Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Исследование транскрипционной роли интронического глушителя RUNX1 от CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин в острых миелоидных клеток лейкемии

Published: September 1, 2019 doi: 10.3791/60130
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Blood Cancer Cytogenetics and Genomics Laboratory, Department of Anatomical and Cellular Pathology, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 2State Key Laboratory in Oncology in South China, The Chinese University of Hong Kong

Summary

Прямая доставка предварительно собранных комплексов РНК-руководства РНК-рибонуклеопротеина является быстрым и эффективным средством для редактирования генома в гематоподетические клетки. Здесь мы используем этот подход, чтобы удалить runX1 интроник глушитель и изучить транскрипционные ответы в OCI-AML3 лейкемии клеток.

Abstract

Основная часть генома человека (98%) состоит из некодирующих последовательностей. ЭлементыCis-regulatory (CREs) являются некодировочными последовательностями ДНК, которые содержат связывающие участки для транскрипционных регуляторов для модулирования экспрессии генов. Изменения СР были вовлечены в различные заболевания, включая рак. В то время как промоутеры и усилители были основными СРР для изучения регуляции генов, очень мало известно о роли глушителя, который является еще одним типом CRE, который опосредует генные репрессии. Первоначально идентифицированный как адаптивная система иммунитета в прокариотах, CRISPR/Cas9 был использован, чтобы быть мощным инструментом для редактирования эукариотического генома. Здесь мы представляем использование этого метода для удаления интронового глушителе в гене RUNX1 человека и исследуем влияние на экспрессию генов в лейкемичных клетках OCI-AML3. Наш подход опирается на электропорацию опосредованных доставки двух предварительно собранных Cas9/руководство РНК (gRNA) рибонуклеопротеин (RNP) комплексов для создания двух двухструнных перерывов (DSBs), которые фланг глушитель. Удаления можно легко проверить с помощью фрагментного анализа. Анализ экспрессии различных мРНК, транскрибированных из альтернативных промоутеров, помогает оценить эффекты, зависящие от промоутеров. Эта стратегия может быть использована для изучения других ЦРТ и особенно подходит для гематопоиетических клеток, которые часто трудно трансфектировать с плазмидными методами. Использование плазмидно-и вирусо-стратегии позволяет просто и быстро оценить функции регулятивного гена.

Introduction

Cis-регулятивные элементы (CREs) являются некодивающие последовательности ДНК, которые содержат связывающие участки для транскрипционных регуляторов для контроля экспрессии генов1,2. Эти элементы, как правило, от 100 до 1000 базовых пар (bp) в длину. Промоутеры и усилители являются двумя наиболее характерными типами CREs. Промоутеры присутствуют в непосредственной близости от сайтов запуска транскрипции и составляют основную единицу транскрипции. Многие гены имеют более одного промотора и их альтернативноеиспользование способствует транскриптомному разнообразию и специфике тканей 3,4. С другой стороны, усилители активируют транскрипцию и могут быть расположены вверх по течению, вниз по течению или внутри интронов генов-мишеней. Усилители могут действовать с дальнего расстояния (более мегабазы) и независимо от ориентации1,2. CREs также включают глушители и изоляторы5,6. Первый действует противоположно усилителям, чтобы ингибировать экспрессию генов, связывая транскрипционные репрессоры, в то время как последние разъедают геном в дискретные топологические домены, чтобы изолировать гены из других ЦРБ из соседних областей. Эти элементы действуют в согласии друг с другом через краткосрочные и / или дальнего взаимодействия хроматина и организованы в регулирующие центры для направления надлежащего пространственно-временной экспрессии генов. Недавние достижения в методах секвенирования высокой пропускной способности ускорили идентификацию и функциональную аннотацию многих СРЦ, которые значительно облегчили наше понимание транскрипционных сетей, которые диктуют ген, охарактерижающий линию выражение в различныхтипах клеток и тканей 7,8,9,10,11,12.

Учитывая фундаментальные роли ЦРБ в регулировании транскрипции, их изменения могут привести к аномальной экспрессии генов. Было показано, что ЦРБ часто нарушается генетических и эпигенетических изменений в различных типах рака человека, тем самым способствуя инициации опухоли, прогрессии и агрессивности13,14. Кроме того, CRE-обязательные факторы часто мутируют и / или неправильно выражены в различных типах рака, что еще больше подчеркивает значение дерегулирования CRE в онкогенезе15. CREs также могут быть затронуты структурными аберрациями, о чем служат частые хромосомные перестановки иммуноглобулина тяжелый (IgH) усилитель гена, что приводит к ненормальной активации соседних онкогенов в B-клеточных лимфомы16. При остром миелоидном лейкозе (АМЛ) перепозиционирование одного усилителя хромосомой 3q реаранжировок вызывает сопутствующее GATA2 downregulation и активацию EVI1, которая потенциально может быть направлена на торможение BET функций усилителя 17. Недавно мы охарактеризовали новый хромосомный транслокации с участием возмущения RUNX1 intronic глушитель, которые могут способствовать прогрессии AML в педиатрической пациента18. Таким образом, расшифровка генома рака, не кодирующего, предоставляет плодотворные возможности для выяснения патогенеза заболеваний, открытия биомаркеров и терапевтических вмешательств, которые в конечном итоге улучшают исходы пациентов.

Путь nuclease CRISPR/Cas9, первоначально идентифицированный как адаптивная иммунная система в прокариотических клетках, был использован как быстрое и экономически эффективное средство для геномного редактирования в живых клетках и организмах19,20 ,21,22. Система CRISPR/Cas9 включает в себя два основных компонента: gRNA и Streptococcuspyogenes-производные Cas9 nuclease. GRNA содержит определенную последовательность, называемую протоскандр, которая распознает область цели и направляет Cas9 для редактирования. GRNA состоит из двух частей: CRISPR РНК (crRNA), как правило, 20-мер нуклеотидной последовательности дополняют целевой ДНК, и транс-активизируя crRNA (tracrRNA), который служит в качестве связывающей эшафот для нуклеаза. Смежный мотив протосказер (PAM) (5'-NGG) непосредственно рядом с целевым участком требуется для расщепления Cas9 и расщепления сайт расположен 3 нуклеотидов вверх по течению ОТ PAM. CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генов обычно осуществляется трансфектирующих клеток с плазмидой, которая кодирует Cas9 и клонированной gRNA23. Тем не менее, этот подход является сложной задачей для гематопоиетических клеток, которые часто трудно трансфектировать и требуют длительных методов трансдукции на основе вирусов. Альтернативным подходом является прямая клеточная доставка предварительно собранных комплексов CAS9/gRNA RNP24. Распространенным методом доставки РНП является электропорация, которая генерирует временные поры в клеточной мембране, что позволяет вносить комплексы RNP в клетки25,26. Преимущества этого подхода включают простоту использования, снижение нецелевых эффектов и стабильность комплексов RNP. Здесь мы описываем протокол использования метода доставки RNP для исследования транскрипционной роли бесцеремония RUNX1 в линии клеток лейкемии OCI-AML318, которая была установлена из периферической крови пациента AML с диагнозом франко-американо-британский подтип M427. Протокол включает в себя проектирование CRRNA, подготовку комплексов РНП, электропорацию, а также скрининг и последующую характеристику желаемых клонов.

Protocol

1. Дизайн CRRNA

  1. Дизайн двух CRAs, один 5 ', а другой 3 ' целевой CRE с помощью веб-инструмента дизайна CRISPR28,29,30,31. Убедитесь, что PAM NGG находится непосредственно вниз по течению целевой последовательности для распознавания Cas9. Конструкция двух CRРA (crRNA-1 и crRNA-2) для удаления глушитель RUNX1 18 показана на рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CRRNA обычно содержит 20-мерный протосканер, который дополняет целевую последовательность.
  2. Проверьте наличие однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs)/indels в мишени и смежных последовательностях PAM, введя геномные места последовательностей в поле поиска онлайн-браузера генома (например, NCBI 1000 Genomes или UCSC Genome Browser).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общие SNPs / indels имеют незначительные частоты аллелей, по крайней мере 1% в общей популяции.
  3. Отправить выбранные последовательности crRNA для синтеза с коммерческим поставщиком. Кроме того, приобрести tracrRNA для образования gRNA дуплекс.

2. Дизайн Удаления Скрининг праймеры

  1. Разработай пару грунтовок, которые обрамляют область предполагаемого удаления. Убедитесь, что праймеры, по крайней мере 50 bp от cas9 расщепления сайтов, так что pcR усиление минимально зависит от indels формируется на расщепления сайтов.
  2. Убедитесь, что ампликон меньше, чем 1200 bp (желательно меньше, чем 600 bp для лучшего разрешения размера). Кроме того, пометить один из грунтовки с флуоресцентным красителем (например, 6-carboxyfluorescein (6-FAM)) на 5'-конец для обнаружения. Праймеры, используемые для скрининга удаления глушителя RUNX1 18, показаны на рисунке 1.

3. Подготовка комплексов CAS9/gRNA RNP

  1. Приостановите crRNA и tracrRNA в буфере 1x TE (10 мм Трис, 0,1 мМ EDTA, pH 7.5) до конечной концентрации в 200 мкм.
  2. Для каждой crRNA, смешать 2,2 л из 200 мкм crRNA, 2,2 зл и 200 мКМ tracrRNA и 5,6 л 1x TE буфера (всего 10 мл) в 0,2 мл трубки для получения окончательной дуплексной концентрации 44 ММ.
  3. Инкубировать при 95 градусах по Цельсию в течение 5 мин в термоциклере. Дайте трубкам остыть до комнатной температуры для образования комплекса gRNA.
  4. Разбавить 10,4 л 62 мкм рекомбинантных Cas9 нуклеаза с 7,6 л 1x фосфат-буфера солине (PBS) для получения окончательной концентрации нуклеаза 36 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта сумма достаточна для подготовки двух комплексов Cas9/gRNA.
  5. Смешайте равные объемы (8,5 л) разбавленной нуклеазы с каждым из дуплексов gRNA, полученных с шага 3.3.
  6. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы позволить RNP образования комплекса. Держите смеси на льду до электропорации.

4. Электропорация комплексов РНП в клетки OCI-AML3

  1. Культура OCI-AML3 клетки в RPMI 1640 средних дополнены 10% тепло-инактивированных сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 1x GlutaMAX, 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (далее называют полным RPMI 1640 средних) на 37
  2. Подсчитайте клетки, используя трипан синий окрашивание. Убедитесь, что жизнеспособность клеток во время электропорации составляет более 90%.
  3. Центрифуга 2,5 х 106 клеток в трубке 1,5 мл при 500 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Удалить супернатант и мыть клетки с 1 мл 1x PBS. Спин вниз клетки снова и удалить все остаточные супернатанта.
  4. Повторное действие клеток в 163 злителе среды RPMI 1640 без фенола красного цвета.  Добавьте в клетки 16,7 л каждого комплекса РНП (от шага 3,6) и 3,6 л из 100 мкм электропорации Enhancer к клеткам (общий объем - 200 л). Смешайте осторожно путем пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электропорация Enhancer является носителем ДНК для повышения эффективности редактирования.
  5. Перенесите смесь в кветт электропорации 0,2 см без пузырьков. Выполнение электропорации с помощью системы электропорации (Режим: экспоненциальный; Напряжение: 150 В; Конденсация 700 кв.м.; Сопротивление No 50 евро).
  6. Перенесите клетки в тканьковую культурную колбу Т-25, содержащую 6 мл полнойсреды RPMI 1640 и инкубировать при 37 градусах Цельсия с 5 % CO 2.

5. Скрининг и выбор клеточных клонов с билельским делециями

  1. Разбавить клетки до 5 х 103/мл в полном RPMI 1640 средних один день после электропорации. Добавьте 100 л разбавленной клеточной подвески в каждую скважину из 96-ну колодцев культуры пластин и дайте клеткам расти в течение 7-14 дней.
  2. Извлекайте геномную ДНК из клеток с помощью высокой пропускной системы очистки.
  3. Добавьте 100 злиц связывания пластины и буфера лиза к каждой скважине из 96-хорошо извистоспособной пластины. Добавьте 5 х 104 ячеек, вновь в1 л 1x PBS в буфер и смешайте их путем пипетки.
  4. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы позволить привязки геномной ДНК к скважинам.
  5. Прикрепите раствор из колодцев, не выскабливая поверхности скважин. Вымойте скважины 120 л буфера для мытья.
  6. Воздух сушит колодцы, содержащие связанную ДНК.
  7. Подготовьте 20 qR смеси (2 qL 10x буфера высокой точности, 0,8 л 50 мМ MgSO4, 0,4 л из 10 мМ dNTPs, 0,4 л из 10 мКМ FAM-маркированных передний грунт (шаг 2.2), 0,4 мЛ 10 мМ немаркированного реверсивного прайма и 0,4 ДНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте мастер-микс для обеспечения добавления стандартизированных реагентов в каждый образец.
  8. Добавьте смесь ПЦР к каждой скважине извлечения пластины и запустить реакции в термоциклер (Условия: первоначальный 94 КК в течение 2 мин, а затем 35 циклов 94 C для 15 с, 56 C для 30 с и 68 C в течение 1 мин).
  9. Оцените количество продуктов путем измерения их концентрации в выбранном количестве образцов с помощью флюорометра. Разбавить все образцы с нуклеазом без H2O до 0,5 нг / Л.
  10. Смешайте 1 зл разбавленных продуктов ПЦР с 8,5 л деионизированного формамида и 0,5 л флуоресцентного красителя, маркированного стандартом в 96-хорошей пластине, совместимой с генетическим анализатором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте мастер-микс, содержащий деионизированный формамид и стандарт размера.
  11. Накройте тарелку плитой септы и денатурацию образцов при 95 градусах по Цельсию в течение 3 мин в термоциклере. Не закрывайте крышку машины.
  12. Выполните капиллярный гель электрофорус, чтобы отделить помеченные продукты ПЦР, как ранее описано32.
  13. После электрофореза откройте программное обеспечение для анализа результатов.
  14. Нажмите Новый проект и выберите Microsatellite. Затем нажмите OK.
  15. Нажмите Добавить образцы для проекта и выберите файлы результата (содержат расширение .fsa). Затем нажмите Добавить, чтобы перечислить для импорта файлов.
  16. В таблице, отображаемой выбранными файлами результатов, выберите Microsatellite Default в столбце метода анализа. Кроме того, выберите стандарт размера, используемый в столбце Размер стандарта. Затем нажмите значок «Анализ», введите имя эксперимента и сохраните эксперимент.
  17. Нажмите Отображение Участки для просмотра результатов и выбрать фрагмент анализа в настройках участка.
  18. Выберите подходящие цветные каналы для анализа. Проверьте оранжевый значок, чтобы просмотреть помеченные фрагменты в стандарте размера, чтобы оценить качество вызова размера.
  19. Проверьте синий значок для просмотра маркированных продуктов ПЦР. Определите пики, которые соответствуют продуктам дикого типа и мутанта (т.е. с ожидаемыми удалениями). Оцените уровень мутантов в каждом образце, разделив область под пиком мутантов на сумму области под пиками дикого типа и мутантов.
  20. Выберите несколько пулов ячеек с высоким уровнем ожидаемых удаляний для дальнейшего последовательного разбавления.
  21. Повторите экстракцию ДНК, флуоресцентные ПЦР и капиллярные шаги электрофореза. Выберите клоны клеток с уровнем мутантов, представляющие двуличие для последующего анализа.
  22. Проверьте личность удаления в выбранных клонов секвенированием Sanger.

6. Функциональный анализ удаления глушителей с помощью количественного анализа RT-PCR в режиме реального времени

  1. Извлекайте полную РНК из выбранных клонов и выполняйте дополнительный синтез ДНК (кДНК).
  2. Смешайте 1 мкг РНК с 1 мл 50 мкм олиго (дТ)20 грунтовки и 1 л 10 мМ dNTP смесь в общей объеме 10 кл. Инкубировать при 65 градусов по Цельсию в течение 5 мин, а затем место на льду, по крайней мере 1 мин.
  3. Добавьте 10 qL смеси синтеза кДНК, содержащей 2 зл и 10x буфера РТ, 4 л 25 мМ MgCl2, 2 Л Л 0,1 М DTT, 1 л ингибитора RNase (40 U/L) и 1 Л обратной транскриптазы (200 U/qL). Инкубировать при 50 градусах по Цельсию в течение 50 мин, а затем 85 градусов по Цельсию в течение 5 мин в термоциклере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте мастер-микс для обратной транскрипции.
  4. Охладите образцы на льду. Добавьте 1 кЛ RNase H и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 20 мин. Храните кДНК при -20 градусах Цельсия.
  5. Дизайн праймеров и TaqMan зонды, которые конкретно признают отдельные варианты стенограммы, порожденные из альтернативных промоутеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно разработанные транскрипт-специфические наборы грунтовки/зонда коммерчески имеющиеся.
  6. Фрагменты ДНК клона, содержащие определенные последовательности стенограммы в плазмидную ДНК. Подготовьте 10-кратную серию разбавления (106 до 10 экземпляров) рекомбинантных плазмидов в качестве стандартных кривых для количественной расшифровки.
  7. Подготовьте 20 qL смеси ПЦР (0,5 л шаблона ДНК, 1 зл 20x предварительно разработанный зонд TaqMan / грунтовка анализ и 10 зл 2x TaqMan PCR Master Mix) для каждого образца (как кДНК и плазмидных стандартов). Измерьте каждый образец в тройном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте мастер-микс для ПЦР в реальном времени.
  8. Запустите реакции в режиме реального времени PCR машины (Условия: первоначальные 50 C для 2 мин и 95 C в течение 10 минут, а затем 40 циклов 94 C для 15 с и 60 C в течение 1 мин).
  9. После усиления щелкните значок «Анализ» в программном обеспечении для анализа данных. Проверьте наклон и коэффициент корреляции стандартных кривых для оценки эффективности и линейности реакций. Убедитесь, что склоны находятся между -3,1 и -3,6, а коэффициенты корреляции превышают 0,99.
  10. Нормализовать номер копии целевых транскриптов в каждом образце с геном домашнего хозяйства (например, GAPDH).

Representative Results

Целью этого эксперимента является удаление интронового глушителе в гене RUNX1 и изучение влияния на транскрипцию RUNX1 в клетках OCI-AML3. Глушитель был идентифицирован комбинированный молекулярный подход и установлено, содержат 209 bp основной элемент18. Для более точной оценки этого основного элемента в управлении экспрессией RUNX1, CRRNA (crRNA-1 и crRNA-2) были разработаны для того, чтобы ориентироваться непосредственно на этот регион18 (рисунок1). Прогнозируемые участки расщепления Cas9, принесенные crRNA-1 и crRNA-2, составили 29 б.п. и 35 б.п. от основного элемента соответственно(рисунок1). Следует отметить, что в то время как PAM сайтов двух CRRNA находятся на противоположных нитей, DSBs будет происходить независимо от pam место последовательности. Таким образом, ожидается, что одновременное внедрение двух комплексов CAS9/gRNA RNP, управляемых CRRNA-1 и crRNA-2, выведет элемент глушитого из локуса RUNX1.

Для проверки желаемого удаления в большом количестве образцов для очистки высокой пропускной информации использовался 96-колодский формат комплекта экстракции геномной ДНК. Кроме того, ДНК, связанная с скважинами извлечения пластин, может подвергаться прямому усилению, тем самым минимизируя ошибки или загрязнения из-за повторной передачи образцов. Праймеры, используемые для скрининга удаления18, показаны на рисунке 1. Ожидаемый размер продукта ПЦР дикого типа составляет около 500 б.п. Так как предполагаемое удаление охватывает 273 bp, мутант продукт, как ожидается, будет около 230 bp. Этот диапазон размеров позволяет простой и быстрый анализ фрагментов с помощью капиллярного геля электрофорасиса. В общей сложности было обследовано 160 первичных пулов ячеек, и было установлено, что 14 из них выполняют ожидаемые удаления с уровнем мутантов не менее 70%. Затем были отобраны пять бассейнов для дальнейшего последовательного разбавления для выявления клонов, несущих двуличные удаления. Репрерограммы из клеточных клонов с различными уровнями мутантных продуктов показаны на рисунке 2А. Личность удаления была подтверждена секвенированием Сэнгера(рисунок 2B). Как и ожидалось, indels формируется не-homologous конца присоединения ремонт DSBs33 наблюдались на прогнозируемых мест расщепления в делегировании клонов. Это привело к усилению мутантных продуктов различных размеров, которые также могут быть обнаружены с помощью капиллярного электрофореза(рисунок 2А).

Ген RUNX1 содержит два промотора, а именно дистальный P1 и проксимальный P2, которые разделены большим интроном, укрывающим элемент глушителе34 . Три основные мРНК стенограммы производятся этими промоутерами: RUNX1c по P1 и RUNX1a и RUNX1b по P234. Нуклеотидная последовательность RUNX1c и RUNX1b идентичны, за исключением первого имеет уникальный N-терминус, из которого может быть разработан ассс экспрессия гена специфического TaqMan (рисунок3A). Для измерения RUNX1b, TaqMan асссу признания как RUNX1b и RUNX1c был использован (Рисунок3A). Уровни RUNX1b были затем определены путем вычитания общего RUNX1b/RUNX1c от RUNX1c. RUNX1a является отчетливо короче изоформы из-за альтернативного сплайсинга и конкретных TaqMan асссе доступен для этого варианта(Рисунок 3A). Таким образом, деятельность промоутеров P1 и P2 может быть определена индивидуально. Количественный RT-PCR в реальном времени показал, что удаление элемента глушителей значительно upregulated уровни выражения как P1- и P2-производных стенограмм(рисунок 3B).

Figure 1
Рисунок 1 : Стратегия по удалению синтроника RUNX1. Глушитель (красный ящик) находится в первом интроне гена RUNX1, разделяющем два промотора P1 и P2 (показаны координаты hg19). Две CRРA (crRNA-1 и crRNA-2) были разработаны для введения DSBs фланговых элемент глушителей. Прогнозируемые участки расщепления Cas9 обозначены вертикальными красными линиями, а сайты PAM (NGG) находятся в фиолетовом цвете. Два грунтовки, используемые для скрининга удаления, представлены открытыми стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 : Идентификация клонов удаления. (A) Представитель электроферограммы клеточных клонов, показывающих различные уровни мутантных продуктов ПЦР (MUT). Размер мутантных продуктов варьируется среди клонов из-за indels формируется на участках расщепления. WT - дикий тип. (B) Проверка удаления из репрезентативных клонов секвенированием Sanger. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 : Функциональные последствия удаления глушителей. (A) Показаны три основные изоформы RUNX1 (RUNX1a, RUNX1b и RUNX1c). Эти варианты содержат тот же связывающий домен RUNt DNA, но различные N- (оранжевый) или C-терминус (синий). Расположение пар зонда/праймера TaqMan обозначено красными линиями. Цифры указывают на остатки аминокислот. (B) В режиме реального времени количественный RT-PCR анализ RUNX1 P1- и P2-производных стенограмм в популяциях клеток с (DEL) или без (WT) бильлетического удаления18. GAPDH был использован для нормализации. - и q) указывают P злт; 0,05 и P lt; 0,01, соответственно, по тесту Манн-Уитни. Эта цифра была изменена из Чэн и др.18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Система CRISPR/Cas9 была использована в широком диапазоне применений редактирования генома, таких как геннокаут и стук-в исследованиях35,36, транскрипционной регуляции37,38, генной инженерии различных модель организмов39,40,41,42,43,44 и генной терапии45,46. Здесь мы демонстрируем использование CRISPR/Cas9 для исследования функциональных последствий удаляния интронового глушителе на генRUNX1. Поставка компонентов CRISPR в нашем подходе не опиралась на плазмидную ДНК, клонирование гРНК или вируса, а на электропорацию предварительно собранных комплексов CAS9/gRNA RNP. Было показано, что использование экзогенной ДНК может быть связано с нежелательной интеграцией посторонней векторных последовательностей в геном хозяина, повышенной токсичностью и низкой эффективностью25,47,48, в то время как методы трансдукции вируса отнимают много времени. Кроме того, длительное выражение Cas9 из плазмидной ДНК может увеличить внецелевое действие48. Напротив, прямой подход к доставке на основе RNP был установлен в качестве предпочтительного метода, поскольку он является быстрым и понятным с повышением эффективности редактирования, избирательности и жизнеспособности клеток. Действительно, различные методы, такие как липофектирование49,50, электропорация25,51, наночастицы52, клеточные пептиды53, iTOP54 и TRIAMF 55 были разработаны для эффективной доставки CRISPR/Cas9 в различные типы клеток, а также животных и растений24,25,26,56,57 , 58 , 59 , 60 лет , 61 год , 62 год , 63. Поскольку некодирование последовательности ДНК являются горячими точками генетических вариаций64, проверка наличия общих SNPs / indels в цели и соседних последовательностей PAM особенно актуальна при проектировании gRNA, что цели нормативных Элементы.

Узкое место в редактировании генома CRISPR/Cas9 включает скрининг желаемых клонов-мутантов в большом количестве образцов. Мы использовали флуоресцентные ПЦР в сочетании с капиллярным гелем электрофорезом для скрининга, так как целевая мутация представляет собой небольшое геномное удаление около 300 б.п. Этот метод является быстрым и чувствительным и может быть выполнен в высокой пропускной форме. Кроме того, этот метод позволяет точно оценивать уровни мутантов и размеры удаления одновременно. Кроме того, поддерживается мультиплексный анализ фрагментов ПЦР, помеченных различными флуоресцентными красителями. Мы регулярно использовали этот метод для генотипа небольших вставок / удаления в миелоидных неоплазм65,66. По нашему опыту, мы можем последовательно обнаруживать размеры фрагментов, которые отличаются на 4 б.п. с высокой точностью и бременем мутантов до 3%. Однако следует отметить, что этот метод имеет предел размера фрагмента 1200 б.п., и поэтому он не подходит для скрининга крупных удаляний. Кроме того, не могут быть обнаружены базовые замены (в результате чего неизменный размер фрагмента) и потенциальные внецелевые события в других геномных регионах. Для последнего требуется дорогостоящее секвенирование всего генома для всестороннего профилирования глобальных нежелательных изменений в целевых клонах. Чтобы принять наш текущий подход к исследованию больших некодирующих регулятивных последовательностей (1000 б.п.), можно провести детальный анализ удаления и мутагенеза из цитирований фактора опорной информации с использованием анализа генов in vitro заранее, чтобы разграничить минимальный функциональный регион для редактирования CRISPR/Cas918.

Поскольку многие гены содержатболее одного промоутера 3,4, важно знать о существовании альтернативных промоутеров в целевой лолок гена, как манипулирование нормативными элементами может повлиять на промоутеров дифференциально. Таким образом, транскрипт варианты, полученные из различных промоутеров должны быть измерены индивидуально для оценки любых промоутер конкретных ответов. Использование TaqMan зонд основе анализов является предпочтительным по сравнению с SYBR Зеленый из-за лучшей специфичности и воспроизводимости. Если доступна более продвинутая цифровая система ПЦР, количественная транскриптация может быть выполнена более точно без необходимости построения стандартной кривой.

Важным фактором при выполнении экспериментов CRISPR/Cas9 в линиях раковых клеток является плоида и целевой номер копии гена в клетках, используемых практически в качестве практически всех линий раковых клеток гавани генетических изменений, включая структурные и вариации числа копий. В нашем случае OCI-AML3 имеет гипердиплоидный кариотип с 45-50 хромосомами. Кроме того, клеточная линия была найдена, чтобы нести нормальный runX1 номер копии, как показано из энциклопедии линии раковых клеток67 и флуоресценции на месте гибридизации исследований18. При таргетинге на ген с увеличением числа копий метод доставки, возможно, потребуется оптимизировать, чтобы обеспечить достаточный уровень компонентов CRISPR для редактирования. Кроме того, больше клонов, возможно, потребуется проверить для того, чтобы определить полный нокаутов. Важно отметить, что было показано, что таргетинг на усиленные геномные области, особенно вызванные структурными перестановками, может вызвать генно-независимые антипролиферативные реакции в раковых клетках, что приводит к ложноположительным результатам в гене функциональные исследования68,69,70. В этой связи для проверки выводов CRISPR следует использовать альтернативные подходы, такие как РНК-интерференция (РНК) нокдаун и/или переэкспрессия кДНК. Кроме того, несколько клеточных линий следует использовать, чтобы избежать неправильного толкования клеточной линии конкретных, но генно-независимых эффектов редактирования CRISPR.

Система CRISPR/Cas9 произвела революцию в фундаментальных и трансляционных исследованиях, предоставив простые и эффективные средства для редактирования генома. Здесь мы демонстрируем легкость использования CRISPR/Cas9, чтобы нарушить интронный глушитель для транскрипционных исследований в линии раковых клеток. Этот метод позволяет изучать ЦРБ на уровне ДНК и дает возможность изучить функции CRE в эндогенном контексте, а не традиционные гетерологические гены репортера. Недавно была также определена система редактирования РНК на основе CRISPR71 и может служить новым инструментом для изучения СРР путем таргетинга НА РНК, транскрибированных из регулятивных элементов. В сочетании с хромосомой конформации захвата методов, CRISPR/ Cas9, безусловно, поможет расшифровать участие CREs в измененной организации генома и экспрессии генов, связанных с различными проблемами со здоровьем.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить профессора M.D. Минден (Принцесса Маргарет онкологический центр, Сеть здравоохранения университета, Торонто, Канада) за предоставление OCI-AML3 клеточной линии. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить основные утилиты рака геномики и патобиологии (Китайский университет Гонконга) для предоставления средств и помощи в поддержку этого исследования.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 cm gap electroporation cuvette Bio-Rad 1652086
1×TE buffer, pH 7.5 Integrated DNA Technologies 11-01-02-02
10 mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific 18427013
3500 Genetic Analyzer Thermo Fisher Scientific 4405673
6-FAM-labeled fluorescent PCR forward primer Thermo Fisher Scientific None
7300 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific None
7300 System SDS Software Thermo Fisher Scientific None Version 1.3.1
Bio-Rad Gene Pulser Xcell system Bio-Rad 1652660
ChargeSwitch Direct gDNA Purification Kit, 96-well Thermo Fisher Scientific CS11205
crRNA-1 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
crRNA-2 Integrated DNA Technologies Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA Components of the Cas9/gRNA complex
Deionized formamide Thermo Fisher Scientific 4311320
Electroporation Enhancer Integrated DNA Technologies 1075915
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270098
Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q32857
GeneMapper Software 5 Thermo Fisher Scientific 4475073
GeneScan 600 LIZ Size Standard Thermo Fisher Scientific 4408399
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
PBS, 10x Solution, pH 7.4 Affymetrix 75889
Penicillin and streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Thermo Fisher Scientific 11304029
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Recombinant S. pyogenes Cas9 nuclease Integrated DNA Technologies 1081058 Components of the Cas9/gRNA complex
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 31800-022
RPMI 1640 medium without phenol red Thermo Fisher Scientific 11835030
RUNX1a TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs04186042_m1
RUNX1b/c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs00231079_m1
RUNX1c TaqMan gene expression assays Thermo Fisher Scientific 4331182 Hs01021966_m1
SuperScript III First-Strand Synthesis System Thermo Fisher Scientific 18080051
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4304437
tracrRNA Integrated DNA Technologies 1072533 Components of the Cas9/gRNA complex
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018
Unlabeled PCR reverse primer Thermo Fisher Scientific None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maston, G. A., Evans, S. K., Green, M. R. Transcriptional regulatory elements in the human genome. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 7, 29-59 (2006).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nature Reviews Genetics. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Research. 16 (1), 55-65 (2006).
  4. Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends in Genetics. 19 (11), 640-648 (2003).
  5. West, A. G., Gaszner, M., Felsenfeld, G. Insulators: many functions, many mechanisms. Genes & Development. 16 (3), 271-288 (2002).
  6. Riethoven, J. J. Regulatory regions in DNA: promoters, enhancers, silencers, and insulators. Methods in Molecular Biology. 674, 33-42 (2010).
  7. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  8. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  9. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  10. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  11. Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
  12. Bernstein, B. E., et al. The NIH roadmap epigenomics mapping consortium. Nature Biotechnology. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  13. Zhou, S., Treloar, A. E., Lupien, M. Emergence of the Noncoding Cancer Genome: A Target of Genetic and Epigenetic Alterations. Cancer Discovery. 6 (11), 1215-1229 (2016).
  14. Khurana, E., et al. Role of non-coding sequence variants in cancer. Nature Reviews Genetics. 17 (2), 93-108 (2016).
  15. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Molecular Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  16. Willis, T. G., Dyer, M. J. The role of immunoglobulin translocations in the pathogenesis of B-cell malignancies. Blood. 96 (3), 808-822 (2000).
  17. Gröschel, S., et al. A single oncogenic enhancer rearrangement causes concomitant EVI1 and GATA2 deregulation in leukemia. Cell. 157 (2), 369-381 (2014).
  18. Cheng, C. K., et al. RUNX1 upregulation via disruption of long-range transcriptional control by a novel t(5;21)(q13;q22) translocation in acute myeloid leukemia. Molecular Cancer. 17 (1), 133 (2018).
  19. Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  20. Bhaya, D., Davison, M., Barrangou, R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annual Review of Genetics. 45, 273-297 (2011).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  23. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  24. Cho, S. W., Lee, J., Carroll, D., Kim, J. S., Lee, J. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Genetics. 195 (3), 1177-1180 (2013).
  25. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
  26. Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 3, 04766 (2014).
  27. Quentmeier, H., et al. Cell line OCI/AML3 bears exon-12 NPM gene mutation-A and cytoplasmic expression of nucleophosmin. Leukemia. 19 (10), 1760-1767 (2005).
  28. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nature Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  29. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  30. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  31. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  32. Ramlee, M. K., Wang, J., Cheung, A. M., Li, S. Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format. Journal of Visualized Experiments. (122), e55586 (2017).
  33. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  34. Sood, R., Kamikubo, Y., Liu, P. Role of RUNX1 in hematological malignancies. Blood. 129 (15), 2070-2082 (2017).
  35. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  36. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  37. Wright, J. B., Sanjana, N. E. CRISPR Screens to Discover Functional Noncoding Elements. Trends in Genetics. 32 (9), 526-529 (2016).
  38. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  39. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  40. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  41. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  42. Chen, C., Fenk, L. A., de Bono, M. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans by CRISPR-targeted homologous recombination. Nucleic Acids Research. 41 (20), 193 (2013).
  43. Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, 16 (2015).
  44. Svitashev, S., et al. Targeted Mutagenesis, Precise Gene Editing, and Site-Specific Gene Insertion in Maize Using Cas9 and Guide RNA. Plant Physiology. 169 (2), 931-945 (2015).
  45. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  46. Ye, L., et al. Genome editing using CRISPR-Cas9 to create the HPFH genotype in HSPCs: An approach for treating sickle cell disease and β-thalassemia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10661-10665 (2016).
  47. Gabriel, R. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nature Biotechnology. 29 (9), 816-823 (2011).
  48. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nature Methods. 9 (8), 805-807 (2012).
  49. Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
  50. Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (11), 2868-2873 (2016).
  51. Gundry, M. C., et al. Highly Efficient Genome Editing of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9. Cell Reports. 17 (5), 1453-1461 (2016).
  52. Mout, R., et al. Direct Cytosolic Delivery of CRISPR/Cas9-Ribonucleoprotein for Efficient Gene Editing. ACS Nano. 11 (3), 2452-2458 (2017).
  53. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Research. 24 (6), 1020-1027 (2014).
  54. D'Astolfo, D. S., et al. Efficient intracellular delivery of native proteins. Cell. 161 (3), 674-690 (2015).
  55. Yen, J., et al. TRIAMF: A New Method for Delivery of Cas9 Ribonucleoprotein Complex to Human Hematopoietic Stem Cells. Scientific Reports. 8 (1), 16304 (2018).
  56. Sung, Y. H., et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Research. 24 (1), 125-131 (2014).
  57. Martin, A., et al. CRISPR/Cas9 mutagenesis reveals versatile roles of Hox genes in crustacean limb specification and evolution. Current Biology. 26 (1), 14-26 (2016).
  58. Menoret, S., et al. Homology-directed repair in rodent zygotes using Cas9 and TALEN engineered proteins. Scientific Reports. 5, 14410 (2015).
  59. Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
  60. Malnoy, M., et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Frontiers in Plant Science. 7, 1904 (2016).
  61. Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
  62. Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 7, 13274 (2016).
  63. Shin, S. E., et al. CRISPR/Cas9-induced knockout and knock-in mutations in Chlamydomonas reinhardtii. Scientific Reports. 6, 27810 (2016).
  64. 1000 Genomes Project Consortium et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
  65. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. The New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  66. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations fro an international expert panel. Blood. 129 (4), 424-447 (2017).
  67. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
  68. Aguirre, A. J., et al. Genomic Copy Number Dictates a Gene-Independent Cell Response to CRISPR/Cas9 Targeting. Cancer Discovery. 6 (8), 914-929 (2016).
  69. Munoz, D. M., et al. CRISPR Screens Provide a Comprehensive Assessment of Cancer Vulnerabilities but Generate False-Positive Hits for Highly Amplified Genomic Regions. Cancer Discovery. 6 (8), 900-913 (2016).
  70. Gonçalves, E., et al. Structural rearrangements generate cell-specific, gene-independent CRISPR-Cas9 loss of fitness effects. Genome Biology. 20 (1), 27 (2019).
  71. Abudayyeh, O. O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550 (7675), 280-284 (2017).

Tags

Генетика Выпуск 151 CRISPR/CAS9 рибонуклеопротеин электропорация цис-регуляторный элемент глушитель Транскрипционный контроль лейкемия
Исследование транскрипционной роли интронического глушителя <em>RUNX1</em> от CRISPR/Cas9 Рибонуклеопротеин в острых миелоидных клеток лейкемии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, C. K., Wong, T. H. Y., Yung,… More

Cheng, C. K., Wong, T. H. Y., Yung, Y. L., Chan, N. C. N., Ng, M. H. L. Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells. J. Vis. Exp. (151), e60130, doi:10.3791/60130 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter