte) en onafhankelijk van oriëntatie1,2. CREs zijn ook geluiddempers en isolatoren5,6. De eerste fungeert tegengesteld aan versterkers voor de remming van genexpressie door binding aan transcriptionele repressors, terwijl de laatste het genoom verdeelt in discrete topologisch domeinen om genen van andere CREs uit naburige domeinen te isoleren. Deze elementen handelen in overleg met elkaar door middel van korte-en/of lange-afstand chromatine interacties en zijn georganiseerd in regelgevende hubs om de juiste spatiotemporale genexpressie te richten. Recente ontwikkelingen op het gebied van sequentie technieken met hoge doorvoer hebben de identificatie en functionele aantekening van vele CREs versneld die ons begrip van de transcriptionele netwerken die het Lineage-specifieke gen dicteren, sterk hebben vergemakkelijkt expressie in verschillende cel-en weefsel typen7,8,9,10,11,12.
Gezien de fundamentele rollen van CREs bij het reguleren van transcriptie, kunnen hun veranderingen leiden tot afwijkende genexpressie. Het is aangetoond dat CREs vaak verstoord wordt door genetische en epigenetische veranderingen in verschillende soorten menselijke kankers, wat bijdraagt aan het initiëren van de tumor, progressie en agressiviteit13,14. Daarnaast worden CRE-bindende factoren vaak gemuleerd en/of misexpressed in verschillende soorten kanker, wat verder de betekenis van CRE-deregulering in oncogenese15benadrukt. CREs kan ook worden beïnvloed door structurele aberraties, zoals wordt geïllustreerd door frequente chromosomale herschikkingen van de immunoglobuline Heavy (IgH) gen Enhancer die resulteren in abnormale activatie van de naburige oncogenen in B-cell lymfoomen16. In acute myeloïde leukemie (AML), herpositionering van een enkele versterker door chromosoom 3Q herschikkingen veroorzaakt gelijktijdige GATA2 Downregulatie en EVI1 activatie, die potentieel kan worden getarget door bet remming van Enhancer functies 17. onlangs kenmerkten we een nieuwe chromosomale translocatie met perturbatie van een RUNX1 intronic-geluiddemper die zou kunnen bijdragen aan AML-progressie bij een pediatrische patiënt18. Zo biedt het ontcijferen van het niet-coderende kanker genoom vruchtbare wegen voor het ophelderende ziekte pathogenese, biomarker Discovery en therapeutische interventies, die uiteindelijk de resultaten van de patiënt verbeteren.
De crispr/Cas9 Nuclease pathway, oorspronkelijk geïdentificeerd als een adaptief immuunsysteem in prokaryote cellen, is gebruikt als een snelle en kosteneffectieve manier voor locatiespecifieke genomische bewerking in levende cellen en organismen19,20 ,21,22. Het CRISPR/Cas9 systeem omvat twee hoofdcomponenten: de door de gRNA en Streptococcus pyogenesafgeleide Cas9 Nuclease. De gRNA bevat een specifieke sequentie genaamd protospacer die de doelregio herkent en Cas9 leidt voor bewerking. De gRNA bestaat uit twee delen: CRISPR RNA (crRNA), meestal een 20-Mer nucleotide sequentie complementair aan het doel-DNA, en een trans-activerende crRNA (tracrRNA), die fungeert als een bindende steiger voor de Nuclease. Een protospacer aangrenzend motief (PAM) (5 '-NGG) direct grenzend aan de doellocatie is nodig voor Cas9 decolleté en de decolleté plaats bevindt zich 3 nucleotiden stroomopwaarts van de PAM. CRISPR/Cas9-gemedieerde genbewerking wordt gewoonlijk uitgevoerd door transfecterende cellen met een plasmide die Cas9 en de gekloonde gRNA23codeert. Echter, deze aanpak is uitdagend voor hematopoietische cellen, die zijn vaak moeilijk te transfect en vereisen langdurige virus-gebaseerde transductie methoden. Een alternatieve aanpak is directe cellulaire levering van voorgemonteerde Cas9/gRNA RNP-complexen24. Een veelgebruikte methode voor de RNP-levering is elektroporation, die tijdelijke poriën in het celmembraan genereert, waardoor de RNP-complexen in de cellen25,26kunnen worden ingevoerd. De voordelen van deze aanpak zijn gebruiksgemak, verminderde off-target effecten en stabiliteit van de RNP-complexen. Hier beschrijven we een protocol van het gebruik van de RNP-leveringsmethode om de transcriptionele rol van een RUNX1 intronic-geluidsdemper te onderzoeken in de OCI-AML3 leukemie Cell line18, die werd vastgesteld aan de hand van het perifere bloed van een AML-patiënt gediagnosticeerd met de Frans-Amerikaans-Britse M4 subtype27. Het protocol omvat het ontwerp van crRNA, de voorbereiding van RNP-complexen, elektroporation, alsmede de screening en de daaropvolgende karakterisering van de gewenste klonen.
Protocol
1. ontwerp van crRNA
- Ontwerp twee crrna's, een 5 ' en de andere 3 ' van de target CRE met behulp van een web-based crispr design tool28,29,30,31. Zorg ervoor dat een PAM van NGG zich onmiddellijk stroomafwaarts van de doel volgorde bevindt voor Cas9 herkenning. Het ontwerp van de twee Crrna's (crRNA-1 en crRNA-2) voor het verwijderen van de RUNX1 geluiddemper18 is afgebeeld in Figuur 1.
Opmerking: Een crRNA bevat meestal een 20-Mer protospacer die complementair is aan de doel volgorde. - Controleer de aanwezigheid van enkelvoudige nucleotide polymorfismen (Snp's)/indels in het doel en de aangrenzende PAM-reeksen door de genomische locaties van de sequenties in te voeren in het zoekvak van een online genoom browser (bijv. NCBI 1000 Genomes of UCSC Genoome browser).
Opmerking: Gemeenschappelijke Snp's/indels hebben een kleine allel frequentie van ten minste 1% in de algemene populatie. - Dien de geselecteerde crRNA-sequenties in voor synthese met een commerciële leverancier. Koop ook de tracrRNA voor gRNA duplex formatie.
2. ontwerp van verwijderings screening primers
- Ontwerp een paar primers die het beoogde verwijderings gebied flankeren. Zorg ervoor dat de primers ten minste 50 BP van de Cas9 decolleté plaatsen zijn, zodat PCR-amplificatie minimaal wordt beïnvloed door indels gevormd op de splijter locaties.
- Zorg ervoor dat de ampliconlengte voor temp kleiner is dan 1.200 BP (bij voorkeur kleiner dan 600 BP voor een betere grootte resolutie). Label ook een van de primers met een fluorescerende kleurstof (bijv. 6-carboxyfluorescein (6-FAM)) aan de 5 '-end voor de detectie. De primers die worden gebruikt voor het screenen van de RUNX1 geluiddemper deletie18 zijn afgebeeld in Figuur 1.
3. bereiding van Cas9/gRNA RNP-complexen
- Respendeer de Crrna's en tracrRNA in 1x TE buffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) tot een eindconcentratie van 200 μM.
- Meng voor elk crRNA 2,2 μL 200 μM crRNA, 2,2 μL 200 μM tracrRNA en 5,6 μL 1x TE buffer (totaal 10 μL) in een tube van 0,2 mL om een uiteindelijke duplex concentratie van 44 μM te verkrijgen.
- Inincuberen bij 95 °C gedurende 5 min in een Thermocycler. Laat de buizen afkoelen tot kamertemperatuur voor gRNA complexe formatie.
- Verdun 10,4 μL 62 μM recombinant Cas9 Nuclease met 7,6 μL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om een uiteindelijke Nuclease concentratie van 36 μM te verkrijgen.
Opmerking: Dit bedrag is voldoende voor de bereiding van twee Cas9/gRNA-complexen. - Meng gelijke volumes (8,5 μL) van de verdunde Nuclease met elk van de gRNA-duplexen verkregen uit stap 3,3.
- Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 min om RNP-complexvorming mogelijk te maken. Houd de mengsels op ijs tot elektroporation.
4. elektroporation van de RNP-complexen in OCI-AML3-cellen
- Kweek OCI-AML3 cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal serum (FBS), 1x GlutaMAX, 100 eenheden/mL penicilinine en 100 μg/mL streptomycine (hierna "complete RPMI 1640 medium" genoemd) bij 37 °C met 5% CO2.
- Tel cellen met trypan blauwe kleuring. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cel ten tijde van de elektrotechniek meer dan 90% is.
- Centrifugeer 2,5 x 106 cellen in een tube van 1,5 mL bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant en was de cellen met 1 mL 1x PBS. Draai de cellen weer omlaag en verwijder alle resterende supernatant.
- Respendeer de cellen in 163 μL RPMI 1640 medium zonder fenolrood. Voeg 16,7 μL van elk RNP-complex (vanaf stap 3,6) en 3,6 μL 100 μM Elektroporation Enhancer toe aan de cellen (totaal volume = 200 μL). Meng zachtjes door pipetteren.
Opmerking: De Electroporation Enhancer is een drager-DNA voor het verbeteren van de bewerkings efficiëntie. - Breng het mengsel over naar een 0,2 cm-gap electroporatie Cuvette zonder bubbels. Voer elektroporation uit met een elektroporation systeem (modus: exponentieel; Spanning =: 150 V; Capaciteit = 700 μF; Weerstand = 50 Ω).
- Breng de cellen over in een T-25-weefselkweek kolf met 6 ml volledig rpmi 1640-medium en Incubeer bij 37 °c met 5% Co2.
5. screening en selectie van Celklonen met Biallelic verwijderingen
- Verdun de cellen tot 5 x 103/ml in volledige rpmi 1640 medium een dag na elektroporation. Voeg 100 μL van de verdunde celsuspensie toe aan elke put van 96-well weefselkweek platen en laat de cellen gedurende 7-14 dagen groeien.
- Extract genomisch DNA uit de cellen met behulp van een hoge doorvoer zuiveringssysteem.
- Voeg 100 μL plaat binding en lysisbuffer toe aan elk goed van een 96-put extractie plaat. Voeg 5 x 104 cellen geresuspendeerd in 10 μL van 1x PBS aan de buffer en meng ze door Pipetting.
- Inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, zodat het genomisch DNA kan worden gebonden aan de putjes.
- Aspireren de oplossing uit de putten zonder schrapen de goed oppervlakken. Was de putjes met 120 μL wasbuffer.
- Lucht drogen de putten met het gebonden DNA.
- Bereid 20 μL PCR-mengsel (2 μL van 10x hoge getrouwheids buffer, 0,8 μL van 50 mM MgSO4, 0,4 μl van 10 mm dNTPs, 0,4 μl 10 μm fam-label voorwaartse primer (stap 2,2), 0,4 μL van 10 μm zonder label omgekeerde primer en 0,4 U van Taq -DNA-polymerase voor elk monster).
Opmerking: Bereid een Mastermix voor om de toevoeging van gestandaardiseerde hoeveelheden reagentia in elk monster te garanderen. - Voeg de PCR-mix toe aan elke put van de extractie plaat en voer de reacties uit in een Thermocycler (voorwaarden: eerste 94 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 35 cycli van 94 °C gedurende 15 s, 56 °C gedurende 30 s en 68 °C gedurende 1 minuut).
- Bereken de hoeveelheid van de producten door de concentraties ervan in een geselecteerd aantal monsters te meten met behulp van een fluor meter. Verdun alle monsters met Nuclease-vrij H2O tot 0,5 ng/μL.
- Meng 1 μL van de verdunde PCR-producten met 8,5 μL gedeïoniseerde formamide en 0,5 μL fluorescerende kleurstof-gelabelde maat standaard in een 96-put-plaat die compatibel is met de genetische analysator.
Opmerking: Bereid een Master mix met gedeïoniseerde formamide en de maat standaard. - Bedek de plaat met een plaat septa en denatureren de monsters bij 95 °C gedurende 3 minuten in een Thermocycler. Sluit de deksel van de machine niet.
- Voer capillaire gel elektroforese uit om de gelabelde PCR-producten te scheiden zoals eerder beschreven32.
- Na elektroforese, open de analyse software om de resultaten te analyseren.
- Klik op Nieuw project en selecteer microsatelliet. Klik vervolgens op OK.
- Klik op voorbeelden toevoegen aan project en selecteer de resultaat bestanden (bevat de. FSA extensie). Klik vervolgens op toevoegen aan lijst om de bestanden te importeren.
- Kies in de tabel waarin de geselecteerde resultaat bestanden worden weergegeven, de standaard Microsatellite in de kolom analysemethode . Selecteer ook de grootte standaard die wordt gebruikt in de kolom grootte standaard . Klik vervolgens op het pictogram analyseren , voer de naam van het experiment en sla het experiment.
- Klik op weergeven plots om de resultaten weer te geven en kies fragment analyse in de instelling plot.
- Kies de juiste gekleurde kanalen voor analyse. Controleer het oranje pictogram om de gelabelde fragmenten in de grootte standaard te bekijken om de kwaliteit van het aanroepen van de grootte te beoordelen.
- Controleer het blauwe pictogram om de gelabelde PCR-producten te bekijken. Identificeer de pieken die corresponderen met het wild-type en Mutant (d.w.z. met de verwachte verwijderingen) producten. Schat het Mutante niveau in elk monster door het gebied onder de Mutant piek te delen door de som van het gebied onder de wild-type en Mutant pieken.
- Selecteer meerdere celgroepen met een hoog niveau van de verwachte verwijderingen voor verdere seriële verdunningen.
- Herhaal de DNA-extractie, fluorescerende PCR en capillaire elektroforese stappen. Selecteer cel klonen met gemuteerde niveaus > 95% die biallelic verwijderingen voor volgende analyses weergeeft.
- Controleer de identiteit van de verwijderingen in de geselecteerde klonen door Sanger-sequencing.
6. functionele analyses van de verwijdering van geluiddemper door real-time kwantitatieve RT-PCR-analyse
- Extract totaal RNA van de geselecteerde klonen en uitvoeren van complementaire DNA (cDNA) synthese.
- Meng 1 μg RNA met 1 μL 50 μM oligo (dT)20 primer en 1 μl 10 mm dNTP-mengsel in een totaal volume van 10 μL. inbroed bij 65 °c gedurende 5 minuten en plaats vervolgens ten minste 1 minuut op het ijs.
- Voeg 10 μL cDNA-synthese mengsel toe met 2 μL 10x RT-buffer, 4 μL van 25 mM MgCl2, 2 μl van 0,1 M DTT, 1 μl RNase-remmer (40 e/μl) en 1 μl reverse-transcriptase (200 e/μl). Inincuberen bij 50 °C gedurende 50 min en vervolgens op 85 °C gedurende 5 min in een Thermocycler.
Opmerking: Bereid een Mastermix voor de omgekeerde transcriptie. - Chill de monsters op ijs. Voeg 1 μL RNase H toe en inincuberen bij 37 °C gedurende 20 min. Bewaar de cDNA bij-20 °C.
- Ontwerp primers en TaqMan-probes die specifiek individuele transcript varianten herkennen die zijn gegenereerd door alternatieve promotors.
Opmerking: Vooraf ontworpen transcript-specifieke primer/sonde sets zijn in de handel verkrijgbaar. - Kloon DNA-fragmenten met de specifieke transcriptie sequenties in plasmide DNA. Bereid een 10-voudige verdunningsreeks (106 tot 10 kopieën) van de recombinant plasmiden als standaard krommen voor een transcriptie kwantificering.
- Bereid 20 μL PCR-mix (0,5 μL DNA-template, 1 μL 20x vooraf ontworpen TaqMan-sonde/primer test en 10 μL 2x TaqMan PCR-Master Mix) voor elk monster (zowel cDNA-als plasmide-normen). Meet elk monster in drievat.
Opmerking: Maak een Master mix voor de real-time PCR. - Voer de reacties uit in een real-time PCR-machine (condities: eerste 50 °C gedurende 2 minuten en 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 94 °C gedurende 15 s en 60 °C gedurende 1 minuut).
- Klik na de versterking op het pictogram analyseren in de software om de gegevens te analyseren. Controleer de helling en de correlatiecoëfficiënt van de standaard curven om de efficiëntie en lineariteit van de reacties te evalueren. Zorg ervoor dat de hellingen tussen-3,1 en-3,6 zijn en dat de correlatiecoëfficiënten groter zijn dan 0,99.
- Normaliseer het kopie nummer van de doel transcripten in elk monster met een huishoudelijk gen (bijv. Gapdh).
Representative Results
Het doel van dit experiment is om een intronic geluiddemper in het RUNX1 gen te verwijderen en de impact op RUNX1 transcriptie in OCI-AML3 cellen te onderzoeken. De geluiddemper werd geïdentificeerd door een combinatorische moleculaire benadering en bleek een 209 BP kernelement18te bevatten. Om een nauwkeurigere evaluatie van dit kernelement in de beheersing van RUNX1 expressie mogelijk te maken, werden de Crrna's (crrna-1 en crrna-2) ontworpen om nauw op deze regio te richten18 (Figuur 1). De voorspelde Cas9 decolleté sites die crRNA-1 en crRNA-2 brachten waren respectievelijk 29 BP en 35 BP van het kernelement (Figuur 1). Opgemerkt moet worden dat terwijl de PAM sites van de twee crRNAs zich bevinden op tegenovergestelde strengen, DSBs zal optreden onafhankelijk van PAM sequentie locatie. De gelijktijdige invoering van twee Cas9/gRNA RNP-complexen onder geleide van crRNA-1 en crRNA-2 wordt naar verwachting de demper element van de RUNX1 Locus.
Om te schermen voor de gewenste verwijderingen in een groot aantal monsters, werd een 96-well-indeling van genomische DNA-extractie Kit gebruikt voor het zuiveren van hoge doorvoer. Ook kan DNA gebonden aan de putten van de extractie platen worden onderworpen aan directe versterking, waardoor fouten of verontreiniging door herhaalde monster overdracht minimaliseren. De primers die worden gebruikt voor het screenen van de verwijderingen18 worden weergegeven in Figuur 1. De verwachte grootte van het wild-type PCR-product is ongeveer 500 BP. Aangezien de beoogde verwijdering 273 BP beslaat, wordt het Mutante product naar verwachting ongeveer 230 BP. Deze groottebereik maakt eenvoudige en snelle fragment analyse door capillaire gel elektroforese. Een totaal van 160 initiële celgroepen werden gescreend en 14 bleken te dragen de verwachte verwijderingen met Mutant niveaus van ten minste 70%. Vervolgens werden vijf zwembaden geselecteerd voor verdere seriële verdunningen om klonen met biallelische verwijderingen te identificeren. Representatieve elektroftalgrammen van celklonen met verschillende niveaus van mutant producten worden weergegeven in Figuur 2A. De identiteit van de verwijderingen werd geverifieerd door Sanger-sequencing (Figuur 2B). Zoals verwacht, werden indels gevormd door niet-homologeuze einde toetreding reparatie van DSBs33 werden waargenomen op de voorspelde splijting sites in de deletie klonen. Deze resulteerden in de versterking van Mutante producten van verschillende groottes, die ook kunnen worden gedetecteerd door capillaire elektroforese (Figuur 2A).
Het RUNX1 gen bevat twee promotors namelijk de distale P1 en proximale P2, die gescheiden worden door een grote intron die het geluiddemper element34verveelt. Drie belangrijke mRNA transcripten worden geproduceerd door deze promotors: RUNX1c by P1 en RUNX1a en RUNX1b door P234. De nucleotide-sequentie van RUNX1c en RUNX1b is identiek, behalve dat de eerste een uniek N-eindpunt heeft, waaruit een specifieke taqman-genexpressie test kan worden ontworpen (Figuur 3a). Om RUNX1bte meten, werd een TaqMan-test gebruikt die zowel RUNX1b als RUNX1c herkent (Figuur 3a). RUNX1b niveaus werden vervolgens bepaald door de totale RUNX1b/RUNX1c af te trekken van RUNX1c. RUNX1a is een duidelijk kortere isovorm als gevolg van alternatieve splicing en een specifieke taqman assay is beschikbaar voor deze variant (Figuur 3a). Zo kan de activiteit van de P1-en P2-promotors individueel worden bepaald. In real-time kwantitatieve RT-PCR bleek dat schrapping van het geluiddemper element de uitdrukkings niveaus van zowel P1-als P2-afgeleide transcripten significant opgaf (Figuur 3B).
Figuur 1 : Strategie om de RUNX1 intronic demper te verwijderen. De geluiddemper (rode doos) bevindt zich in het eerste intron van het RUNX1 gen dat de twee promotors P1 en P2 scheidt (hg19 coördinaten worden getoond). Twee Crrna's (crRNA-1 en crRNA-2) werden ontworpen voor het introduceren van DSBs flankerende de demper element. De voorspelde Cas9 decolleté sites worden aangegeven door verticale rode lijnen en de PAM sites (NGG) zijn in paars. De twee primers die worden gebruikt voor het screenen van de verwijderingen worden vertegenwoordigd door open pijlen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Identificatie van de verwijderings klonen. A) representatieve elektroftalgrammen van celklonen die verschillende niveaus van mutant PCR-producten vertonen (MUT). De grootte van de Mutant producten varieert tussen de klonen vanwege indels gevormd op de splijting sites. WT = wild-type. B) verificatie van de verwijderingen van representatieve klonen door Sanger-sequencing. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Functionele gevolgen van de verwijdering van geluiddemper. A) de drie grote RUNX1 isovormen (RUNX1a, RUNX1b en RUNX1c) worden weergegeven. Deze varianten bevatten hetzelfde runt DNA binding domein, maar verschillende N-(oranje) of C-Terminus (blauw). De locatie van de TaqMan sonde/primer paren wordt aangegeven door rode lijnen. Getallen geven de aminozuurresiduen aan. B) real-time kwantitatieve RT-PCR-analyse van RUNX1 P1-en P2-afgeleide transcripten in CELPOPULATIES met (del) of zonder (WT) de biallelic deleties18. Gapdh werd gebruikt voor normalisatie. * en * * vermeld p < 0,05 en p < 0,01, respectievelijk door de Mann-Whitney-test. Dit cijfer is gewijzigd van Cheng et al.18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Het crispr/Cas9 systeem is gebruikt in een breed scala aan genoom bewerkings toepassingen zoals Gene Knockout en knock-in studies35,36, transcriptionele regulatie37,38, genetische manipulatie van verschillende model organismen39,40,41,42,43,44 en gentherapie45,46. Hier demonstreren we het gebruik van CRISPR/Cas9 om de functionele gevolgen van het verwijderen van een intronic geluiddemper op het RUNX1 gen te onderzoeken. De levering van de CRISPR componenten in onze aanpak was niet afhankelijk van plasmide DNA, klonen van gRNA of virus maar elektroporation van voorgemonteerde Cas9/gRNA RNP-complexen. Het is aangetoond dat het gebruik van exogeen DNA kan worden geassocieerd met ongewenste integratie van vreemde vector sequenties in het ontvangende genoom, verhoogde toxiciteit en lage efficiëntie25,47,48, terwijl de methoden voor virus transductie zijn tijdrovend. Bovendien kan een langdurige expressie van Cas9 uit plasmide DNA de niet-doel effecten vergroten48. Integendeel, de directe RNP-gebaseerde levering aanpak is vastgesteld als de voorkeursmethode als het is snel en ongecompliceerd met verbeterde bewerkings efficiëntie, selectiviteit en levensvatbaarheid van de cel. Inderdaad, een verscheidenheid van methoden zoals lipofection49,50, electroporatie25,51, nanodeeltjes52, cel-penetrerende peptiden53, iTOP54 en triamf 55 zijn ontwikkeld voor efficiënte crispr/Cas9 levering in diverse celtypen, evenals dier-en plantensoorten24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63. aangezien niet-CODEER bare DNA-sequenties hotspots zijn van genetische variaties64, is het controleren van de aanwezigheid van gemeenschappelijke snp's/indels in de target en naburige pam-reeksen bijzonder relevant bij het ontwerpen van grna die gericht is op regelgevings Elementen.
Een knelpunt bij het bewerken van CRISPR/Cas9 genoom omvat het screenen van de gewenste mutanten in een groot aantal monsters. We werkten fluorescerende PCR in combinatie met capillaire gel elektroforese voor de screening als de doel mutatie is een kleine genomische deletie van ongeveer 300 BP. Deze methode is snel en gevoelig en kan worden uitgevoerd op een manier met hoge doorvoer. Ook, deze methode maakt nauwkeurige schatting van de Mutant niveaus en verwijdering maten tegelijkertijd. Bovendien wordt multiplex analyse van PCR-fragmenten met verschillende fluorescerende kleurstoffen ondersteund. We hebben deze techniek routinematig gebruikt voor het genotype van kleine inserties/verwijderingen in myeloïde Neoplasmata65,66. In onze ervaring kunnen we consistent fragment grootten detecteren die verschillen van 4 BP met hoge precisie en Mutante last tot ~ 3%. Echter, opgemerkt moet worden dat deze methode heeft een fragment groottelimiet van 1.200 BP, en dus het is niet geschikt voor het screenen van grote verwijderingen. Bovendien kunnen basis vervangingen (resulterend in ongewijzigde fragment grootte) en potentiële gebeurtenissen buiten het doel in andere genomische regio's niet worden gedetecteerd. Voor deze laatste is de kostbare gehele genoom volgorde vereist om globale ongewenste veranderingen in de doel klonen volledig te kunnen profiel. Om onze huidige aanpak voor onderzoek van grote non-coding regelgevings sequenties (> 1000 BP) aan te nemen, kan een gedetailleerde deletie-en mutagenese analyse van putatieve transcriptiefactor bindings locaties met behulp van in vitro reporter gene assays worden uitgevoerd vooraf om de minimale functionele regio voor CRISPR/Cas9 Editing18te afbakenen.
Aangezien veel genen meer dan één promotors3,4bevatten, is het belangrijk om op de hoogte te zijn van het bestaan van alternatieve promotors in de target Gene Locus, omdat het manipuleren van regelgevings elementen de organisatoren differentieel kan beïnvloeden. Zo moeten transcript varianten die zijn afgeleid van verschillende promotors afzonderlijk worden gemeten om elke Promoter-specifieke reactie te evalueren. Het gebruik van TaqMan probe-gebaseerde testen heeft de voorkeur boven SYBR Green vanwege een betere specificiteit en reproduceerbaarheid. Als het geavanceerdere digitale PCR-systeem beschikbaar is, kan transcriptie kwantificering nauwkeuriger worden uitgevoerd zonder dat standaard curve constructie nodig is.
Een belangrijke overweging bij het uitvoeren van crispr/Cas9 experimenten in kanker cellijnen is de ploïdie en doelwit gen kopie nummer in de cellen die worden gebruikt als vrijwel alle kanker cellijnen Harbor genetische veranderingen met inbegrip van structurele en kopie aantal variaties. In ons geval heeft OCI-AML3 een hyperdiploïde karyotype met 45 tot 50 chromosomen. Ook bleek de cellijn een normaal RUNX1 kopie nummer te dragen zoals blijkt uit de kanker cellijn encyclopedie67 en fluorescentie in situ hybridisatie studies18. Bij het targeten van een gen met afschriftnummer versterking moet de leveringsmethode mogelijk worden geoptimaliseerd om voldoende niveaus van de CRISPR-componenten voor de bewerking te bieden. Er kunnen ook meer klonen worden vertoond om de volledige Knockouts te identificeren. Belangrijk is dat er is aangetoond dat targeting op versterkte genomische regio's, met name die veroorzaakt door structurele herschikkingen, genonafhankelijke antiproliferatieve reacties in kankercellen kan veroorzaken, wat leidt tot vals-positieve resultaten in genen functionele studies68,69,70. In dit verband moeten alternatieve benaderingen zoals RNA-interferentie (RNAi) knockdown en/of cDNA-overexpressie worden gebruikt om de CRISPR-bevindingen te controleren. Ook moeten meerdere cellijnen worden gebruikt om onjuiste interpretatie van cellijn-specifieke maar genonafhankelijke CRISPR-bewerkingseffecten te voorkomen.
Het CRISPR/Cas9-systeem heeft een revolutie teweeggebracht in fundamenteel en translationeel onderzoek door een eenvoudig en efficiënt middel te bieden aan genoom bewerking. Hier demonstreren we het gemak van het gebruik van CRISPR/Cas9 om een intronic-demper te verstoren voor transcriptionele studies in een kankercel lijn. Deze techniek maakt de studie van CREs op DNA-niveau mogelijk en biedt de mogelijkheid om CRE-functies in de endogene context te onderzoeken in plaats van de traditionele heterologeuze reporter genen. Onlangs is een op CRISPR gebaseerd RNA-bewerkingssysteem ook geïdentificeerd71 en kan het fungeren als een nieuw hulpmiddel om CREs te bestuderen door zich te RICHTEN op RNA die is getranscribeerd uit de regelgevende elementen. Door te combineren met de opnametechnieken van chromosoom conformatie, zal CRISPR/Cas9 zeker helpen de involepen van CREs te ontcijferen in veranderde genoom organisatie en genexpressie gekoppeld aan verschillende gezondheidsproblemen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Prof. M.D. Minden (Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, Toronto, Canada) bedanken voor het verstrekken van de OCI-AML3 cellijn. Ook willen de auteurs de belangrijkste nutsvoorzieningen van kanker Genomics en Pathobiologie (de Chinese Universiteit van Hong Kong) bedanken voor het bieden van de faciliteiten en bijstand ter ondersteuning van dit onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 cm gap electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | |
| 1×TE buffer, pH 7.5 | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
| 3500 Genetic Analyzer | Thermo Fisher Scientific | 4405673 | |
| 6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer | Thermo Fisher Scientific | None | |
| 7300 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | None | |
| 7300 System SDS Software | Thermo Fisher Scientific | None | Version 1.3.1 |
| Bio-Rad Gene Pulser Xcell system | Bio-Rad | 1652660 | |
| ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well | Thermo Fisher Scientific | CS11205 | |
| crRNA-1 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
| crRNA-2 | Integrated DNA Technologies | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Components of the Cas9/gRNA complex |
| Deionized formamide | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
| Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32857 | |
| GeneMapper Software 5 | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| GeneScan 600 LIZ Size Standard | Thermo Fisher Scientific | 4408399 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| PBS, 10x Solution, pH 7.4 | Affymetrix | 75889 | |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 11304029 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081058 | Components of the Cas9/gRNA complex |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 31800-022 | |
| RPMI 1640 medium without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | |
| RUNX1a TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs04186042_m1 |
| RUNX1b/c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs00231079_m1 |
| RUNX1c TaqMan gene expression assays | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Hs01021966_m1 |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4304437 | |
| tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072533 | Components of the Cas9/gRNA complex |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Unlabeled PCR reverse primer | Thermo Fisher Scientific | None |
References
- Maston, G. A., Evans, S. K., Green, M. R. Transcriptional regulatory elements in the human genome. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 29-59 (2006).
- Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nature Reviews Genetics. 15 (4), 272-286 (2014).
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Research. 16 (1), 55-65 (2006).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends in Genetics. 19 (11), 640-648 (2003).
- West, A. G., Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: many functions, many mechanisms. Genes & Development. 16 (3), 271-288 (2002).
- Riethoven, J. J. Regulatory regions in DNA: promoters, enhancers, silencers, and insulators. Methods in Molecular Biology. 674, 33-42 (2010).
- Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- Bernstein, B. E., et al. The NIH roadmap epigenomics mapping consortium. Nature Biotechnology. 28 (10), 1045-1048 (2010).
- Zhou, S., Treloar, A. E., Lupien, M. Emergence of the Noncoding Cancer Genome: A Target of Genetic and Epigenetic Alterations. Cancer Discovery. 6 (11), 1215-1229 (2016).
- Khurana, E., et al. Role of non-coding sequence variants in cancer. Nature Reviews Genetics. 17 (2), 93-108 (2016).
- Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Molecular Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
- Willis, T. G., Dyer, M. J. The role of immunoglobulin translocations in the pathogenesis of B-cell malignancies. Blood. 96 (3), 808-822 (2000).
- Gröschel, S., et al. A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in leukemia. Cell. 157 (2), 369-381 (2014).
- Cheng, C. K., et al. RUNX1 upregulation via disruption of long-range transcriptional control by a novel t(5;21)(q13;q22) translocation in acute myeloid leukemia. Molecular Cancer. 17 (1), 133 (2018).
- Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual Review of Genetics. 45, 273-297 (2011).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Cho, S. W., Lee, J., Carroll, D., Kim, J. S., Lee, J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genetics. 195 (3), 1177-1180 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, 04766 (2014).
- Quentmeier, H., et al. Cell line OCI/AML3 bears exon-12 NPM gene mutation-A and cytoplasmic expression of nucleophosmin. Leukemia. 19 (10), 1760-1767 (2005).
- Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. Journal of Visualized Experiments. (122), e55586 (2017).
- Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
- Sood, R., Kamikubo, Y., Liu, P. Role of RUNX1 in hematological malignancies. Blood. 129 (15), 2070-2082 (2017).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Wright, J. B., Sanjana, N. E. CRISPR Screens to Discover Functional Noncoding Elements. Trends in Genetics. 32 (9), 526-529 (2016).
- Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Chen, C., Fenk, L. A., de Bono, M. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans by CRISPR-targeted homologous recombination. Nucleic Acids Research. 41 (20), 193 (2013).
- Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, 16 (2015).
- Svitashev, S., et al. Targeted Mutagenesis, Precise Gene Editing, and Site-Specific Gene Insertion in Maize Using Cas9 and Guide RNA. Plant Physiology. 169 (2), 931-945 (2015).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Ye, L., et al. Genome editing using CRISPR-Cas9 to create the HPFH genotype in HSPCs: An approach for treating sickle cell disease and β-thalassemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10661-10665 (2016).
- Gabriel, R. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nature Biotechnology. 29 (9), 816-823 (2011).
- Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nature Methods. 9 (8), 805-807 (2012).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Gundry, M. C., et al. Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9. Cell Reports. 17 (5), 1453-1461 (2016).
- Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
- D'Astolfo, D. S., et al. Efficient intracellular delivery of native proteins. Cell. 161 (3), 674-690 (2015).
- Yen, J., et al. TRIAMF: A New Method for Delivery of Cas9 Ribonucleoprotein Complex to Human Hematopoietic Stem Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16304 (2018).
- Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
- Martin, A., et al. CRISPR/Cas9 mutagenesis reveals versatile roles of Hox genes in crustacean limb specification and evolution. Current Biology. 26 (1), 14-26 (2016).
- Menoret, S., et al. Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineered proteins. Scientific Reports. 5, 14410 (2015).
- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
- Malnoy, M., et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Frontiers in Plant Science. 7, 1904 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 7, 13274 (2016).
- Shin, S. E., et al. CRISPR/Cas9-induced knockout and knock-in mutations in Chlamydomonas reinhardtii. Scientific Reports. 6, 27810 (2016).
- 1000 Genomes Project Consortium et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. The New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations fro an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Aguirre, A. J., et al. Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting. Cancer Discovery. 6 (8), 914-929 (2016).
- Munoz, D. M., et al. CRISPR Screens Provide a Comprehensive Assessment of Cancer Vulnerabilities but Generate False-Positive Hits for Highly Amplified Genomic Regions. Cancer Discovery. 6 (8), 900-913 (2016).
- Gonçalves, E., et al. Structural rearrangements generate cell-specific, gene-independent CRISPR-Cas9 loss of fitness effects. Genome Biology. 20 (1), 27 (2019).
- Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).
