Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En oppspore modell av betennelse-sensibilisert late premature hypoxic-iskemiske hjerneskade

Published: November 19, 2019 doi: 10.3791/60131

Summary

Metoden beskriver betennelse-sensibilisert hypoxic-iskemiske og hyperoxic hjerneskade i P17 Ferret å modellere komplekse samspillet mellom langvarig betennelse og oksidativt hjerneskade oppleves i en rekke sene premature spedbarn.

Abstract

Det er et pågående behov for klinisk relevante modeller av Perinatal infeksjon og hypoksi-iskemi (HI) der for å teste terapeutiske intervensjoner for spedbarn med nevrologiske sequela av prematurity. Oppspore er ideal søkerne for modellering det premature Human hjerne, idet de er født lissencephalic og utvikle gyrencephalic hjerne fødselen. For fødselen, oppspore hjerne utviklingen er analog med en 13 uke Human Foster, med postnatal-dag (pencen) 17 kits betraktet som å bli ekvivalent å en spedbarn for 32 – 36 ukens ' svangerskapet. Vi beskrive en skaden modell inne det P17 oppspore, der hvor lipopolysakkarid administrasjon er føle etter av bilateral cerebral iskemi, hypoksi, og hyperoxia. Dette simulerer kompleks interaksjon av langvarig betennelse, iskemi, hypoksi, og oksidativt stress oppleves i en rekke nyfødte som utvikler hjerneskade. Skadde dyr viser en rekke brutto skade alvorlighetsgrad, med morfologiske endringer i hjernen, inkludert innsnevring av flere kortikale Gyri og tilhørende sulci. Skadde dyr viser også redusert refleks utvikling, tregere og mer variabel hastighet på bevegelse i en automatisert catwalk, og redusert leting i et åpent felt. Denne modellen gir en plattform for å teste antatte behandling for spedbarn med nyfødt encefalopati forbundet med betennelser og HI, studere mekanismer for skade som påvirker kortikale utvikling, og undersøke trasé som gir elastisitet i upåvirket dyr.

Introduction

Det er et pågående behov for store dyremodeller som reflekterer patofysiologi av prematurity og Perinatal hypoksi-iskemi der terapeutiske intervensjoner for spedbarn kan testes. I 2017 ble 9,93% av de 382 726 spedbarn født i USA født premature, og 84% av disse spedbarna ble født mellom 32 og 36 uker av svangerskapet1. Hos premature spedbarn, Perinatal eksponering for infeksjon eller betennelse er vanlig, der mors immun aktivering på grunn av viral eller bakterielle patogener kan initiere premature arbeidskraft. Fødselen, premature spedbarn har høy risiko for tidlig eller sen utbruddet sepsis2. Premature spedbarn også ofte opplever perioder med hypoksi, hypotensjon, og hyperoxia på grunn av deres umodne cardiorespiratory system, forhøyet oksygen spenninger i atmosfæren i forhold til de som oppleves i Utero, og iatrogenic eksponeringer. I tillegg, i premature spedbarn, antioksidant forsvar er umodne3 og Pro-apoptotisk faktorer er naturlig upregulated4. Oksidativt stress og celle død fører til aktivering av immunsystemet og nevroinflammasjon. Disse kombinerte faktorene antas å bidra til utviklingsmessige og fysiologiske sårbarhet i hjernen, og føre til eller forverre encefalopati forbundet med dårlige utviklingsmessige utfall i premature spedbarn5,6,7.

På grunn av det fysisk og utviklingen likheter det det oppspore hjerne aksjer med det Human hjerne, det oppspore er en attraktiv Art i hvilket å modell hjerne skaden8,9,10,11,12. Oppspore er likeledes ideal søkerne å modell det premature Human hjerne, idet de er født lissencephalic og utvikle gyrencephalic hjerne fødselen, hvilke skaffer en vindu i hvilket å avsløre det utvikler hjerne å krenke det etterligne dem erfaring av spedbarn født premature. For fødselen, oppspore hjerne utviklingen er analog med en 13 uke Human Foster, med postnatal-dag (pencen) 17 kits betraktet som å bli ekvivalent å en spedbarn for 32 – 36 ukens av svangerskapet13.

Vår gruppe har nylig publisert en modell av ekstremt premature (< 28 ukers svangerskap) hjerneskade i P10 Ferret ved å kombinere inflammatorisk allergi med Escherichia COLI lipopolysakkarid (LPS) med påfølgende eksponering for hypoksi og hyperoxia12. Inne det fulgte protokollen, vi nå beskrive en sen tidlig premature modell inne det P17 oppspore, der hvor LPS allergi er føle etter av bilateral cerebral iskemi, hypoksi, og hyperoxia. Dette resulterer i mer alvorlig skade i en undergruppe av dyr, og nærmere modeller den komplekse samspillet av langvarig betennelse, iskemi, hypoksi, og oksidativt stress oppleves i en rekke premature spedbarn som utvikler hjerneskade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Prosedyrer ble utført i samsvar med NIH guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr og som en del av en godkjent protokoll ved University of Washington institusjonelle Animal Care og use Committee.

1. forberedelse og LPS administrasjon

Merk: Se figur 1 for en tidslinje for prosedyrene.

  1. Før du starter prosedyren, forsegle, sterilisere og autoklav alle kirurgiske instrumenter og kirurgiske forheng. Forbered pre-operative medisiner i sterile hetteglass. Beregn strømningshastigheten som kreves for å erstatte luften i hypoksi/hyperoxia kammeret med den eksperimentelle gassen i 8 – 10 min.
  2. Klargjør lipopolysakkarid (LPS fra E. coli 055: B5) i sterilt saltvann for å produsere en konsentrasjon på 1 mg/ml. Fjerne P17 oppspore kits fra deres Jills. Veie og nummerere dem. Tilfeldig dyrene av søppel og kjønn å kontrollen eller skadet (eller handling) holdene.
  3. Ved hjelp av en 300 μL insulinsprøyte, administreres 3 mg/kg LPS-intraperitonealt til settene i skade gruppen, og et tilsvarende volum av sterilt saltvanns kjøretøy (3 μL/g) for å kontrollere dyr.
  4. Plasser dyr i et kammer i et vannbad ved 37 – 40 ° c for å opprettholde en mål rektal temperatur på 36 – 37 ° c gjennom kirurgiske prosedyrer.

2. anestesi

  1. Under prosedyren, kontinuerlig overvåke temperatur, åndedrett rate, og hjertefrekvensen av dyret.
  2. Administrering av buprenorfin (0,05 mg/kg) subkutant 30 min før kirurgisk inngrep. Indusere anestesi i en blanding av 3% isoflurane balansert med 100% oksygen. Fjern settet fra induksjon kammeret og plasser det liggende på et drapert kirurgisk vann teppe satt til 37 ° c. Overfør anestesi til nesen kjegle og redusere isoflurane nivå til 2-3%.

3. kirurgisk forberedelse

  1. Benytter liten dyr avklipt fjerne alle håret på ventrale halsområde. Barbering i et rektangulært mønster med omhu for å unngå skår av huden eller generering av barberhøvel. Administrer lokal bedøvelse til det barberte området ved hjelp av intradermal lidokain (4 mg/kg) og bupivakain (2,5 mg/kg).
  2. Forbered nakken ved vekslende påføring av povidon-jod og 70% etanol skrubb med sterile bomullspinner. Gjenta scrub slik at povidon-jod og 70% etanol er hver påføres 3x i vekslende mote.
  3. Bekreft dybden av anestesi via fravær av toe-klype refleks. Opprettholde nivået av isoflurane på den minste prosentandelen som kreves for et kirurgisk fly av anestesi. Ved hjelp av sterile en gangs cut-out forheng som utsetter nakken regionen, gardiner dyret.

4. bilateral hals puls ligation

  1. Med en enkelt-bruk #11 skalpell blad, lage en 1,5 cm midtlinjen snitt i midten av nakken. Bruke fine hemostats og buet tang, rett ut analysere ned til venstre hals puls arterien. Analysere arterien bort fra den tilknyttede nevrovaskulære bunt.
  2. Ved hjelp av et par buede fine tang, passerer en løkker 10 cm lengde på sterile 5-0 silke Sutur under arterien. Skjær Sutur i to. Ombinde arterien ved å binde begge lengdene av Sutur på en sikker måte, og etterlater minst 2 mm mellom knop. Kontinuerlig den venstre halspulsåren mellom sting, ta vare å forlate nerve intakt.
  3. Gjenta disseksjon på høyre side. Reverserbart ombinde høyre hals puls arterie med en enkelt steril 1/8 tommer navle slips. Lukk såret med kirurgiske hud klips.
  4. La dyret til å gjenopprette i en temperatur-kontrollerte vannbad i minst 30 min før hypoksi.
    Merk: Hvis arteriene ikke er helt isolert fra resten av nevrovaskulære bunt, økt dødelighet kan sees før eller under senere hypoksi.

5. sekvensiell hypoksi, Hyperoxia og hypoksi

  1. Under hypoksi og hyperoxia, endre vannbad temperatur som nødvendig for å opprettholde rektal temperatur under hypoksi ved 37 ° c i Sentinel dyr (s).
  2. Plasser dyr i skade gruppen i et lufttett kammer i et vannbad. Kontinuerlig overvåke oksygen konsentrasjon i kammeret, samt rektal temperatur i minst ett Sentinel dyr. Skyll kammeret med fuktet 9% oksygen (91% nitrogen) og opprettholde en strømningshastighet på 3 – 5 L/min, avhengig av kammer størrelse. Når konsentrasjonen av oksygen i kammeret har nådd 9%, fortsetter i 30 min.
  3. Etter 30 min, bytte gasstilførsel til 80% fuktet oksygen (20% nitrogen), og la kammeret for å nå målet konsentrasjon basert på strømningshastighet og kammer størrelse. Fortsett i 30 minutter av hyperoxia. Åpne kammeret slik at det raskere nå normoxia av equilibrating med rom luft.
  4. Forsegle kammeret, og skyll med 9% fuktet oksygen. Kontinuerlig overvåke alle dyrene visuelt, ta note av dyr som viser bradypnea. Når konsentrasjonen av oksygen i kammeret har nådd 9%, fortsetter i 30 min. Hvis intra-hypoxic dødelighet (åndedretts arrest) i noen av dyrene er sett før slutten av 30 min periode, avslutte hypoksi umiddelbart.

6. reversering av høyre hals puls arterie ligation

  1. Returner dyr til operasjonsområdet, og indusere anestesi i en blanding av 3% isoflurane balansert med 100% oksygen. Overfør anestesi til nese kjegle og Reduser isoflurane nivå til 2 – 3%. Fjern kirurgiske sår klippene og re-forberede sårområdet med povidon-jod. Bekreft dybden av anestesi via fravær av toe-klype refleks. Opprettholde nivået av isoflurane på den minste prosentandelen som kreves for et kirurgisk fly av anestesi. Ved hjelp av sterile en gangs cut-out forheng som utsetter nakken regionen, gardiner dyret.
  2. Ved hjelp av buet tang, identifisere og løse navle tapen fra høyre hals puls arterien. Lukk såret med kirurgiske hud klips.

7. gjenoppretting og temperaturstyring

  1. Returner alle settene til Jills deres for 60 min, for sykepleie og gjenvinning. Etter 60 min, returner skadde dyr til vann badene ved 37 – 40 ° c i 6 timer, og Juster vanntemperaturen etter behov for å opprettholde rektal temperatur ved 36 – 37 ° c. Return kits til deres Jills.
  2. Fjern kirurgiske klipp 10-14 dager etter operasjonen (P27 – P31).

8. refleks testing

  1. Utføre alle refleks tester daglig fra P21-P28, og minst 3x per uke fra P28-P42, mens resterende blindet til eksponering (eller behandling) gruppe. Før refleks testing, plassere kits i et kammer med varme assistanse (37 ° c vannbad, varme pad, etc.) for 1 t. For hver test fullfører du alle forsøkene per sett før du tester neste sett.
  2. Negativ geotaxis (25 °)
    1. Plasser et flatt bord (16 1/2 i. x 12 i.) innpakket i en absorberende stasjonære beskytter mot et objekt, slik at styret danner en 25 ° vinkel med bordet. Plasser et sett på brettet liggende og vendt nedover, ca 75% av veien opp brettet.
    2. Pass på at det er rett og at den har alle fire poter grep mot brettet før den slippes. Så snart settet er plassert, starter du tids vurderingen.
    3. Ta opp tiden når settet klarer å rotere kroppen 90 ° i forhold til startposisjonen. Ta opp tiden hvor settet roterer kroppen 180 ° og tar et helt skritt mot toppen av brettet. Utfør 3 forsøk ved 25 ° stigning før du går videre til neste test.
  3. Negativ geotaxis (45 °)
    1. Utfør tre forsøk av den tidligere beskrevne negative geotaxis test igjen, denne gangen med styret satt til en 45 ° vinkel.
  4. Cliff aversjon
    1. Plasser en polstret plattform rundt 1 fot under kanten for å minimere skade på settene hvis de faller.
    2. Plasser et kit vendt, og vinkelrett på, kanten av lab benken. Sørg for at kroppen til utstyret er rett, med front bena i flukt med kanten. Starttid vurdering fra det øyeblikket settet er plassert. Pass på å skille mellom bevisst bevegelse bort fra klippen og andre spontane bevegelser som ikke involverer koordinert walking.
    3. Ta opp tiden når settet beveger kroppen bort fra kanten (definert som settet sikkerhetskopiere, snu kroppen, eller flytte foran lemmer bort fra kanten). Registrere tiden settet fullfører sitt første skritt i motsatt retning av kanten (definert som en hvilken som helst retning eller vinkel forbi en 90 ° rotasjon fra startposisjonen vendt mot kanten).
    4. Utfør 3 Cliff aversjon forsøk per Kit før du flytter til neste test.
  5. Rettende refleks
    1. Plasser et kit liggende på benken, holder den forsiktig i den posisjonen før du slipper den og samtidig begynner stoppeklokken. Ta opp tiden som settet gir seg til å hvile med alle fire poter samtidig flatt mot benken i vektbærende posisjoner. Ta opp tiden når settet tar en full skritt i alle retninger (definert som plassering av alle fire poter for å oppnå fremgang i en gitt retning uten spinning eller dra av kroppen).
    2. Utfør 5 forsøk med rettende refleks test per dyr.
    3. Etter at hver pakke har fullført 5 rettende refleks forsøk, returnere kullet til Jill.

9. catwalk testing

  1. På P42, fjerne kits fra Jill. Plasser kits i plast bur ca 10 min før testing, slik at de kan acclimate til miljøet. Slå av lysene i testrommet for å sikre at omgivelseslyset ikke påvirker catwalk-funksjonen.
  2. Opprett et nytt eksperiment i den aktuelle programvaren. Juster eksperimentelle innstillinger slik at maksimal kjøre varighet ikke overstiger 10,00 s og minimum kjøre varighet er ikke mindre enn 1,50 s. Angi maksimal hastighet variasjon slik at den ikke overstiger 60%. Angi et minimumskrav for tre kompatible kjøringer for hvert dyr.
  3. Juster bredden på gangvei i forhold til størrelsen på dyret, slik at det er i stand til å fritt locomote uten å berøre veggene mens resterende smal nok til å motvirke snu. Legg til en ny gjenkjennings innstilling i fanen profiler for registreringsinnstillinger ved hjelp av automatisk registrering. Bruk de samme deteksjons innstillingene for alle kull og dyr i en gitt alder.
  4. Rengjør gangvei grundig med lav lo papir vev og 70% etanol før og etter hvert dyr. Feilfri det oppspore ' paws regelmessig å gjøre bedre nøyaktighet av oppdagelsen og klassifisering. Når gangvei og dyr er forberedt, begynner rettssaken oppkjøpet.
  5. Pause oppkjøpet å rengjøre catwalk hvis overføringene akkumuleres på glasset, eller hvis dyr passerer urin eller avføring. Stopp oppkjøpet når catwalk-programvaren har gjenkjent tre kompatible kjøringer basert på de forhåndsbestemte eksperimentinnstillingene.

10. åpne felt testing (P42)

  1. Bruk en ikke-porøs akryl boks (55 cm x 55 cm x 40 cm høy) malt Matt-hvit. Plasser kameraet slik at det er sentrert direkte over boksen, og alle fire veggene er fanget. Rengjør test arenaen med 70% etanol før første gangs bruk og mellom dyr.
  2. Velg ny fra mal i den aktuelle programvaren, og Bruk en forhåndsdefinert mal. Fortsett oppsettprosedyren ved å velge Emne typei rekkefølge: annet; Arena mal: åpne felt, firkant; Sone mal: Center, Border, hjørner; Funksjoner som skal spores: midtpunkt.
  3. Åpne Arena innstillinger og grip bakgrunnsbildet fra kameraet input, og pass på at toppen av arenaen veggene er synlige. Kalibrer dimensjonene på arenaen ved hjelp av skaleringsverktøyet.
  4. Juster de forhåndsdefinerte Arena sonene ved å endre størrelsen på konturene slik at de passer til vegg sonene (NW, NE, SW, SE) og gulv sonene (venstre topp, midtre topp, høyre topp, venstre midten, midten, høyre midten, venstre bunn, midtre bunn, høyre nederst). Valider oppsettet for å bekrefte at ingen soner overlapper.
  5. Åpne anskaffelses vinduet , og trykk på Start anskaffelse. Sted det oppspore for senteret av testingen Arena orientert inne slik en vei det er gjennomført for enhver test motiv. Tillate det oppspore å bevege fritt helt gjennom arenaen for en periode av 5 min. Trykk på Stopp anskaffelsepå slutten av testperioden. Gjentagelse fremgangsmåten med det neste oppspore.
    Merk: Alle forskere inne rommet burde holdning dem selv å bli uopplevelige av det oppspore og være igjen ro under tester periode.

11. fiksering

  1. På P42, dypt bedøve kits med 5% isoflurane. Administrering av en pentobarbital overdose (120 – 150 mg/kg IP). Sikre dyp anestesi av mangel på respons på tå klype og tap av luftveiene bevegelser.
  2. Overfør dyret til en avtrekksvifte. Åpne thorax og klem den synkende aorta ved hjelp av fine hemostats. Skjær høyre Atrium. Ved bruk av en perfuse har den venstre ventrikkel med 60 mL sterilt saltvann med en hastighet på 30 mL/min. Perfuse med 60 mL formalin (10% formaldehyd) med en hastighet på 30 mL/min.
  3. Halshugge stammen, og fjerne hjernen fra skallen ved hjelp av saks, tang, benrongeurer, og en slikkepott. Ta høyoppløselige fotografier av rygg, ventrale og laterale aspekter av hver hjerne. Post-Fix hjernen i formalin i minst 48 h.

12. ex vivo Brain måling

  1. Fjern hjernen fra formalin (trinn 11,3) og plasser på et papir håndkle å absorbere overflødig væske.
  2. Ved hjelp av en elektronisk tykkelse, måle høyden på hjernen ved å plassere tuppen av sko på rygg og ventrale aspekter av hjernen. Mål lengden av hjernen ved å plassere tuppen av sko på olfactory pære og den mest bakre grensen av occipital flik. Mål bredden av hjernen ved å plassere tuppen av en tykkelse på de mest laterale deler av Tinning fliker. Veie hjernen.
  3. Mål den langsgående sprekken (fremre og bakre til cruciate sulcus), lateral sulci, suprasylvian sulci, koronale sulci, pseudosylvian sulci, ansinate sulci, cruciate sulci, presylvian sulci, lateral Gyri, suprasylvian Gyri, sigmoid Gyri ( fremre og bakre), koronale Gyri, ectosylvian Gyri (fremre og bakre), og orbital Gyri. Mål alle sulci fra begynnelsen og slutten av den mest distinkte delen av den tilsvarende sulcus. Mål alle Gyri fra det bredeste aspektet av hver tilsvarende gyrus.
  4. Mål mengden av lillehjernen eksponert ved å plassere en spissen av den tykkelse på det mest bakre punktet av den langsgående sprekken og plassere den andre spissen av sko på den mest bakre del av lillehjernen.
    Merk: Det oppspore hjerne Atlas, idet grunnlegge inne Biology og sykdommen av det oppspore14, var pleide utvikle det ex vivo oppspore hjerne måler.

13. brutto skade scoring

  1. Bruk fotografiene som ble tatt i trinn 11,3., bruk poengkriteriene i trinn 13.2 – 13.4 for å vurdere brutto hjerneskade (0 – 9 skala) mens resterende blindet til eksponerings grupper (eller behandling).
  2. Vurdere langsgående sprekken. Hvis det ser ut som normalt, tildeler du en poengsum på 0. Hvis det er mildt utvides (ca 2x normal bredde), men økningen i bredden er ufullstendig langs lengden av sprekken, tildele en poengsum på 1. Hvis det er moderat utvidet (ca. 2 – 3x normal), tilordne en poengsum på 2. Hvis det er markert utvides, med et synlig gap > 3x normal bredde langs det meste av lengden av sprekken, bruke en poengsum på 3.
  3. Vurdere lateral sulci. Hvis de viser normal definisjon, med atskillelse av det lateral Gyri og suprasylvian Gyri, anvise en snes av 0. Hvis mild ensidig eller bilateral redusert definisjon av sulcus er sett, spesielt i den caudal delen, med minimal innsnevring av frontal og timelige fliker i forhold til occipital fliker, tildele en poengsum på 1.
    1. Hvis moderat redusert definisjon av sulci er sett, med depresjon av suprasylvian Gyri, innsnevring av koronale og ectosylvian Gyri, og mild innsnevring av frontal og timelige fliker i forhold til occipital fliker, tildele en poengsum på 2. Hvis ensidig cystisk degenerasjon er sett, med minimal endring av kontralateral halvkule, tildele en poengsum på 3. Hvis dårlig definisjon av lateral sulci er til stede, med bilaterale cystisk eller alvorlig degenerasjon av occipital og timelige fliker, tildele en poengsum på 4.
  4. Vurder den synlige delen av lillehjernen. Hvis det ser normalt ut, med (< 75% av vermis og < 66% av halvkulene synlige, tilordne en poengsum på 0. Hvis 75 – 90% av vermis og ≥ 66% av halvkulene er synlige, tilordner du en poengsum på 1. Hvis det meste av lillehjernen er synlig, viser alle av det vermis og ≥ 66% av halvkuler, anvise en snes av 2.

14. data analyse

  1. For refleks testing data, tildele feil en poengsum på 61 s for å tillate dem å bli sammenlignet med suksesser på slutten av tiden (60 s), men med en dårligere rangering i statistisk analyse. Beregn et område under kurven for hvert dyr over tid i hver av refleks testene.
  2. Juster catwalk data som involverer pote størrelsen på trykket av vekten av dyret.
  3. Analyser data ved hjelp av ikke-parametriske statistiske metoder, som beskriver data ved hjelp av median og interquartile område (IQR).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Av 34 (n = 18 hanner, n = 16 kvinner) dyr fra seks kull eksponert for fornærmelse, åtte dyr (24%; n = 4 hanner, n = 4 kvinner) i den skadde gruppen døde under den andre hypoksi perioden (n = 5), under temperaturstyring (n = 2), eller over natten etter fornærmelse (n = 1). I den skadde gruppen, ni av 26 overlevende (35%) hadde synlig grov skade. Fem dyr (n = 5 hanner) hadde moderat skade, og fire dyr (n = 2 hanner, n = 2 kvinner) hadde alvorlige skader, definert som brutto patologi score på 2-5 og 6 – 9, henholdsvis (figur 2A). Dyr utsatt for fornærmelse derfor har en 50% risiko for død eller betydelig grov skade. Med økende skade, innsnevring av Gyri i Tinning og/eller occipital fliker er sett, med tilhørende sulcus forkortelse, utvidelse av den langsgående sprekken, og store områder av områder med cystisk vev tap i de mest alvorlig-skadde dyr (figur 2B). I gjenlevende skadde dyr (n = 26; n = 14 menn, n = 12 kvinner), signifikant større eksponering av lillehjernen er sett (Figur 3A), samt forkortelse av den langsgående sprekken (Figur 3D). Det er også signifikant innsnevring av koronale og fremre ectosylvian Gyri (Figur 3B, E), samt forkortelse av lateral og suprasylvian sulci (Figur 3C, F). Median (IQR) hjernens vekt var 8,1 g (7,9 – 9.7 g, n = 6) i kontroll dyr, og 7,0 g (6,5 – 7.7 g) hos skadde dyr (n = 26, p = 0,005). I kontroll dyr, median (IQR) hjerne lengde var 28.9 mm (27.8 – 29.6 mm, n = 6) sammenlignet med 27,5 mm (25.5 – 38.0 mm, n = 26) i skadde dyr (p = 0,007). Lignende mønstre er sett over hele hjernen, med median bredde og høyde 5 – 7% mindre i skadde dyr. Anatomiske strukturer på både venstre og høyre side er påvirket på en lignende måte, uten forskjell mellom halvkuler. Se figur 1B for skildringer av de anatomiske stedene. Over refleks testing perioden (P21-P39), skadde dyr vise tregere tid til å rotere i den negative geotaxis oppgave (Figur 4A), tregere tid til å rotere bort fra kanten i klippen aversjon oppgave (Figur 4B), og tregere tid til høyre (Figur 4C). I catwalk, skadde dyr har en tilsvarende gjennomsnittlig hastighet til kontroller (figur 5a), men viser en betydelig større grad av hastighet variasjon under hvert løp (figur 5B). Den vekt-justerte avstanden mellom forgrunnen poter og hind paws (Print stilling) er betydelig større i skadde dyr (figur 5C), med mindre press utøves per enhet pote området gjennom forgrunnen poter (figur 5D). I det åpne feltet, skadde dyr dekker mindre total avstand (figur 6A), og stoppe oftere (figur 6B). De tilbringer betydelig mer tid i midten av feltet, og mindre tid i hjørnene (figur 6C, D). Representative varme kart over kontroll og skadde dyr er vist i figur 7A, B.

Figure 1
Figur 1: tidslinje. På P17, dyr administreres 3 mg/kg LPS før under bilaterale hals puls arterien ligation og 30 min hver (ikke inkludert tid forkammeret til likevekt) av hypoksi (9% oksygen), hyperoxia (80% oksygen) og hypoksi (9%). Høyre hals puls ligation blir deretter reversert. Dyr er eksponert for 6 h av normothermia å sikre at de ikke blir spontant hypotermi i reiret i perioden etter skade. Reflex testing utføres deretter daglig fra P21-P28, og tre ganger per uke fra P28-P42. På P42, dyr er testet i catwalk og åpent felt før offer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representativ skade fordeling og skildring. (A) brutto skade scoring fra 26 overlevende (n = 14 hanner, n = 12 kvinner) i den skadde gruppen, sammenlignet med seks kull kompis kontroller. Fem dyr (n = 5 hanner) hadde moderat skade, og fire dyr (n = 2 hanner, n = 2 kvinner) hadde alvorlige skader, definert som brutto patologi score på 2-5 og 6 – 9, henholdsvis. Grafen viser median med interquartile rekkevidde. (B) kontroll hjernen (venstre panel, score 0), med hjerner som viser økende brutto skade score på 2, 5 og 8 av en total mulig poengsum på 9, fra venstre til høyre. Kontrollen hjernen viser anatomiske strukturer spesielt utsatt for skade; 1 = langsgående sprekken, 2 = lateral sulcus, 3 = suprasylvian sulcus, a = koronale gyrus, b = fremre ectosylvian gyrus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representative hjerne målinger. Sammenlignet med kontroller (n = 6), skadde dyr (n = 26) viser betydelig økt eksponering av lillehjernen (A), forkortelse av den langsgående sprekken (D), innsnevring av koronale (B) og fremre ectosylvian (E) Gyri, og forkortelse av lateral (C) og suprasylvian (F) sulci. Grafer viser median med interquartile rekkevidde. * betegner p < 0,05 (Wilcoxon-mann-Whitney U-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representative refleks utvikling. Sammenlignet med kontroller (n = 6), skadde dyr (n = 26) vise tregere utvikling (område under kurven, AUC) av negative geotaxis (A), Cliff aversjon (B), og rettende refleks (C). Grafer viser median med interquartile rekkevidde. * betegner p < 0,05 (Wilcoxon-mann-Whitney U-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representative catwalk-resultater. Sammenlignet med kontroller (n = 6), skadde dyr (n = 26) gå på en tilsvarende gjennomsnittlig tempo (a), men med en større variasjon i hastighet under walking (B). Skadde dyr viser også en lengre gjennomsnittlig utskriftsposisjon (C), med mindre trykk brukt per enhet område (D). Grafer viser median med interquartile rekkevidde. * betegner p < 0,05 (Wilcoxon-mann-Whitney U-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: representativ åpen virkemåte for felt. Sammenlignet med kontroller (n = 6), skadde dyr (n = 26) dekker en mindre total distanse (a), samt stoppe oftere (B). Skadde dyr også bruke mer tid i sentrum (C) enn i hjørnene (D). Grafer viser median med interquartile rekkevidde. * betegner p < 0,05 (Wilcoxon-mann-Whitney U-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: representative åpne felt varme kart. (A) kontroll hunn, (B) skadet hunn. Skadde dyr dekker en betydelig mindre avstand innenfor det åpne feltet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grunn av det fysisk og utviklingsmessige likheter delt imellom det oppspore hjerne og Human hjerne, det oppspore er i stigende grad tilværelse pleide modell begge to voksen og utviklingsmessige hjerne skaden. 8,9,10,11,12. Imidlertid, forskning inntil dato tyder på det det oppspore hjerne er begge to motstandsdyktig å Initial skaden likeledes idet høylig-plastikk, med opptreden underskudd avtagende over tid aften inne innfatningen av synlig patologisk skaden10,12. Her beskriver vi den første modellen av betennelse-sensibilisert hypoxic-iskemiske (HI) hjerneskade i slutten av premature-tilsvarende ilder, noe som resulterer i betydelig bilateral skade og vedvarende atferdsmessige underskudd i overlevende. Som med alle prekliniske modell, var målet ikke å nøyaktig reprodusere de eksponeringer møtt av premature spedbarn klinisk, men å gi en samløpet av mekanistisk faktorene antas å være involvert i prematur hjerneskade. Disse inkluderer betennelse, hypoksi og oksidativt stress7.

Ettall betenkelig aspektet av LPS administrasjon inne våre oppspore modeller er en enkelt høy dose gitt i nærheten 4 h tidligere hypoksi. LPS eksponering i nær-term ekvivalent gnagere resulterer i en sirkulerende inflammatorisk cytokin peak rundt 4 h etter eksponering, som tilsvarer med allergi av hjernen til hypoksi-iskemi, og en betydelig økning i hjerneskade15,16,17. En lignende tid løpet av inflammatorisk cytokin release (peak TNF-α og IL-6 Release 2-4 h etter LPS eksponering) er sett i isolert oppspore perifere blod mononukleære celler18. Forutsatt et enkelt kirurgisk oppsett, administrere LPS 30-60 min før starten av operasjonen gir tilstrekkelig tid til å utføre 12-15 bilaterale hals puls arterien ligations og initiere den første hypoksi eksponering 4 h etter LPS administrasjon. Undermodell utvikling, en LPS dose av 5 mg/kg ble opprinnelig brukt, som beskrevet i vår P10 skademodell12. Imidlertid var denne LPS dose assosiert med betydelig intra-hypoxic dødelighet og lungeødem på obduksjon. Både dødelighet og lungeødem ble redusert ved å redusere LPS-dosen til 3 mg/kg.

Under hypoksi eksponering synes en rekke faktorer å være avgjørende for å sikre betydelig brutto skade, samtidig som de også forhindrer høye nivåer av dødelighet. På grunn av laboratorium oppspore tilværelse outbred, det er en iboende variasjon inne hypoksi toleranse vannrett søppel. Inne våre erfaring, krysset-Foster dyrene eller forbinder dyrene fra annerledes søppel inne det likt hypoksi kammeret overveiende resultater inne det tidligere død av større dyrene eller dyrene fra de fleste mottagelig søppel. Hvis flere mottagelig dyrene dø tidligere målet 30 min hypoksi avsøring og hypoksi er stanset tidlig, mindre dyrene fra færre mottagelig søppel ville få suboptimal hypoksi avsøring, og er usannsynlig å holde betydelig skaden. Som et resultat, bør hvert kull av dyr bli utsatt for hypoksi i sitt eget separate kammer. Den andre hypoksi perioden ble lagt til som en del av en gjentakende modell utviklingsprosess som vi tidligere har beskrevet12. En enkelt hypoksi periode resulterte enten i død eller overlevelse uten signifikant skade, uansett lengde.

Idet oppspore er kjøpedyktig tolerere lang perioder av akutt hypoksi eller bilateral hals puls arterie ligation uten viser betydelig hjerne skaden, våre aktuelle hypotese er det alt perioden av hyperoxia resultater inne opphøyet metabolisme og vasodilatasjon det Letter hjernen iskemi under den andre hypoksi perioden. Å minimere variasjon inne modellen, vi anvendt pre-bestilt kjønn-balansert søppel av 8 oppspore det ankom inne våre letter opp på P15. Inne hver søppel, 6 – 7 dyrene gjennomgikk kirurgi føle etter av hypoksi innen en enkelt kammeret.

Etter hypoksi og reversering av høyre hals puls arterie ligation, bør dyrene returneres til sine Jills for en periode for å mate på grunn av en risiko for dehydrering og hypoglykemi fra den langvarige skade protokollen. Hvis betydelig dødelighet oppleves i løpet av temperatur forvaltnings perioden, kan dyr trenger ekstra Fluid gjenoppliving (subkutan saltvann og/eller hånd fôring med formel og vann) før de blir plassert i vannbad for 6 h. Temperaturen ledelse perioden er imidlertid en kritisk faktor på lang tids skade, som dyr kan ellers oppleve neuroprotection fra relativ nedkjøling i reiret. Denne risikoen for nedkjøling er minst delvis på grunn av den lave temperaturen av bolig forhold som kreves for oppspore (60 – 70 ° f).

Det opptreden prøver beskrevet var hovedsakelig bebygget innen det laboratorium, med noe basis inne refleks prøver tidligere beskrevet inne det utvikler oppspore19, med catwalk og åpen åker prøver tilpasset fra voksen Red å bli anvendt inne juvenile oppspore. Annet holdene ha likeledes beskrevet åpen åker, labyrint, og gange tester inne voksen oppspore etter traumatisk hjerne skaden10, likeledes idet effekten av inne Utero betennelse opp på sosiale vekselvirkningen inne voksen oppspore20. Skjønt en lang fastende periode er ikke anbefalt inne oppspore på grunn av deres kort tarmen transitt tid, sted seg inne en dyr bærer for 30 – 60 min tidligere noen av det prøver er fordelaktig for at tillate seg å admission card urin og feces tidligere prøvene. Idet det oppspore er av Art en nysgjerrig dyr, den ofte arter inne en opposite vei å Red inne disse opptreden prøver. Denne er spesielt tydelig inne det catwalk, der hvor lyset og lyder, spesielt registreringene av en annen oppspore synge (â € dooking €), kan brukes å motivere det oppspore å gå videresende.

Den gjeldende protokollen har noen begrensninger. Som det ble utviklet iteratively bruker tidligere utviklet metoder i P10 Ferret12, vi vet foreløpig ikke den relative bidrag av LPS, hypoksi, hyperoxia, og reperfusion til den endelige graden av skade sett. Det er imidlertid verdt å merke seg at utviklingen av metoden beskrevet her, inkludert ved hjelp av den opprinnelige Vannucci-modellen (ensidig hals puls ligation, etterfulgt av en enkelt periode med hypoksi) i oppspore21, som ikke resulterte i noen betydelig skade. Interaksjoner mellom flere deler av skade protokollen er derfor sannsynligvis nødvendig for varig skade. Til tross for dette, er det fortsatt en tydelig variasjon i brutto skade i overlevende dyr, som er en annen potensiell begrensning. Selv om dyr uten signifikant grov skade kan ha skader som oppdages ved hjelp av MRI eller histopatologi12, vil fremtidig arbeid på modellen inkluderer gjentakelser for å prøve og øke antall dyr som oppholder betydelig skade, for eksempel ved hjelp av permanent bilaterale hals puls ligation. Til slutt, for at denne modellen skal være maksimalt nyttig å teste antatte nervecellene terapi for utviklingsmessige hjerneskade, bør det bli validert ved å vurdere effekten av nervecellene midler som er enten etablert for behandling av HI hjerneskade i menneskelig nyfødte, eller har vært vellykket i en rekke andre dyremodeller av nyfødt hjerneskade. Fremtidige studier vil derfor vurdere effekten av terapeutisk nedkjøling og erytropoietin i denne modellen, inkludert sex-baserte terapeutiske responser og ex vivo MRI12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Utvikling av modellen ble finansiert Bill og Melinda Gates Foundation, samt av NIH gi 5R21NS093154-02 (NICHD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
80% Oxygen Praxair
9% Oxygen Praxair
Absorbent benchtop protector Kimtech 7546
Automated catwalk Noldus
Betadine surgical scrub
Bupivacaine Patterson Veterinary 07-888-9382
Buprenorphine
Calipers SRA Measurement Products ME-CAL-FP-200 200 mm range, 0.01 mm resolution
Cotton Gauze Sponge Fisher Scientific 22028556
Curved fine hemostat Roboz RS-7101
Curved forceps World Precision Instruments 501215
Curved suture-tying hemostat Roboz RS-7111
Ethovision tracking software Noldus
Eye Lubricant Rugby NDC 0536-1970-72
Ferrets (Mustela putorius furo) Marshall Biosciences Outbred (no specific strain)
Formalin Fisher Scientific SF100-4 10% (Phosphate Buffer/Certified)
Hair Clippers Conair GMT175N
Insulin Syringes BD 329461 0.3 cc 3 mm 31 G
Isoflurane Piramal 66794-017-25
Lidocaine Patterson Veterinary 07-808-8202
LPS List Biological LPS Ultrapure #423
Oxygen sensor BW Gas Alert GAXT-X-DL-2
Pentobarbital
Plastic chamber Tellfresh 1960 10 L; 373 x 270 x 135 mm3
Saline Solution, 0.9% Hospira RL-4492
Scalpel blade Integra Miltex 297
Scalpel handle World Precision Instruments 500236 #3, 13 cm
Sterile suture Fine Science Tools 18020-50 Braided Silk, 5/0
Surgical clip applicator Fine Science Tools 12020-09
Surgical clip remover Fine Science Tools 12023-00
Surgical drapes Medline Unidrape VET3000
Surgical gloves Ansell Perry Inc 5785004
Surigical clips Fine Science Tools 12022-09
Thermometer (rectal) YSI Precision 4000A
Thermometer (water) Fisher Scientific 14-648-26
Umbilical tape Grafco 3031 Sterile
Water bath Thermo Scientific TSCOL19 19 L

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martin, J. A., Hamilton, B. E., Osterman, M. J. K., Driscoll, A. K., Drake, P. Births: Final Data for 2017. National Vital Statistics Report. 67 (8), 1-49 (2018).
  2. Vanhaesebrouck, P., et al. The EPIBEL study: outcomes to discharge from hospital for extremely preterm infants in Belgium. Pediatrics. 114 (3), 663-675 (2004).
  3. Raju, T. N., et al. Long-Term Healthcare Outcomes of Preterm Birth: An Executive Summary of a Conference Sponsored by the National Institutes of Health. Journal of Pediatrics. , (2016).
  4. Raju, T. N. K., Buist, A. S., Blaisdell, C. J., Moxey-Mims, M., Saigal, S. Adults born preterm: a review of general health and system-specific outcomes. Acta Paediatrica. 106 (9), 1409-1437 (2017).
  5. Bennet, L., et al. Chronic inflammation and impaired development of the preterm brain. Journal of Reproductive Immunology. 125, 45-55 (2018).
  6. Reich, B., Hoeber, D., Bendix, I., Felderhoff-Mueser, U. Hyperoxia and the Immature Brain. Developmental Neuroscience. 38 (5), 311-330 (2016).
  7. Galinsky, R., et al. Complex interactions between hypoxia-ischemia and inflammation in preterm brain injury. Developmental Medicine & Child Neurology. 60 (2), 126-133 (2018).
  8. Empie, K., Rangarajan, V., Juul, S. E. Is the ferret a suitable species for studying perinatal brain injury. International Journal of Developlemental Neuroscience. 45, 2-10 (2015).
  9. Snyder, J. M., et al. Ontogeny of white matter, toll-like receptor expression, and motor skills in the neonatal ferret. International Journal of Developlemental Neuroscience. , (2018).
  10. Schwerin, S. C., et al. Progression of histopathological and behavioral abnormalities following mild traumatic brain injury in the male ferret. Journal of Neuroscience Research. 96 (4), 556-572 (2018).
  11. Rafaels, K. A., et al. Brain injury risk from primary blast. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 73 (4), 895-901 (2012).
  12. Wood, T., et al. A Ferret Model of Encephalopathy of Prematurity. Developlemental Neuroscience. , (2019).
  13. Barnette, A. R., et al. Characterization of Brain Development in the Ferret via Magnetic Resonance Imaging. Pediatric Research. 66 (1), 80-84 (2009).
  14. Kroenke, C. D., Mills, B. D., Olavarria, J. F., Neil, J. J. Biology and Diseases of the Ferret. , WIley. (2014).
  15. Eklind, S., et al. Bacterial endotoxin sensitizes the immature brain to hypoxic--ischaemic injury. European Journal of Neuroscience. 13 (6), 1101-1106 (2001).
  16. Falck, M., et al. Neonatal Systemic Inflammation Induces Inflammatory Reactions and Brain Apoptosis in a Pathogen-Specific Manner. Neonatology. 113 (3), 212-220 (2018).
  17. Osredkar, D., et al. Hypothermia Does Not Reverse Cellular Responses Caused by Lipopolysaccharide in Neonatal Hypoxic-Ischaemic Brain Injury. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 390-397 (2015).
  18. Nakata, M., Itou, T., Sakai, T. Quantitative analysis of inflammatory cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of the ferret (Mustela putorius furo) using real-time PCR. Veterinary Immunology and Immunopathology. 130 (1-2), 88-91 (2009).
  19. Christensson, M., Garwicz, M. Time course of postnatal motor development in ferrets: ontogenetic and comparative perspectives. Behavioral Brain Research. 158 (2), 231-242 (2005).
  20. Li, Y., Dugyala, S. R., Ptacek, T. S., Gilmore, J. H., Frohlich, F. Maternal Immune Activation Alters Adult Behavior, Gut Microbiome and Juvenile Brain Oscillations in Ferrets. eNeuro. 5 (5), (2018).
  21. Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurolology. 9 (2), 131-141 (1981).

Tags

Nevrovitenskap oppspore nyfødt hypoksi-iskemi neuroprotection lipopolysakkarid hals puls ligation hyperoxia
En oppspore modell av betennelse-sensibilisert late premature hypoxic-iskemiske hjerneskade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wood, T., Moralejo, D., Corry, K.,More

Wood, T., Moralejo, D., Corry, K., Fisher, C., Snyder, J. M., Acuna, V., Holden-Hunt, A., Virk, S., White, O., Law, J., Parikh, P., Juul, S. E. A Ferret Model of Inflammation-sensitized Late Preterm Hypoxic-ischemic Brain Injury. J. Vis. Exp. (153), e60131, doi:10.3791/60131 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter