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Medicine

UV-Vis및 말라리아 방지 프리마퀸의 육안 측정을 위한 최적화된 Griess 반응

doi: 10.3791/60136 Published: October 11, 2019
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜은 합성 소변 및 인간 혈청에서 말라리아 프리마퀸 (PMQ) 검출을위한 새로운 색채 방법을 설명합니다.

Abstract

Primaquine (PMQ), 중요 한 안티 말라리아 약물, 세계 보건 기구에 의해 권장 되었습니다 (WHO) P. vivax와 ovale에의해 발생 하는 생명을 위협 하는 감염의 치료에 대 한. 그러나, PMQ는 포도당-6-인산 탈수소 효소 (G6PD) 결핍을 가진 환자에 있는 심각한 용혈으로 이끌어 내는 원치 않는 역효과가 있습니다. 복용량 모니터링의 목적으로 PMQ 결정에 대 한 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 개발 하는 필요가 있다. 2019년 초, PMQ 색채 정량화를 위한 UV-Vis 및 육안 기반 접근법을 보고했습니다. 검출은 PMQ와 anilines 사이의 Griess와 같은 반응을 기반으로하여 착색 된 아조 제품을 생성 할 수 있습니다. 합성 소변에서 PMQ의 직접 측정에 대한 검출 한계는 나노 몰 범위에 있다. 더욱이, 이 방법은 임상적으로 관련된 농도에서 인간 혈청 샘플로부터 PMQ 정량화에 대한 큰 잠재력을 보여주었다. 이 프로토콜에서는 유색 아조 제품의 합성 및 특성화, 시약 준비 및 PMQ 결정 절차에 대한 기술적 세부 사항을 설명합니다.

Introduction

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PMQ는 가장 중요한 말라리아 약물 중 하나이며, 재발을 방지하기 위해 조직 주혈계뿐만 아니라 질병전염을방해하는 게임 세포질로도 작동1,2,3,4. 혈관 내 용혈은 PMQ의 부작용에 관한 중 하나입니다, 이는 G6PD에 그 결핍에 매우 심각해진다. G6PD 유전 무질서는 말라리아 풍토성 지역에 있는 3-30% 사이 유전자 주파수로 세계전반 분포한다는 것을 알려지다. PMQ 약점의 엄격은 G6PD 부족의 정도 뿐만 아니라 복용량 및 PMQ 노출의 내구에 달려있습니다5,6. 위험을 낮추기 위해 WHO는 말라리아 치료를 위해 PMQ의 단일 저용량(0.25 mg 염기/kg)을 권장했습니다. 그러나, 이것은 여전히 환자 약물 감수성5,7의변화에 의해 도전된다. 용량 모니터링은 PMQ 투여 후 약물 동력학을 평가하는 데 필요하며, 이는 제한된 독성으로 성공적인 치료를 위한 투여 량 조정에 영향을 미칠 수 있다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 PMQ 임상 측정에 가장 널리 사용되는 기술입니다. Endoh 등은 C-18 폴리머 겔 컬럼8을사용하여 혈청 PMQ 정량화를 위한 UV 검출기를 이용한 HPLC 시스템을 보고하. 그들의 시스템에서, 혈청 단백질은 먼저 아세토니트릴로 침전되었고, 그 후 상층부에서PMQ를 HPLC용으로 분리시켰다. 교정 곡선은 0.01-1.0 μg/mL8의농도 범위에 걸쳐 선형이었습니다. 254 nm에서 UV 검출을 이용한 역상 HPLC에 기초한 또 다른 방법은 PMQ 및 이의 주요 대사산물9의정량화를 위해 보고되었다. PMQ의 교정 곡선은 0.025-100 μg/mL 사이의 범위에서 선형이었습니다. 유기상으로서 헥산과 에틸 아세테이트를 혼합한 추가의 액체-액체 추출은 89%9에도달한 백분율 회수와 함께 PMQ 분리를 위해 사용되었다. 최근에는 미란다 외가 3 μg/mL10의검출 한계를 가진 정제 제형에서 PMQ 분석을 위해 260 nm에서 UV 검출을 하는 UPLC 방법을 개발했습니다.

HPLC 방법은 약물 측정에 유망한 감도를 나타내고 HPLC가 질량 분석기가 장착되어 있는 경우 감도가 더욱 향상될 수 있지만 여전히 몇 가지 단점이 있습니다. 많은 생체 분자가 분석에 크게 영향을 미칠 수 있기 때문에 생물학적 유체의 직접 약물 측정은 일반적으로 HPLC에 의해 접근 할 수 없습니다. 추가 추출은 HPLC 분석11,12전에 내인성 분자를 제거하는 데 필요합니다. 더욱이, HPLC-UV 검출기에 의한 PMQ 검출은 전형적으로 최대 흡수 파장(260 nm)에서 수행된다. 그러나, 260 nm에서 강한 흡광도를 가진 생물학 액체에 있는 많은 내인성 분자가 있습니다 (예를 들면, 아미노산, 비타민, 핵산 및 비뇨기과 색소), 따라서 PMQ UV 검출을 방해하. 합리적인 감도와 선택성을 갖춘 PMQ 측정을 위한 간단하고 비용 효율적인 방법을 개발할 필요가 있습니다.

Griess 반응은 아질산염검출13,14,15,16에대한 비대검 시험으로서 1879년에 처음 발표되었다. 최근, 이러한 반응은 아질산염뿐만 아니라 다른 생물학적으로 관련된 분자17,18,19,20을검출하기 위해 광범위하게 탐구되고 있다. 우리는 이전에 PMQ를 가진 예기치 않은 Griess 반응의 첫번째 체계적인 연구 결과 보고했습니다(그림 1). 이 시스템에서 PMQ는 산성 조건하에서 아질산 이온이있는 경우 대체 된 음선과 결합 될 때 착색 된 아조스를 형성 할 수 있습니다. 우리는 또한 아조스의 색이음질(21)에대한 대체물의 대체기의 기부 효과를 증가시킬 때 노란색에서 파란색으로 변화한다는 것을 발견했다. PMQ 정량화를 위한 UV-vis 흡수 기반 착색 방법은 4-메톡시아닌산염과 PMQ 사이의 최적화된 반응을 통해 개발되었습니다. 이 방법은 생체 관련 유체에서 PMQ의 민감하고 선택적 검출에 대한 큰 잠재력을 보여주었습니다. 여기서는 이 대색 전략을 기반으로 PMQ 결정에 대한 자세한 절차를 설명하는 것을 목표로 합니다.

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Protocol

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1. 유색 아조스의 합성

  1. 25 mL 라운드 바닥 플라스크(RBF)에서, 안일린(0.1 mmol)과 프리마퀸 비스포스페이트(45.5 mg, 0.1 mmol)를 H3PO4 용액 10 mL(5% v/v)로 용해시. 얼음 욕조에 RBF를 넣고, 용액에 적절한 크기의 교반 바를 추가하고, 교반 판에 RBF를 넣어.
    참고: 아조 3g (그림 2)의합성을 위해, 프리마퀸 비스포스페이트 0.2 mmol을 사용한다.
  2. NaNO2 (6.9 mg, 0.1 mmol)를 냉각수 1 mL에 녹인 다음 반응 혼합물을 드롭 으로 첨가하십시오. 얼음 욕조를 제거하고 반응 혼합물을 실온에서 교반하십시오.
  3. 실리카 겔 코팅 된 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 플레이트로 반응을 모니터링합니다. 디클로로메탄(DCM)/메탄올(MeOH) 혼합물(vol/vol = 5:1)을 TLC용 용리온으로 사용하십시오. Azo 제품은 TLC 플레이트에 색이 있는 반점을 나타내며, 육안으로 구별하기 쉽습니다. TLC에서 PMQ 반점이 사라지면 반응을 멈춥시다.
  4. 얼음 욕조에서 NaOH (2M)에 의해 pH >10로 반응 혼합물을 조정합니다. 50 mL 분리 깔때기를 사용하여 각각 20 mL의 에틸 아세테이트와 혼합물을 3 회 추출하고 회전 증발기를 사용하여 진공 하에서 유기 상을 결합하고 농축하십시오.
    참고: 추출하기 전에 반응 솔루션의 pH 값을 10 이상으로 조정합니다. 이것은 그것의 비 이온화한 양식으로 1 차적인 아민을 유지할 수 있습니다, 따라서 추출을 용이하게.
  5. MeOH/H2O를 용리온으로 사용하여 정상 압력하에서 역상 실리카 젤로 플래시 크로마토그래피로 잔기를 정화합니다. 용이성 화를 통해 제품 용액을 건조하여 원하는 아조 제품을 제공합니다.
    참고: 희석된 HCl 솔루션(0.2 M)에서도 동일한 반응을 수행할 수 있다.

2. UV-Vis 측정 및 이론적 계산

  1. 순수 아조(50 μM)를 증류수 또는 5% H3PO4 용액(pH 1.1)에 각각 용해합니다. 실온(25°C)에서 분광광도계에 UV-vis 흡수 분광법(250-700 nm)을 기록합니다. 추가 분석을 위해 데이터를 .xls/.xlsx 파일로 내보냅니다.
  2. 가우시안 16 프로그램을 사용하여 PMQ 자체 및 아조 제품에 대한 모든 이론적 계산을 수행합니다. 6-31G 기준 세트를 사용하여 시간 의존 밀도 함수 이론(TD-DFT)을 사용합니다. 물을 사용하여 편광 가능한 연속체 모델(PCM) 형식주의에 의한 용매 효과를 포함합니다.
    1. 소프트웨어(예: Chemdraw Office)를 사용하여 구조를 그린 다음 구조를 가우시안 입력 파일(.gif)으로 저장합니다.
    2. 가우스 보기로 GIF 파일을 열고 계산버튼을 클릭합니다. 가우시안 계산 설정, 옵트+주파수접지 상태 DFT-B3LYP-6-31G를 선택합니다. 그런 다음 제출을클릭합니다. 형상 최적화는 .log 파일을 생성합니다.
    3. 위의 절차에 따라 Gauss View를 사용하여 이 로그 파일을 엽니다. 계산 -가우시안 계산 설정을 클릭하고 에너지와 TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-싱글만선택합니다. 그런 다음 을 제출합니다. 에너지 계산은 다른 로그 파일과 큐브 파일을 생성합니다.
    4. 가우스 뷰를 사용하여 에너지 계산에서 로그 파일을 엽니다. 결과-UV/Vis를 클릭하여 예측된 흡수를 확인합니다.
    5. 가우스 뷰를 사용하여 큐브 파일을 엽니다. 결과s를 클릭하고 곡면 및 등고선-곡면 작업및 새 곡면을 선택하여 궤도를 확인합니다.
  3. 실험 측정과 가우시안 계산의 결과를 비교합니다. 다음 방정식에 따라 계산된 값과 측정값 사이의 백분율 오차를 계산합니다.
                  오류 = | (W최대 cal.-W최대최대 내량. / W최대엑스퍼. | × 100 %
    여기서 Wmax cal.은 이론적 계산및 Wmax exper의 최대 흡광도 파장을 나타냅니다. 는 실험 결과에서 파장을 나타냅니다.

3. PMQ 결정

  1. 96웰 플레이트를 이용한 PMQ 측정(그림5)
    1. 200 mM 애니라인 용액, R1을 위해 0.2 M HCl에 4-메톡시아니린을 용해시다. 증류수에 아질산 나트륨을 용해하여 5 mM 용액, R2를 얻습니다. 사용하기 전에 냉장고에 있는 모든 용액을 4°C로 유지하십시오.
    2. R1 100 μL을 96웰 플레이트에 넣고 샘플을 함유한 PMQ 50 μL을 플레이트에 추가하여 R1과 혼합합니다. 그런 다음 접시에 R2 50 μL을 추가합니다. 반복파이팅으로 솔루션을 혼합합니다.
    3. 플레이트를 실온에서 15분 동안 유지한 다음 UV-vis 흡광도를 504 nm로 기록합니다. 각 테스트에 대해 3x를 반복합니다.  azo 제품은 실내 조명 노출로 안정적입니다. 접시를 어둡게 유지할 필요가 없습니다.
    4. 추가 분석을 위해 데이터를 .xls/.xlsx 파일로 내보냅니다.
  2. 소변 샘플에서 직접 PMQ 측정을 위한 교정 곡선
    1. PMQ 농도가 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM에서 합성 소변을 사용하여 PMQ 솔루션을 준비합니다.
    2. 100 μL의 R1을 96웰 플레이트에 넣고 50 μL의 PMQ 소변 용액을 추가하여 R1과 혼합합니다. 그런 다음 위의 혼합물에 R2 50 μL을 추가합니다. 반복파이팅으로 솔루션을 혼합합니다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 유지한 다음 UV-vis 흡광도를 504 nm로 기록합니다.
    3. 흡광도 I504 및 PMQ 농도에 기초하여 캘리브레이션 곡선을 생성한다. PMQ가 없는 웰의 값을 공백으로 사용하고 데이터 처리 전에 모든 테스트에서 빈 값을 뺍니다.
    4. 선형 맞춤을 수행하여 선형 방정식을 Y = aX+b로생성하고, 여기서 Y는 504 nm의 흡광도 강도이고, X는 PMQ의 농도이고, a는 경사이고, b는 선형 선의 y-절편이다.
  3. 인간 혈청 시료에서 직접 PMQ 측정을 위한 교정 곡선
    1. 각각 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM에서 PMQ 농도로 인간 혈청을 사용하여 PMQ 솔루션을 준비합니다.
    2. 100 μL의 R1을 96웰 플레이트에 넣고 50 μL의 PMQ 세럼 용액을 추가하여 R1과 혼합합니다. 위의 혼합물에 R2 50 μL을 추가하고 반복파이팅하여 솔루션을 혼합합니다. 플레이트를 실온에서 15분 간 유지한 다음 UV-vis 흡광도를 504 nm로 기록합니다. 추가 분석을 위해 데이터를 .xls/.xlsx 파일로 내보냅니다.
    3. 흡광도 I504 및 PMQ 농도에 기초하여 캘리브레이션 곡선을 생성한다. PMQ가 없는 웰의 값을 공백으로 사용하고 데이터 처리 전에 모든 테스트에서 빈 값을 뺍니다.
    4. 선형 맞춤을 수행하여 선형 방정식을 Y = aX+b로생성하고, 여기서 Y는 504 nm의 흡광도 강도이고, X는 PMQ의 농도이고, a는 경사이고, b는 선형 선의 y-절편이다.
  4. 혈청에서 PMQ 추출
    1. PMQ 함유 세럼을 시뮬레이션하기 위해 일정량의 PMQ를 인간 세럼에 추가합니다. PMQ 추출을 위해, 에틸 아세테이트/헥산(7:1 v/v)의 혼합물 6 mL를 15 mL 원심분리기 튜브에 PMQ 함유 세럼 2mL에 넣습니다.
    2. 추출 시스템에 수산화 나트륨 (2M) 용액 100 μL을 추가하십시오. 30s. 유기층을 수집하고 진공 하에서 회전 증발기를 사용하여 농축하는 와류 믹서를 사용하여 튜브를 격렬하게 흔들어 줍니다.
    3. 200 μL의 증류수로 잔류물을 재용해 내고 220 nm 크기의 디스크 모양 멤브레인을 통해 여과하여 불용성 지질 성분을 제거합니다. 테스트를 위해 최종 솔루션을 사용합니다.
  5. 추출로 혈청에서 PMQ 결정
    1. 3.2 또는 3.3 단계를 수행하여 증류수에서 PMQ에 대한 교정 곡선을 생성합니다. 3.4단계에 따라 PMQ 함유 세럼에서 PMQ를 추출합니다.
    2. 100 μL의 R1 및 50 μL의 PMQ 용액을 96웰 플레이트에 추가합니다. 위의 혼합물에 R2 50 μL을 추가하고 반복 파이펫팅으로 솔루션을 혼합합니다.
    3. 플레이트를 실온에서 15분 동안 유지하고 UV-vis 흡광도를 504 nm로 기록합니다. 제어로 PMQ없이 R1 및 R2와 우물을 사용합니다. 추가 분석을 위해 데이터를 .xls/.xlsx 파일로 내보냅니다.
    4. 각 테스트에 대한 흡광도 값 I504에서 제어 값을 뺀 다음 보정 곡선의 라이너 방정식에 따른 농도 계산에 결과를 사용합니다.
      참고: 모든 경우에 PMQ에 대한 검출 한계(LOD)는 표준 방법22에따라 계산될 수 있다. 계산은 보정 함수를 기반으로 했습니다: LOD = 3.3 × SD/b,여기서 SD는 공백의 표준 편차이고 b는 회귀 선의 경사입니다.

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Representative Results

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반응 조건을 최적화하기위해(그림 2),다양한 아니라인이 Griess 반응을 통해 PMQ와 결합하는 데 사용되었다. 우리는 다른 색상의 아조스의 시리즈를 달성했다. 전자 기증 치장을 가진 아니라인은 UV-vis 흡수 스펙트럼에 적색 변화를 일으킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이론적 계산은 시간 의존 밀도 기능 이론(TD-DFT)을 통해 수행되었다. 도 2A에제시된 바와 같이, 계산 결과는 3.1%의 평균 오차와 광학 측정에 양호한 일치하였다. 4-메톡시아니린은 반응속도, 제품 용해도 및안정성(21)에서의양호한 성능으로 인해 PMQ 검출 반응을 수행하기 위해 사용되었다. 또한, 4-메톡시아니라인의 아조 제품은 붉은색으로 육안으로 구별하기 쉽습니다. 따라서, 이러한 반응은 육안 PMQ 검출에 대한 잠재력을제공한다(그림 3).

도 4A는 아조 생성물 3d의 UV-vis 흡수 스펙트럼에 대한 pH 효과를 나타낸다. I(504)는 pH를 1.0에서 6.0으로 증가시킬 때 변하지 않는다. I504 under pH 7.0은 약간의 감소를 나타내며, 기본 pH(8.0 및 9.0)는 흡수에 큰 영향을 미칩니다. 도 4B는 Griess 반응에 대한 PMQ 용액의 pH 효과를 나타낸다. 다양한 pHs(4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0)를 가진 PBS 버퍼에서 PMQ(50 μM)를 섹션 3.1에 기재된 바와 같이 시험 시약과 개별적으로 혼합하였다. I504는 실온에서 15분 후에 측정되었다. 표시된 바와 같이, PMQ 솔루션의 기본 pHs(8.0, 9.0)는 잠재적으로 반응에 영향을 미칩니다. 도 5는 PMQ 검출을 위한 Griess 반응을 수행하는 일반적인 절차를 나타낸다. 프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이, 분석을 위한 흡수 데이터 I(504)을 얻기 위해서는 4단계가 요구된다. 도 6A6B는 시료 전처리 없이 각각 소변 및 혈청 샘플로부터 PMQ를 직접 검출하기 위한 교정 곡선을 보여준다. 우수한 선형관계(R2 = 0.998)는 합성 소변에서 PMQ가 0 에서 200 μM 범위일 때 발견되었다. 혈청 샘플의 기간동안, 선형 관계는 10~200 μM 범위의 농도에서 발견되었다.

도 7A는 혈청으로부터 PMQ를 추출하는 절차를 나타낸다. 잔류물을 추출 및 농축 후 증류수에서 재용해낸 다음, 여과시켰다. 실제 PMQ 함유 혈청을 시뮬레이션하기 위해, PMQ는 0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 μM에서 최종 농도로 인간 혈청에 첨가되었다. 3.4 단계 및 3.5단계를 사용하여, 혈청 내의 PMQ 농도는 각각 0.02, 0.14, 0.44, 0.90 및 1.78 μM(도7C)인것으로 나타났다. 결과에 기초하여, PMQ 회복의 백분율은 PMQ가 이전 보고9와비교된 혈청에 있는 0.5 μM 이상일 때 약 90%인 것을 것을을 발견되었습니다.

Figure 1
그림 1: PMQ.(A)아질산염 분석을 위한 고전적인 Griess 반응에 대한Griess 반응의 개략성. (B)제안된 PMQ 검출 방법에서 Griess 반응. 이 그림은 전작21의허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 합성 아조스의 광물리적 특성. (A)다른 변조에서 생성된 아조스의 최대 흡수에 대한 UV-vis 측정 및 이론적 계산. 브래킷 외부의 숫자는 중성 pH 조건에 가까운 증류된H2O에서최대 흡광도 측정을 나타냅니다. 브래킷의 숫자는 5% H3PO4 용액(pH □ 1.1)의 측정을 참조합니다. λ복근/ nm 엑스퍼. 실험 데이터와 λ복근/석회.이론적 계산 데이터를 나타냅니다. Eexc는 여기 에너지(eV)이고 f는 발진기 강도입니다. (B)5% 인산 용액에 다른 치규체를 가진 PMQ 및 아조 제품의 사진 이미지, 50 μM. (C)합성 제품의 UV-vis 스펙트럼. 값이 0에서 1 사이의 범위로 정규화되었습니다. 이 그림은 전작21의허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: PMQ의 비색 측정. (A)시간에 따라 최대 I504에서 흡광도 변화를 모니터링합니다. 반응은 4-메톡시아니린을 사용하여 수행되었고, PMQ는 100 μM에서 사용되었고; (B)PMQ의 다른 농도로 반응의 색상 변화: 4-메톡시아닐린 용액 400 μL(0.2 MHCl에서 200 mM) 및 200 μL의 아질산나트륨(5 mM), PMQ 용액 200 μL(0, 1, 2, 5) , 10, 20, 50, 100 μM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: PMQ 검출에 대한 pH 효과. (A)아조 생성물 3d(50 μM)의 UV-vis 흡광도에 대한 pH 효과; (B)PMQ(50 μM)는 상이한 pHs(4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0)를 가진 PBS 버퍼에서 3.1단계에서 설명한 바와 같이 반응을 수행하기 위해 사용되었다. 15분 후, 504 nm에서의 흡광도를 측정했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 96 웰 플레이트 기반 시스템에서 Griess 반응을 통한 PMQ 측정. R1은 0.2 M HCl에서 200 mM 4-메톡시아니라인 용액을 지칭한다; R2는 증류수에서 5 mM 아질산나트륨을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: (A) 합성 소변 및 (B) 인간 혈청 샘플에서 PMQ 측정을위한 교정 곡선. PMQ의 농도는 0-200 μM 범위입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: 혈청 샘플로부터의 PMQ 측정. (A)정량 분석을 위한 혈청 샘플로부터의 PMQ 추출의 개략적 예시. (B) 0에서 100 μM 범위 내에서 I504 및 PMQ 농도 사이에서 발견된 선형 관계. (C)혈청 내의 PMQ는 혈청 내로 첨가된 정확한 양과 비교하여 Griess 반응 기반 방법에 의해 정량화되었다. 이 그림은 전작21의허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Table 1
표 1. 로그 D의 이론적 계산과 PMQ 및 CPMQ의 물 분포 비율.

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Discussion

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편리한 PMQ 정량화를 위한 대색 방법을 설명했습니다. 잠재적으로 가장 간단하고 비용 효율적인 현재 방법입니다. 더 중요한 것은, 이 방법은 어떤 장비를 사용하지 않고 육안 기반 PMQ 측정을 가능하게 제공 제공합니다.

PMQ 검출을 위한 최적화된 Griess 반응은 504 nm에서 최대 흡수를 가진 적색 아조를 생성할 수 있습니다. 내인성 생체 분자의 UV-vis 흡수로 인한 잠재적 영향은 제한적이므로 생물학적 유체에서 PMQ를 직접 측정할 수 있는 방법을 약속합니다. 결과에 의해 지시된 바와 같이, 우수한 선형관계(R2= 0.998)는 0-200 μM의 농도 범위에 걸쳐 소변 PMQ 검출에 대해 발견되었다(도6A). PMQ에 대한 검출 한계(LOD)는 0.63 μM인 것으로 나타났다. 이 방법은 또한 인간 혈청에서 PMQ의 직접 측정에 대한 큰 잠재력을 보여 주었다. 혈청 PMQ 검출을 위한 10~200 μM 범위의 농도에서 우수한 선형 관계가발견되었다(도 6B). 우리는 추출 및 농도를 통해 혈청 샘플을 미리 처리하여 감도를 더욱 향상시킬 수 있습니다. 도 7이 간단한 추출 공정으로 보여 주듯이, 이 방법은 임상적으로 관련된 범위에서 혈청 PMQ를 정량화할 수 있다. 반응 메커니즘에 기초하여, PMQ(CPMQ)의 주요 카르복실 대사산물은 잠재적으로 유사한 UV-Vis 특성을 가진 아조 생성물체를 형성할 수 있다. 그러나, 기본 pH 조건하에서 액체-액체 추출은 잠재적으로 CPMQ로부터의 간섭을 최소화할 수 있다. 표 1은 PMQ 및 CPMQ 모두의 계산된 로그 D 및 물 분포를 나타낸다. 도시 된 바와 같이, pH >10에서 PMQ의 6.33 % 미만은 수단계에서 발견되는 반면 CPMQ의 98.54 % 이상은 수단계에 있을 것입니다. 따라서 이론적으로 PMQ의 93.7% 이상및 CPMQ의 1.56% 미만이 시험을 위해 추출될 수 있습니다. 주 대사산물 CPMQ로부터의 간섭이 제한적이라는 결론을 내릴 수 있다.

PMQ 검출 절차는 매우 쉽게 처리할 수 있습니다. 예를 들어, 96 웰 플레이트 기반 시스템을 취하면, 전체 절차는 4 단계로 구성됩니다: 1) 4-메톡시아니린 용액의 100 μL(0.2 M HCl에서 200 mM) R1을 96웰 플레이트에 추가; 2) 50 μL의 PMQ 농도 알 수 없는 샘플을 R1과 혼합하는; 3) 실온에서 반응을 수행하기 위해 R2 (5 mM 아질산 나트륨 용액)의 50 μL을 첨가하는; 및 4) 분광계를 사용하여 504 nm에서 UV-vis 흡수를 기록하였다. 알 수 없는 샘플로부터의 PMQ의 농도는 보정 곡선으로부터의 흡수 강도 I(504) 및 선형 방정식에 기초하여 계산될 수 있다. 전체 절차는 배양없이 실온에서 수행됩니다. 컬러 제품은 실내 조명에 민감하지 않기 때문에 전체 절차에 어두운 환경이 필요하지 않습니다.

반응 용액이 포화I(504)에 도달하는 시간은 온도에 따라 달라지는 것을 주목해야 한다. 도 3에나타낸 바와 같이, 실온(25°C)에서 적어도 12분이 요구되었다. 25°C 이하의 온도에서 반응을 수행하면 반응 시간이 더 길어질 것이다. PMQ 솔루션의 기본 pH 상태는 잠재적으로 흡광도 I504에영향을 미칠 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 PMQ 솔루션의 pH를 7.0 미만으로 조정합니다. 그렇지 않으면 pH가 7.0 이상인 용액에 새로운 교정 곡선이 필요합니다. 또한, 시험된 샘플의 내장 아질산염은 검출에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 이것은 고농도의 아질산염(5 mM)이 표준 시험에서 사용되었기 때문에 본질적인 아질산염의 농도가 매우 높을 때만 발생할 수 있다.

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Disclosures

저자는 선언할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 광저우 중국 의학 대학의 창업 보조금과 GZUCM의 청소년 과학 연구 교육 프로젝트 (2019QNPY06)를 인정합니다. 우리는 또한 시설에 대한 지원에 대한 광저우 중국 의학 대학의 링난 의학 연구 센터를 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Methoxyaniline Aladdin K1709027
2,4-Dimethoxyaniline Heowns 10154207
3,4-Dimethoxyaniline Bidepharm BD21914
4-Methylaniline Adamas-beta P1414526
4-Nitroaniline Macklin C10191447
96-wells,Flat Botton Labserv 310109008
Gaussian@16 software Gaussian, Inc Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acid GCRF 20180902
Marvin sketch (software) CHEMAXON free edition: 15.6.29
Phosphoric acid Macklin C10112815
Primaquine bisiphosphate 3A Chemicals CEBK200054
Sodium nitrite Alfa Aesar 5006K18R
Sulfonamides TCI(shanghai) GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate reader Thermo Fisher Supplied with SkanIt Software 4.1

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References

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UV-Vis및 말라리아 방지 프리마퀸의 육안 측정을 위한 최적화된 Griess 반응
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Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).More

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).

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