Summary
Die Methode beschreibt entzündungsempfindliche hypoxisch-ischämische und hyperoxische Hirnverletzungen im P17-Ferret, um die komplexe Wechselwirkung zwischen längeren Entzündungen und oxidativen Hirnverletzungen bei einer Reihe von späten Frühgeborenen zu modellieren.
Abstract
Es besteht ein ständiger Bedarf an klinisch relevanten Modellen der perinatalen Infektion und Hypoxia-Ischämie (HI), in denen therapeutische Interventionen für Säuglinge mit der neurologischen Fortsetzung der Frühreife getestet werden können. Frettchen sind ideale Kandidaten für die Modellierung des frühgeborenen menschlichen Gehirns, da sie lissencephalic geboren werden und gyrencephale Gehirne postnatal entwickeln. Bei der Geburt ähnelt die Entwicklung des Frettchen-Gehirns einem 13-wöchigen menschlichen Fötus, wobei postnatale Tagessätze (P) 17 Kits als gleichwertig mit einem Säugling bei 32–36 Wochen Schwangerschaft angesehen werden. Wir beschreiben ein Verletzungsmodell im Frettchen P17, bei dem auf die Verabreichung von Lipopolysaccharid bilaterale zerebrale Ischämie, Hypoxie und Hyperoxia folgt. Dies simuliert die komplexe Wechselwirkung von längeren Entzündungen, Ischämie, Hypoxie, und oxidativen Stress in einer Reihe von Neonaten erlebt, die Hirnverletzungen entwickeln. Verletzte Tiere zeigen eine Reihe von schweren Verletzungen Schwere, mit morphologischen Veränderungen im Gehirn einschließlich Verengung von multiplen kortikalen Gyri und damit verbundenen Sulci. Verletzte Tiere zeigen auch verlangsamte Reflexentwicklung, langsamere und variablere Geschwindigkeit der Fortbewegung in einem automatisierten Laufsteg und verringerte Exploration in einem offenen Feld. Dieses Modell bietet eine Plattform, um vermeintliche Therapien für Säuglinge mit neonataler Enzephalopathie im Zusammenhang mit Entzündungen und HI zu testen, Verletzungsmechanismen zu untersuchen, die die kortikale Entwicklung beeinflussen, und Wege zu untersuchen, die Resilienz in nicht betroffene Tiere.
Introduction
Es besteht ein ständiger Bedarf an großen Tiermodellen, die die Pathophysiologie der Frühreife und perinatalen Hypoxia-Ischämie widerspiegeln, in denen therapeutische Interventionen für Säuglinge getestet werden können. Im Jahr 2017 wurden 9,93% der 382.726 in den Vereinigten Staaten geborenen Säuglinge früh geboren, und 84% dieser Säuglinge wurden zwischen 32 und 36 Wochen der Schwangerschaft1geboren. Bei Frühgeborenen ist eine perinatale Exposition gegenüber Infektionen oder Entzündungen häufig, bei denen die aktivierung des mütterlichen Immunsystems durch virale oder bakterielle Krankheitserreger Früharbeit auslösen kann. Postnatal sind Frühgeborene einem hohen Risiko für eine frühe oder späte Sepsis2ausgesetzt. Frühgeborene erleben auch häufig Perioden von Hypoxie, Hypotonie und Hyperoxia aufgrund ihres unreifen kardiorespiratorischen Systems, erhöhte Sauerstoffspannung in der Atmosphäre im Vergleich zu denen in der Gebärmutter erlebt, und iatrogene Expositionen. Zusätzlich, bei Frühgeborenen, antioxidative Abwehrkräfte sind unreif3 und pro-apoptotische Faktoren sind natürlich upregulated4. Oxidativer Stress und Zelltod führen zur Aktivierung des Immunsystems und Neuroinflammation. Diese kombinierten Faktoren werden gedacht, um zur Entwicklungs- und physiologischen Verletzlichkeit des Gehirns beitragen, und führen zu oder verschlimmern die Enzephalopathie mit schlechten Entwicklungsergebnissen bei Frühgeborenen5,6,7.
Aufgrund der physikalischen und entwicklungsähnlichen Ähnlichkeiten, die das Frettchenhirn mit dem menschlichen Gehirn teilt, ist das Frettchen eine attraktive Spezies, bei der Hirnverletzungen8,9,10,11,12modellieren können. Ferrets sind auch ideale Kandidaten, um das frühgeborene menschliche Gehirn zu modellieren, da sie lissencephalic geboren werden und gyrencephale Gehirne postnatal entwickeln, die ein Fenster bieten, in dem das sich entwickelnde Gehirn Beleidigungen auszusetzen ist, die diejenigen nachahmen, die von Säuglingen erlebt werden, die früh geboren wurden. Bei der Geburt ähnelt die Entwicklung des Frettchen-Gehirns einem 13-wöchigen menschlichen Fötus, wobei postnatale Tagessätze (P) 17 Kits als gleichwertig mit einem Säugling bei 32–36 Wochen Schwangerschaft13angesehen werden.
Unsere Gruppe hat vor kurzem ein Modell für extrem frühfristige (<28 Wochen Schwangerschaft) Hirnverletzung im P10 Frettchen veröffentlicht, indem eine entzündliche Sensibilisierung mit Escherichia coli Lipopolysaccharid (LPS) mit anschließender Exposition gegenüber Hypoxie und Hyperoxia12kombiniert wird. Im folgenden Protokoll beschreiben wir nun ein spätes Frühsprätermmodell im P17-Ferret, bei dem auf die LPS-Sensibilisierung bilaterale zerebrale Ischämie, Hypoxie und Hyperoxia folgt. Dies führt zu schwereren Verletzungen bei einer Teilmenge von Tieren, und genauer modelliert die komplexe Wechselwirkung von längeren Entzündungen, Ischämie, Hypoxie, und oxidativen Stress erlebt in einer Reihe von Frühgeborenen, die Hirnverletzungen entwickeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Die Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und als Teil eines vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Washington genehmigten Protokolls durchgeführt.
1. Vorbereitung und LPS-Administration
HINWEIS: Eine Zeitleiste der Verfahren finden Sie in Abbildung 1.
- Vor dem Eingriff alle chirurgischen Instrumente und chirurgischen Vorhänge versiegeln, sterilisieren und autoklavieren. Bereiten Sie präoperative Medikamente in sterilen Durchstechflaschen vor. Berechnen Sie den Durchfluss, der erforderlich ist, um die Luft in der Hypoxie/Hyperoxia-Kammer in 8–10 min durch das Versuchsgas zu ersetzen.
- Bereiten Sie das Lipopolysaccharid (LPS von E. coli 055:B5) in steriler Kochsaline vor, um eine Konzentration von 1 mg/ml zu ergeben. Entfernen Sie P17 Frettchen-Kits von ihren Jills. Wiegen und nummerieren Sie sie. Randomize Tiere durch Wurf und Sex zu den Kontroll- oder verletzten (oder Behandlungs-)Gruppen.
- Mit einer 300-L-Insulinspritze 3 mg/kg LPS intraperitoneal an Kits in der Verletzungsgruppe und ein entsprechendes Volumen an sterilem Saline-Fahrzeug (3 l/g) zur Kontrolle von Tieren verabreichen.
- Legen Sie die Tiere in einer Kammer in einem Wasserbad bei 37–40 °C, um während der chirurgischen Eingriffe eine Ziel-Rektaltemperatur von 36–37 °C zu halten.
2. Anästhesie
- Während des Eingriffs, kontinuierlich überwachen Temperatur, Atmungsrate, und Herzfrequenz des Tieres.
- Buprenorphin (0,05 mg/kg) 30 min subkutan vor dem chirurgischen Eingriff verabreichen. Induzieren Anästhesie in einer Mischung von 3% Isofluran mit 100% Sauerstoff ausgeglichen. Entfernen Sie das Kit aus der Induktionskammer und legen Sie es auf eine drapierte chirurgische Wasserdecke, die auf 37 °C eingestellt ist. Anästhesie auf den Nasenkegel übertragen und Isofluranspiegel auf 2–3% reduzieren.
3. Chirurgische Vorbereitung
- Mit kleinen Tierknipsern entfernen Sie alle Haare auf dem ventralen Halsbereich. Rasieren Sie in einem rechteckigen Muster mit Sorgfalt, um zu vermeiden, die Haut zu nicken oder Rasiermesser Ausschlag zu erzeugen. Lokalanästhesie mit intradermalen Lidocain (4 mg/kg) und Bupivacain (2,5 mg/kg) auf den rasierten Bereich verabreichen.
- Bereiten Sie den Hals durch abwechselnde Anwendung von Povidon-Jod und 70% Ethanol Peeling mit sterilen Wattestäbchen. Wiederholen Sie das Peeling so, dass Povidon-Jod und 70% Ethanol jeweils 3x abwechselnd aufgetragen werden.
- Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Abwesenheit von Zehen-Pinch-Reflex. Halten Sie das Isofluranniveau auf dem Mindestprozentsatz, der für eine chirurgische Anästhesieebene erforderlich ist. Mit sterilen Einweg-Ausschnitt-Vorhänge, die den Halsbereich aussetzen, drapieren Sie das Tier.
4. Bilaterale Carotis Artery Ligation
- Mit einem einweg #11 Skalpellklinge, machen Sie einen 1,5 cm Mittellinienschnitt in der Mitte des Halses. Mit feinen Hämostaten und gekrümmten Zangen, stumpf nach unten auf die linke Halsschlagader sezieren. Sezieren Sie die Arterie weg vom zugehörigen neurovaskulären Bündel.
- Mit einem Paar gekrümmter feiner Zange, passieren Sie eine Schleife 10 cm Länge der sterilen 5-0 Seidennaht unter der Arterie. Die Naht halbieren. Ligate die Arterie, indem sie beide Längen der Naht sicher binden, so dass mindestens 2 mm zwischen den Knoten. Transect die linke Halsschlagader zwischen den Nähten, wobei darauf geachtet wird, den Nerv intakt zu lassen.
- Wiederholen Sie die Sezierpartie auf der rechten Seite. Reversibel ligate die rechte Halsschlagader mit einer einzigen sterilen 1/8 Zoll Nabelkrawatte. Schließen Sie die Wunde mit chirurgischen Hautclips.
- Lassen Sie das Tier in einem temperaturgeregelten Wasserbad für mindestens 30 min vor Hypoxie erholen.
HINWEIS: Wenn die Arterien nicht vollständig vom Rest des neurovaskulären Bündels isoliert sind, kann eine erhöhte Sterblichkeit vor oder während der späteren Hypoxie beobachtet werden.
5. Sequenzielle Hypoxie, Hyperoxia und Hypoxie
- Während Hypoxie und Hyperoxia die Wasserbadetemperatur nach Bedarf ändern, um die Rektaltemperatur während der Hypoxie bei 37 °C im Sentineltier(n) aufrechtzuerhalten.
- Legen Sie Tiere in der Verletzungsgruppe in eine luftdichte Kammer innerhalb eines Wasserbades. Kontinuierliche Überwachung der Sauerstoffkonzentration in der Kammer sowie der Rektaltemperatur in mindestens einem Sentineltier. Spülen Sie die Kammer mit befeuchtetem 9% Sauerstoff (91% Stickstoff) und halten Sie dann eine Durchflussrate von 3–5 l/min, abhängig von der Kammergröße. Sobald die Sauerstoffkonzentration in der Kammer 9% erreicht hat, weiter für 30 min.
- Nach 30 min die Gasversorgung auf 80% befeuchteten Sauerstoff (20% Stickstoff) umstellen und der Kammer ermöglichen, die Zielkonzentration basierend auf Durchflussrate und Kammergröße zu erreichen. Fahren Sie 30 min Hyperoxia fort. Öffnen Sie die Kammer, damit sie durch Gleichgewicht mit Raumluft schneller normoxia erreichen kann.
- Versiegeln Sie die Kammer und spülen Sie mit 9% befeuchtetem Sauerstoff. Kontinuierliche Überwachung aller Tiere visuell, beachten Sie Tiere, die Bradypnoe zeigen. Sobald die Sauerstoffkonzentration in der Kammer 9% erreicht hat, weiter für 30 min. Wenn die intrahypoxische Mortalität (Atemstillstand) bei einem der Tiere vor dem Ende der 30-min-Periode beobachtet wird, beenden Sie hypoxie sofort.
6. Umkehrung der rechten Carotis Arterie Ligation
- Bringen Sie Tiere in den operationschirurgischen Bereich zurück und induzieren Sie Anästhesie in einer Mischung von 3% Isofluran, die mit 100% Sauerstoff ausgeglichen sind. Anästhesie auf Nasenkegel übertragen und Isofluranspiegel auf 2–3% reduzieren. Entfernen Sie die chirurgischen Wundclips und bereiten Sie den Wundbereich mit Povidon-Jod wieder vor. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Abwesenheit von Zehen-Pinch-Reflex. Halten Sie den Isoflurangehalt auf dem Mindestprozentsatz, der für eine chirurgische Anästhesieebene erforderlich ist. Mit sterilen Einweg-Ausschnitt-Vorhänge, die den Halsbereich aussetzen, drapieren Sie das Tier.
- Identifizieren und binden Sie das Nabelband mit gekrümmten Zangen von der rechten Halsschlagader. Schließen Sie die Wunde mit chirurgischen Hautclips.
7. Recovery und Temperaturmanagement
- Bringen Sie alle Kits für 60 min in ihre Jills zurück, für Diepflege und Genesung. Nach 60 min kehren Sie verletzte Tiere bei 37–40 °C für 6 h in die Wasserbäder zurück und passen die Wassertemperatur nach Bedarf an, um die Rektaltemperatur bei 36–37 °C zu halten. Bringen Sie Kits an ihre Jills zurück.
- Entfernen Sie chirurgische Clips 10–14 Tage nach der Operation (P27–P31).
8. Reflexprüfung
- Führen Sie alle Reflextests täglich von P21–P28 und mindestens 3x pro Woche von P28–P42 durch, während Sie blind gegenüber der Expositions- (oder Behandlungs-)Gruppe bleiben. Vor der Reflexprüfung Kits 1 h in eine Kammer mit Wärmeunterstützung (37 °C Wasserbad, Wärmepolster usw.) stellen. Führen Sie für jeden Test alle Tests pro Kit aus, bevor Sie das nächste Kit testen.
- Negative Geotaxis (25°)
- Legen Sie eine flache Platte (16 1/2 in. x 12 in.) in einem saugfähigen Sitzschutz gegen ein Objekt gewickelt, so dass die Platte einen 25°-Winkel mit dem Tisch bildet. Legen Sie ein Kit auf das Brett anfällig und nach unten, etwa 75% des Weges nach oben das Brett.
- Stellen Sie sicher, dass der Körper des Kits gerade ist und dass alle vier Pfoten gegen das Brett gegriffen sind, bevor Sie es loslassen. Sobald das Kit platziert ist, beginnen Sie mit der Zeitbewertung.
- Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der es dem Kit gelingt, seinen Körper um 90° relativ zu seiner Ausgangsposition zu drehen. Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der das Kit seinen Körper um 180° dreht und einen vollen Schritt in Richtung der Oberseite des Boards macht. Führen Sie 3 Versuche an der 25°-Neigung durch, bevor Sie zum nächsten Test übergehen.
- Negative Geotaxis (45°)
- Führen Sie erneut 3 Versuche des zuvor beschriebenen negativen Geotaxis-Tests durch, diesmal mit einem 45°-Winkel der Platine.
- Klippen-Aversion
- Platzieren Sie eine gepolsterte Plattform etwa 1 Fuß unter der Leiste, um Verletzungen von Kits zu minimieren, wenn sie fallen.
- Platzieren Sie ein Kit nach und senkrecht zum Rand der Laborbank. Stellen Sie sicher, dass der Körper des Kits gerade ist, wobei seine Vorderpfoten bündig mit der Kante sind. Beginnen Sie die Zeitbewertung ab dem Zeitpunkt, an dem das Kit platziert wird. Achten Sie darauf, zwischen bewusster Bewegung weg von der Klippe und anderen spontanen Bewegungen zu unterscheiden, die kein koordiniertes Gehen beinhalten.
- Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der das Kit seinen Körper von der Kante wegbewegt (definiert als das Kit, das den Körper zurückstellt, seinen Körper dreht oder seine vorderen Gliedmaßen von der Kante wegbewegt). Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der das Kit seinen ersten Schritt in entgegengesetzter Richtung der Kante abschließt (definiert als jede Richtung oder ein Winkel, der über eine 90°-Drehung von seiner Startposition nach der Kante hinausgeht).
- Führen Sie 3 Klippenaversionsversuche pro Kit durch, bevor Sie zum nächsten Test übergehen.
- Rechter Reflex
- Legen Sie ein Kit supine auf der Bank, halten Sie es sanft in dieser Position, bevor Sie es loslassen und gleichzeitig die Stoppuhr zu beginnen. Zeichnen Sie die Zeit auf, die sich das Kit mit allen vier Pfoten gleichzeitig flach gegen die Bank in gewichtstragenden Positionen zum Liegen bringt. Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der das Kit einen vollen Schritt in eine beliebige Richtung macht (definiert als die Platzierung aller vier Pfoten, um Fortschritte in einer bestimmten Richtung ohne Drehen oder Ziehen des Körpers zu erzielen).
- Führen Sie 5 Versuche des Rechtsreflextests pro Tier durch.
- Nachdem jeder Satz die 5 richtigen Reflexversuche abgeschlossen hat, geben Sie den Wurf an den Jill zurück.
9. Catwalk-Tests
- Entfernen Sie auf P42 Kits aus dem Jill. Legen Sie Kits ca. 10 min vor dem Testen in Kunststoffkäfige, damit sie sich an die Umwelt anklimatisieren können. Schalten Sie die Lichter im Testraum aus, um sicherzustellen, dass das Umgebungslicht die Laufstegfunktion nicht beeinträchtigt.
- Erstellen Sie ein neues Experiment in der entsprechenden Software. Passen Sie die experimentellen Einstellungen so an, dass die maximale Laufzeit 10,00 s und die minimale Laufzeit nicht weniger als 1,50 s beträgt. Legen Sie die maximale Geschwindigkeitsvariation so fest, dass sie 60 % nicht überschreitet. Legen Sie eine Mindestanforderung von drei konformen Läufen für jedes Tier fest.
- Passen Sie die Breite des Gehwegs relativ zur Größe des Tieres an, so dass es in der Lage ist, frei zu locomote, ohne die Wände zu berühren, während es schmal genug bleibt, um das Abbiegen zu verhindern. Fügen Sie mithilfe der automatischen Erkennung eine neue Erkennungseinstellung auf der Registerkarte Profile für Erkennungseinstellungen hinzu. Verwenden Sie die gleichen Erkennungseinstellungen für alle Würfe und Tiere in einem bestimmten Alter.
- Reinigen Sie den Gehweg vor und nach jedem Tier gründlich mit einem papierarmen Papiergewebe und 70 % Ethanol. Reinigen Sie die Pfoten des Frettchens regelmäßig, um die Genauigkeit der Erkennung und Klassifizierung zu verbessern. Sobald der Gehweg und das Tier vorbereitet sind, beginnen Sie mit dem Erwerb von Versuchen.
- Pause Erwerb, um den Laufsteg zu reinigen, wenn Fußabdrücke auf dem Glas sammeln, oder wenn Tiere Urin oder Kot passieren. Beenden Sie die Erfassung, sobald die Laufsteg-Software drei konforme Runs basierend auf den vorgegebenen Experimenteinstellungen erkannt hat.
10. Offene Feldprüfung (P42)
- Verwenden Sie eine nicht poröse Acrylbox (55 cm x 55 cm x 40 cm hoch) mattweiß lackiert. Positionieren Sie die Kamera so, dass sie direkt über dem Kasten zentriert ist und alle vier Wände erfasst werden. Reinigen Sie die Testarena vor dem ersten Gebrauch und zwischen Tieren mit 70 % Ethanol.
- Wählen Sie in der entsprechenden Software "Neue Vorlage" aus, und wenden Sie eine vordefinierte Vorlagean. Fahren Sie mit dem Einrichtungsverfahren fort, indem Sie sequenziell Dentumstyp: Andere auswählen. Arena-Vorlage: Offenes Feld, Quadrat; Zonenvorlage: Mitte, Rahmen, Ecken; Features zum Nachverfolgen: Mittelpunkt.
- Öffnen Sie die Arena-Einstellungen, und greifen Sie das Hintergrundbild aus dem Kameraeingang, um sicherzustellen, dass die Oberseiten der Arenawände sichtbar sind. Kalibrieren Sie die Abmessungen der Arena mit dem Skalierungswerkzeug.
- Passen Sie die vordefinierten Arenazonen an, indem Sie die Größe der Umrisse an die Wandzonen (NW, NE, SW, SE) und die Bodenzonen (links oben, unten oben, rechts oben, links oben, links in der Mitte, in der Mitte, in der rechten Mitte, links unten, unten, unten unten) anpassen. Überprüfen Sie die Einrichtung, um sicherzustellen, dass sich keine Zonen überlappen.
- Öffnen Sie das Fenster "Erfassung" und drücken Sie "Akquisition starten ". Stellen Sie das Frettchen in die Mitte der Testarena, die für jeden Testgegenstand konsistent ist. Lassen Sie das Frettchen für einen Zeitraum von 5 min frei durch die Arena bewegen. Am Ende des Testzeitraums drücken Sie Stop Acquisition. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem nächsten Frettchen.
HINWEIS: Alle Experimentatoren im Raum sollten sich so positionieren, dass sie vom Frettchen nicht beobachtbar sind und während der Testphase ruhig bleiben.
11. Fixierungsperfusion
- Auf P42, tief anästhesisieren Kits mit 5% Isofluran. Eine Pentobarbital-Überdosierung (120–150 mg/kg i.p.) verabreichen. Sicherstellen einer tiefen Anästhesie durch mangelnde Reaktion auf Zehenstich und Verlust von Atemwegsbewegungen.
- Übertragen Sie das Tier auf eine Dunstabzugshaube. Öffnen Sie den Thorax und klemmen Sie die absteigende Aorta mit feinen Hämostaten. Schneiden Sie das rechte Atrium. Mit einer Perfusionspumpe den linken Ventrikel mit 60 ml steriler Saline bei einer Rate von 30 ml/min durchdringen. Perfuse mit 60 ml Formalin (10% Formaldehyd) mit einer Rate von 30 ml/min.
- Enthaupten Sie den Kadaver, und entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel mit Schere, Zange, Rongeurs und einem Spachtel. Nehmen Sie hochauflösende Fotos der dorsalen, ventralen und lateralen Aspekte jedes Gehirns auf. Post-Fix das Gehirn in Formalin für mindestens 48 h.
12. Ex-Vivo-Gehirnmessung
- Entfernen Sie das Gehirn aus Formalin (Schritt 11.3) und legen Sie es auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen.
- Mit einem elektronischen Bremssattel, messen Sie die Höhe des Gehirns, indem Sie die Spitzen des Bremssattels an den dorsalen und ventralen Aspekten des Gehirns platzieren. Messen Sie die Länge des Gehirns, indem Sie die Spitzen des Bremssattels an der Olfaktor-Lampe und die hintere Grenze des okzipitalen Lappens platzieren. Messen Sie die Breite des Gehirns, indem Sie die Spitzen des Bremssattels auf die meisten seitlichen Teile der zeitlichen Lappen legen. Wiegen Sie das Gehirn.
- Messen Sie die Längsspalte (vordere und hintere bis zum Kreuzbandsulcus), seitliche Sulci, suprasylvian sulci, coronal sulci, pseudosylvian sulci, ansinate sulci, cruciate sulci, presylvian sulci, lateral gyri, suprasylvian gyri, sigmoid gyri ( vorder und hinter), koronaler Gyri, ektosylvian gyri (vorder und hinter) und Orbitalgyri. Messen Sie alle Sulci vom Anfang und Ende des unterschiedlichsten Teils des entsprechenden Sulcus. Messen Sie alle Gyri aus dem breitesten Aspekt jedes entsprechenden Gyrus.
- Messen Sie die Menge des ausgesetzten Kleinhirns, indem Sie eine Spitze des Bremssattels an der hintersten Stelle der Längsspalte platzieren und die andere Spitze des Bremssattels am hintersten Teil des Kleinhirns platzieren.
HINWEIS: Der Frettchen-Hirnatlas, wie er in Biologie und Krankheiten des Ferret14gefunden wurde, wurde verwendet, um die ex vivo Frettchen-Gehirnmessungen zu entwickeln.
13. Brutto-Verletzungs-Scoring
- Wenden Sie anhand der in Schritt 11.3. aufgenommenen Fotos die Bewertungskriterien in den Schritten 13.2–13.4 an, um grobe Hirnverletzungen (0–9-Skala) zu bewerten, während sie blind gegenüber Expositionsgruppen (oder Behandlungsgruppen) bleiben.
- Bewerten Sie die Längsspalte. Wenn es normal erscheint, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu. Wenn es leicht verbreitert ist (ca. 2x normale Breite), aber die Erhöhung der Breite ist unvollständig entlang der Länge der Spalte, weisen Sie eine Punktzahl von 1. Wenn es mäßig erweitert ist (ungefähr 2-3x normal), weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu. Wenn es deutlich verbreitert ist, mit einem sichtbaren Spalt >3x normale Breite entlang der meisten der Länge der Spalte, wenden Sie eine Punktzahl von 3 an.
- Bewerten Sie den lateralen Sulci. Wenn sie eine normale Definition aufweisen, mit Trennung des lateralen Gyri und des suprasylvian gyri, weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu. Wenn eine leichte einseitige oder bilateralreduzierte Definition von Sulcus, insbesondere im kaudalen Teil, mit minimaler Verengung von frontalen und zeitlichen Lappen relativ zu den okzipitalen Lappen beobachtet wird, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu.
- Wenn eine mäßig reduzierte Definition des Sulci beobachtet wird, mit Depression des suprasylvianischen Gyri, Verengung des koronalen und ektolästischen Gyri, und einer leichten Verengung von frontalen und zeitlichen Lappen relativ zu okzipitalen Lappen, weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu. Wenn eine einseitige zystische Degeneration mit minimaler Veränderung der kontralateralen Hemisphäre beobachtet wird, weisen Sie eine Punktzahl von 3 zu. Wenn eine schlechte Definition des lateralen Sulci vorhanden ist, mit bilateraler zystischer oder schwerer Degeneration der okzipitalen und zeitlichen Lappen, weisen Sie eine Punktzahl von 4 zu.
- Bewerten Sie den sichtbaren Teil des Kleinhirns. Wenn es normal erscheint, mit (<75% der Vermis und <66% der Hemisphären sichtbar, weisen Sie eine Punktzahl von 0. Wenn 75–90 % der Vermis und 66 % der Hemisphären sichtbar sind, weisen Sie eine Punktzahl von 1 zu. Wenn der größte Teil des Kleinhirns sichtbar ist und alle Vermis und 66 % der Hemisphären anzeigt, weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu.
14. Datenanalyse
- Weisen Sie bei Reflextestdaten Fehler mit einer Punktzahl von 61 s zu, damit sie mit Erfolgen am Ende der Zeit (60 s) verglichen werden können, jedoch mit einer schlechteren Rangfolge in der statistischen Analyse. Berechnen Sie in jedem der Reflextests eine Fläche unter der Kurve für jedes Tier im Laufe der Zeit.
- Passen Sie Laufstegdaten an, die die Pfotengröße des Drucks durch das Gewicht des Tieres betreffen.
- Analysieren Sie Daten mit nicht-parametrischen statistischen Methoden und beschreiben Sie Daten mithilfe des Median- und Interquartilbereichs (IQR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Von 34 (n = 18 Männchen, n = 16 Weibchen) Tieren aus sechs Wurfen, die der Beleidigung ausgesetzt waren, starben acht Tiere (24%; n = 4 Männchen, n = 4 Weibchen) in der verletzten Gruppe während der zweiten Hypoxieperiode (n = 5), während der Temperaturverwaltung (n = 2) oder über Nacht nach der Beleidigung (n = 1). In der verletzten Gruppe wurden neun von 26 Überlebenden (35%) hatte sichtbare grobe Verletzungen. Fünf Tiere (n = 5 Männchen) hatten mittelschwere Verletzungen, und vier Tiere (n = 2 Männchen, n = 2 Weibchen) hatten schwere Verletzungen, definiert als grobe Pathologiewerte von 2:5 bzw. 6:9(Abbildung 2A). Tiere, die der Beleidigung ausgesetzt sind, haben daher ein 50-prozentiges Sterberisiko oder erhebliche schwere Verletzungen. Mit zunehmender Verletzung wird eine Verengung des Gyri in den zeitlichen und/oder okzipitalen Lappen beobachtet, mit der damit verbundenen Sulkalverkürzung, der Verbreiterung der Längsspalte und großen Bereichen von Bereichen des zystischen Gewebeverlusts bei den schwer verletzten Tieren(Abbildung 2B). Bei überlebenden verletzten Tieren (n = 26; n = 14 Männchen, n = 12 Weibchen) ist eine signifikant größere Exposition des Kleinhirns zu beobachten (Abbildung 3A), sowie eine Verkürzung der Längsspalte (Abbildung 3D). Es gibt auch eine signifikante Verengung des koronalen und vorderen ektosylvian gyri (Abbildung 3B,E), sowie Verkürzung der seitlichen und suprasylvian sulci (Abbildung 3C,F). Das mittlere Hirngewicht (IQR) betrug 8,1 g (7,9–9,7 g, n = 6) bei Kontrolltieren und 7,0 g (6,5–7,7 g) bei verletzten Tieren (n = 26, p = 0,005). Bei Kontrolltieren betrug die mittlere Hirnlänge (IQR) 28,9 mm (27,8–29,6 mm, n = 6) im Vergleich zu 27,5 mm (25,5–38,0 mm, n = 26) bei verletzten Tieren (p = 0,007). Ähnliche Muster sind im gesamten Gehirn zu sehen, mit mittlerer Breite und Höhe 5–7% kleiner bei verletzten Tieren. Anatomische Strukturen auf der linken und rechten Seite sind in ähnlicher Weise betroffen, ohne Unterschied zwischen den Hemisphären. Siehe Abbildung 1B für Darstellungen der anatomischen Positionen. Während des Reflextestzeitraums (P21–P39) zeigen verletzte Tiere eine langsamere Drehzeit in der negativen Geotaxis-Aufgabe(Abbildung 4A),eine langsamere Zeit zum Drehen von der Kante in der Klippenaversion (Abbildung 4B) und eine langsamere Zeit nach rechts(Abbildung 4C). Auf dem Laufsteg haben verletzte Tiere eine ähnliche Durchschnittsgeschwindigkeit wie Kontrollen(Abbildung 5A), weisen aber bei jedem Lauf eine deutlich größere Geschwindigkeitsabweichung auf (Abbildung 5B). Der gewichtsbereinigte Abstand zwischen Vorderpfoten und Hinterpfoten (Druckposition) ist bei verletzten Tieren deutlich größer(Abbildung 5C), wobei pro Pfotenfläche weniger Druck durch die Vorpfoten ausgeübt wird (Abbildung 5D). Im freien Feld legen verletzte Tiere weniger Gesamtdistanz zurück (Abbildung 6A) und halten häufiger an (Abbildung 6B). Sie verbringen deutlich mehr Zeit in der Mitte des Feldes und weniger Zeit in den Ecken (Abbildung 6C,D). Repräsentative Heatmaps von Kontroll- und verletzten Tieren sind in Abbildung 7A,B dargestellt.
Abbildung 1:Zeitleiste. Auf P17 werden den Tieren 3 mg/kg LPS verabreicht, bevor sie sich einer bilateralen Karotisarterienligation und jeweils 30 min (ohne Zeit für die Kammer zum Ausgleich) von Hypoxie (9% Sauerstoff), Hyperoxie (80% Sauerstoff) und Hypoxie (9%) unterziehen. Die rechte Halsschlagader ligation wird dann umgekehrt. Die Tiere sind 6 h Normothermie ausgesetzt, um sicherzustellen, dass sie in der Zeit nach der Verletzung nicht spontan hypothermisch im Nest werden. Reflextests werden dann täglich von P21–P28 und dreimal pro Woche von P28–P42 durchgeführt. Auf P42 werden Tiere auf dem Laufsteg und auf dem offenen Feld vor dem Opfern getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Verletzungsverteilung und -darstellung. (A) Bruttoverletzung siert von 26 Überlebenden (n = 14 Männer, n = 12 Frauen) in der verletzten Gruppe, verglichen mit sechs Wurfpaarkontrollen. Fünf Tiere (n = 5 Männchen) hatten mittelschwere Verletzungen, und vier Tiere (n = 2 Männchen, n = 2 Weibchen) hatten schwere Verletzungen, definiert als grobe Pathologiewerte von 2:5 bzw. 6:9. Graph zeigt median mit interquartiler Reichweite. (B) Steuern Sie das Gehirn (linkes Panel, Punktzahl 0), mit Gehirnen, die steigende Bruttoverletzungswerte von 2, 5 und 8 von einer möglichen Gesamtpunktzahl von 9 von links nach rechts darstellen. Das Kontrollhirn zeigt anatomische Strukturen, die besonders anfällig für Verletzungen sind; 1 = Längsspalte, 2 = seitlicher Sulcus, 3 = suprasylvian sulfus, a = koronaler Gyrus, b = anteriorer ektosilvian gyrus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Hirnmessungen. Im Vergleich zu Kontrollen (n = 6) zeigen verletzte Tiere (n = 26) eine signifikant erhöhte Exposition des Kleinhirns (A), verkürzung der Längsspalte (D), Verengung des koronalen (B) und vorderen ektosylvian (E) Gyri, und Verkürzung des lateralen (C) und suprasylvian (F) Sulci. Graphen zeigen median mit Interquartilbereich. *bezeichnet p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Repräsentative Reflexentwicklung. Im Vergleich zu Kontrollen (n = 6) zeigen verletzte Tiere (n = 26) eine langsamere Entwicklung (Fläche unter der Kurve, AUC) negativer Geotaxis (A), Klippenaversion (B) und Rechtsreflex (C). Graphen zeigen median mit Interquartilbereich. *bezeichnet p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Laufstegergebnisse. Im Vergleich zu Kontrollen (n = 6) gehen verletzte Tiere (n = 26) mit einem ähnlichen Durchschnittstempo (A), aber mit einer größeren Geschwindigkeitsvariabilität beim Gehen (B). Verletzte Tiere zeigen auch eine längere durchschnittliche Druckposition (C), mit weniger Druck pro Flächeneinheit (D). Graphen zeigen median mit Interquartilbereich. * bezeichnet p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6:Repräsentatives Verhalten im offenen Feld. Im Vergleich zu Kontrollen (n = 6) legen verletzte Tiere (n = 26) eine kleinere Gesamtstrecke (A) zurück und halten häufiger an (B). Verletzte Tiere verbringen auch mehr Zeit im Zentrum (C) als in den Ecken (D). Graphen zeigen median mit Interquartilbereich. *bezeichnet p < 0.05 (Wilcoxon-Mann-Whitney U-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Repräsentative Offene Feld-Wärmekarten. (A) Kontrollweibchen, (B) verletztes Weibchen. Verletzte Tiere legen im freien Feld einen deutlich kleineren Abstand zurück. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aufgrund der physikalischen und entwicklungsähnlichen Ähnlichkeiten zwischen dem Frettchen-Gehirn und dem menschlichen Gehirn wird das Frettchen zunehmend verwendet, um sowohl Erwachsene als auch Entwicklungsverletzungen zu modellieren. 8,9,10,11,12. Die bisherigen Untersuchungen deuten jedoch darauf hin, dass das Frettchenhirn sowohl resistent gegen anfängliche Verletzungen als auch hochplastisch ist, wobei die Verhaltensdefizite im Laufe der Zeit sogar bei der Einstellung sichtbarer pathologischer Verletzungen abnehmen10,12. Hier beschreiben wir das erste Modell der entzündungssensionierten hypoxisch-ischämischen (HI) Hirnverletzung im späten frühäquivalenten Frettchen, was zu erheblichen bilateralen Verletzungen und anhaltenden Verhaltensdefiziten bei Überlebenden führt. Wie bei jedem präklinischen Modell bestand das Ziel nicht darin, die Expositionen von Frühgeborenen klinisch genau zu reproduzieren, sondern einen Zusammenfluss der mechanistischen Faktoren zu liefern, von denen angenommen wird, dass sie an vorzeitigen Hirnverletzungen beteiligt sind. Dazu gehören Entzündungen, Hypoxie und oxidativer Stress7.
Ein kritischer Aspekt der LPS-Administration in unseren Frettchenmodellen ist eine einzelne hohe Dosis, die etwa 4 h vor Hypoxie verabreicht wird. LPS-Exposition bei kurzfristig äquivalenten Nagetieren führt zu einem zirkulierenden entzündlichen Zytokin-Peak um 4 h nach der Exposition, was einer Sensibilisierung des Gehirns für Hypoxia-Ischämie und einer signifikanten Zunahme der Hirnverletzung15,16,17entspricht. Ein ähnlicher Zeitverlauf der entzündlichen Zytokinfreisetzung (Peak TNF-- und IL-6-Freisetzung 2–4 h nach LPS-Exposition) wird in isolierten frettigen peripheren mononukleären Blutzellen18beobachtet. Unter der Annahme eines einzigen chirurgischen Aufbaus ermöglicht die Verabreichung von LPS 30–60 min vor Beginn der Operation eine ausreichende Zeit, um 12–15 bilaterale Karotisarterien-Ligationen durchzuführen und die erste Hypoxie-Exposition 4 h nach LPS-Verabreichung einzuleiten. Während der Modellentwicklung wurde zunächst eine LPS-Dosis von 5 mg/kg verwendet, wie in unserem P10-Verletzungsmodell12beschrieben. Diese LPS-Dosis war jedoch mit einer signifikanten intrahypoxischen Mortalität und einem Lungenödem bei Nekropsie verbunden. Sowohl die Sterblichkeit als auch das Lungenödem wurden reduziert, indem die LPS-Dosis auf 3 mg/kg gesenkt wurde.
Während der Hypoxie-Exposition scheinen eine Reihe von Faktoren entscheidend zu sein, um eine signifikante Bruttoverletzung zu gewährleisten und gleichzeitig eine hohe Sterblichkeit zu verhindern. Da Laborfrettchen ausgezüchtet werden, gibt es eine inhärente Variabilität der Hypoxietoleranz über Würfe hinweg. Nach unserer Erfahrung führt die Querpflege oder die Kombination von Tieren aus verschiedenen Würfen in derselben Hypoxiekammer überwiegend zum früheren Tod größerer Tiere oder Tiere aus dem anfälligsten Wurf. Wenn anfälligere Tiere sterben, bevor die 30 min Hypoxie-Exposition und Hypoxie frühzeitig gestoppt werden, werden kleinere Tiere aus weniger anfälligen Würfen eine suboptimale Hypoxie-Exposition erhalten und es unwahrscheinlich sein, dass sie signifikante Verletzungen erleiden. Daher sollte jeder Wurf von Tieren in seiner eigenen Kammer Hypoxie ausgesetzt werden. Die zweite Hypoxieperiode wurde als Teil eines iterativen Modellentwicklungsprozesses hinzugefügt, den wir zuvor12beschrieben haben. Eine einzelne Hypoxie-Periode führte entweder zum Tod oder zum Überleben ohne signifikante Verletzungen, unabhängig von der Länge.
Da Frettchen in der Lage sind, lange Perioden akuter Hypoxie oder bilateraler Karotisarterienligation zu tolerieren, ohne eine signifikante Hirnverletzung zu zeigen, ist unsere aktuelle Hypothese, dass die Periode der Hyperoxie zu einem erhöhten Stoffwechsel und einer Vasodilatatation führt, die Hirnischämie während der zweiten Hypoxie-Periode. Um die Variabilität des Modells zu minimieren, verwendeten wir vorbestellte geschlechtssymmetrische Würfe von 8 Frettchen, die in unserer Anlage auf P15 ankamen. In jedem Wurf wurden 6–7 Tiere operiert, gefolgt von Hypoxie in einer einzigen Kammer.
Nach Hypoxie und Umkehrung der rechten Karotisarterienligation sollten die Tiere aufgrund des Risikos von Dehydrierung und Hypoglykämie aus dem längeren Verletzungsprotokoll für einen bestimmten Zeitraum an ihre Jills zurückgegeben werden, um sich zu ernähren. Wenn während des Temperaturmanagementzeitraums eine signifikante Sterblichkeit zu verzeichnen ist, benötigen die Tiere möglicherweise eine zusätzliche Flüssigkeitsreanimation (subkutane Salz- und/oder Handfütterung mit Formel und Wasser), bevor sie 6 h in die Wasserbäder gebracht werden. Die Temperaturmanagementperiode ist jedoch eine entscheidende Determinante für Langzeitverletzungen, da Tiere sonst Neuroprotektion durch relative Unterkühlung im Nest erfahren können. Dieses Risiko der Unterkühlung ist zumindest teilweise auf die niedrige Temperatur der Gehäusebedingungen zurückzuführen, die für das Frettchen erforderlich sind (60–70 °F).
Die beschriebenen Verhaltenstests wurden weitgehend im Labor entwickelt, mit einer gewissen Grundlage in Reflextests, die zuvor im sich entwickelnden Frettchen19beschrieben wurden, mit Laufsteg- und Freifeldtests, die von erwachsenen Nagetieren angepasst wurden, um in junglichen Frettchen verwendet zu werden. Andere Gruppen haben auch open field, labyrinth, und Gangtests in erwachsenen Frettchen nach traumatischen Hirnverletzungenbeschrieben 10, sowie die Wirkung von in utero Entzündung auf soziale Interaktion bei erwachsenen Frettchen20. Obwohl eine lange Fastenzeit bei Frettchen aufgrund ihrer kurzen Darmtransitzeit nicht empfohlen wird, ist es vorteilhaft, sie für 30–60 min in einen Tiertransporter zu legen, bevor einer der Tests von Vorteil ist, damit sie Vorderwaren Urin und Kot passieren können. Da das Frettchen von Natur aus ein wissbegieriges Tier ist, verhält es sich bei diesen Verhaltenstests oft anders als Nagetiere. Besonders deutlich wird dies auf dem Laufsteg, wo Lichter und Klänge, insbesondere Aufnahmen eines anderen Frettchen-Gesangs ("dooking"), verwendet werden können, um das Frettchen zum Vorwärtsgehen zu motivieren.
Das aktuelle Protokoll hat einige Einschränkungen. Da es iterativ mit zuvor entwickelten Methoden im P10 Frettchen12entwickelt wurde, kennen wir derzeit nicht die relativen Beiträge von LPS, Hypoxie, Hyperoxia und Reperfusion zum letzten Grad der Verletzung gesehen. Es ist jedoch erwähnenswert, dass die Entwicklung der hier beschriebenen Methode die Verwendung des ursprünglichen Vannucci-Modells (einseitige Karotisarterienligation gefolgt von einer einzigen Hypoxie- Periode) im Frettchen21umfasste, was zu keiner nennenswerten Schädigung geführt hat. Daher sind Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Teilen des Verletzungsprotokolls wahrscheinlich für eine anhaltende Verletzung erforderlich. Dennoch bleibt eine deutliche Variabilität der Grobverletzungen bei überlebenden Tieren, was eine weitere potenzielle Einschränkung darstellt. Obwohl Tiere ohne signifikante grobe Verletzung Verletzungen haben können, die mit MRT oder Histopathologie12nachweisbar sind, werden zukünftige Arbeiten an dem Modell Iterationen umfassen, um zu versuchen, die Anzahl der Tiere zu erhöhen, die erhebliche Verletzungen erleiden, zum Beispiel durch die Verwendung permanenter bilateraler Karotisarterienligation. Schließlich sollte dieses Modell, damit es maximal nützlich ist, um vermeintliche neuroprotektive Therapien für entwicklungsfördernde Hirnverletzungen zu testen, durch die Beurteilung der Wirksamkeit neuroprotektiver Wirkstoffe validiert werden, die entweder für die Behandlung von HI-Hirnverletzungen bei menschlichen Neugeborenen etabliert sind oder in einer Reihe anderer Tiermodelle neonataler Hirnverletzungen erfolgreich waren. Zukünftige Studien werden daher die Wirksamkeit von therapeutischer Hypothermie und Erythropoietin in diesem Modell bewerten, einschließlich geschlechtsbasierter therapeutischer Reaktionen und ex vivo MRT12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Entwicklung des Modells wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation sowie vom NIH-Zuschuss 5R21NS093154-02 (NICHD) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 80% Oxygen | Praxair | ||
| 9% Oxygen | Praxair | ||
| Absorbent benchtop protector | Kimtech | 7546 | |
| Automated catwalk | Noldus | ||
| Betadine surgical scrub | |||
| Bupivacaine | Patterson Veterinary | 07-888-9382 | |
| Buprenorphine | |||
| Calipers | SRA Measurement Products | ME-CAL-FP-200 | 200 mm range, 0.01 mm resolution |
| Cotton Gauze Sponge | Fisher Scientific | 22028556 | |
| Curved fine hemostat | Roboz | RS-7101 | |
| Curved forceps | World Precision Instruments | 501215 | |
| Curved suture-tying hemostat | Roboz | RS-7111 | |
| Ethovision tracking software | Noldus | ||
| Eye Lubricant | Rugby | NDC 0536-1970-72 | |
| Ferrets (Mustela putorius furo) | Marshall Biosciences | Outbred (no specific strain) | |
| Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% (Phosphate Buffer/Certified) |
| Hair Clippers | Conair | GMT175N | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | 0.3 cc 3 mm 31 G |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Lidocaine | Patterson Veterinary | 07-808-8202 | |
| LPS | List Biological | LPS Ultrapure #423 | |
| Oxygen sensor | BW Gas Alert | GAXT-X-DL-2 | |
| Pentobarbital | |||
| Plastic chamber | Tellfresh | 1960 | 10 L; 373 x 270 x 135 mm3 |
| Saline Solution, 0.9% | Hospira | RL-4492 | |
| Scalpel blade | Integra Miltex | 297 | |
| Scalpel handle | World Precision Instruments | 500236 | #3, 13 cm |
| Sterile suture | Fine Science Tools | 18020-50 | Braided Silk, 5/0 |
| Surgical clip applicator | Fine Science Tools | 12020-09 | |
| Surgical clip remover | Fine Science Tools | 12023-00 | |
| Surgical drapes | Medline Unidrape | VET3000 | |
| Surgical gloves | Ansell Perry Inc | 5785004 | |
| Surigical clips | Fine Science Tools | 12022-09 | |
| Thermometer (rectal) | YSI | Precision 4000A | |
| Thermometer (water) | Fisher Scientific | 14-648-26 | |
| Umbilical tape | Grafco | 3031 | Sterile |
| Water bath | Thermo Scientific | TSCOL19 | 19 L |
References
- Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
- Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm infants in Belgium. Pediatrics. 114 (3), 663-675 (2004).
- Raju, T. N., et al. Long-Term Healthcare Outcomes of Preterm Birth: An Executive Summary of a Conference Sponsored by the National Institutes of Health. Journal of Pediatrics. , (2016).
- Raju, T. N. K., Buist, A. S., Blaisdell, C. J., Moxey-Mims, M., Saigal, S. Adults born preterm: a review of general health and system-specific outcomes. Acta Paediatrica. 106 (9), 1409-1437 (2017).
- Bennet, L., et al. Chronic inflammation and impaired development of the preterm brain. Journal of Reproductive Immunology. 125, 45-55 (2018).
- Reich, B., Hoeber, D., Bendix, I., Felderhoff-Mueser, U. Hyperoxia and the Immature Brain. Developmental Neuroscience. 38 (5), 311-330 (2016).
- Galinsky, R., et al. Complex interactions between hypoxia-ischemia and inflammation in preterm brain injury. Developmental Medicine & Child Neurology. 60 (2), 126-133 (2018).
- Empie, K., Rangarajan, V., Juul, S. E. Is the ferret a suitable species for studying perinatal brain injury. International Journal of Developlemental Neuroscience. 45, 2-10 (2015).
- Snyder, J. M., et al. Ontogeny of white matter, toll-like receptor expression, and motor skills in the neonatal ferret. International Journal of Developlemental Neuroscience. , (2018).
- Schwerin, S. C., et al. Progression of histopathological and behavioral abnormalities following mild traumatic brain injury in the male ferret. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 556-572 (2018).
- Rafaels, K. A., et al. Brain injury risk from primary blast. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 73 (4), 895-901 (2012).
- Wood, T., et al. A Ferret Model of Encephalopathy of Prematurity. Developlemental Neuroscience. , (2019).
- Barnette, A. R., et al. Characterization of Brain Development in the Ferret via Magnetic Resonance Imaging. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
- Kroenke, C. D., Mills, B. D., Olavarria, J. F., Neil, J. J. Biology and Diseases of the Ferret. , WIley. (2014).
- Eklind, S., et al. Bacterial endotoxin sensitizes the immature brain to hypoxic--ischaemic injury. European Journal of Neuroscience. 13 (6), 1101-1106 (2001).
- Falck, M., et al. Neonatal Systemic Inflammation Induces Inflammatory Reactions and Brain Apoptosis in a Pathogen-Specific Manner. Neonatology. 113 (3), 212-220 (2018).
- Osredkar, D., et al. Hypothermia Does Not Reverse Cellular Responses Caused by Lipopolysaccharide in Neonatal Hypoxic-Ischaemic Brain Injury. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 390-397 (2015).
- Nakata, M., Itou, T., Sakai, T. Quantitative analysis of inflammatory cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of the ferret (Mustela putorius furo) using real-time PCR. Veterinary Immunology and Immunopathology. 130 (1-2), 88-91 (2009).
- Christensson, M., Garwicz, M. Time course of postnatal motor development in ferrets: ontogenetic and comparative perspectives. Behavioral Brain Research. 158 (2), 231-242 (2005).
- Li, Y., Dugyala, S. R., Ptacek, T. S., Gilmore, J. H., Frohlich, F. Maternal Immune Activation Alters Adult Behavior, Gut Microbiome and Juvenile Brain Oscillations in Ferrets. eNeuro. 5 (5), (2018).
- Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurolology. 9 (2), 131-141 (1981).
